Rafael Duarte Silva

Modelo experimental de induccedilatildeo agrave tendinose de Aquiles Um estudo morfomeacutetrico

Belo HorizonteFaculdade de Medicina

Universidade Federal de Minas Gerais2008

Rafael Duarte Silva

Modelo experimental de induccedilatildeo agrave tendinose de Aquiles Um estudo morfomeacutetrico

Dissertaccedilatildeo apresentada ao curso de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial agrave obtenccedilatildeo do tiacutetulo de MestreOrientador Prof Dr Anilton Ceacutesar VasconcelosCo-orientadora Profa Dra Tacircnia Clarete Sampaio

Belo HorizonteFaculdade de Medicina

Universidade Federal de Minas Gerais2008

Silva Rafael DuarteS586m Modelo experimental de induccedilatildeo agrave tendinose de Aquiles

[manuscrito] um estudo morfomeacutetrico Rafael Duarte Silva - - Belo Horizonte 2008 91f il Orientador Anilton Ceacutesar Vasconcelos Co-orientadora Tacircnia Clarete Sampaio Aacuterea de concentraccedilatildeo Patologia Dissertaccedilatildeo (mestrado) Universidade Federal de Minas Gerais Faculdade de Medicina

1 Tendinopatia 2 Tendatildeo do Calcacircneoetiologia 3 Modalidades de Fisioterapia 4 Dissertaccedilotildees Acadecircmicas I Vasconcelos Anilton Ceacutesar II Samapio Tacircnia Clarete III Universidade Federal de Minas Gerais Faculdade de Medicina IV Tiacutetulo NLM WE 600

Dedico este trabalho aos meus pais Niacutevio e Lourdes pelo amor incondicional agrave Fernanda minha companheira agrave minha irmatilde Liacutevia pela credibilidade e aos meus familiares e amigos por todo apoio

2

Agradecimentos

- Primeiramente agrave Deus por mais uma etapa vencida

- Ao Prof Dr Aniacutelton Ceacutesar Vasconcelos por ter acreditado no projeto e pela sincera

amizade Muito obrigado Professor Aniacutelton

- A todos os meus professores da Faculdade de Ciecircncias Meacutedicas de Minas Gerais

que foram exemplo de profissionalismo em minha carreira e em especial a Profa

Dra Tacircnia Clarete Sampaio pela sua contribuiccedilatildeo no trabalho

- A todos os professores da Universidade Federal de Minas Gerais em especial a

Profa Dra Denise Carmona Cara que me ldquoabriu as portasrdquo do Departamento de

Patologia

- Ao Prof Dr Mark Anthony Glazebrook por sua atenccedilatildeo e assistecircncia

- Ao meu pai agrave minha matildee e agrave minha irmatilde pela credibilidade e amor incondicional

- Agrave Fernanda pelo amor companherismo e paciecircncia nos momentos difiacuteceis

- A todos os integrantes do Laboratoacuterio de Apoptose em especial minha amiga Laiacutes

que sempre se demonstrou disponiacutevel em ajudar

- Aos meus colegas de profissatildeo pelo incentivo de buscar sempre mais pois nada eacute

impossiacutevel

- A todos os meus familiares e amigos que sempre estiveram do meu lado

- Ao Departamento de Farmacologia pelas contribuiccedilotildees no projeto

- Agrave FAPEMIG e ao CNPq pelo apoio financeiro

3

ldquoAprende que natildeo importa aonde jaacute chegou mas aonde estaacute indordquoldquo e que ser flexiacutevel natildeo signica ser fraco ou sem personalidade pois natildeo importa o quatildeo delicada e fraacutegil eacute uma situaccedilatildeo sempre existem dois ladosrdquoldquoAprende que paciecircncia requer muita praacuteticardquo ldquo e que maturidade tem mais a ver com os tipos de experiecircncia que se teve e o que vocecirc aprendeu com elas do que com quantos aniversaacuterios vocecirc celebrourdquoldquoPortanto plante seu jardim e decore sua alma em vez de esperar que algueacutem lhe traga floresrdquo ldquoNossas daacutedivas satildeo traidoras e nos fazem perder o bem que poderiacuteamos conquistar se natildeo fosse o medo de tentarrdquo

O Menestrel ndash William Shakespeare

4

ResumoIntroduccedilatildeo Microscopicamente a tendinpatia se apresenta com desorganizaccedilatildeo e

microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade maior deposiccedilatildeo de colaacutegeno

tipo III e glicosaminoglicanos

Objetivo Avaliar morfometricamente os eventos envolvidos na patogenia e

evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo em ratos

machos

Metodologia Foram utilizados trinta ratos machos Wistar divididos aleatoriamente

em Grupo experimental (n=15) e Grupo controle (n=15) Cada grupo foi dividido nos

intervalos de quatro (n=5) oito (n=5) e dezesseis (n=5) semanas O grupo

experimental correu em uma esteira adaptada cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin Apoacutes o protocolo os animais foram

submetidos agrave eutanaacutesia e os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo foram

extirpados fixados e processados Em seguida realizou-se as coloraccedilotildees de

Hematoxilina-Eosina Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e TUNEL

Resultados A densidade celular e as lacunas intersticiais aumentaram nos grupos

experimentais da quarta (092 plusmn 006 vs 061 plusmn 005 - Plt001) (993 plusmn 155 vs 37 plusmn

079 - Plt001) oitava (085 plusmn 004 vs 058 plusmn 006 - Plt005) (116 plusmn 259 vs 381 plusmn

087 - Plt001) e deacutecima sexta (082 plusmn 004 vs 053 plusmn 006 - Plt001) (1213 plusmn 103 vs

444 plusmn 056 - Plt0001) semana respectivamente Houve maior deposiccedilatildeo de

colaacutegeno tipo III e glicosaminoglicanos nos grupos experimentais da quarta (434 plusmn

384 vs 657 plusmn 306 - Plt0001) (833 plusmn 117 vs 397 plusmn 071 - Plt001) oitava (5045 plusmn

42 vs 671 plusmn 284 - Plt00001) (912 plusmn 117 vs 419 plusmn 075 - Plt001) e deacutecima sexta

(596 plusmn 241 vs 496 plusmn 132 - Plt00001) (1253 plusmn 156 vs 384 plusmn 066 - Plt001)

semana respectivamente A expressatildeo da atividade celular foi maior nos grupos

experimentais (4 grumosnuacutecleo vs 2 grumosnuacutecleo - Plt00001) de todos os

intervalos de tempo

Conclusatildeo Pode-se observar que o modelo proposto eacute eficaz para desenvolver

uma lesatildeo degenerativa no tendatildeo de Aquiles livre de infiltrado inflamatoacuterio Apartir

desse modelo futuras pesquisas devem investigar o efeito das diversas terapias

fiacutesicas e farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

Palavras-chaves tendinopatia tendatildeo de Aquiles experimento animal

5

AbstractBackground Microscopically tendinosis presents collagen fibers disorganization

and microtears hipercellularity higher collagen type III and glicosaminoglicans

deposition

Purpose Morphometric evaluation of the Aquiles tendinosis` pathogen events and

evolution using a male rats induction model

Methods Thirty male Wistar rats were randomized splitted in an experimental (n=15)

and a control groups (n=15) Five animalsgroup were euthanized at four eight and

sixteen weeks Experimental group ran on an adapted treadmill 5 times a week 80

minutes daily at 268 mmin Then the right and left Achilles tendons were collected

and processed Obtained slides were stained by Hematoxilyn-Eosin Picrosirius Red

Alcian Blue AgNOR and TUNEL

Results Cellular density and microtearing raised in the experimental group at fourth

(092 plusmn 006 vs 061 plusmn 005 - Plt001) (993 plusmn 155 vs 37 plusmn 079 - Plt001) eighth

(085 plusmn 004 vs 058 plusmn 006 - Plt005) (116 plusmn 259 vs 381 plusmn 087 - Plt001) and

sixteenth (082 plusmn 004 vs 053 plusmn 006 - Plt001) (1213 plusmn 103 vs 444 plusmn 056 -

Plt0001) weeks respectively There were more type III collagen and

glycosaminoglycans deposition in the experimental group at fourth (434 plusmn 384 vs

657 plusmn 306 - Plt0001) (833 plusmn 117 vs 397 plusmn 071 - Plt001) eighth (5045 plusmn 42 vs

671 plusmn 284 - Plt00001) (912 plusmn 117 vs 419 plusmn 075 - Plt001) and sixteenth (596 plusmn

241 vs 496 plusmn 132 - Plt00001) (1253 plusmn 156 vs 384 plusmn 066 - Plt001) weeks

respectively The cellular activity expression was higher in the experimental groups

(4 clustersnucleus vs 2 clustersnucleus - Plt00001) of all time intervals

Conclusions The proposed model was able to induce degenerative injury and

morphometry showed important results Future researches must investigate physical

and pharmacological therapies effects to the Achilles tendinosis

Keywords tendinopathy Achilles tendon animal experimentation

6

Lista de figurasPaacutegina

Figura I Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas

sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 13Figura II Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo 14Figura III Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) 14Figura IV Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress 15Figura V Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo 23Figura VI Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente

para os ratos 24Figura VII Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo 27Figura VIII Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x 29Figura IX Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo

controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva

de 10x 30Figura X Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta

semana (A) oitava semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash

detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz

polarizada objetiva de 10x 33Figura XI Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como

aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue objetiva de 10x 34Figura XII Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande

quantidade de marcaccedilotildees intranucleares AgNOR objetiva de 40x 35Figura XIII Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena

quantidade de marcaccedilotildees intranucleares AgNOR objetiva de 40x 35Figura XIV Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo

controle (A) e experimental (B) TUNEL objetiva de

40x

36

Figura XV Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta

bioloacutegica poderaacute ter um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende

diretamente das caracteriacutesticas da carga impostahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 41

7

Lista de organogramasPaacutegina

Organograma I Etiologia multifatorial da tendinose 17Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no

tendatildeo 18Organograma III Desenho de estudo do experimento 23

8

Lista de graacuteficosPaacutegina

Graacutefico I Evoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos

trecircs intervalos de tempo 30Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 31Graacutefico III Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e

controle ao decorrer do protocolo 31Graacutefico IV Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao

decorrer do protocolo 32Graacutefico V Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo

experimental ao decorrer do protocolo 32Graacutefico VI Evoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 33

9

Lista de tabelasPaacutegina

Tabela I Meacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e

experimental 29Tabela II Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo

controle e experimental 31Tabela III Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo

controle e experimental 32Tabela IV Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo

controle e experimental 34

10

Lista de abreviaturas e siglas

AgNOR Regiatildeo Organizadora de Nucleacuteolo corado pela Prata

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e TecnoloacutegicoCO2 Dioxido de carbonoCOX-2 Ciclooxigenase-2DNA Do inglecircs Deoxyribonucleic Acid - Aacutecido desoxirribonucleacuteicoFAPEMIG Fundaccedilatildeo de Amparo a Pesquisa de Minas GeraisFLAP Do inglecircs 5-Lipoxygenase-activating ProteinHE Hematoxilina-eosinaH2O2 Peroacutexido de hidrogecircnioGAG GlicosaminoglicanoIA Iacutendice ApoptoacuteticoIGF-1 Fator de crescimento insuliacutenicoIL InterleucinaIBRAMED Induacutestria Brasileira de Equipamentos MeacutedicosICB Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas MEC Matriz extra-celularMMPs Metaloproteinases de matrizPG ProstaglandinaTUNEL Do inglecircs Terminal deoxynucleotidyl Transferase Urydine Nick End

Labeling - Marcaccedilatildeo in situ da fragmentaccedilatildeo do genoma com transferase

terminal de deoxinucleotiacutedioUFMG Universidade Federal de Minas Geraismicrom microcircmetros

11

Sum aacute rio Paacutegina

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo 13

Tendinose 16

Modelos de induccedilatildeo a tendinose 19

Objetivos 22

Material e meacutetodos

Distribuiccedilatildeo dos grupos 23

Anaacutelise histoloacutegica 24

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetrica 25

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HE 25

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red 26

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian Blue 27

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNOR 27

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNEL 28

Anaacutelise estatiacutestica 28

Resultados 29

Discussatildeo 37

Conclusatildeo 44

Referecircncias Bibliograacuteficas 45

Apecircndice I (Selecionado entre os melhores pocircsteres do I Encontro de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Patologia da UFMG)55

Apecircndice II (Modelos experimentais de induccedilatildeo agrave tendinose por esforccedilo repetitivo - Revisatildeo de literatura)56

Apecircndice III (Experimental model of Achilles Tendinosis` induction A morphometrical study)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

12

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo

O tendatildeo eacute um conjunto de fibras colaacutegenas compactas que conectam o muacutesculo

ao osso Possui aproximadamente 70 de aacutegua com boa parte associada aos

glicosaminoglicanos da matriz extracelular (Riley et al 1994) Jaacute o colaacutegeno seu

constituinte baacutesico representa ateacute 95 do peso seco do tendatildeo sendo que uma

grande proporccedilatildeo se refere ao tipo I e o restante (menos de 10) ao tipo III

(Gross 1992 Rufai et al 1995) Aleacutem desses constituintes estaacute presente cerca

de 2 de elastina (Eyden amp Tzaphlidou 2001) e pequena quantidade de

colaacutegeno tipo IV (Ahtikoski et al 2003)

O colaacutegeno eacute formado pelo tropocolaacutegeno que por sua vez eacute formado por trecircs

cadeias peptiacutedicas helicoidais e espiraladas (Rich amp Crick 1961) (Figura I) Eacute

interessante ressaltar que a moleacutecula de tropocolaacutegeno eacute cerca de dez vezes

mais resistente que o tendatildeo (forccedila de resistecircncia secccedilatildeo transversa) Isso

porque as ligaccedilotildees intra-moleculares formam interaccedilotildees mais fortes do que as

interaccedilotildees inter-moleculares (Gustavson 1956) Dessa maneira as lesotildees

acontecem principalmente no niacutevel inter-molecular

Considerando as ligaccedilotildees inter-moleculares o colaacutegeno tipo I apresenta

interaccedilotildees mais resistentes agraves tensotildees com ligaccedilotildees estaacuteveis e natildeo-redutiacuteveis

que natildeo se organizam dinamicamente Por outro lado o colaacutegeno tipo III

apresenta interaccedilotildees menos resistentes agraves tensotildees com poucas ligaccedilotildees estaacuteveis

e redutiacuteveis que tecircm a capacidade de se organizar dinamicamente (Viidik et al 1982) O colaacutegeno tipo IV natildeo contribui para as caracteriacutesticas mecacircnicas do

tendatildeo

13

Figura I ndash Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 (Adaptado de Junqueira amp Carneiro 2004)

As moleacuteculas de tropocolaacutegeno se agrupam em feixes primaacuterios para formar as

microfibrilas e fibrilas (Figura II) Os grupos de feixes primaacuterios unem-se para

formar os fasciacuteculos ou feixes secundaacuterios essas satildeo as menores unidades

funcionais do tendatildeo (Khan et al 1999) Envolvendo os fasciacuteculos encontra-se

uma camada de tecido conectivo denominada endotendatildeo Essa camada conteacutem

estruturas nervosas vasculares e linfaacuteticas Agrupando os endotendotildees e

envolvendo o tendatildeo propriamente dito se encontra o epitendatildeo e mais

externamente o paratendatildeo que eacute a camada mais vascularizada Este uacuteltimo

pode se tornar uma camada dupla preenchida por liquido sinovial (bursa) em

tendotildees sujeitos a fricccedilatildeo

O arranjo em paralelo dessas fibras de colaacutegeno eacute adaptado para a funccedilatildeo do

tendatildeo que controla cargas tensionais unidirecionais De maneira distinta os

ligamentos possuem um arranjo entrelaccedilado pois podem controlar cargas

tensionais em vaacuterias direccedilotildees (Figura III) (Snell 1984)

14

Figura II ndash Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo (Adaptado de Silva amp Castro 2006)

Figura III ndash Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) (Adaptado de Snell 1984)

A baixa proporccedilatildeo de elastina eacute responsaacutevel pela baixa elasticidade do tendatildeo

sendo que seu comprimento aumenta em apenas 8 a 10 antes de atingir o ponto

de ruptura total (Figura IV) (Butler et al 1978) Isso eacute importante para funccedilatildeo do

tendatildeo pois se ele fosse mais elaacutestico poderia alongar-se com a contraccedilatildeo

muscular em vez de transmitir forccedila ao osso

A presenccedila de aacutegua e glicosaminoglicanos contribui para manter o espaccedilamento

entre as fibras de colaacutegeno facilitando o deslizamento entre elas E juntamente

com as fibras de colaacutegeno e elastina conferem ao tendatildeo sua propriedade

viscoelaacutestica na qual o tecido retorna ao seu tamanho original depois de algum

tempo apoacutes ser submetido a certo niacutevel de forccedila de deformaccedilatildeo (Taylor et al 1990) Alguns tendotildees apresentam zonas de hipovascularizaccedilatildeo (Carr 1989) embora

todos sejam nutridos suficientemente para promover o processo reparativo

Entretanto este processo eacute lento devido agrave baixa taxa metaboacutelica Dessa forma se

o tendatildeo natildeo tiver um tempo adequado de recuperaccedilatildeo capaz de equilibrar o

processo de siacutentese e degradaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno ele estaraacute entatildeo sujeito

a lesotildees (Riley 2004)

15

Figura IV ndash Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress (Adaptado de Butler et al 1978)

Tendinose

Atualmente haacute uma tendecircncia de diagnosticar clinicamente todas as lesotildees no

tendatildeo como tendinopatia reservando os termos tendinite tendinose eou

paratendinite apenas para anaacutelises histopatoloacutegicas (Maffulli et al 1998) No

entanto eacute certo que as lesotildees agudas que apresentam infiltrado inflamatoacuterio reativo

se comportam de maneira distinta das lesotildees crocircnicas degenerativas tanto na

gecircnese da doenccedila quanto na propedecircutica Portanto criteacuterios cliacutenicos mais precisos

satildeo necessaacuterios para que natildeo ocorram procedimentos terapecircuticos incorretos

A tendinose eacute generalizadamente caracterizada por degeneraccedilatildeo intratendiacutenea

e desorganizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno Macroscopicamente se apresenta como

uma degeneraccedilatildeo mucoacuteide com o tecido friaacutevel desorganizado e de cor

acastanhada Microscopicamente confirma-se que esta estrutura apresenta

desorganizaccedilatildeo e microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade com

arredondamento dos nuacutecleos (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento significativo de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo a quantidade de

colaacutegeno tipo I (Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) neovascularizaccedilatildeo (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1999 Szomor et al 2006) e apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007) Outras caracteriacutesticas patoloacutegicas

comumente presentes satildeo as adiposes fibrocartilaginoses e metaplasias oacutesseas

(Kannus amp Jozsa 1991 Riley et al 1996) Aleacutem dessas alteraccedilotildees morfoloacutegicas

pode-se observar um aumento da produccedilatildeo de glutamato (Alfredson et al 1999 Alfredson et al 2001) e uma maior expressatildeo de IGF-1 (Olesen et al 2006 Scott et al 2007) e oacutexido niacutetrico (Szomor et al 2006)

Os altos niacuteveis do neurotransmissor excitatoacuterio glutamato estatildeo relacionados

com a sensaccedilatildeo dolorosa (Alfredson et al 2001) A maior expressatildeo de IGF-1 eacute

considerada responsaacutevel por estimular a siacutentese de colaacutegeno a proliferaccedilatildeo celular

e o acuacutemulo de glicosaminoglicanos em resposta agraves cargas no entanto natildeo se sabe

se essa eacute uma resposta adaptativa ou patoloacutegica (Olesen et al 2006) Jaacute o papel

do oacutexido niacutetrico natildeo estaacute completamente claro Tem se associado altos niacuteveis dessa

16

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

Referecircncias Bibliograacuteficas

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Type IV collagen in rat skeletal muscle during immobilization in shortened and

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aetiopathogenesis of tendinopathy is it the over-stimulation or the under-

stimulation of tendon cells Int J Exp Pathol 2007 88 217ndash226

45

Rafael Duarte Silva

Modelo experimental de induccedilatildeo agrave tendinose de Aquiles Um estudo morfomeacutetrico

Dissertaccedilatildeo apresentada ao curso de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial agrave obtenccedilatildeo do tiacutetulo de MestreOrientador Prof Dr Anilton Ceacutesar VasconcelosCo-orientadora Profa Dra Tacircnia Clarete Sampaio

Belo HorizonteFaculdade de Medicina

Universidade Federal de Minas Gerais2008

Silva Rafael DuarteS586m Modelo experimental de induccedilatildeo agrave tendinose de Aquiles

[manuscrito] um estudo morfomeacutetrico Rafael Duarte Silva - - Belo Horizonte 2008 91f il Orientador Anilton Ceacutesar Vasconcelos Co-orientadora Tacircnia Clarete Sampaio Aacuterea de concentraccedilatildeo Patologia Dissertaccedilatildeo (mestrado) Universidade Federal de Minas Gerais Faculdade de Medicina

1 Tendinopatia 2 Tendatildeo do Calcacircneoetiologia 3 Modalidades de Fisioterapia 4 Dissertaccedilotildees Acadecircmicas I Vasconcelos Anilton Ceacutesar II Samapio Tacircnia Clarete III Universidade Federal de Minas Gerais Faculdade de Medicina IV Tiacutetulo NLM WE 600

Dedico este trabalho aos meus pais Niacutevio e Lourdes pelo amor incondicional agrave Fernanda minha companheira agrave minha irmatilde Liacutevia pela credibilidade e aos meus familiares e amigos por todo apoio

2

Agradecimentos

- Primeiramente agrave Deus por mais uma etapa vencida

- Ao Prof Dr Aniacutelton Ceacutesar Vasconcelos por ter acreditado no projeto e pela sincera

amizade Muito obrigado Professor Aniacutelton

- A todos os meus professores da Faculdade de Ciecircncias Meacutedicas de Minas Gerais

que foram exemplo de profissionalismo em minha carreira e em especial a Profa

Dra Tacircnia Clarete Sampaio pela sua contribuiccedilatildeo no trabalho

- A todos os professores da Universidade Federal de Minas Gerais em especial a

Profa Dra Denise Carmona Cara que me ldquoabriu as portasrdquo do Departamento de

Patologia

- Ao Prof Dr Mark Anthony Glazebrook por sua atenccedilatildeo e assistecircncia

- Ao meu pai agrave minha matildee e agrave minha irmatilde pela credibilidade e amor incondicional

- Agrave Fernanda pelo amor companherismo e paciecircncia nos momentos difiacuteceis

- A todos os integrantes do Laboratoacuterio de Apoptose em especial minha amiga Laiacutes

que sempre se demonstrou disponiacutevel em ajudar

- Aos meus colegas de profissatildeo pelo incentivo de buscar sempre mais pois nada eacute

impossiacutevel

- A todos os meus familiares e amigos que sempre estiveram do meu lado

- Ao Departamento de Farmacologia pelas contribuiccedilotildees no projeto

- Agrave FAPEMIG e ao CNPq pelo apoio financeiro

3

ldquoAprende que natildeo importa aonde jaacute chegou mas aonde estaacute indordquoldquo e que ser flexiacutevel natildeo signica ser fraco ou sem personalidade pois natildeo importa o quatildeo delicada e fraacutegil eacute uma situaccedilatildeo sempre existem dois ladosrdquoldquoAprende que paciecircncia requer muita praacuteticardquo ldquo e que maturidade tem mais a ver com os tipos de experiecircncia que se teve e o que vocecirc aprendeu com elas do que com quantos aniversaacuterios vocecirc celebrourdquoldquoPortanto plante seu jardim e decore sua alma em vez de esperar que algueacutem lhe traga floresrdquo ldquoNossas daacutedivas satildeo traidoras e nos fazem perder o bem que poderiacuteamos conquistar se natildeo fosse o medo de tentarrdquo

O Menestrel ndash William Shakespeare

4

ResumoIntroduccedilatildeo Microscopicamente a tendinpatia se apresenta com desorganizaccedilatildeo e

microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade maior deposiccedilatildeo de colaacutegeno

tipo III e glicosaminoglicanos

Objetivo Avaliar morfometricamente os eventos envolvidos na patogenia e

evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo em ratos

machos

Metodologia Foram utilizados trinta ratos machos Wistar divididos aleatoriamente

em Grupo experimental (n=15) e Grupo controle (n=15) Cada grupo foi dividido nos

intervalos de quatro (n=5) oito (n=5) e dezesseis (n=5) semanas O grupo

experimental correu em uma esteira adaptada cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin Apoacutes o protocolo os animais foram

submetidos agrave eutanaacutesia e os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo foram

extirpados fixados e processados Em seguida realizou-se as coloraccedilotildees de

Hematoxilina-Eosina Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e TUNEL

Resultados A densidade celular e as lacunas intersticiais aumentaram nos grupos

experimentais da quarta (092 plusmn 006 vs 061 plusmn 005 - Plt001) (993 plusmn 155 vs 37 plusmn

079 - Plt001) oitava (085 plusmn 004 vs 058 plusmn 006 - Plt005) (116 plusmn 259 vs 381 plusmn

087 - Plt001) e deacutecima sexta (082 plusmn 004 vs 053 plusmn 006 - Plt001) (1213 plusmn 103 vs

444 plusmn 056 - Plt0001) semana respectivamente Houve maior deposiccedilatildeo de

colaacutegeno tipo III e glicosaminoglicanos nos grupos experimentais da quarta (434 plusmn

384 vs 657 plusmn 306 - Plt0001) (833 plusmn 117 vs 397 plusmn 071 - Plt001) oitava (5045 plusmn

42 vs 671 plusmn 284 - Plt00001) (912 plusmn 117 vs 419 plusmn 075 - Plt001) e deacutecima sexta

(596 plusmn 241 vs 496 plusmn 132 - Plt00001) (1253 plusmn 156 vs 384 plusmn 066 - Plt001)

semana respectivamente A expressatildeo da atividade celular foi maior nos grupos

experimentais (4 grumosnuacutecleo vs 2 grumosnuacutecleo - Plt00001) de todos os

intervalos de tempo

Conclusatildeo Pode-se observar que o modelo proposto eacute eficaz para desenvolver

uma lesatildeo degenerativa no tendatildeo de Aquiles livre de infiltrado inflamatoacuterio Apartir

desse modelo futuras pesquisas devem investigar o efeito das diversas terapias

fiacutesicas e farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

Palavras-chaves tendinopatia tendatildeo de Aquiles experimento animal

5

AbstractBackground Microscopically tendinosis presents collagen fibers disorganization

and microtears hipercellularity higher collagen type III and glicosaminoglicans

deposition

Purpose Morphometric evaluation of the Aquiles tendinosis` pathogen events and

evolution using a male rats induction model

Methods Thirty male Wistar rats were randomized splitted in an experimental (n=15)

and a control groups (n=15) Five animalsgroup were euthanized at four eight and

sixteen weeks Experimental group ran on an adapted treadmill 5 times a week 80

minutes daily at 268 mmin Then the right and left Achilles tendons were collected

and processed Obtained slides were stained by Hematoxilyn-Eosin Picrosirius Red

Alcian Blue AgNOR and TUNEL

Results Cellular density and microtearing raised in the experimental group at fourth

(092 plusmn 006 vs 061 plusmn 005 - Plt001) (993 plusmn 155 vs 37 plusmn 079 - Plt001) eighth

(085 plusmn 004 vs 058 plusmn 006 - Plt005) (116 plusmn 259 vs 381 plusmn 087 - Plt001) and

sixteenth (082 plusmn 004 vs 053 plusmn 006 - Plt001) (1213 plusmn 103 vs 444 plusmn 056 -

Plt0001) weeks respectively There were more type III collagen and

glycosaminoglycans deposition in the experimental group at fourth (434 plusmn 384 vs

657 plusmn 306 - Plt0001) (833 plusmn 117 vs 397 plusmn 071 - Plt001) eighth (5045 plusmn 42 vs

671 plusmn 284 - Plt00001) (912 plusmn 117 vs 419 plusmn 075 - Plt001) and sixteenth (596 plusmn

241 vs 496 plusmn 132 - Plt00001) (1253 plusmn 156 vs 384 plusmn 066 - Plt001) weeks

respectively The cellular activity expression was higher in the experimental groups

(4 clustersnucleus vs 2 clustersnucleus - Plt00001) of all time intervals

Conclusions The proposed model was able to induce degenerative injury and

morphometry showed important results Future researches must investigate physical

and pharmacological therapies effects to the Achilles tendinosis

Keywords tendinopathy Achilles tendon animal experimentation

6

Lista de figurasPaacutegina

Figura I Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas

sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 13Figura II Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo 14Figura III Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) 14Figura IV Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress 15Figura V Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo 23Figura VI Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente

para os ratos 24Figura VII Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo 27Figura VIII Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x 29Figura IX Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo

controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva

de 10x 30Figura X Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta

semana (A) oitava semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash

detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz

polarizada objetiva de 10x 33Figura XI Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como

aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue objetiva de 10x 34Figura XII Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande

quantidade de marcaccedilotildees intranucleares AgNOR objetiva de 40x 35Figura XIII Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena

quantidade de marcaccedilotildees intranucleares AgNOR objetiva de 40x 35Figura XIV Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo

controle (A) e experimental (B) TUNEL objetiva de

40x

36

Figura XV Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta

bioloacutegica poderaacute ter um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende

diretamente das caracteriacutesticas da carga impostahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 41

7

Lista de organogramasPaacutegina

Organograma I Etiologia multifatorial da tendinose 17Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no

tendatildeo 18Organograma III Desenho de estudo do experimento 23

8

Lista de graacuteficosPaacutegina

Graacutefico I Evoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos

trecircs intervalos de tempo 30Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 31Graacutefico III Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e

controle ao decorrer do protocolo 31Graacutefico IV Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao

decorrer do protocolo 32Graacutefico V Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo

experimental ao decorrer do protocolo 32Graacutefico VI Evoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 33

9

Lista de tabelasPaacutegina

Tabela I Meacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e

experimental 29Tabela II Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo

controle e experimental 31Tabela III Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo

controle e experimental 32Tabela IV Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo

controle e experimental 34

10

Lista de abreviaturas e siglas

AgNOR Regiatildeo Organizadora de Nucleacuteolo corado pela Prata

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e TecnoloacutegicoCO2 Dioxido de carbonoCOX-2 Ciclooxigenase-2DNA Do inglecircs Deoxyribonucleic Acid - Aacutecido desoxirribonucleacuteicoFAPEMIG Fundaccedilatildeo de Amparo a Pesquisa de Minas GeraisFLAP Do inglecircs 5-Lipoxygenase-activating ProteinHE Hematoxilina-eosinaH2O2 Peroacutexido de hidrogecircnioGAG GlicosaminoglicanoIA Iacutendice ApoptoacuteticoIGF-1 Fator de crescimento insuliacutenicoIL InterleucinaIBRAMED Induacutestria Brasileira de Equipamentos MeacutedicosICB Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas MEC Matriz extra-celularMMPs Metaloproteinases de matrizPG ProstaglandinaTUNEL Do inglecircs Terminal deoxynucleotidyl Transferase Urydine Nick End

Labeling - Marcaccedilatildeo in situ da fragmentaccedilatildeo do genoma com transferase

terminal de deoxinucleotiacutedioUFMG Universidade Federal de Minas Geraismicrom microcircmetros

11

Sum aacute rio Paacutegina

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo 13

Tendinose 16

Modelos de induccedilatildeo a tendinose 19

Objetivos 22

Material e meacutetodos

Distribuiccedilatildeo dos grupos 23

Anaacutelise histoloacutegica 24

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetrica 25

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HE 25

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red 26

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian Blue 27

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNOR 27

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNEL 28

Anaacutelise estatiacutestica 28

Resultados 29

Discussatildeo 37

Conclusatildeo 44

Referecircncias Bibliograacuteficas 45

Apecircndice I (Selecionado entre os melhores pocircsteres do I Encontro de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Patologia da UFMG)55

Apecircndice II (Modelos experimentais de induccedilatildeo agrave tendinose por esforccedilo repetitivo - Revisatildeo de literatura)56

Apecircndice III (Experimental model of Achilles Tendinosis` induction A morphometrical study)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

12

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo

O tendatildeo eacute um conjunto de fibras colaacutegenas compactas que conectam o muacutesculo

ao osso Possui aproximadamente 70 de aacutegua com boa parte associada aos

glicosaminoglicanos da matriz extracelular (Riley et al 1994) Jaacute o colaacutegeno seu

constituinte baacutesico representa ateacute 95 do peso seco do tendatildeo sendo que uma

grande proporccedilatildeo se refere ao tipo I e o restante (menos de 10) ao tipo III

(Gross 1992 Rufai et al 1995) Aleacutem desses constituintes estaacute presente cerca

de 2 de elastina (Eyden amp Tzaphlidou 2001) e pequena quantidade de

colaacutegeno tipo IV (Ahtikoski et al 2003)

O colaacutegeno eacute formado pelo tropocolaacutegeno que por sua vez eacute formado por trecircs

cadeias peptiacutedicas helicoidais e espiraladas (Rich amp Crick 1961) (Figura I) Eacute

interessante ressaltar que a moleacutecula de tropocolaacutegeno eacute cerca de dez vezes

mais resistente que o tendatildeo (forccedila de resistecircncia secccedilatildeo transversa) Isso

porque as ligaccedilotildees intra-moleculares formam interaccedilotildees mais fortes do que as

interaccedilotildees inter-moleculares (Gustavson 1956) Dessa maneira as lesotildees

acontecem principalmente no niacutevel inter-molecular

Considerando as ligaccedilotildees inter-moleculares o colaacutegeno tipo I apresenta

interaccedilotildees mais resistentes agraves tensotildees com ligaccedilotildees estaacuteveis e natildeo-redutiacuteveis

que natildeo se organizam dinamicamente Por outro lado o colaacutegeno tipo III

apresenta interaccedilotildees menos resistentes agraves tensotildees com poucas ligaccedilotildees estaacuteveis

e redutiacuteveis que tecircm a capacidade de se organizar dinamicamente (Viidik et al 1982) O colaacutegeno tipo IV natildeo contribui para as caracteriacutesticas mecacircnicas do

tendatildeo

13

Figura I ndash Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 (Adaptado de Junqueira amp Carneiro 2004)

As moleacuteculas de tropocolaacutegeno se agrupam em feixes primaacuterios para formar as

microfibrilas e fibrilas (Figura II) Os grupos de feixes primaacuterios unem-se para

formar os fasciacuteculos ou feixes secundaacuterios essas satildeo as menores unidades

funcionais do tendatildeo (Khan et al 1999) Envolvendo os fasciacuteculos encontra-se

uma camada de tecido conectivo denominada endotendatildeo Essa camada conteacutem

estruturas nervosas vasculares e linfaacuteticas Agrupando os endotendotildees e

envolvendo o tendatildeo propriamente dito se encontra o epitendatildeo e mais

externamente o paratendatildeo que eacute a camada mais vascularizada Este uacuteltimo

pode se tornar uma camada dupla preenchida por liquido sinovial (bursa) em

tendotildees sujeitos a fricccedilatildeo

O arranjo em paralelo dessas fibras de colaacutegeno eacute adaptado para a funccedilatildeo do

tendatildeo que controla cargas tensionais unidirecionais De maneira distinta os

ligamentos possuem um arranjo entrelaccedilado pois podem controlar cargas

tensionais em vaacuterias direccedilotildees (Figura III) (Snell 1984)

14

Figura II ndash Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo (Adaptado de Silva amp Castro 2006)

Figura III ndash Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) (Adaptado de Snell 1984)

A baixa proporccedilatildeo de elastina eacute responsaacutevel pela baixa elasticidade do tendatildeo

sendo que seu comprimento aumenta em apenas 8 a 10 antes de atingir o ponto

de ruptura total (Figura IV) (Butler et al 1978) Isso eacute importante para funccedilatildeo do

tendatildeo pois se ele fosse mais elaacutestico poderia alongar-se com a contraccedilatildeo

muscular em vez de transmitir forccedila ao osso

A presenccedila de aacutegua e glicosaminoglicanos contribui para manter o espaccedilamento

entre as fibras de colaacutegeno facilitando o deslizamento entre elas E juntamente

com as fibras de colaacutegeno e elastina conferem ao tendatildeo sua propriedade

viscoelaacutestica na qual o tecido retorna ao seu tamanho original depois de algum

tempo apoacutes ser submetido a certo niacutevel de forccedila de deformaccedilatildeo (Taylor et al 1990) Alguns tendotildees apresentam zonas de hipovascularizaccedilatildeo (Carr 1989) embora

todos sejam nutridos suficientemente para promover o processo reparativo

Entretanto este processo eacute lento devido agrave baixa taxa metaboacutelica Dessa forma se

o tendatildeo natildeo tiver um tempo adequado de recuperaccedilatildeo capaz de equilibrar o

processo de siacutentese e degradaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno ele estaraacute entatildeo sujeito

a lesotildees (Riley 2004)

15

Figura IV ndash Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress (Adaptado de Butler et al 1978)

Tendinose

Atualmente haacute uma tendecircncia de diagnosticar clinicamente todas as lesotildees no

tendatildeo como tendinopatia reservando os termos tendinite tendinose eou

paratendinite apenas para anaacutelises histopatoloacutegicas (Maffulli et al 1998) No

entanto eacute certo que as lesotildees agudas que apresentam infiltrado inflamatoacuterio reativo

se comportam de maneira distinta das lesotildees crocircnicas degenerativas tanto na

gecircnese da doenccedila quanto na propedecircutica Portanto criteacuterios cliacutenicos mais precisos

satildeo necessaacuterios para que natildeo ocorram procedimentos terapecircuticos incorretos

A tendinose eacute generalizadamente caracterizada por degeneraccedilatildeo intratendiacutenea

e desorganizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno Macroscopicamente se apresenta como

uma degeneraccedilatildeo mucoacuteide com o tecido friaacutevel desorganizado e de cor

acastanhada Microscopicamente confirma-se que esta estrutura apresenta

desorganizaccedilatildeo e microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade com

arredondamento dos nuacutecleos (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento significativo de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo a quantidade de

colaacutegeno tipo I (Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) neovascularizaccedilatildeo (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1999 Szomor et al 2006) e apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007) Outras caracteriacutesticas patoloacutegicas

comumente presentes satildeo as adiposes fibrocartilaginoses e metaplasias oacutesseas

(Kannus amp Jozsa 1991 Riley et al 1996) Aleacutem dessas alteraccedilotildees morfoloacutegicas

pode-se observar um aumento da produccedilatildeo de glutamato (Alfredson et al 1999 Alfredson et al 2001) e uma maior expressatildeo de IGF-1 (Olesen et al 2006 Scott et al 2007) e oacutexido niacutetrico (Szomor et al 2006)

Os altos niacuteveis do neurotransmissor excitatoacuterio glutamato estatildeo relacionados

com a sensaccedilatildeo dolorosa (Alfredson et al 2001) A maior expressatildeo de IGF-1 eacute

considerada responsaacutevel por estimular a siacutentese de colaacutegeno a proliferaccedilatildeo celular

e o acuacutemulo de glicosaminoglicanos em resposta agraves cargas no entanto natildeo se sabe

se essa eacute uma resposta adaptativa ou patoloacutegica (Olesen et al 2006) Jaacute o papel

do oacutexido niacutetrico natildeo estaacute completamente claro Tem se associado altos niacuteveis dessa

16

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

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2007 25(5) 617-624

Archambault JM Wiley JP Bray RC Exercise loading f tendon and the

development of overuse injuries a review of current literature Sports Med

1995 20(2) 77-89

Arnoczky SP Lavagnino M Egerbacher M The mechanobiological

aetiopathogenesis of tendinopathy is it the over-stimulation or the under-

stimulation of tendon cells Int J Exp Pathol 2007 88 217ndash226

45

Silva Rafael DuarteS586m Modelo experimental de induccedilatildeo agrave tendinose de Aquiles

[manuscrito] um estudo morfomeacutetrico Rafael Duarte Silva - - Belo Horizonte 2008 91f il Orientador Anilton Ceacutesar Vasconcelos Co-orientadora Tacircnia Clarete Sampaio Aacuterea de concentraccedilatildeo Patologia Dissertaccedilatildeo (mestrado) Universidade Federal de Minas Gerais Faculdade de Medicina

1 Tendinopatia 2 Tendatildeo do Calcacircneoetiologia 3 Modalidades de Fisioterapia 4 Dissertaccedilotildees Acadecircmicas I Vasconcelos Anilton Ceacutesar II Samapio Tacircnia Clarete III Universidade Federal de Minas Gerais Faculdade de Medicina IV Tiacutetulo NLM WE 600

Dedico este trabalho aos meus pais Niacutevio e Lourdes pelo amor incondicional agrave Fernanda minha companheira agrave minha irmatilde Liacutevia pela credibilidade e aos meus familiares e amigos por todo apoio

2

Agradecimentos

- Primeiramente agrave Deus por mais uma etapa vencida

- Ao Prof Dr Aniacutelton Ceacutesar Vasconcelos por ter acreditado no projeto e pela sincera

amizade Muito obrigado Professor Aniacutelton

- A todos os meus professores da Faculdade de Ciecircncias Meacutedicas de Minas Gerais

que foram exemplo de profissionalismo em minha carreira e em especial a Profa

Dra Tacircnia Clarete Sampaio pela sua contribuiccedilatildeo no trabalho

- A todos os professores da Universidade Federal de Minas Gerais em especial a

Profa Dra Denise Carmona Cara que me ldquoabriu as portasrdquo do Departamento de

Patologia

- Ao Prof Dr Mark Anthony Glazebrook por sua atenccedilatildeo e assistecircncia

- Ao meu pai agrave minha matildee e agrave minha irmatilde pela credibilidade e amor incondicional

- Agrave Fernanda pelo amor companherismo e paciecircncia nos momentos difiacuteceis

- A todos os integrantes do Laboratoacuterio de Apoptose em especial minha amiga Laiacutes

que sempre se demonstrou disponiacutevel em ajudar

- Aos meus colegas de profissatildeo pelo incentivo de buscar sempre mais pois nada eacute

impossiacutevel

- A todos os meus familiares e amigos que sempre estiveram do meu lado

- Ao Departamento de Farmacologia pelas contribuiccedilotildees no projeto

- Agrave FAPEMIG e ao CNPq pelo apoio financeiro

3

ldquoAprende que natildeo importa aonde jaacute chegou mas aonde estaacute indordquoldquo e que ser flexiacutevel natildeo signica ser fraco ou sem personalidade pois natildeo importa o quatildeo delicada e fraacutegil eacute uma situaccedilatildeo sempre existem dois ladosrdquoldquoAprende que paciecircncia requer muita praacuteticardquo ldquo e que maturidade tem mais a ver com os tipos de experiecircncia que se teve e o que vocecirc aprendeu com elas do que com quantos aniversaacuterios vocecirc celebrourdquoldquoPortanto plante seu jardim e decore sua alma em vez de esperar que algueacutem lhe traga floresrdquo ldquoNossas daacutedivas satildeo traidoras e nos fazem perder o bem que poderiacuteamos conquistar se natildeo fosse o medo de tentarrdquo

O Menestrel ndash William Shakespeare

4

ResumoIntroduccedilatildeo Microscopicamente a tendinpatia se apresenta com desorganizaccedilatildeo e

microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade maior deposiccedilatildeo de colaacutegeno

tipo III e glicosaminoglicanos

Objetivo Avaliar morfometricamente os eventos envolvidos na patogenia e

evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo em ratos

machos

Metodologia Foram utilizados trinta ratos machos Wistar divididos aleatoriamente

em Grupo experimental (n=15) e Grupo controle (n=15) Cada grupo foi dividido nos

intervalos de quatro (n=5) oito (n=5) e dezesseis (n=5) semanas O grupo

experimental correu em uma esteira adaptada cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin Apoacutes o protocolo os animais foram

submetidos agrave eutanaacutesia e os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo foram

extirpados fixados e processados Em seguida realizou-se as coloraccedilotildees de

Hematoxilina-Eosina Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e TUNEL

Resultados A densidade celular e as lacunas intersticiais aumentaram nos grupos

experimentais da quarta (092 plusmn 006 vs 061 plusmn 005 - Plt001) (993 plusmn 155 vs 37 plusmn

079 - Plt001) oitava (085 plusmn 004 vs 058 plusmn 006 - Plt005) (116 plusmn 259 vs 381 plusmn

087 - Plt001) e deacutecima sexta (082 plusmn 004 vs 053 plusmn 006 - Plt001) (1213 plusmn 103 vs

444 plusmn 056 - Plt0001) semana respectivamente Houve maior deposiccedilatildeo de

colaacutegeno tipo III e glicosaminoglicanos nos grupos experimentais da quarta (434 plusmn

384 vs 657 plusmn 306 - Plt0001) (833 plusmn 117 vs 397 plusmn 071 - Plt001) oitava (5045 plusmn

42 vs 671 plusmn 284 - Plt00001) (912 plusmn 117 vs 419 plusmn 075 - Plt001) e deacutecima sexta

(596 plusmn 241 vs 496 plusmn 132 - Plt00001) (1253 plusmn 156 vs 384 plusmn 066 - Plt001)

semana respectivamente A expressatildeo da atividade celular foi maior nos grupos

experimentais (4 grumosnuacutecleo vs 2 grumosnuacutecleo - Plt00001) de todos os

intervalos de tempo

Conclusatildeo Pode-se observar que o modelo proposto eacute eficaz para desenvolver

uma lesatildeo degenerativa no tendatildeo de Aquiles livre de infiltrado inflamatoacuterio Apartir

desse modelo futuras pesquisas devem investigar o efeito das diversas terapias

fiacutesicas e farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

Palavras-chaves tendinopatia tendatildeo de Aquiles experimento animal

5

AbstractBackground Microscopically tendinosis presents collagen fibers disorganization

and microtears hipercellularity higher collagen type III and glicosaminoglicans

deposition

Purpose Morphometric evaluation of the Aquiles tendinosis` pathogen events and

evolution using a male rats induction model

Methods Thirty male Wistar rats were randomized splitted in an experimental (n=15)

and a control groups (n=15) Five animalsgroup were euthanized at four eight and

sixteen weeks Experimental group ran on an adapted treadmill 5 times a week 80

minutes daily at 268 mmin Then the right and left Achilles tendons were collected

and processed Obtained slides were stained by Hematoxilyn-Eosin Picrosirius Red

Alcian Blue AgNOR and TUNEL

Results Cellular density and microtearing raised in the experimental group at fourth

(092 plusmn 006 vs 061 plusmn 005 - Plt001) (993 plusmn 155 vs 37 plusmn 079 - Plt001) eighth

(085 plusmn 004 vs 058 plusmn 006 - Plt005) (116 plusmn 259 vs 381 plusmn 087 - Plt001) and

sixteenth (082 plusmn 004 vs 053 plusmn 006 - Plt001) (1213 plusmn 103 vs 444 plusmn 056 -

Plt0001) weeks respectively There were more type III collagen and

glycosaminoglycans deposition in the experimental group at fourth (434 plusmn 384 vs

657 plusmn 306 - Plt0001) (833 plusmn 117 vs 397 plusmn 071 - Plt001) eighth (5045 plusmn 42 vs

671 plusmn 284 - Plt00001) (912 plusmn 117 vs 419 plusmn 075 - Plt001) and sixteenth (596 plusmn

241 vs 496 plusmn 132 - Plt00001) (1253 plusmn 156 vs 384 plusmn 066 - Plt001) weeks

respectively The cellular activity expression was higher in the experimental groups

(4 clustersnucleus vs 2 clustersnucleus - Plt00001) of all time intervals

Conclusions The proposed model was able to induce degenerative injury and

morphometry showed important results Future researches must investigate physical

and pharmacological therapies effects to the Achilles tendinosis

Keywords tendinopathy Achilles tendon animal experimentation

6

Lista de figurasPaacutegina

Figura I Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas

sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 13Figura II Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo 14Figura III Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) 14Figura IV Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress 15Figura V Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo 23Figura VI Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente

para os ratos 24Figura VII Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo 27Figura VIII Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x 29Figura IX Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo

controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva

de 10x 30Figura X Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta

semana (A) oitava semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash

detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz

polarizada objetiva de 10x 33Figura XI Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como

aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue objetiva de 10x 34Figura XII Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande

quantidade de marcaccedilotildees intranucleares AgNOR objetiva de 40x 35Figura XIII Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena

quantidade de marcaccedilotildees intranucleares AgNOR objetiva de 40x 35Figura XIV Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo

controle (A) e experimental (B) TUNEL objetiva de

40x

36

Figura XV Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta

bioloacutegica poderaacute ter um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende

diretamente das caracteriacutesticas da carga impostahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 41

7

Lista de organogramasPaacutegina

Organograma I Etiologia multifatorial da tendinose 17Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no

tendatildeo 18Organograma III Desenho de estudo do experimento 23

8

Lista de graacuteficosPaacutegina

Graacutefico I Evoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos

trecircs intervalos de tempo 30Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 31Graacutefico III Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e

controle ao decorrer do protocolo 31Graacutefico IV Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao

decorrer do protocolo 32Graacutefico V Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo

experimental ao decorrer do protocolo 32Graacutefico VI Evoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 33

9

Lista de tabelasPaacutegina

Tabela I Meacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e

experimental 29Tabela II Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo

controle e experimental 31Tabela III Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo

controle e experimental 32Tabela IV Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo

controle e experimental 34

10

Lista de abreviaturas e siglas

AgNOR Regiatildeo Organizadora de Nucleacuteolo corado pela Prata

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e TecnoloacutegicoCO2 Dioxido de carbonoCOX-2 Ciclooxigenase-2DNA Do inglecircs Deoxyribonucleic Acid - Aacutecido desoxirribonucleacuteicoFAPEMIG Fundaccedilatildeo de Amparo a Pesquisa de Minas GeraisFLAP Do inglecircs 5-Lipoxygenase-activating ProteinHE Hematoxilina-eosinaH2O2 Peroacutexido de hidrogecircnioGAG GlicosaminoglicanoIA Iacutendice ApoptoacuteticoIGF-1 Fator de crescimento insuliacutenicoIL InterleucinaIBRAMED Induacutestria Brasileira de Equipamentos MeacutedicosICB Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas MEC Matriz extra-celularMMPs Metaloproteinases de matrizPG ProstaglandinaTUNEL Do inglecircs Terminal deoxynucleotidyl Transferase Urydine Nick End

Labeling - Marcaccedilatildeo in situ da fragmentaccedilatildeo do genoma com transferase

terminal de deoxinucleotiacutedioUFMG Universidade Federal de Minas Geraismicrom microcircmetros

11

Sum aacute rio Paacutegina

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo 13

Tendinose 16

Modelos de induccedilatildeo a tendinose 19

Objetivos 22

Material e meacutetodos

Distribuiccedilatildeo dos grupos 23

Anaacutelise histoloacutegica 24

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetrica 25

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HE 25

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red 26

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian Blue 27

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNOR 27

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNEL 28

Anaacutelise estatiacutestica 28

Resultados 29

Discussatildeo 37

Conclusatildeo 44

Referecircncias Bibliograacuteficas 45

Apecircndice I (Selecionado entre os melhores pocircsteres do I Encontro de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Patologia da UFMG)55

Apecircndice II (Modelos experimentais de induccedilatildeo agrave tendinose por esforccedilo repetitivo - Revisatildeo de literatura)56

Apecircndice III (Experimental model of Achilles Tendinosis` induction A morphometrical study)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

12

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo

O tendatildeo eacute um conjunto de fibras colaacutegenas compactas que conectam o muacutesculo

ao osso Possui aproximadamente 70 de aacutegua com boa parte associada aos

glicosaminoglicanos da matriz extracelular (Riley et al 1994) Jaacute o colaacutegeno seu

constituinte baacutesico representa ateacute 95 do peso seco do tendatildeo sendo que uma

grande proporccedilatildeo se refere ao tipo I e o restante (menos de 10) ao tipo III

(Gross 1992 Rufai et al 1995) Aleacutem desses constituintes estaacute presente cerca

de 2 de elastina (Eyden amp Tzaphlidou 2001) e pequena quantidade de

colaacutegeno tipo IV (Ahtikoski et al 2003)

O colaacutegeno eacute formado pelo tropocolaacutegeno que por sua vez eacute formado por trecircs

cadeias peptiacutedicas helicoidais e espiraladas (Rich amp Crick 1961) (Figura I) Eacute

interessante ressaltar que a moleacutecula de tropocolaacutegeno eacute cerca de dez vezes

mais resistente que o tendatildeo (forccedila de resistecircncia secccedilatildeo transversa) Isso

porque as ligaccedilotildees intra-moleculares formam interaccedilotildees mais fortes do que as

interaccedilotildees inter-moleculares (Gustavson 1956) Dessa maneira as lesotildees

acontecem principalmente no niacutevel inter-molecular

Considerando as ligaccedilotildees inter-moleculares o colaacutegeno tipo I apresenta

interaccedilotildees mais resistentes agraves tensotildees com ligaccedilotildees estaacuteveis e natildeo-redutiacuteveis

que natildeo se organizam dinamicamente Por outro lado o colaacutegeno tipo III

apresenta interaccedilotildees menos resistentes agraves tensotildees com poucas ligaccedilotildees estaacuteveis

e redutiacuteveis que tecircm a capacidade de se organizar dinamicamente (Viidik et al 1982) O colaacutegeno tipo IV natildeo contribui para as caracteriacutesticas mecacircnicas do

tendatildeo

13

Figura I ndash Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 (Adaptado de Junqueira amp Carneiro 2004)

As moleacuteculas de tropocolaacutegeno se agrupam em feixes primaacuterios para formar as

microfibrilas e fibrilas (Figura II) Os grupos de feixes primaacuterios unem-se para

formar os fasciacuteculos ou feixes secundaacuterios essas satildeo as menores unidades

funcionais do tendatildeo (Khan et al 1999) Envolvendo os fasciacuteculos encontra-se

uma camada de tecido conectivo denominada endotendatildeo Essa camada conteacutem

estruturas nervosas vasculares e linfaacuteticas Agrupando os endotendotildees e

envolvendo o tendatildeo propriamente dito se encontra o epitendatildeo e mais

externamente o paratendatildeo que eacute a camada mais vascularizada Este uacuteltimo

pode se tornar uma camada dupla preenchida por liquido sinovial (bursa) em

tendotildees sujeitos a fricccedilatildeo

O arranjo em paralelo dessas fibras de colaacutegeno eacute adaptado para a funccedilatildeo do

tendatildeo que controla cargas tensionais unidirecionais De maneira distinta os

ligamentos possuem um arranjo entrelaccedilado pois podem controlar cargas

tensionais em vaacuterias direccedilotildees (Figura III) (Snell 1984)

14

Figura II ndash Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo (Adaptado de Silva amp Castro 2006)

Figura III ndash Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) (Adaptado de Snell 1984)

A baixa proporccedilatildeo de elastina eacute responsaacutevel pela baixa elasticidade do tendatildeo

sendo que seu comprimento aumenta em apenas 8 a 10 antes de atingir o ponto

de ruptura total (Figura IV) (Butler et al 1978) Isso eacute importante para funccedilatildeo do

tendatildeo pois se ele fosse mais elaacutestico poderia alongar-se com a contraccedilatildeo

muscular em vez de transmitir forccedila ao osso

A presenccedila de aacutegua e glicosaminoglicanos contribui para manter o espaccedilamento

entre as fibras de colaacutegeno facilitando o deslizamento entre elas E juntamente

com as fibras de colaacutegeno e elastina conferem ao tendatildeo sua propriedade

viscoelaacutestica na qual o tecido retorna ao seu tamanho original depois de algum

tempo apoacutes ser submetido a certo niacutevel de forccedila de deformaccedilatildeo (Taylor et al 1990) Alguns tendotildees apresentam zonas de hipovascularizaccedilatildeo (Carr 1989) embora

todos sejam nutridos suficientemente para promover o processo reparativo

Entretanto este processo eacute lento devido agrave baixa taxa metaboacutelica Dessa forma se

o tendatildeo natildeo tiver um tempo adequado de recuperaccedilatildeo capaz de equilibrar o

processo de siacutentese e degradaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno ele estaraacute entatildeo sujeito

a lesotildees (Riley 2004)

15

Figura IV ndash Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress (Adaptado de Butler et al 1978)

Tendinose

Atualmente haacute uma tendecircncia de diagnosticar clinicamente todas as lesotildees no

tendatildeo como tendinopatia reservando os termos tendinite tendinose eou

paratendinite apenas para anaacutelises histopatoloacutegicas (Maffulli et al 1998) No

entanto eacute certo que as lesotildees agudas que apresentam infiltrado inflamatoacuterio reativo

se comportam de maneira distinta das lesotildees crocircnicas degenerativas tanto na

gecircnese da doenccedila quanto na propedecircutica Portanto criteacuterios cliacutenicos mais precisos

satildeo necessaacuterios para que natildeo ocorram procedimentos terapecircuticos incorretos

A tendinose eacute generalizadamente caracterizada por degeneraccedilatildeo intratendiacutenea

e desorganizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno Macroscopicamente se apresenta como

uma degeneraccedilatildeo mucoacuteide com o tecido friaacutevel desorganizado e de cor

acastanhada Microscopicamente confirma-se que esta estrutura apresenta

desorganizaccedilatildeo e microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade com

arredondamento dos nuacutecleos (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento significativo de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo a quantidade de

colaacutegeno tipo I (Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) neovascularizaccedilatildeo (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1999 Szomor et al 2006) e apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007) Outras caracteriacutesticas patoloacutegicas

comumente presentes satildeo as adiposes fibrocartilaginoses e metaplasias oacutesseas

(Kannus amp Jozsa 1991 Riley et al 1996) Aleacutem dessas alteraccedilotildees morfoloacutegicas

pode-se observar um aumento da produccedilatildeo de glutamato (Alfredson et al 1999 Alfredson et al 2001) e uma maior expressatildeo de IGF-1 (Olesen et al 2006 Scott et al 2007) e oacutexido niacutetrico (Szomor et al 2006)

Os altos niacuteveis do neurotransmissor excitatoacuterio glutamato estatildeo relacionados

com a sensaccedilatildeo dolorosa (Alfredson et al 2001) A maior expressatildeo de IGF-1 eacute

considerada responsaacutevel por estimular a siacutentese de colaacutegeno a proliferaccedilatildeo celular

e o acuacutemulo de glicosaminoglicanos em resposta agraves cargas no entanto natildeo se sabe

se essa eacute uma resposta adaptativa ou patoloacutegica (Olesen et al 2006) Jaacute o papel

do oacutexido niacutetrico natildeo estaacute completamente claro Tem se associado altos niacuteveis dessa

16

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

Referecircncias Bibliograacuteficas

Ahtikoski AM Koskinen SOA Virtanen P Kovanen V Risteli J Takala TES

Type IV collagen in rat skeletal muscle during immobilization in shortened and

lengthened positions Acta Physiol Scand 2003 177 473-481

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High levels of glutamate but not prostaglandin E2 in chronic Achilles tendon

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immunohistochemical analyses of tendon tissue demonstrated high amounts of

free glutamate and glutamate NMDAR1 receptors but no signs of

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development of overuse injuries a review of current literature Sports Med

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Arnoczky SP Lavagnino M Egerbacher M The mechanobiological

aetiopathogenesis of tendinopathy is it the over-stimulation or the under-

stimulation of tendon cells Int J Exp Pathol 2007 88 217ndash226

45

Dedico este trabalho aos meus pais Niacutevio e Lourdes pelo amor incondicional agrave Fernanda minha companheira agrave minha irmatilde Liacutevia pela credibilidade e aos meus familiares e amigos por todo apoio

2

Agradecimentos

- Primeiramente agrave Deus por mais uma etapa vencida

- Ao Prof Dr Aniacutelton Ceacutesar Vasconcelos por ter acreditado no projeto e pela sincera

amizade Muito obrigado Professor Aniacutelton

- A todos os meus professores da Faculdade de Ciecircncias Meacutedicas de Minas Gerais

que foram exemplo de profissionalismo em minha carreira e em especial a Profa

Dra Tacircnia Clarete Sampaio pela sua contribuiccedilatildeo no trabalho

- A todos os professores da Universidade Federal de Minas Gerais em especial a

Profa Dra Denise Carmona Cara que me ldquoabriu as portasrdquo do Departamento de

Patologia

- Ao Prof Dr Mark Anthony Glazebrook por sua atenccedilatildeo e assistecircncia

- Ao meu pai agrave minha matildee e agrave minha irmatilde pela credibilidade e amor incondicional

- Agrave Fernanda pelo amor companherismo e paciecircncia nos momentos difiacuteceis

- A todos os integrantes do Laboratoacuterio de Apoptose em especial minha amiga Laiacutes

que sempre se demonstrou disponiacutevel em ajudar

- Aos meus colegas de profissatildeo pelo incentivo de buscar sempre mais pois nada eacute

impossiacutevel

- A todos os meus familiares e amigos que sempre estiveram do meu lado

- Ao Departamento de Farmacologia pelas contribuiccedilotildees no projeto

- Agrave FAPEMIG e ao CNPq pelo apoio financeiro

3

ldquoAprende que natildeo importa aonde jaacute chegou mas aonde estaacute indordquoldquo e que ser flexiacutevel natildeo signica ser fraco ou sem personalidade pois natildeo importa o quatildeo delicada e fraacutegil eacute uma situaccedilatildeo sempre existem dois ladosrdquoldquoAprende que paciecircncia requer muita praacuteticardquo ldquo e que maturidade tem mais a ver com os tipos de experiecircncia que se teve e o que vocecirc aprendeu com elas do que com quantos aniversaacuterios vocecirc celebrourdquoldquoPortanto plante seu jardim e decore sua alma em vez de esperar que algueacutem lhe traga floresrdquo ldquoNossas daacutedivas satildeo traidoras e nos fazem perder o bem que poderiacuteamos conquistar se natildeo fosse o medo de tentarrdquo

O Menestrel ndash William Shakespeare

4

ResumoIntroduccedilatildeo Microscopicamente a tendinpatia se apresenta com desorganizaccedilatildeo e

microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade maior deposiccedilatildeo de colaacutegeno

tipo III e glicosaminoglicanos

Objetivo Avaliar morfometricamente os eventos envolvidos na patogenia e

evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo em ratos

machos

Metodologia Foram utilizados trinta ratos machos Wistar divididos aleatoriamente

em Grupo experimental (n=15) e Grupo controle (n=15) Cada grupo foi dividido nos

intervalos de quatro (n=5) oito (n=5) e dezesseis (n=5) semanas O grupo

experimental correu em uma esteira adaptada cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin Apoacutes o protocolo os animais foram

submetidos agrave eutanaacutesia e os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo foram

extirpados fixados e processados Em seguida realizou-se as coloraccedilotildees de

Hematoxilina-Eosina Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e TUNEL

Resultados A densidade celular e as lacunas intersticiais aumentaram nos grupos

experimentais da quarta (092 plusmn 006 vs 061 plusmn 005 - Plt001) (993 plusmn 155 vs 37 plusmn

079 - Plt001) oitava (085 plusmn 004 vs 058 plusmn 006 - Plt005) (116 plusmn 259 vs 381 plusmn

087 - Plt001) e deacutecima sexta (082 plusmn 004 vs 053 plusmn 006 - Plt001) (1213 plusmn 103 vs

444 plusmn 056 - Plt0001) semana respectivamente Houve maior deposiccedilatildeo de

colaacutegeno tipo III e glicosaminoglicanos nos grupos experimentais da quarta (434 plusmn

384 vs 657 plusmn 306 - Plt0001) (833 plusmn 117 vs 397 plusmn 071 - Plt001) oitava (5045 plusmn

42 vs 671 plusmn 284 - Plt00001) (912 plusmn 117 vs 419 plusmn 075 - Plt001) e deacutecima sexta

(596 plusmn 241 vs 496 plusmn 132 - Plt00001) (1253 plusmn 156 vs 384 plusmn 066 - Plt001)

semana respectivamente A expressatildeo da atividade celular foi maior nos grupos

experimentais (4 grumosnuacutecleo vs 2 grumosnuacutecleo - Plt00001) de todos os

intervalos de tempo

Conclusatildeo Pode-se observar que o modelo proposto eacute eficaz para desenvolver

uma lesatildeo degenerativa no tendatildeo de Aquiles livre de infiltrado inflamatoacuterio Apartir

desse modelo futuras pesquisas devem investigar o efeito das diversas terapias

fiacutesicas e farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

Palavras-chaves tendinopatia tendatildeo de Aquiles experimento animal

5

AbstractBackground Microscopically tendinosis presents collagen fibers disorganization

and microtears hipercellularity higher collagen type III and glicosaminoglicans

deposition

Purpose Morphometric evaluation of the Aquiles tendinosis` pathogen events and

evolution using a male rats induction model

Methods Thirty male Wistar rats were randomized splitted in an experimental (n=15)

and a control groups (n=15) Five animalsgroup were euthanized at four eight and

sixteen weeks Experimental group ran on an adapted treadmill 5 times a week 80

minutes daily at 268 mmin Then the right and left Achilles tendons were collected

and processed Obtained slides were stained by Hematoxilyn-Eosin Picrosirius Red

Alcian Blue AgNOR and TUNEL

Results Cellular density and microtearing raised in the experimental group at fourth

(092 plusmn 006 vs 061 plusmn 005 - Plt001) (993 plusmn 155 vs 37 plusmn 079 - Plt001) eighth

(085 plusmn 004 vs 058 plusmn 006 - Plt005) (116 plusmn 259 vs 381 plusmn 087 - Plt001) and

sixteenth (082 plusmn 004 vs 053 plusmn 006 - Plt001) (1213 plusmn 103 vs 444 plusmn 056 -

Plt0001) weeks respectively There were more type III collagen and

glycosaminoglycans deposition in the experimental group at fourth (434 plusmn 384 vs

657 plusmn 306 - Plt0001) (833 plusmn 117 vs 397 plusmn 071 - Plt001) eighth (5045 plusmn 42 vs

671 plusmn 284 - Plt00001) (912 plusmn 117 vs 419 plusmn 075 - Plt001) and sixteenth (596 plusmn

241 vs 496 plusmn 132 - Plt00001) (1253 plusmn 156 vs 384 plusmn 066 - Plt001) weeks

respectively The cellular activity expression was higher in the experimental groups

(4 clustersnucleus vs 2 clustersnucleus - Plt00001) of all time intervals

Conclusions The proposed model was able to induce degenerative injury and

morphometry showed important results Future researches must investigate physical

and pharmacological therapies effects to the Achilles tendinosis

Keywords tendinopathy Achilles tendon animal experimentation

6

Lista de figurasPaacutegina

Figura I Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas

sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 13Figura II Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo 14Figura III Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) 14Figura IV Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress 15Figura V Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo 23Figura VI Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente

para os ratos 24Figura VII Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo 27Figura VIII Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x 29Figura IX Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo

controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva

de 10x 30Figura X Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta

semana (A) oitava semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash

detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz

polarizada objetiva de 10x 33Figura XI Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como

aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue objetiva de 10x 34Figura XII Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande

quantidade de marcaccedilotildees intranucleares AgNOR objetiva de 40x 35Figura XIII Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena

quantidade de marcaccedilotildees intranucleares AgNOR objetiva de 40x 35Figura XIV Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo

controle (A) e experimental (B) TUNEL objetiva de

40x

36

Figura XV Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta

bioloacutegica poderaacute ter um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende

diretamente das caracteriacutesticas da carga impostahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 41

7

Lista de organogramasPaacutegina

Organograma I Etiologia multifatorial da tendinose 17Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no

tendatildeo 18Organograma III Desenho de estudo do experimento 23

8

Lista de graacuteficosPaacutegina

Graacutefico I Evoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos

trecircs intervalos de tempo 30Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 31Graacutefico III Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e

controle ao decorrer do protocolo 31Graacutefico IV Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao

decorrer do protocolo 32Graacutefico V Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo

experimental ao decorrer do protocolo 32Graacutefico VI Evoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 33

9

Lista de tabelasPaacutegina

Tabela I Meacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e

experimental 29Tabela II Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo

controle e experimental 31Tabela III Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo

controle e experimental 32Tabela IV Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo

controle e experimental 34

10

Lista de abreviaturas e siglas

AgNOR Regiatildeo Organizadora de Nucleacuteolo corado pela Prata

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e TecnoloacutegicoCO2 Dioxido de carbonoCOX-2 Ciclooxigenase-2DNA Do inglecircs Deoxyribonucleic Acid - Aacutecido desoxirribonucleacuteicoFAPEMIG Fundaccedilatildeo de Amparo a Pesquisa de Minas GeraisFLAP Do inglecircs 5-Lipoxygenase-activating ProteinHE Hematoxilina-eosinaH2O2 Peroacutexido de hidrogecircnioGAG GlicosaminoglicanoIA Iacutendice ApoptoacuteticoIGF-1 Fator de crescimento insuliacutenicoIL InterleucinaIBRAMED Induacutestria Brasileira de Equipamentos MeacutedicosICB Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas MEC Matriz extra-celularMMPs Metaloproteinases de matrizPG ProstaglandinaTUNEL Do inglecircs Terminal deoxynucleotidyl Transferase Urydine Nick End

Labeling - Marcaccedilatildeo in situ da fragmentaccedilatildeo do genoma com transferase

terminal de deoxinucleotiacutedioUFMG Universidade Federal de Minas Geraismicrom microcircmetros

11

Sum aacute rio Paacutegina

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo 13

Tendinose 16

Modelos de induccedilatildeo a tendinose 19

Objetivos 22

Material e meacutetodos

Distribuiccedilatildeo dos grupos 23

Anaacutelise histoloacutegica 24

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetrica 25

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HE 25

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red 26

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian Blue 27

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNOR 27

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNEL 28

Anaacutelise estatiacutestica 28

Resultados 29

Discussatildeo 37

Conclusatildeo 44

Referecircncias Bibliograacuteficas 45

Apecircndice I (Selecionado entre os melhores pocircsteres do I Encontro de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Patologia da UFMG)55

Apecircndice II (Modelos experimentais de induccedilatildeo agrave tendinose por esforccedilo repetitivo - Revisatildeo de literatura)56

Apecircndice III (Experimental model of Achilles Tendinosis` induction A morphometrical study)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

12

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo

O tendatildeo eacute um conjunto de fibras colaacutegenas compactas que conectam o muacutesculo

ao osso Possui aproximadamente 70 de aacutegua com boa parte associada aos

glicosaminoglicanos da matriz extracelular (Riley et al 1994) Jaacute o colaacutegeno seu

constituinte baacutesico representa ateacute 95 do peso seco do tendatildeo sendo que uma

grande proporccedilatildeo se refere ao tipo I e o restante (menos de 10) ao tipo III

(Gross 1992 Rufai et al 1995) Aleacutem desses constituintes estaacute presente cerca

de 2 de elastina (Eyden amp Tzaphlidou 2001) e pequena quantidade de

colaacutegeno tipo IV (Ahtikoski et al 2003)

O colaacutegeno eacute formado pelo tropocolaacutegeno que por sua vez eacute formado por trecircs

cadeias peptiacutedicas helicoidais e espiraladas (Rich amp Crick 1961) (Figura I) Eacute

interessante ressaltar que a moleacutecula de tropocolaacutegeno eacute cerca de dez vezes

mais resistente que o tendatildeo (forccedila de resistecircncia secccedilatildeo transversa) Isso

porque as ligaccedilotildees intra-moleculares formam interaccedilotildees mais fortes do que as

interaccedilotildees inter-moleculares (Gustavson 1956) Dessa maneira as lesotildees

acontecem principalmente no niacutevel inter-molecular

Considerando as ligaccedilotildees inter-moleculares o colaacutegeno tipo I apresenta

interaccedilotildees mais resistentes agraves tensotildees com ligaccedilotildees estaacuteveis e natildeo-redutiacuteveis

que natildeo se organizam dinamicamente Por outro lado o colaacutegeno tipo III

apresenta interaccedilotildees menos resistentes agraves tensotildees com poucas ligaccedilotildees estaacuteveis

e redutiacuteveis que tecircm a capacidade de se organizar dinamicamente (Viidik et al 1982) O colaacutegeno tipo IV natildeo contribui para as caracteriacutesticas mecacircnicas do

tendatildeo

13

Figura I ndash Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 (Adaptado de Junqueira amp Carneiro 2004)

As moleacuteculas de tropocolaacutegeno se agrupam em feixes primaacuterios para formar as

microfibrilas e fibrilas (Figura II) Os grupos de feixes primaacuterios unem-se para

formar os fasciacuteculos ou feixes secundaacuterios essas satildeo as menores unidades

funcionais do tendatildeo (Khan et al 1999) Envolvendo os fasciacuteculos encontra-se

uma camada de tecido conectivo denominada endotendatildeo Essa camada conteacutem

estruturas nervosas vasculares e linfaacuteticas Agrupando os endotendotildees e

envolvendo o tendatildeo propriamente dito se encontra o epitendatildeo e mais

externamente o paratendatildeo que eacute a camada mais vascularizada Este uacuteltimo

pode se tornar uma camada dupla preenchida por liquido sinovial (bursa) em

tendotildees sujeitos a fricccedilatildeo

O arranjo em paralelo dessas fibras de colaacutegeno eacute adaptado para a funccedilatildeo do

tendatildeo que controla cargas tensionais unidirecionais De maneira distinta os

ligamentos possuem um arranjo entrelaccedilado pois podem controlar cargas

tensionais em vaacuterias direccedilotildees (Figura III) (Snell 1984)

14

Figura II ndash Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo (Adaptado de Silva amp Castro 2006)

Figura III ndash Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) (Adaptado de Snell 1984)

A baixa proporccedilatildeo de elastina eacute responsaacutevel pela baixa elasticidade do tendatildeo

sendo que seu comprimento aumenta em apenas 8 a 10 antes de atingir o ponto

de ruptura total (Figura IV) (Butler et al 1978) Isso eacute importante para funccedilatildeo do

tendatildeo pois se ele fosse mais elaacutestico poderia alongar-se com a contraccedilatildeo

muscular em vez de transmitir forccedila ao osso

A presenccedila de aacutegua e glicosaminoglicanos contribui para manter o espaccedilamento

entre as fibras de colaacutegeno facilitando o deslizamento entre elas E juntamente

com as fibras de colaacutegeno e elastina conferem ao tendatildeo sua propriedade

viscoelaacutestica na qual o tecido retorna ao seu tamanho original depois de algum

tempo apoacutes ser submetido a certo niacutevel de forccedila de deformaccedilatildeo (Taylor et al 1990) Alguns tendotildees apresentam zonas de hipovascularizaccedilatildeo (Carr 1989) embora

todos sejam nutridos suficientemente para promover o processo reparativo

Entretanto este processo eacute lento devido agrave baixa taxa metaboacutelica Dessa forma se

o tendatildeo natildeo tiver um tempo adequado de recuperaccedilatildeo capaz de equilibrar o

processo de siacutentese e degradaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno ele estaraacute entatildeo sujeito

a lesotildees (Riley 2004)

15

Figura IV ndash Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress (Adaptado de Butler et al 1978)

Tendinose

Atualmente haacute uma tendecircncia de diagnosticar clinicamente todas as lesotildees no

tendatildeo como tendinopatia reservando os termos tendinite tendinose eou

paratendinite apenas para anaacutelises histopatoloacutegicas (Maffulli et al 1998) No

entanto eacute certo que as lesotildees agudas que apresentam infiltrado inflamatoacuterio reativo

se comportam de maneira distinta das lesotildees crocircnicas degenerativas tanto na

gecircnese da doenccedila quanto na propedecircutica Portanto criteacuterios cliacutenicos mais precisos

satildeo necessaacuterios para que natildeo ocorram procedimentos terapecircuticos incorretos

A tendinose eacute generalizadamente caracterizada por degeneraccedilatildeo intratendiacutenea

e desorganizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno Macroscopicamente se apresenta como

uma degeneraccedilatildeo mucoacuteide com o tecido friaacutevel desorganizado e de cor

acastanhada Microscopicamente confirma-se que esta estrutura apresenta

desorganizaccedilatildeo e microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade com

arredondamento dos nuacutecleos (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento significativo de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo a quantidade de

colaacutegeno tipo I (Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) neovascularizaccedilatildeo (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1999 Szomor et al 2006) e apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007) Outras caracteriacutesticas patoloacutegicas

comumente presentes satildeo as adiposes fibrocartilaginoses e metaplasias oacutesseas

(Kannus amp Jozsa 1991 Riley et al 1996) Aleacutem dessas alteraccedilotildees morfoloacutegicas

pode-se observar um aumento da produccedilatildeo de glutamato (Alfredson et al 1999 Alfredson et al 2001) e uma maior expressatildeo de IGF-1 (Olesen et al 2006 Scott et al 2007) e oacutexido niacutetrico (Szomor et al 2006)

Os altos niacuteveis do neurotransmissor excitatoacuterio glutamato estatildeo relacionados

com a sensaccedilatildeo dolorosa (Alfredson et al 2001) A maior expressatildeo de IGF-1 eacute

considerada responsaacutevel por estimular a siacutentese de colaacutegeno a proliferaccedilatildeo celular

e o acuacutemulo de glicosaminoglicanos em resposta agraves cargas no entanto natildeo se sabe

se essa eacute uma resposta adaptativa ou patoloacutegica (Olesen et al 2006) Jaacute o papel

do oacutexido niacutetrico natildeo estaacute completamente claro Tem se associado altos niacuteveis dessa

16

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

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aetiopathogenesis of tendinopathy is it the over-stimulation or the under-

stimulation of tendon cells Int J Exp Pathol 2007 88 217ndash226

45

Agradecimentos

- Primeiramente agrave Deus por mais uma etapa vencida

- Ao Prof Dr Aniacutelton Ceacutesar Vasconcelos por ter acreditado no projeto e pela sincera

amizade Muito obrigado Professor Aniacutelton

- A todos os meus professores da Faculdade de Ciecircncias Meacutedicas de Minas Gerais

que foram exemplo de profissionalismo em minha carreira e em especial a Profa

Dra Tacircnia Clarete Sampaio pela sua contribuiccedilatildeo no trabalho

- A todos os professores da Universidade Federal de Minas Gerais em especial a

Profa Dra Denise Carmona Cara que me ldquoabriu as portasrdquo do Departamento de

Patologia

- Ao Prof Dr Mark Anthony Glazebrook por sua atenccedilatildeo e assistecircncia

- Ao meu pai agrave minha matildee e agrave minha irmatilde pela credibilidade e amor incondicional

- Agrave Fernanda pelo amor companherismo e paciecircncia nos momentos difiacuteceis

- A todos os integrantes do Laboratoacuterio de Apoptose em especial minha amiga Laiacutes

que sempre se demonstrou disponiacutevel em ajudar

- Aos meus colegas de profissatildeo pelo incentivo de buscar sempre mais pois nada eacute

impossiacutevel

- A todos os meus familiares e amigos que sempre estiveram do meu lado

- Ao Departamento de Farmacologia pelas contribuiccedilotildees no projeto

- Agrave FAPEMIG e ao CNPq pelo apoio financeiro

3

ldquoAprende que natildeo importa aonde jaacute chegou mas aonde estaacute indordquoldquo e que ser flexiacutevel natildeo signica ser fraco ou sem personalidade pois natildeo importa o quatildeo delicada e fraacutegil eacute uma situaccedilatildeo sempre existem dois ladosrdquoldquoAprende que paciecircncia requer muita praacuteticardquo ldquo e que maturidade tem mais a ver com os tipos de experiecircncia que se teve e o que vocecirc aprendeu com elas do que com quantos aniversaacuterios vocecirc celebrourdquoldquoPortanto plante seu jardim e decore sua alma em vez de esperar que algueacutem lhe traga floresrdquo ldquoNossas daacutedivas satildeo traidoras e nos fazem perder o bem que poderiacuteamos conquistar se natildeo fosse o medo de tentarrdquo

O Menestrel ndash William Shakespeare

4

ResumoIntroduccedilatildeo Microscopicamente a tendinpatia se apresenta com desorganizaccedilatildeo e

microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade maior deposiccedilatildeo de colaacutegeno

tipo III e glicosaminoglicanos

Objetivo Avaliar morfometricamente os eventos envolvidos na patogenia e

evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo em ratos

machos

Metodologia Foram utilizados trinta ratos machos Wistar divididos aleatoriamente

em Grupo experimental (n=15) e Grupo controle (n=15) Cada grupo foi dividido nos

intervalos de quatro (n=5) oito (n=5) e dezesseis (n=5) semanas O grupo

experimental correu em uma esteira adaptada cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin Apoacutes o protocolo os animais foram

submetidos agrave eutanaacutesia e os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo foram

extirpados fixados e processados Em seguida realizou-se as coloraccedilotildees de

Hematoxilina-Eosina Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e TUNEL

Resultados A densidade celular e as lacunas intersticiais aumentaram nos grupos

experimentais da quarta (092 plusmn 006 vs 061 plusmn 005 - Plt001) (993 plusmn 155 vs 37 plusmn

079 - Plt001) oitava (085 plusmn 004 vs 058 plusmn 006 - Plt005) (116 plusmn 259 vs 381 plusmn

087 - Plt001) e deacutecima sexta (082 plusmn 004 vs 053 plusmn 006 - Plt001) (1213 plusmn 103 vs

444 plusmn 056 - Plt0001) semana respectivamente Houve maior deposiccedilatildeo de

colaacutegeno tipo III e glicosaminoglicanos nos grupos experimentais da quarta (434 plusmn

384 vs 657 plusmn 306 - Plt0001) (833 plusmn 117 vs 397 plusmn 071 - Plt001) oitava (5045 plusmn

42 vs 671 plusmn 284 - Plt00001) (912 plusmn 117 vs 419 plusmn 075 - Plt001) e deacutecima sexta

(596 plusmn 241 vs 496 plusmn 132 - Plt00001) (1253 plusmn 156 vs 384 plusmn 066 - Plt001)

semana respectivamente A expressatildeo da atividade celular foi maior nos grupos

experimentais (4 grumosnuacutecleo vs 2 grumosnuacutecleo - Plt00001) de todos os

intervalos de tempo

Conclusatildeo Pode-se observar que o modelo proposto eacute eficaz para desenvolver

uma lesatildeo degenerativa no tendatildeo de Aquiles livre de infiltrado inflamatoacuterio Apartir

desse modelo futuras pesquisas devem investigar o efeito das diversas terapias

fiacutesicas e farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

Palavras-chaves tendinopatia tendatildeo de Aquiles experimento animal

5

AbstractBackground Microscopically tendinosis presents collagen fibers disorganization

and microtears hipercellularity higher collagen type III and glicosaminoglicans

deposition

Purpose Morphometric evaluation of the Aquiles tendinosis` pathogen events and

evolution using a male rats induction model

Methods Thirty male Wistar rats were randomized splitted in an experimental (n=15)

and a control groups (n=15) Five animalsgroup were euthanized at four eight and

sixteen weeks Experimental group ran on an adapted treadmill 5 times a week 80

minutes daily at 268 mmin Then the right and left Achilles tendons were collected

and processed Obtained slides were stained by Hematoxilyn-Eosin Picrosirius Red

Alcian Blue AgNOR and TUNEL

Results Cellular density and microtearing raised in the experimental group at fourth

(092 plusmn 006 vs 061 plusmn 005 - Plt001) (993 plusmn 155 vs 37 plusmn 079 - Plt001) eighth

(085 plusmn 004 vs 058 plusmn 006 - Plt005) (116 plusmn 259 vs 381 plusmn 087 - Plt001) and

sixteenth (082 plusmn 004 vs 053 plusmn 006 - Plt001) (1213 plusmn 103 vs 444 plusmn 056 -

Plt0001) weeks respectively There were more type III collagen and

glycosaminoglycans deposition in the experimental group at fourth (434 plusmn 384 vs

657 plusmn 306 - Plt0001) (833 plusmn 117 vs 397 plusmn 071 - Plt001) eighth (5045 plusmn 42 vs

671 plusmn 284 - Plt00001) (912 plusmn 117 vs 419 plusmn 075 - Plt001) and sixteenth (596 plusmn

241 vs 496 plusmn 132 - Plt00001) (1253 plusmn 156 vs 384 plusmn 066 - Plt001) weeks

respectively The cellular activity expression was higher in the experimental groups

(4 clustersnucleus vs 2 clustersnucleus - Plt00001) of all time intervals

Conclusions The proposed model was able to induce degenerative injury and

morphometry showed important results Future researches must investigate physical

and pharmacological therapies effects to the Achilles tendinosis

Keywords tendinopathy Achilles tendon animal experimentation

6

Lista de figurasPaacutegina

Figura I Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas

sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 13Figura II Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo 14Figura III Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) 14Figura IV Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress 15Figura V Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo 23Figura VI Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente

para os ratos 24Figura VII Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo 27Figura VIII Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x 29Figura IX Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo

controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva

de 10x 30Figura X Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta

semana (A) oitava semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash

detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz

polarizada objetiva de 10x 33Figura XI Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como

aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue objetiva de 10x 34Figura XII Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande

quantidade de marcaccedilotildees intranucleares AgNOR objetiva de 40x 35Figura XIII Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena

quantidade de marcaccedilotildees intranucleares AgNOR objetiva de 40x 35Figura XIV Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo

controle (A) e experimental (B) TUNEL objetiva de

40x

36

Figura XV Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta

bioloacutegica poderaacute ter um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende

diretamente das caracteriacutesticas da carga impostahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 41

7

Lista de organogramasPaacutegina

Organograma I Etiologia multifatorial da tendinose 17Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no

tendatildeo 18Organograma III Desenho de estudo do experimento 23

8

Lista de graacuteficosPaacutegina

Graacutefico I Evoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos

trecircs intervalos de tempo 30Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 31Graacutefico III Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e

controle ao decorrer do protocolo 31Graacutefico IV Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao

decorrer do protocolo 32Graacutefico V Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo

experimental ao decorrer do protocolo 32Graacutefico VI Evoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 33

9

Lista de tabelasPaacutegina

Tabela I Meacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e

experimental 29Tabela II Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo

controle e experimental 31Tabela III Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo

controle e experimental 32Tabela IV Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo

controle e experimental 34

10

Lista de abreviaturas e siglas

AgNOR Regiatildeo Organizadora de Nucleacuteolo corado pela Prata

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e TecnoloacutegicoCO2 Dioxido de carbonoCOX-2 Ciclooxigenase-2DNA Do inglecircs Deoxyribonucleic Acid - Aacutecido desoxirribonucleacuteicoFAPEMIG Fundaccedilatildeo de Amparo a Pesquisa de Minas GeraisFLAP Do inglecircs 5-Lipoxygenase-activating ProteinHE Hematoxilina-eosinaH2O2 Peroacutexido de hidrogecircnioGAG GlicosaminoglicanoIA Iacutendice ApoptoacuteticoIGF-1 Fator de crescimento insuliacutenicoIL InterleucinaIBRAMED Induacutestria Brasileira de Equipamentos MeacutedicosICB Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas MEC Matriz extra-celularMMPs Metaloproteinases de matrizPG ProstaglandinaTUNEL Do inglecircs Terminal deoxynucleotidyl Transferase Urydine Nick End

Labeling - Marcaccedilatildeo in situ da fragmentaccedilatildeo do genoma com transferase

terminal de deoxinucleotiacutedioUFMG Universidade Federal de Minas Geraismicrom microcircmetros

11

Sum aacute rio Paacutegina

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo 13

Tendinose 16

Modelos de induccedilatildeo a tendinose 19

Objetivos 22

Material e meacutetodos

Distribuiccedilatildeo dos grupos 23

Anaacutelise histoloacutegica 24

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetrica 25

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HE 25

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red 26

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian Blue 27

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNOR 27

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNEL 28

Anaacutelise estatiacutestica 28

Resultados 29

Discussatildeo 37

Conclusatildeo 44

Referecircncias Bibliograacuteficas 45

Apecircndice I (Selecionado entre os melhores pocircsteres do I Encontro de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Patologia da UFMG)55

Apecircndice II (Modelos experimentais de induccedilatildeo agrave tendinose por esforccedilo repetitivo - Revisatildeo de literatura)56

Apecircndice III (Experimental model of Achilles Tendinosis` induction A morphometrical study)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

12

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo

O tendatildeo eacute um conjunto de fibras colaacutegenas compactas que conectam o muacutesculo

ao osso Possui aproximadamente 70 de aacutegua com boa parte associada aos

glicosaminoglicanos da matriz extracelular (Riley et al 1994) Jaacute o colaacutegeno seu

constituinte baacutesico representa ateacute 95 do peso seco do tendatildeo sendo que uma

grande proporccedilatildeo se refere ao tipo I e o restante (menos de 10) ao tipo III

(Gross 1992 Rufai et al 1995) Aleacutem desses constituintes estaacute presente cerca

de 2 de elastina (Eyden amp Tzaphlidou 2001) e pequena quantidade de

colaacutegeno tipo IV (Ahtikoski et al 2003)

O colaacutegeno eacute formado pelo tropocolaacutegeno que por sua vez eacute formado por trecircs

cadeias peptiacutedicas helicoidais e espiraladas (Rich amp Crick 1961) (Figura I) Eacute

interessante ressaltar que a moleacutecula de tropocolaacutegeno eacute cerca de dez vezes

mais resistente que o tendatildeo (forccedila de resistecircncia secccedilatildeo transversa) Isso

porque as ligaccedilotildees intra-moleculares formam interaccedilotildees mais fortes do que as

interaccedilotildees inter-moleculares (Gustavson 1956) Dessa maneira as lesotildees

acontecem principalmente no niacutevel inter-molecular

Considerando as ligaccedilotildees inter-moleculares o colaacutegeno tipo I apresenta

interaccedilotildees mais resistentes agraves tensotildees com ligaccedilotildees estaacuteveis e natildeo-redutiacuteveis

que natildeo se organizam dinamicamente Por outro lado o colaacutegeno tipo III

apresenta interaccedilotildees menos resistentes agraves tensotildees com poucas ligaccedilotildees estaacuteveis

e redutiacuteveis que tecircm a capacidade de se organizar dinamicamente (Viidik et al 1982) O colaacutegeno tipo IV natildeo contribui para as caracteriacutesticas mecacircnicas do

tendatildeo

13

Figura I ndash Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 (Adaptado de Junqueira amp Carneiro 2004)

As moleacuteculas de tropocolaacutegeno se agrupam em feixes primaacuterios para formar as

microfibrilas e fibrilas (Figura II) Os grupos de feixes primaacuterios unem-se para

formar os fasciacuteculos ou feixes secundaacuterios essas satildeo as menores unidades

funcionais do tendatildeo (Khan et al 1999) Envolvendo os fasciacuteculos encontra-se

uma camada de tecido conectivo denominada endotendatildeo Essa camada conteacutem

estruturas nervosas vasculares e linfaacuteticas Agrupando os endotendotildees e

envolvendo o tendatildeo propriamente dito se encontra o epitendatildeo e mais

externamente o paratendatildeo que eacute a camada mais vascularizada Este uacuteltimo

pode se tornar uma camada dupla preenchida por liquido sinovial (bursa) em

tendotildees sujeitos a fricccedilatildeo

O arranjo em paralelo dessas fibras de colaacutegeno eacute adaptado para a funccedilatildeo do

tendatildeo que controla cargas tensionais unidirecionais De maneira distinta os

ligamentos possuem um arranjo entrelaccedilado pois podem controlar cargas

tensionais em vaacuterias direccedilotildees (Figura III) (Snell 1984)

14

Figura II ndash Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo (Adaptado de Silva amp Castro 2006)

Figura III ndash Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) (Adaptado de Snell 1984)

A baixa proporccedilatildeo de elastina eacute responsaacutevel pela baixa elasticidade do tendatildeo

sendo que seu comprimento aumenta em apenas 8 a 10 antes de atingir o ponto

de ruptura total (Figura IV) (Butler et al 1978) Isso eacute importante para funccedilatildeo do

tendatildeo pois se ele fosse mais elaacutestico poderia alongar-se com a contraccedilatildeo

muscular em vez de transmitir forccedila ao osso

A presenccedila de aacutegua e glicosaminoglicanos contribui para manter o espaccedilamento

entre as fibras de colaacutegeno facilitando o deslizamento entre elas E juntamente

com as fibras de colaacutegeno e elastina conferem ao tendatildeo sua propriedade

viscoelaacutestica na qual o tecido retorna ao seu tamanho original depois de algum

tempo apoacutes ser submetido a certo niacutevel de forccedila de deformaccedilatildeo (Taylor et al 1990) Alguns tendotildees apresentam zonas de hipovascularizaccedilatildeo (Carr 1989) embora

todos sejam nutridos suficientemente para promover o processo reparativo

Entretanto este processo eacute lento devido agrave baixa taxa metaboacutelica Dessa forma se

o tendatildeo natildeo tiver um tempo adequado de recuperaccedilatildeo capaz de equilibrar o

processo de siacutentese e degradaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno ele estaraacute entatildeo sujeito

a lesotildees (Riley 2004)

15

Figura IV ndash Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress (Adaptado de Butler et al 1978)

Tendinose

Atualmente haacute uma tendecircncia de diagnosticar clinicamente todas as lesotildees no

tendatildeo como tendinopatia reservando os termos tendinite tendinose eou

paratendinite apenas para anaacutelises histopatoloacutegicas (Maffulli et al 1998) No

entanto eacute certo que as lesotildees agudas que apresentam infiltrado inflamatoacuterio reativo

se comportam de maneira distinta das lesotildees crocircnicas degenerativas tanto na

gecircnese da doenccedila quanto na propedecircutica Portanto criteacuterios cliacutenicos mais precisos

satildeo necessaacuterios para que natildeo ocorram procedimentos terapecircuticos incorretos

A tendinose eacute generalizadamente caracterizada por degeneraccedilatildeo intratendiacutenea

e desorganizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno Macroscopicamente se apresenta como

uma degeneraccedilatildeo mucoacuteide com o tecido friaacutevel desorganizado e de cor

acastanhada Microscopicamente confirma-se que esta estrutura apresenta

desorganizaccedilatildeo e microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade com

arredondamento dos nuacutecleos (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento significativo de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo a quantidade de

colaacutegeno tipo I (Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) neovascularizaccedilatildeo (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1999 Szomor et al 2006) e apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007) Outras caracteriacutesticas patoloacutegicas

comumente presentes satildeo as adiposes fibrocartilaginoses e metaplasias oacutesseas

(Kannus amp Jozsa 1991 Riley et al 1996) Aleacutem dessas alteraccedilotildees morfoloacutegicas

pode-se observar um aumento da produccedilatildeo de glutamato (Alfredson et al 1999 Alfredson et al 2001) e uma maior expressatildeo de IGF-1 (Olesen et al 2006 Scott et al 2007) e oacutexido niacutetrico (Szomor et al 2006)

Os altos niacuteveis do neurotransmissor excitatoacuterio glutamato estatildeo relacionados

com a sensaccedilatildeo dolorosa (Alfredson et al 2001) A maior expressatildeo de IGF-1 eacute

considerada responsaacutevel por estimular a siacutentese de colaacutegeno a proliferaccedilatildeo celular

e o acuacutemulo de glicosaminoglicanos em resposta agraves cargas no entanto natildeo se sabe

se essa eacute uma resposta adaptativa ou patoloacutegica (Olesen et al 2006) Jaacute o papel

do oacutexido niacutetrico natildeo estaacute completamente claro Tem se associado altos niacuteveis dessa

16

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

Referecircncias Bibliograacuteficas

Ahtikoski AM Koskinen SOA Virtanen P Kovanen V Risteli J Takala TES

Type IV collagen in rat skeletal muscle during immobilization in shortened and

lengthened positions Acta Physiol Scand 2003 177 473-481

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aetiopathogenesis of tendinopathy is it the over-stimulation or the under-

stimulation of tendon cells Int J Exp Pathol 2007 88 217ndash226

45

ldquoAprende que natildeo importa aonde jaacute chegou mas aonde estaacute indordquoldquo e que ser flexiacutevel natildeo signica ser fraco ou sem personalidade pois natildeo importa o quatildeo delicada e fraacutegil eacute uma situaccedilatildeo sempre existem dois ladosrdquoldquoAprende que paciecircncia requer muita praacuteticardquo ldquo e que maturidade tem mais a ver com os tipos de experiecircncia que se teve e o que vocecirc aprendeu com elas do que com quantos aniversaacuterios vocecirc celebrourdquoldquoPortanto plante seu jardim e decore sua alma em vez de esperar que algueacutem lhe traga floresrdquo ldquoNossas daacutedivas satildeo traidoras e nos fazem perder o bem que poderiacuteamos conquistar se natildeo fosse o medo de tentarrdquo

O Menestrel ndash William Shakespeare

4

ResumoIntroduccedilatildeo Microscopicamente a tendinpatia se apresenta com desorganizaccedilatildeo e

microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade maior deposiccedilatildeo de colaacutegeno

tipo III e glicosaminoglicanos

Objetivo Avaliar morfometricamente os eventos envolvidos na patogenia e

evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo em ratos

machos

Metodologia Foram utilizados trinta ratos machos Wistar divididos aleatoriamente

em Grupo experimental (n=15) e Grupo controle (n=15) Cada grupo foi dividido nos

intervalos de quatro (n=5) oito (n=5) e dezesseis (n=5) semanas O grupo

experimental correu em uma esteira adaptada cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin Apoacutes o protocolo os animais foram

submetidos agrave eutanaacutesia e os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo foram

extirpados fixados e processados Em seguida realizou-se as coloraccedilotildees de

Hematoxilina-Eosina Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e TUNEL

Resultados A densidade celular e as lacunas intersticiais aumentaram nos grupos

experimentais da quarta (092 plusmn 006 vs 061 plusmn 005 - Plt001) (993 plusmn 155 vs 37 plusmn

079 - Plt001) oitava (085 plusmn 004 vs 058 plusmn 006 - Plt005) (116 plusmn 259 vs 381 plusmn

087 - Plt001) e deacutecima sexta (082 plusmn 004 vs 053 plusmn 006 - Plt001) (1213 plusmn 103 vs

444 plusmn 056 - Plt0001) semana respectivamente Houve maior deposiccedilatildeo de

colaacutegeno tipo III e glicosaminoglicanos nos grupos experimentais da quarta (434 plusmn

384 vs 657 plusmn 306 - Plt0001) (833 plusmn 117 vs 397 plusmn 071 - Plt001) oitava (5045 plusmn

42 vs 671 plusmn 284 - Plt00001) (912 plusmn 117 vs 419 plusmn 075 - Plt001) e deacutecima sexta

(596 plusmn 241 vs 496 plusmn 132 - Plt00001) (1253 plusmn 156 vs 384 plusmn 066 - Plt001)

semana respectivamente A expressatildeo da atividade celular foi maior nos grupos

experimentais (4 grumosnuacutecleo vs 2 grumosnuacutecleo - Plt00001) de todos os

intervalos de tempo

Conclusatildeo Pode-se observar que o modelo proposto eacute eficaz para desenvolver

uma lesatildeo degenerativa no tendatildeo de Aquiles livre de infiltrado inflamatoacuterio Apartir

desse modelo futuras pesquisas devem investigar o efeito das diversas terapias

fiacutesicas e farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

Palavras-chaves tendinopatia tendatildeo de Aquiles experimento animal

5

AbstractBackground Microscopically tendinosis presents collagen fibers disorganization

and microtears hipercellularity higher collagen type III and glicosaminoglicans

deposition

Purpose Morphometric evaluation of the Aquiles tendinosis` pathogen events and

evolution using a male rats induction model

Methods Thirty male Wistar rats were randomized splitted in an experimental (n=15)

and a control groups (n=15) Five animalsgroup were euthanized at four eight and

sixteen weeks Experimental group ran on an adapted treadmill 5 times a week 80

minutes daily at 268 mmin Then the right and left Achilles tendons were collected

and processed Obtained slides were stained by Hematoxilyn-Eosin Picrosirius Red

Alcian Blue AgNOR and TUNEL

Results Cellular density and microtearing raised in the experimental group at fourth

(092 plusmn 006 vs 061 plusmn 005 - Plt001) (993 plusmn 155 vs 37 plusmn 079 - Plt001) eighth

(085 plusmn 004 vs 058 plusmn 006 - Plt005) (116 plusmn 259 vs 381 plusmn 087 - Plt001) and

sixteenth (082 plusmn 004 vs 053 plusmn 006 - Plt001) (1213 plusmn 103 vs 444 plusmn 056 -

Plt0001) weeks respectively There were more type III collagen and

glycosaminoglycans deposition in the experimental group at fourth (434 plusmn 384 vs

657 plusmn 306 - Plt0001) (833 plusmn 117 vs 397 plusmn 071 - Plt001) eighth (5045 plusmn 42 vs

671 plusmn 284 - Plt00001) (912 plusmn 117 vs 419 plusmn 075 - Plt001) and sixteenth (596 plusmn

241 vs 496 plusmn 132 - Plt00001) (1253 plusmn 156 vs 384 plusmn 066 - Plt001) weeks

respectively The cellular activity expression was higher in the experimental groups

(4 clustersnucleus vs 2 clustersnucleus - Plt00001) of all time intervals

Conclusions The proposed model was able to induce degenerative injury and

morphometry showed important results Future researches must investigate physical

and pharmacological therapies effects to the Achilles tendinosis

Keywords tendinopathy Achilles tendon animal experimentation

6

Lista de figurasPaacutegina

Figura I Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas

sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 13Figura II Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo 14Figura III Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) 14Figura IV Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress 15Figura V Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo 23Figura VI Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente

para os ratos 24Figura VII Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo 27Figura VIII Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x 29Figura IX Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo

controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva

de 10x 30Figura X Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta

semana (A) oitava semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash

detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz

polarizada objetiva de 10x 33Figura XI Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como

aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue objetiva de 10x 34Figura XII Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande

quantidade de marcaccedilotildees intranucleares AgNOR objetiva de 40x 35Figura XIII Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena

quantidade de marcaccedilotildees intranucleares AgNOR objetiva de 40x 35Figura XIV Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo

controle (A) e experimental (B) TUNEL objetiva de

40x

36

Figura XV Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta

bioloacutegica poderaacute ter um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende

diretamente das caracteriacutesticas da carga impostahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 41

7

Lista de organogramasPaacutegina

Organograma I Etiologia multifatorial da tendinose 17Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no

tendatildeo 18Organograma III Desenho de estudo do experimento 23

8

Lista de graacuteficosPaacutegina

Graacutefico I Evoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos

trecircs intervalos de tempo 30Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 31Graacutefico III Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e

controle ao decorrer do protocolo 31Graacutefico IV Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao

decorrer do protocolo 32Graacutefico V Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo

experimental ao decorrer do protocolo 32Graacutefico VI Evoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 33

9

Lista de tabelasPaacutegina

Tabela I Meacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e

experimental 29Tabela II Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo

controle e experimental 31Tabela III Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo

controle e experimental 32Tabela IV Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo

controle e experimental 34

10

Lista de abreviaturas e siglas

AgNOR Regiatildeo Organizadora de Nucleacuteolo corado pela Prata

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e TecnoloacutegicoCO2 Dioxido de carbonoCOX-2 Ciclooxigenase-2DNA Do inglecircs Deoxyribonucleic Acid - Aacutecido desoxirribonucleacuteicoFAPEMIG Fundaccedilatildeo de Amparo a Pesquisa de Minas GeraisFLAP Do inglecircs 5-Lipoxygenase-activating ProteinHE Hematoxilina-eosinaH2O2 Peroacutexido de hidrogecircnioGAG GlicosaminoglicanoIA Iacutendice ApoptoacuteticoIGF-1 Fator de crescimento insuliacutenicoIL InterleucinaIBRAMED Induacutestria Brasileira de Equipamentos MeacutedicosICB Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas MEC Matriz extra-celularMMPs Metaloproteinases de matrizPG ProstaglandinaTUNEL Do inglecircs Terminal deoxynucleotidyl Transferase Urydine Nick End

Labeling - Marcaccedilatildeo in situ da fragmentaccedilatildeo do genoma com transferase

terminal de deoxinucleotiacutedioUFMG Universidade Federal de Minas Geraismicrom microcircmetros

11

Sum aacute rio Paacutegina

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo 13

Tendinose 16

Modelos de induccedilatildeo a tendinose 19

Objetivos 22

Material e meacutetodos

Distribuiccedilatildeo dos grupos 23

Anaacutelise histoloacutegica 24

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetrica 25

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HE 25

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red 26

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian Blue 27

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNOR 27

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNEL 28

Anaacutelise estatiacutestica 28

Resultados 29

Discussatildeo 37

Conclusatildeo 44

Referecircncias Bibliograacuteficas 45

Apecircndice I (Selecionado entre os melhores pocircsteres do I Encontro de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Patologia da UFMG)55

Apecircndice II (Modelos experimentais de induccedilatildeo agrave tendinose por esforccedilo repetitivo - Revisatildeo de literatura)56

Apecircndice III (Experimental model of Achilles Tendinosis` induction A morphometrical study)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

12

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo

O tendatildeo eacute um conjunto de fibras colaacutegenas compactas que conectam o muacutesculo

ao osso Possui aproximadamente 70 de aacutegua com boa parte associada aos

glicosaminoglicanos da matriz extracelular (Riley et al 1994) Jaacute o colaacutegeno seu

constituinte baacutesico representa ateacute 95 do peso seco do tendatildeo sendo que uma

grande proporccedilatildeo se refere ao tipo I e o restante (menos de 10) ao tipo III

(Gross 1992 Rufai et al 1995) Aleacutem desses constituintes estaacute presente cerca

de 2 de elastina (Eyden amp Tzaphlidou 2001) e pequena quantidade de

colaacutegeno tipo IV (Ahtikoski et al 2003)

O colaacutegeno eacute formado pelo tropocolaacutegeno que por sua vez eacute formado por trecircs

cadeias peptiacutedicas helicoidais e espiraladas (Rich amp Crick 1961) (Figura I) Eacute

interessante ressaltar que a moleacutecula de tropocolaacutegeno eacute cerca de dez vezes

mais resistente que o tendatildeo (forccedila de resistecircncia secccedilatildeo transversa) Isso

porque as ligaccedilotildees intra-moleculares formam interaccedilotildees mais fortes do que as

interaccedilotildees inter-moleculares (Gustavson 1956) Dessa maneira as lesotildees

acontecem principalmente no niacutevel inter-molecular

Considerando as ligaccedilotildees inter-moleculares o colaacutegeno tipo I apresenta

interaccedilotildees mais resistentes agraves tensotildees com ligaccedilotildees estaacuteveis e natildeo-redutiacuteveis

que natildeo se organizam dinamicamente Por outro lado o colaacutegeno tipo III

apresenta interaccedilotildees menos resistentes agraves tensotildees com poucas ligaccedilotildees estaacuteveis

e redutiacuteveis que tecircm a capacidade de se organizar dinamicamente (Viidik et al 1982) O colaacutegeno tipo IV natildeo contribui para as caracteriacutesticas mecacircnicas do

tendatildeo

13

Figura I ndash Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 (Adaptado de Junqueira amp Carneiro 2004)

As moleacuteculas de tropocolaacutegeno se agrupam em feixes primaacuterios para formar as

microfibrilas e fibrilas (Figura II) Os grupos de feixes primaacuterios unem-se para

formar os fasciacuteculos ou feixes secundaacuterios essas satildeo as menores unidades

funcionais do tendatildeo (Khan et al 1999) Envolvendo os fasciacuteculos encontra-se

uma camada de tecido conectivo denominada endotendatildeo Essa camada conteacutem

estruturas nervosas vasculares e linfaacuteticas Agrupando os endotendotildees e

envolvendo o tendatildeo propriamente dito se encontra o epitendatildeo e mais

externamente o paratendatildeo que eacute a camada mais vascularizada Este uacuteltimo

pode se tornar uma camada dupla preenchida por liquido sinovial (bursa) em

tendotildees sujeitos a fricccedilatildeo

O arranjo em paralelo dessas fibras de colaacutegeno eacute adaptado para a funccedilatildeo do

tendatildeo que controla cargas tensionais unidirecionais De maneira distinta os

ligamentos possuem um arranjo entrelaccedilado pois podem controlar cargas

tensionais em vaacuterias direccedilotildees (Figura III) (Snell 1984)

14

Figura II ndash Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo (Adaptado de Silva amp Castro 2006)

Figura III ndash Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) (Adaptado de Snell 1984)

A baixa proporccedilatildeo de elastina eacute responsaacutevel pela baixa elasticidade do tendatildeo

sendo que seu comprimento aumenta em apenas 8 a 10 antes de atingir o ponto

de ruptura total (Figura IV) (Butler et al 1978) Isso eacute importante para funccedilatildeo do

tendatildeo pois se ele fosse mais elaacutestico poderia alongar-se com a contraccedilatildeo

muscular em vez de transmitir forccedila ao osso

A presenccedila de aacutegua e glicosaminoglicanos contribui para manter o espaccedilamento

entre as fibras de colaacutegeno facilitando o deslizamento entre elas E juntamente

com as fibras de colaacutegeno e elastina conferem ao tendatildeo sua propriedade

viscoelaacutestica na qual o tecido retorna ao seu tamanho original depois de algum

tempo apoacutes ser submetido a certo niacutevel de forccedila de deformaccedilatildeo (Taylor et al 1990) Alguns tendotildees apresentam zonas de hipovascularizaccedilatildeo (Carr 1989) embora

todos sejam nutridos suficientemente para promover o processo reparativo

Entretanto este processo eacute lento devido agrave baixa taxa metaboacutelica Dessa forma se

o tendatildeo natildeo tiver um tempo adequado de recuperaccedilatildeo capaz de equilibrar o

processo de siacutentese e degradaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno ele estaraacute entatildeo sujeito

a lesotildees (Riley 2004)

15

Figura IV ndash Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress (Adaptado de Butler et al 1978)

Tendinose

Atualmente haacute uma tendecircncia de diagnosticar clinicamente todas as lesotildees no

tendatildeo como tendinopatia reservando os termos tendinite tendinose eou

paratendinite apenas para anaacutelises histopatoloacutegicas (Maffulli et al 1998) No

entanto eacute certo que as lesotildees agudas que apresentam infiltrado inflamatoacuterio reativo

se comportam de maneira distinta das lesotildees crocircnicas degenerativas tanto na

gecircnese da doenccedila quanto na propedecircutica Portanto criteacuterios cliacutenicos mais precisos

satildeo necessaacuterios para que natildeo ocorram procedimentos terapecircuticos incorretos

A tendinose eacute generalizadamente caracterizada por degeneraccedilatildeo intratendiacutenea

e desorganizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno Macroscopicamente se apresenta como

uma degeneraccedilatildeo mucoacuteide com o tecido friaacutevel desorganizado e de cor

acastanhada Microscopicamente confirma-se que esta estrutura apresenta

desorganizaccedilatildeo e microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade com

arredondamento dos nuacutecleos (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento significativo de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo a quantidade de

colaacutegeno tipo I (Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) neovascularizaccedilatildeo (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1999 Szomor et al 2006) e apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007) Outras caracteriacutesticas patoloacutegicas

comumente presentes satildeo as adiposes fibrocartilaginoses e metaplasias oacutesseas

(Kannus amp Jozsa 1991 Riley et al 1996) Aleacutem dessas alteraccedilotildees morfoloacutegicas

pode-se observar um aumento da produccedilatildeo de glutamato (Alfredson et al 1999 Alfredson et al 2001) e uma maior expressatildeo de IGF-1 (Olesen et al 2006 Scott et al 2007) e oacutexido niacutetrico (Szomor et al 2006)

Os altos niacuteveis do neurotransmissor excitatoacuterio glutamato estatildeo relacionados

com a sensaccedilatildeo dolorosa (Alfredson et al 2001) A maior expressatildeo de IGF-1 eacute

considerada responsaacutevel por estimular a siacutentese de colaacutegeno a proliferaccedilatildeo celular

e o acuacutemulo de glicosaminoglicanos em resposta agraves cargas no entanto natildeo se sabe

se essa eacute uma resposta adaptativa ou patoloacutegica (Olesen et al 2006) Jaacute o papel

do oacutexido niacutetrico natildeo estaacute completamente claro Tem se associado altos niacuteveis dessa

16

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

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45

ResumoIntroduccedilatildeo Microscopicamente a tendinpatia se apresenta com desorganizaccedilatildeo e

microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade maior deposiccedilatildeo de colaacutegeno

tipo III e glicosaminoglicanos

Objetivo Avaliar morfometricamente os eventos envolvidos na patogenia e

evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo em ratos

machos

Metodologia Foram utilizados trinta ratos machos Wistar divididos aleatoriamente

em Grupo experimental (n=15) e Grupo controle (n=15) Cada grupo foi dividido nos

intervalos de quatro (n=5) oito (n=5) e dezesseis (n=5) semanas O grupo

experimental correu em uma esteira adaptada cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin Apoacutes o protocolo os animais foram

submetidos agrave eutanaacutesia e os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo foram

extirpados fixados e processados Em seguida realizou-se as coloraccedilotildees de

Hematoxilina-Eosina Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e TUNEL

Resultados A densidade celular e as lacunas intersticiais aumentaram nos grupos

experimentais da quarta (092 plusmn 006 vs 061 plusmn 005 - Plt001) (993 plusmn 155 vs 37 plusmn

079 - Plt001) oitava (085 plusmn 004 vs 058 plusmn 006 - Plt005) (116 plusmn 259 vs 381 plusmn

087 - Plt001) e deacutecima sexta (082 plusmn 004 vs 053 plusmn 006 - Plt001) (1213 plusmn 103 vs

444 plusmn 056 - Plt0001) semana respectivamente Houve maior deposiccedilatildeo de

colaacutegeno tipo III e glicosaminoglicanos nos grupos experimentais da quarta (434 plusmn

384 vs 657 plusmn 306 - Plt0001) (833 plusmn 117 vs 397 plusmn 071 - Plt001) oitava (5045 plusmn

42 vs 671 plusmn 284 - Plt00001) (912 plusmn 117 vs 419 plusmn 075 - Plt001) e deacutecima sexta

(596 plusmn 241 vs 496 plusmn 132 - Plt00001) (1253 plusmn 156 vs 384 plusmn 066 - Plt001)

semana respectivamente A expressatildeo da atividade celular foi maior nos grupos

experimentais (4 grumosnuacutecleo vs 2 grumosnuacutecleo - Plt00001) de todos os

intervalos de tempo

Conclusatildeo Pode-se observar que o modelo proposto eacute eficaz para desenvolver

uma lesatildeo degenerativa no tendatildeo de Aquiles livre de infiltrado inflamatoacuterio Apartir

desse modelo futuras pesquisas devem investigar o efeito das diversas terapias

fiacutesicas e farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

Palavras-chaves tendinopatia tendatildeo de Aquiles experimento animal

5

AbstractBackground Microscopically tendinosis presents collagen fibers disorganization

and microtears hipercellularity higher collagen type III and glicosaminoglicans

deposition

Purpose Morphometric evaluation of the Aquiles tendinosis` pathogen events and

evolution using a male rats induction model

Methods Thirty male Wistar rats were randomized splitted in an experimental (n=15)

and a control groups (n=15) Five animalsgroup were euthanized at four eight and

sixteen weeks Experimental group ran on an adapted treadmill 5 times a week 80

minutes daily at 268 mmin Then the right and left Achilles tendons were collected

and processed Obtained slides were stained by Hematoxilyn-Eosin Picrosirius Red

Alcian Blue AgNOR and TUNEL

Results Cellular density and microtearing raised in the experimental group at fourth

(092 plusmn 006 vs 061 plusmn 005 - Plt001) (993 plusmn 155 vs 37 plusmn 079 - Plt001) eighth

(085 plusmn 004 vs 058 plusmn 006 - Plt005) (116 plusmn 259 vs 381 plusmn 087 - Plt001) and

sixteenth (082 plusmn 004 vs 053 plusmn 006 - Plt001) (1213 plusmn 103 vs 444 plusmn 056 -

Plt0001) weeks respectively There were more type III collagen and

glycosaminoglycans deposition in the experimental group at fourth (434 plusmn 384 vs

657 plusmn 306 - Plt0001) (833 plusmn 117 vs 397 plusmn 071 - Plt001) eighth (5045 plusmn 42 vs

671 plusmn 284 - Plt00001) (912 plusmn 117 vs 419 plusmn 075 - Plt001) and sixteenth (596 plusmn

241 vs 496 plusmn 132 - Plt00001) (1253 plusmn 156 vs 384 plusmn 066 - Plt001) weeks

respectively The cellular activity expression was higher in the experimental groups

(4 clustersnucleus vs 2 clustersnucleus - Plt00001) of all time intervals

Conclusions The proposed model was able to induce degenerative injury and

morphometry showed important results Future researches must investigate physical

and pharmacological therapies effects to the Achilles tendinosis

Keywords tendinopathy Achilles tendon animal experimentation

6

Lista de figurasPaacutegina

Figura I Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas

sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 13Figura II Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo 14Figura III Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) 14Figura IV Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress 15Figura V Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo 23Figura VI Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente

para os ratos 24Figura VII Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo 27Figura VIII Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x 29Figura IX Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo

controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva

de 10x 30Figura X Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta

semana (A) oitava semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash

detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz

polarizada objetiva de 10x 33Figura XI Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como

aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue objetiva de 10x 34Figura XII Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande

quantidade de marcaccedilotildees intranucleares AgNOR objetiva de 40x 35Figura XIII Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena

quantidade de marcaccedilotildees intranucleares AgNOR objetiva de 40x 35Figura XIV Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo

controle (A) e experimental (B) TUNEL objetiva de

40x

36

Figura XV Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta

bioloacutegica poderaacute ter um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende

diretamente das caracteriacutesticas da carga impostahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 41

7

Lista de organogramasPaacutegina

Organograma I Etiologia multifatorial da tendinose 17Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no

tendatildeo 18Organograma III Desenho de estudo do experimento 23

8

Lista de graacuteficosPaacutegina

Graacutefico I Evoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos

trecircs intervalos de tempo 30Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 31Graacutefico III Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e

controle ao decorrer do protocolo 31Graacutefico IV Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao

decorrer do protocolo 32Graacutefico V Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo

experimental ao decorrer do protocolo 32Graacutefico VI Evoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 33

9

Lista de tabelasPaacutegina

Tabela I Meacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e

experimental 29Tabela II Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo

controle e experimental 31Tabela III Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo

controle e experimental 32Tabela IV Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo

controle e experimental 34

10

Lista de abreviaturas e siglas

AgNOR Regiatildeo Organizadora de Nucleacuteolo corado pela Prata

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e TecnoloacutegicoCO2 Dioxido de carbonoCOX-2 Ciclooxigenase-2DNA Do inglecircs Deoxyribonucleic Acid - Aacutecido desoxirribonucleacuteicoFAPEMIG Fundaccedilatildeo de Amparo a Pesquisa de Minas GeraisFLAP Do inglecircs 5-Lipoxygenase-activating ProteinHE Hematoxilina-eosinaH2O2 Peroacutexido de hidrogecircnioGAG GlicosaminoglicanoIA Iacutendice ApoptoacuteticoIGF-1 Fator de crescimento insuliacutenicoIL InterleucinaIBRAMED Induacutestria Brasileira de Equipamentos MeacutedicosICB Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas MEC Matriz extra-celularMMPs Metaloproteinases de matrizPG ProstaglandinaTUNEL Do inglecircs Terminal deoxynucleotidyl Transferase Urydine Nick End

Labeling - Marcaccedilatildeo in situ da fragmentaccedilatildeo do genoma com transferase

terminal de deoxinucleotiacutedioUFMG Universidade Federal de Minas Geraismicrom microcircmetros

11

Sum aacute rio Paacutegina

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo 13

Tendinose 16

Modelos de induccedilatildeo a tendinose 19

Objetivos 22

Material e meacutetodos

Distribuiccedilatildeo dos grupos 23

Anaacutelise histoloacutegica 24

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetrica 25

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HE 25

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red 26

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian Blue 27

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNOR 27

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNEL 28

Anaacutelise estatiacutestica 28

Resultados 29

Discussatildeo 37

Conclusatildeo 44

Referecircncias Bibliograacuteficas 45

Apecircndice I (Selecionado entre os melhores pocircsteres do I Encontro de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Patologia da UFMG)55

Apecircndice II (Modelos experimentais de induccedilatildeo agrave tendinose por esforccedilo repetitivo - Revisatildeo de literatura)56

Apecircndice III (Experimental model of Achilles Tendinosis` induction A morphometrical study)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

12

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo

O tendatildeo eacute um conjunto de fibras colaacutegenas compactas que conectam o muacutesculo

ao osso Possui aproximadamente 70 de aacutegua com boa parte associada aos

glicosaminoglicanos da matriz extracelular (Riley et al 1994) Jaacute o colaacutegeno seu

constituinte baacutesico representa ateacute 95 do peso seco do tendatildeo sendo que uma

grande proporccedilatildeo se refere ao tipo I e o restante (menos de 10) ao tipo III

(Gross 1992 Rufai et al 1995) Aleacutem desses constituintes estaacute presente cerca

de 2 de elastina (Eyden amp Tzaphlidou 2001) e pequena quantidade de

colaacutegeno tipo IV (Ahtikoski et al 2003)

O colaacutegeno eacute formado pelo tropocolaacutegeno que por sua vez eacute formado por trecircs

cadeias peptiacutedicas helicoidais e espiraladas (Rich amp Crick 1961) (Figura I) Eacute

interessante ressaltar que a moleacutecula de tropocolaacutegeno eacute cerca de dez vezes

mais resistente que o tendatildeo (forccedila de resistecircncia secccedilatildeo transversa) Isso

porque as ligaccedilotildees intra-moleculares formam interaccedilotildees mais fortes do que as

interaccedilotildees inter-moleculares (Gustavson 1956) Dessa maneira as lesotildees

acontecem principalmente no niacutevel inter-molecular

Considerando as ligaccedilotildees inter-moleculares o colaacutegeno tipo I apresenta

interaccedilotildees mais resistentes agraves tensotildees com ligaccedilotildees estaacuteveis e natildeo-redutiacuteveis

que natildeo se organizam dinamicamente Por outro lado o colaacutegeno tipo III

apresenta interaccedilotildees menos resistentes agraves tensotildees com poucas ligaccedilotildees estaacuteveis

e redutiacuteveis que tecircm a capacidade de se organizar dinamicamente (Viidik et al 1982) O colaacutegeno tipo IV natildeo contribui para as caracteriacutesticas mecacircnicas do

tendatildeo

13

Figura I ndash Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 (Adaptado de Junqueira amp Carneiro 2004)

As moleacuteculas de tropocolaacutegeno se agrupam em feixes primaacuterios para formar as

microfibrilas e fibrilas (Figura II) Os grupos de feixes primaacuterios unem-se para

formar os fasciacuteculos ou feixes secundaacuterios essas satildeo as menores unidades

funcionais do tendatildeo (Khan et al 1999) Envolvendo os fasciacuteculos encontra-se

uma camada de tecido conectivo denominada endotendatildeo Essa camada conteacutem

estruturas nervosas vasculares e linfaacuteticas Agrupando os endotendotildees e

envolvendo o tendatildeo propriamente dito se encontra o epitendatildeo e mais

externamente o paratendatildeo que eacute a camada mais vascularizada Este uacuteltimo

pode se tornar uma camada dupla preenchida por liquido sinovial (bursa) em

tendotildees sujeitos a fricccedilatildeo

O arranjo em paralelo dessas fibras de colaacutegeno eacute adaptado para a funccedilatildeo do

tendatildeo que controla cargas tensionais unidirecionais De maneira distinta os

ligamentos possuem um arranjo entrelaccedilado pois podem controlar cargas

tensionais em vaacuterias direccedilotildees (Figura III) (Snell 1984)

14

Figura II ndash Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo (Adaptado de Silva amp Castro 2006)

Figura III ndash Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) (Adaptado de Snell 1984)

A baixa proporccedilatildeo de elastina eacute responsaacutevel pela baixa elasticidade do tendatildeo

sendo que seu comprimento aumenta em apenas 8 a 10 antes de atingir o ponto

de ruptura total (Figura IV) (Butler et al 1978) Isso eacute importante para funccedilatildeo do

tendatildeo pois se ele fosse mais elaacutestico poderia alongar-se com a contraccedilatildeo

muscular em vez de transmitir forccedila ao osso

A presenccedila de aacutegua e glicosaminoglicanos contribui para manter o espaccedilamento

entre as fibras de colaacutegeno facilitando o deslizamento entre elas E juntamente

com as fibras de colaacutegeno e elastina conferem ao tendatildeo sua propriedade

viscoelaacutestica na qual o tecido retorna ao seu tamanho original depois de algum

tempo apoacutes ser submetido a certo niacutevel de forccedila de deformaccedilatildeo (Taylor et al 1990) Alguns tendotildees apresentam zonas de hipovascularizaccedilatildeo (Carr 1989) embora

todos sejam nutridos suficientemente para promover o processo reparativo

Entretanto este processo eacute lento devido agrave baixa taxa metaboacutelica Dessa forma se

o tendatildeo natildeo tiver um tempo adequado de recuperaccedilatildeo capaz de equilibrar o

processo de siacutentese e degradaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno ele estaraacute entatildeo sujeito

a lesotildees (Riley 2004)

15

Figura IV ndash Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress (Adaptado de Butler et al 1978)

Tendinose

Atualmente haacute uma tendecircncia de diagnosticar clinicamente todas as lesotildees no

tendatildeo como tendinopatia reservando os termos tendinite tendinose eou

paratendinite apenas para anaacutelises histopatoloacutegicas (Maffulli et al 1998) No

entanto eacute certo que as lesotildees agudas que apresentam infiltrado inflamatoacuterio reativo

se comportam de maneira distinta das lesotildees crocircnicas degenerativas tanto na

gecircnese da doenccedila quanto na propedecircutica Portanto criteacuterios cliacutenicos mais precisos

satildeo necessaacuterios para que natildeo ocorram procedimentos terapecircuticos incorretos

A tendinose eacute generalizadamente caracterizada por degeneraccedilatildeo intratendiacutenea

e desorganizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno Macroscopicamente se apresenta como

uma degeneraccedilatildeo mucoacuteide com o tecido friaacutevel desorganizado e de cor

acastanhada Microscopicamente confirma-se que esta estrutura apresenta

desorganizaccedilatildeo e microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade com

arredondamento dos nuacutecleos (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento significativo de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo a quantidade de

colaacutegeno tipo I (Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) neovascularizaccedilatildeo (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1999 Szomor et al 2006) e apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007) Outras caracteriacutesticas patoloacutegicas

comumente presentes satildeo as adiposes fibrocartilaginoses e metaplasias oacutesseas

(Kannus amp Jozsa 1991 Riley et al 1996) Aleacutem dessas alteraccedilotildees morfoloacutegicas

pode-se observar um aumento da produccedilatildeo de glutamato (Alfredson et al 1999 Alfredson et al 2001) e uma maior expressatildeo de IGF-1 (Olesen et al 2006 Scott et al 2007) e oacutexido niacutetrico (Szomor et al 2006)

Os altos niacuteveis do neurotransmissor excitatoacuterio glutamato estatildeo relacionados

com a sensaccedilatildeo dolorosa (Alfredson et al 2001) A maior expressatildeo de IGF-1 eacute

considerada responsaacutevel por estimular a siacutentese de colaacutegeno a proliferaccedilatildeo celular

e o acuacutemulo de glicosaminoglicanos em resposta agraves cargas no entanto natildeo se sabe

se essa eacute uma resposta adaptativa ou patoloacutegica (Olesen et al 2006) Jaacute o papel

do oacutexido niacutetrico natildeo estaacute completamente claro Tem se associado altos niacuteveis dessa

16

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

Referecircncias Bibliograacuteficas

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Type IV collagen in rat skeletal muscle during immobilization in shortened and

lengthened positions Acta Physiol Scand 2003 177 473-481

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immunohistochemical analyses of tendon tissue demonstrated high amounts of

free glutamate and glutamate NMDAR1 receptors but no signs of

inflammation in Jumperrsquos knee J Orthop Res 2001 19(5) 881-886

Allen GM Tauro PG Ostlere SJ Proximal patellar tendinosis and

abnormalities of patellar tracking Skeletal Radiol 1999 28(4) 220-223

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chronic repetitive loading Connect Tissue Res 2001 42(1) 13-24

Archambault JM Jelinsky SA Lake SP Hill AA Glaser DL Soslowsky LJ Rat

supraspinatus tendon expresses cartilage markers with overuse J Orthop Res

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Archambault JM Wiley JP Bray RC Exercise loading f tendon and the

development of overuse injuries a review of current literature Sports Med

1995 20(2) 77-89

Arnoczky SP Lavagnino M Egerbacher M The mechanobiological

aetiopathogenesis of tendinopathy is it the over-stimulation or the under-

stimulation of tendon cells Int J Exp Pathol 2007 88 217ndash226

45

AbstractBackground Microscopically tendinosis presents collagen fibers disorganization

and microtears hipercellularity higher collagen type III and glicosaminoglicans

deposition

Purpose Morphometric evaluation of the Aquiles tendinosis` pathogen events and

evolution using a male rats induction model

Methods Thirty male Wistar rats were randomized splitted in an experimental (n=15)

and a control groups (n=15) Five animalsgroup were euthanized at four eight and

sixteen weeks Experimental group ran on an adapted treadmill 5 times a week 80

minutes daily at 268 mmin Then the right and left Achilles tendons were collected

and processed Obtained slides were stained by Hematoxilyn-Eosin Picrosirius Red

Alcian Blue AgNOR and TUNEL

Results Cellular density and microtearing raised in the experimental group at fourth

(092 plusmn 006 vs 061 plusmn 005 - Plt001) (993 plusmn 155 vs 37 plusmn 079 - Plt001) eighth

(085 plusmn 004 vs 058 plusmn 006 - Plt005) (116 plusmn 259 vs 381 plusmn 087 - Plt001) and

sixteenth (082 plusmn 004 vs 053 plusmn 006 - Plt001) (1213 plusmn 103 vs 444 plusmn 056 -

Plt0001) weeks respectively There were more type III collagen and

glycosaminoglycans deposition in the experimental group at fourth (434 plusmn 384 vs

657 plusmn 306 - Plt0001) (833 plusmn 117 vs 397 plusmn 071 - Plt001) eighth (5045 plusmn 42 vs

671 plusmn 284 - Plt00001) (912 plusmn 117 vs 419 plusmn 075 - Plt001) and sixteenth (596 plusmn

241 vs 496 plusmn 132 - Plt00001) (1253 plusmn 156 vs 384 plusmn 066 - Plt001) weeks

respectively The cellular activity expression was higher in the experimental groups

(4 clustersnucleus vs 2 clustersnucleus - Plt00001) of all time intervals

Conclusions The proposed model was able to induce degenerative injury and

morphometry showed important results Future researches must investigate physical

and pharmacological therapies effects to the Achilles tendinosis

Keywords tendinopathy Achilles tendon animal experimentation

6

Lista de figurasPaacutegina

Figura I Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas

sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 13Figura II Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo 14Figura III Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) 14Figura IV Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress 15Figura V Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo 23Figura VI Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente

para os ratos 24Figura VII Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo 27Figura VIII Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x 29Figura IX Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo

controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva

de 10x 30Figura X Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta

semana (A) oitava semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash

detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz

polarizada objetiva de 10x 33Figura XI Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como

aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue objetiva de 10x 34Figura XII Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande

quantidade de marcaccedilotildees intranucleares AgNOR objetiva de 40x 35Figura XIII Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena

quantidade de marcaccedilotildees intranucleares AgNOR objetiva de 40x 35Figura XIV Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo

controle (A) e experimental (B) TUNEL objetiva de

40x

36

Figura XV Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta

bioloacutegica poderaacute ter um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende

diretamente das caracteriacutesticas da carga impostahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 41

7

Lista de organogramasPaacutegina

Organograma I Etiologia multifatorial da tendinose 17Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no

tendatildeo 18Organograma III Desenho de estudo do experimento 23

8

Lista de graacuteficosPaacutegina

Graacutefico I Evoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos

trecircs intervalos de tempo 30Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 31Graacutefico III Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e

controle ao decorrer do protocolo 31Graacutefico IV Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao

decorrer do protocolo 32Graacutefico V Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo

experimental ao decorrer do protocolo 32Graacutefico VI Evoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 33

9

Lista de tabelasPaacutegina

Tabela I Meacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e

experimental 29Tabela II Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo

controle e experimental 31Tabela III Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo

controle e experimental 32Tabela IV Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo

controle e experimental 34

10

Lista de abreviaturas e siglas

AgNOR Regiatildeo Organizadora de Nucleacuteolo corado pela Prata

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e TecnoloacutegicoCO2 Dioxido de carbonoCOX-2 Ciclooxigenase-2DNA Do inglecircs Deoxyribonucleic Acid - Aacutecido desoxirribonucleacuteicoFAPEMIG Fundaccedilatildeo de Amparo a Pesquisa de Minas GeraisFLAP Do inglecircs 5-Lipoxygenase-activating ProteinHE Hematoxilina-eosinaH2O2 Peroacutexido de hidrogecircnioGAG GlicosaminoglicanoIA Iacutendice ApoptoacuteticoIGF-1 Fator de crescimento insuliacutenicoIL InterleucinaIBRAMED Induacutestria Brasileira de Equipamentos MeacutedicosICB Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas MEC Matriz extra-celularMMPs Metaloproteinases de matrizPG ProstaglandinaTUNEL Do inglecircs Terminal deoxynucleotidyl Transferase Urydine Nick End

Labeling - Marcaccedilatildeo in situ da fragmentaccedilatildeo do genoma com transferase

terminal de deoxinucleotiacutedioUFMG Universidade Federal de Minas Geraismicrom microcircmetros

11

Sum aacute rio Paacutegina

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo 13

Tendinose 16

Modelos de induccedilatildeo a tendinose 19

Objetivos 22

Material e meacutetodos

Distribuiccedilatildeo dos grupos 23

Anaacutelise histoloacutegica 24

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetrica 25

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HE 25

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red 26

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian Blue 27

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNOR 27

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNEL 28

Anaacutelise estatiacutestica 28

Resultados 29

Discussatildeo 37

Conclusatildeo 44

Referecircncias Bibliograacuteficas 45

Apecircndice I (Selecionado entre os melhores pocircsteres do I Encontro de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Patologia da UFMG)55

Apecircndice II (Modelos experimentais de induccedilatildeo agrave tendinose por esforccedilo repetitivo - Revisatildeo de literatura)56

Apecircndice III (Experimental model of Achilles Tendinosis` induction A morphometrical study)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

12

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo

O tendatildeo eacute um conjunto de fibras colaacutegenas compactas que conectam o muacutesculo

ao osso Possui aproximadamente 70 de aacutegua com boa parte associada aos

glicosaminoglicanos da matriz extracelular (Riley et al 1994) Jaacute o colaacutegeno seu

constituinte baacutesico representa ateacute 95 do peso seco do tendatildeo sendo que uma

grande proporccedilatildeo se refere ao tipo I e o restante (menos de 10) ao tipo III

(Gross 1992 Rufai et al 1995) Aleacutem desses constituintes estaacute presente cerca

de 2 de elastina (Eyden amp Tzaphlidou 2001) e pequena quantidade de

colaacutegeno tipo IV (Ahtikoski et al 2003)

O colaacutegeno eacute formado pelo tropocolaacutegeno que por sua vez eacute formado por trecircs

cadeias peptiacutedicas helicoidais e espiraladas (Rich amp Crick 1961) (Figura I) Eacute

interessante ressaltar que a moleacutecula de tropocolaacutegeno eacute cerca de dez vezes

mais resistente que o tendatildeo (forccedila de resistecircncia secccedilatildeo transversa) Isso

porque as ligaccedilotildees intra-moleculares formam interaccedilotildees mais fortes do que as

interaccedilotildees inter-moleculares (Gustavson 1956) Dessa maneira as lesotildees

acontecem principalmente no niacutevel inter-molecular

Considerando as ligaccedilotildees inter-moleculares o colaacutegeno tipo I apresenta

interaccedilotildees mais resistentes agraves tensotildees com ligaccedilotildees estaacuteveis e natildeo-redutiacuteveis

que natildeo se organizam dinamicamente Por outro lado o colaacutegeno tipo III

apresenta interaccedilotildees menos resistentes agraves tensotildees com poucas ligaccedilotildees estaacuteveis

e redutiacuteveis que tecircm a capacidade de se organizar dinamicamente (Viidik et al 1982) O colaacutegeno tipo IV natildeo contribui para as caracteriacutesticas mecacircnicas do

tendatildeo

13

Figura I ndash Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 (Adaptado de Junqueira amp Carneiro 2004)

As moleacuteculas de tropocolaacutegeno se agrupam em feixes primaacuterios para formar as

microfibrilas e fibrilas (Figura II) Os grupos de feixes primaacuterios unem-se para

formar os fasciacuteculos ou feixes secundaacuterios essas satildeo as menores unidades

funcionais do tendatildeo (Khan et al 1999) Envolvendo os fasciacuteculos encontra-se

uma camada de tecido conectivo denominada endotendatildeo Essa camada conteacutem

estruturas nervosas vasculares e linfaacuteticas Agrupando os endotendotildees e

envolvendo o tendatildeo propriamente dito se encontra o epitendatildeo e mais

externamente o paratendatildeo que eacute a camada mais vascularizada Este uacuteltimo

pode se tornar uma camada dupla preenchida por liquido sinovial (bursa) em

tendotildees sujeitos a fricccedilatildeo

O arranjo em paralelo dessas fibras de colaacutegeno eacute adaptado para a funccedilatildeo do

tendatildeo que controla cargas tensionais unidirecionais De maneira distinta os

ligamentos possuem um arranjo entrelaccedilado pois podem controlar cargas

tensionais em vaacuterias direccedilotildees (Figura III) (Snell 1984)

14

Figura II ndash Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo (Adaptado de Silva amp Castro 2006)

Figura III ndash Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) (Adaptado de Snell 1984)

A baixa proporccedilatildeo de elastina eacute responsaacutevel pela baixa elasticidade do tendatildeo

sendo que seu comprimento aumenta em apenas 8 a 10 antes de atingir o ponto

de ruptura total (Figura IV) (Butler et al 1978) Isso eacute importante para funccedilatildeo do

tendatildeo pois se ele fosse mais elaacutestico poderia alongar-se com a contraccedilatildeo

muscular em vez de transmitir forccedila ao osso

A presenccedila de aacutegua e glicosaminoglicanos contribui para manter o espaccedilamento

entre as fibras de colaacutegeno facilitando o deslizamento entre elas E juntamente

com as fibras de colaacutegeno e elastina conferem ao tendatildeo sua propriedade

viscoelaacutestica na qual o tecido retorna ao seu tamanho original depois de algum

tempo apoacutes ser submetido a certo niacutevel de forccedila de deformaccedilatildeo (Taylor et al 1990) Alguns tendotildees apresentam zonas de hipovascularizaccedilatildeo (Carr 1989) embora

todos sejam nutridos suficientemente para promover o processo reparativo

Entretanto este processo eacute lento devido agrave baixa taxa metaboacutelica Dessa forma se

o tendatildeo natildeo tiver um tempo adequado de recuperaccedilatildeo capaz de equilibrar o

processo de siacutentese e degradaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno ele estaraacute entatildeo sujeito

a lesotildees (Riley 2004)

15

Figura IV ndash Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress (Adaptado de Butler et al 1978)

Tendinose

Atualmente haacute uma tendecircncia de diagnosticar clinicamente todas as lesotildees no

tendatildeo como tendinopatia reservando os termos tendinite tendinose eou

paratendinite apenas para anaacutelises histopatoloacutegicas (Maffulli et al 1998) No

entanto eacute certo que as lesotildees agudas que apresentam infiltrado inflamatoacuterio reativo

se comportam de maneira distinta das lesotildees crocircnicas degenerativas tanto na

gecircnese da doenccedila quanto na propedecircutica Portanto criteacuterios cliacutenicos mais precisos

satildeo necessaacuterios para que natildeo ocorram procedimentos terapecircuticos incorretos

A tendinose eacute generalizadamente caracterizada por degeneraccedilatildeo intratendiacutenea

e desorganizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno Macroscopicamente se apresenta como

uma degeneraccedilatildeo mucoacuteide com o tecido friaacutevel desorganizado e de cor

acastanhada Microscopicamente confirma-se que esta estrutura apresenta

desorganizaccedilatildeo e microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade com

arredondamento dos nuacutecleos (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento significativo de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo a quantidade de

colaacutegeno tipo I (Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) neovascularizaccedilatildeo (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1999 Szomor et al 2006) e apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007) Outras caracteriacutesticas patoloacutegicas

comumente presentes satildeo as adiposes fibrocartilaginoses e metaplasias oacutesseas

(Kannus amp Jozsa 1991 Riley et al 1996) Aleacutem dessas alteraccedilotildees morfoloacutegicas

pode-se observar um aumento da produccedilatildeo de glutamato (Alfredson et al 1999 Alfredson et al 2001) e uma maior expressatildeo de IGF-1 (Olesen et al 2006 Scott et al 2007) e oacutexido niacutetrico (Szomor et al 2006)

Os altos niacuteveis do neurotransmissor excitatoacuterio glutamato estatildeo relacionados

com a sensaccedilatildeo dolorosa (Alfredson et al 2001) A maior expressatildeo de IGF-1 eacute

considerada responsaacutevel por estimular a siacutentese de colaacutegeno a proliferaccedilatildeo celular

e o acuacutemulo de glicosaminoglicanos em resposta agraves cargas no entanto natildeo se sabe

se essa eacute uma resposta adaptativa ou patoloacutegica (Olesen et al 2006) Jaacute o papel

do oacutexido niacutetrico natildeo estaacute completamente claro Tem se associado altos niacuteveis dessa

16

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

Referecircncias Bibliograacuteficas

Ahtikoski AM Koskinen SOA Virtanen P Kovanen V Risteli J Takala TES

Type IV collagen in rat skeletal muscle during immobilization in shortened and

lengthened positions Acta Physiol Scand 2003 177 473-481

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pain Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc 1999 7(6) 378-381

Alfredson H Forsgren S Thorsen K Lorentzon R In vivo microdialysis and

immunohistochemical analyses of tendon tissue demonstrated high amounts of

free glutamate and glutamate NMDAR1 receptors but no signs of

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Allen GM Tauro PG Ostlere SJ Proximal patellar tendinosis and

abnormalities of patellar tracking Skeletal Radiol 1999 28(4) 220-223

Archambault JM Hart DA Herzog W Response of rabbit Achilles tendon to

chronic repetitive loading Connect Tissue Res 2001 42(1) 13-24

Archambault JM Jelinsky SA Lake SP Hill AA Glaser DL Soslowsky LJ Rat

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Archambault JM Wiley JP Bray RC Exercise loading f tendon and the

development of overuse injuries a review of current literature Sports Med

1995 20(2) 77-89

Arnoczky SP Lavagnino M Egerbacher M The mechanobiological

aetiopathogenesis of tendinopathy is it the over-stimulation or the under-

stimulation of tendon cells Int J Exp Pathol 2007 88 217ndash226

45

Lista de figurasPaacutegina

Figura I Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas

sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 13Figura II Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo 14Figura III Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) 14Figura IV Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress 15Figura V Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo 23Figura VI Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente

para os ratos 24Figura VII Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo 27Figura VIII Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x 29Figura IX Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo

controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva

de 10x 30Figura X Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta

semana (A) oitava semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash

detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz

polarizada objetiva de 10x 33Figura XI Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como

aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue objetiva de 10x 34Figura XII Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande

quantidade de marcaccedilotildees intranucleares AgNOR objetiva de 40x 35Figura XIII Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena

quantidade de marcaccedilotildees intranucleares AgNOR objetiva de 40x 35Figura XIV Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo

controle (A) e experimental (B) TUNEL objetiva de

40x

36

Figura XV Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta

bioloacutegica poderaacute ter um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende

diretamente das caracteriacutesticas da carga impostahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 41

7

Lista de organogramasPaacutegina

Organograma I Etiologia multifatorial da tendinose 17Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no

tendatildeo 18Organograma III Desenho de estudo do experimento 23

8

Lista de graacuteficosPaacutegina

Graacutefico I Evoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos

trecircs intervalos de tempo 30Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 31Graacutefico III Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e

controle ao decorrer do protocolo 31Graacutefico IV Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao

decorrer do protocolo 32Graacutefico V Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo

experimental ao decorrer do protocolo 32Graacutefico VI Evoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 33

9

Lista de tabelasPaacutegina

Tabela I Meacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e

experimental 29Tabela II Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo

controle e experimental 31Tabela III Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo

controle e experimental 32Tabela IV Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo

controle e experimental 34

10

Lista de abreviaturas e siglas

AgNOR Regiatildeo Organizadora de Nucleacuteolo corado pela Prata

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e TecnoloacutegicoCO2 Dioxido de carbonoCOX-2 Ciclooxigenase-2DNA Do inglecircs Deoxyribonucleic Acid - Aacutecido desoxirribonucleacuteicoFAPEMIG Fundaccedilatildeo de Amparo a Pesquisa de Minas GeraisFLAP Do inglecircs 5-Lipoxygenase-activating ProteinHE Hematoxilina-eosinaH2O2 Peroacutexido de hidrogecircnioGAG GlicosaminoglicanoIA Iacutendice ApoptoacuteticoIGF-1 Fator de crescimento insuliacutenicoIL InterleucinaIBRAMED Induacutestria Brasileira de Equipamentos MeacutedicosICB Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas MEC Matriz extra-celularMMPs Metaloproteinases de matrizPG ProstaglandinaTUNEL Do inglecircs Terminal deoxynucleotidyl Transferase Urydine Nick End

Labeling - Marcaccedilatildeo in situ da fragmentaccedilatildeo do genoma com transferase

terminal de deoxinucleotiacutedioUFMG Universidade Federal de Minas Geraismicrom microcircmetros

11

Sum aacute rio Paacutegina

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo 13

Tendinose 16

Modelos de induccedilatildeo a tendinose 19

Objetivos 22

Material e meacutetodos

Distribuiccedilatildeo dos grupos 23

Anaacutelise histoloacutegica 24

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetrica 25

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HE 25

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red 26

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian Blue 27

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNOR 27

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNEL 28

Anaacutelise estatiacutestica 28

Resultados 29

Discussatildeo 37

Conclusatildeo 44

Referecircncias Bibliograacuteficas 45

Apecircndice I (Selecionado entre os melhores pocircsteres do I Encontro de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Patologia da UFMG)55

Apecircndice II (Modelos experimentais de induccedilatildeo agrave tendinose por esforccedilo repetitivo - Revisatildeo de literatura)56

Apecircndice III (Experimental model of Achilles Tendinosis` induction A morphometrical study)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

12

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo

O tendatildeo eacute um conjunto de fibras colaacutegenas compactas que conectam o muacutesculo

ao osso Possui aproximadamente 70 de aacutegua com boa parte associada aos

glicosaminoglicanos da matriz extracelular (Riley et al 1994) Jaacute o colaacutegeno seu

constituinte baacutesico representa ateacute 95 do peso seco do tendatildeo sendo que uma

grande proporccedilatildeo se refere ao tipo I e o restante (menos de 10) ao tipo III

(Gross 1992 Rufai et al 1995) Aleacutem desses constituintes estaacute presente cerca

de 2 de elastina (Eyden amp Tzaphlidou 2001) e pequena quantidade de

colaacutegeno tipo IV (Ahtikoski et al 2003)

O colaacutegeno eacute formado pelo tropocolaacutegeno que por sua vez eacute formado por trecircs

cadeias peptiacutedicas helicoidais e espiraladas (Rich amp Crick 1961) (Figura I) Eacute

interessante ressaltar que a moleacutecula de tropocolaacutegeno eacute cerca de dez vezes

mais resistente que o tendatildeo (forccedila de resistecircncia secccedilatildeo transversa) Isso

porque as ligaccedilotildees intra-moleculares formam interaccedilotildees mais fortes do que as

interaccedilotildees inter-moleculares (Gustavson 1956) Dessa maneira as lesotildees

acontecem principalmente no niacutevel inter-molecular

Considerando as ligaccedilotildees inter-moleculares o colaacutegeno tipo I apresenta

interaccedilotildees mais resistentes agraves tensotildees com ligaccedilotildees estaacuteveis e natildeo-redutiacuteveis

que natildeo se organizam dinamicamente Por outro lado o colaacutegeno tipo III

apresenta interaccedilotildees menos resistentes agraves tensotildees com poucas ligaccedilotildees estaacuteveis

e redutiacuteveis que tecircm a capacidade de se organizar dinamicamente (Viidik et al 1982) O colaacutegeno tipo IV natildeo contribui para as caracteriacutesticas mecacircnicas do

tendatildeo

13

Figura I ndash Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 (Adaptado de Junqueira amp Carneiro 2004)

As moleacuteculas de tropocolaacutegeno se agrupam em feixes primaacuterios para formar as

microfibrilas e fibrilas (Figura II) Os grupos de feixes primaacuterios unem-se para

formar os fasciacuteculos ou feixes secundaacuterios essas satildeo as menores unidades

funcionais do tendatildeo (Khan et al 1999) Envolvendo os fasciacuteculos encontra-se

uma camada de tecido conectivo denominada endotendatildeo Essa camada conteacutem

estruturas nervosas vasculares e linfaacuteticas Agrupando os endotendotildees e

envolvendo o tendatildeo propriamente dito se encontra o epitendatildeo e mais

externamente o paratendatildeo que eacute a camada mais vascularizada Este uacuteltimo

pode se tornar uma camada dupla preenchida por liquido sinovial (bursa) em

tendotildees sujeitos a fricccedilatildeo

O arranjo em paralelo dessas fibras de colaacutegeno eacute adaptado para a funccedilatildeo do

tendatildeo que controla cargas tensionais unidirecionais De maneira distinta os

ligamentos possuem um arranjo entrelaccedilado pois podem controlar cargas

tensionais em vaacuterias direccedilotildees (Figura III) (Snell 1984)

14

Figura II ndash Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo (Adaptado de Silva amp Castro 2006)

Figura III ndash Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) (Adaptado de Snell 1984)

A baixa proporccedilatildeo de elastina eacute responsaacutevel pela baixa elasticidade do tendatildeo

sendo que seu comprimento aumenta em apenas 8 a 10 antes de atingir o ponto

de ruptura total (Figura IV) (Butler et al 1978) Isso eacute importante para funccedilatildeo do

tendatildeo pois se ele fosse mais elaacutestico poderia alongar-se com a contraccedilatildeo

muscular em vez de transmitir forccedila ao osso

A presenccedila de aacutegua e glicosaminoglicanos contribui para manter o espaccedilamento

entre as fibras de colaacutegeno facilitando o deslizamento entre elas E juntamente

com as fibras de colaacutegeno e elastina conferem ao tendatildeo sua propriedade

viscoelaacutestica na qual o tecido retorna ao seu tamanho original depois de algum

tempo apoacutes ser submetido a certo niacutevel de forccedila de deformaccedilatildeo (Taylor et al 1990) Alguns tendotildees apresentam zonas de hipovascularizaccedilatildeo (Carr 1989) embora

todos sejam nutridos suficientemente para promover o processo reparativo

Entretanto este processo eacute lento devido agrave baixa taxa metaboacutelica Dessa forma se

o tendatildeo natildeo tiver um tempo adequado de recuperaccedilatildeo capaz de equilibrar o

processo de siacutentese e degradaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno ele estaraacute entatildeo sujeito

a lesotildees (Riley 2004)

15

Figura IV ndash Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress (Adaptado de Butler et al 1978)

Tendinose

Atualmente haacute uma tendecircncia de diagnosticar clinicamente todas as lesotildees no

tendatildeo como tendinopatia reservando os termos tendinite tendinose eou

paratendinite apenas para anaacutelises histopatoloacutegicas (Maffulli et al 1998) No

entanto eacute certo que as lesotildees agudas que apresentam infiltrado inflamatoacuterio reativo

se comportam de maneira distinta das lesotildees crocircnicas degenerativas tanto na

gecircnese da doenccedila quanto na propedecircutica Portanto criteacuterios cliacutenicos mais precisos

satildeo necessaacuterios para que natildeo ocorram procedimentos terapecircuticos incorretos

A tendinose eacute generalizadamente caracterizada por degeneraccedilatildeo intratendiacutenea

e desorganizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno Macroscopicamente se apresenta como

uma degeneraccedilatildeo mucoacuteide com o tecido friaacutevel desorganizado e de cor

acastanhada Microscopicamente confirma-se que esta estrutura apresenta

desorganizaccedilatildeo e microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade com

arredondamento dos nuacutecleos (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento significativo de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo a quantidade de

colaacutegeno tipo I (Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) neovascularizaccedilatildeo (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1999 Szomor et al 2006) e apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007) Outras caracteriacutesticas patoloacutegicas

comumente presentes satildeo as adiposes fibrocartilaginoses e metaplasias oacutesseas

(Kannus amp Jozsa 1991 Riley et al 1996) Aleacutem dessas alteraccedilotildees morfoloacutegicas

pode-se observar um aumento da produccedilatildeo de glutamato (Alfredson et al 1999 Alfredson et al 2001) e uma maior expressatildeo de IGF-1 (Olesen et al 2006 Scott et al 2007) e oacutexido niacutetrico (Szomor et al 2006)

Os altos niacuteveis do neurotransmissor excitatoacuterio glutamato estatildeo relacionados

com a sensaccedilatildeo dolorosa (Alfredson et al 2001) A maior expressatildeo de IGF-1 eacute

considerada responsaacutevel por estimular a siacutentese de colaacutegeno a proliferaccedilatildeo celular

e o acuacutemulo de glicosaminoglicanos em resposta agraves cargas no entanto natildeo se sabe

se essa eacute uma resposta adaptativa ou patoloacutegica (Olesen et al 2006) Jaacute o papel

do oacutexido niacutetrico natildeo estaacute completamente claro Tem se associado altos niacuteveis dessa

16

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

Referecircncias Bibliograacuteficas

Ahtikoski AM Koskinen SOA Virtanen P Kovanen V Risteli J Takala TES

Type IV collagen in rat skeletal muscle during immobilization in shortened and

lengthened positions Acta Physiol Scand 2003 177 473-481

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Arnoczky SP Lavagnino M Egerbacher M The mechanobiological

aetiopathogenesis of tendinopathy is it the over-stimulation or the under-

stimulation of tendon cells Int J Exp Pathol 2007 88 217ndash226

45

Lista de organogramasPaacutegina

Organograma I Etiologia multifatorial da tendinose 17Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no

tendatildeo 18Organograma III Desenho de estudo do experimento 23

8

Lista de graacuteficosPaacutegina

Graacutefico I Evoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos

trecircs intervalos de tempo 30Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 31Graacutefico III Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e

controle ao decorrer do protocolo 31Graacutefico IV Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao

decorrer do protocolo 32Graacutefico V Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo

experimental ao decorrer do protocolo 32Graacutefico VI Evoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 33

9

Lista de tabelasPaacutegina

Tabela I Meacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e

experimental 29Tabela II Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo

controle e experimental 31Tabela III Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo

controle e experimental 32Tabela IV Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo

controle e experimental 34

10

Lista de abreviaturas e siglas

AgNOR Regiatildeo Organizadora de Nucleacuteolo corado pela Prata

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e TecnoloacutegicoCO2 Dioxido de carbonoCOX-2 Ciclooxigenase-2DNA Do inglecircs Deoxyribonucleic Acid - Aacutecido desoxirribonucleacuteicoFAPEMIG Fundaccedilatildeo de Amparo a Pesquisa de Minas GeraisFLAP Do inglecircs 5-Lipoxygenase-activating ProteinHE Hematoxilina-eosinaH2O2 Peroacutexido de hidrogecircnioGAG GlicosaminoglicanoIA Iacutendice ApoptoacuteticoIGF-1 Fator de crescimento insuliacutenicoIL InterleucinaIBRAMED Induacutestria Brasileira de Equipamentos MeacutedicosICB Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas MEC Matriz extra-celularMMPs Metaloproteinases de matrizPG ProstaglandinaTUNEL Do inglecircs Terminal deoxynucleotidyl Transferase Urydine Nick End

Labeling - Marcaccedilatildeo in situ da fragmentaccedilatildeo do genoma com transferase

terminal de deoxinucleotiacutedioUFMG Universidade Federal de Minas Geraismicrom microcircmetros

11

Sum aacute rio Paacutegina

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo 13

Tendinose 16

Modelos de induccedilatildeo a tendinose 19

Objetivos 22

Material e meacutetodos

Distribuiccedilatildeo dos grupos 23

Anaacutelise histoloacutegica 24

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetrica 25

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HE 25

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red 26

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian Blue 27

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNOR 27

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNEL 28

Anaacutelise estatiacutestica 28

Resultados 29

Discussatildeo 37

Conclusatildeo 44

Referecircncias Bibliograacuteficas 45

Apecircndice I (Selecionado entre os melhores pocircsteres do I Encontro de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Patologia da UFMG)55

Apecircndice II (Modelos experimentais de induccedilatildeo agrave tendinose por esforccedilo repetitivo - Revisatildeo de literatura)56

Apecircndice III (Experimental model of Achilles Tendinosis` induction A morphometrical study)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

12

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo

O tendatildeo eacute um conjunto de fibras colaacutegenas compactas que conectam o muacutesculo

ao osso Possui aproximadamente 70 de aacutegua com boa parte associada aos

glicosaminoglicanos da matriz extracelular (Riley et al 1994) Jaacute o colaacutegeno seu

constituinte baacutesico representa ateacute 95 do peso seco do tendatildeo sendo que uma

grande proporccedilatildeo se refere ao tipo I e o restante (menos de 10) ao tipo III

(Gross 1992 Rufai et al 1995) Aleacutem desses constituintes estaacute presente cerca

de 2 de elastina (Eyden amp Tzaphlidou 2001) e pequena quantidade de

colaacutegeno tipo IV (Ahtikoski et al 2003)

O colaacutegeno eacute formado pelo tropocolaacutegeno que por sua vez eacute formado por trecircs

cadeias peptiacutedicas helicoidais e espiraladas (Rich amp Crick 1961) (Figura I) Eacute

interessante ressaltar que a moleacutecula de tropocolaacutegeno eacute cerca de dez vezes

mais resistente que o tendatildeo (forccedila de resistecircncia secccedilatildeo transversa) Isso

porque as ligaccedilotildees intra-moleculares formam interaccedilotildees mais fortes do que as

interaccedilotildees inter-moleculares (Gustavson 1956) Dessa maneira as lesotildees

acontecem principalmente no niacutevel inter-molecular

Considerando as ligaccedilotildees inter-moleculares o colaacutegeno tipo I apresenta

interaccedilotildees mais resistentes agraves tensotildees com ligaccedilotildees estaacuteveis e natildeo-redutiacuteveis

que natildeo se organizam dinamicamente Por outro lado o colaacutegeno tipo III

apresenta interaccedilotildees menos resistentes agraves tensotildees com poucas ligaccedilotildees estaacuteveis

e redutiacuteveis que tecircm a capacidade de se organizar dinamicamente (Viidik et al 1982) O colaacutegeno tipo IV natildeo contribui para as caracteriacutesticas mecacircnicas do

tendatildeo

13

Figura I ndash Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 (Adaptado de Junqueira amp Carneiro 2004)

As moleacuteculas de tropocolaacutegeno se agrupam em feixes primaacuterios para formar as

microfibrilas e fibrilas (Figura II) Os grupos de feixes primaacuterios unem-se para

formar os fasciacuteculos ou feixes secundaacuterios essas satildeo as menores unidades

funcionais do tendatildeo (Khan et al 1999) Envolvendo os fasciacuteculos encontra-se

uma camada de tecido conectivo denominada endotendatildeo Essa camada conteacutem

estruturas nervosas vasculares e linfaacuteticas Agrupando os endotendotildees e

envolvendo o tendatildeo propriamente dito se encontra o epitendatildeo e mais

externamente o paratendatildeo que eacute a camada mais vascularizada Este uacuteltimo

pode se tornar uma camada dupla preenchida por liquido sinovial (bursa) em

tendotildees sujeitos a fricccedilatildeo

O arranjo em paralelo dessas fibras de colaacutegeno eacute adaptado para a funccedilatildeo do

tendatildeo que controla cargas tensionais unidirecionais De maneira distinta os

ligamentos possuem um arranjo entrelaccedilado pois podem controlar cargas

tensionais em vaacuterias direccedilotildees (Figura III) (Snell 1984)

14

Figura II ndash Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo (Adaptado de Silva amp Castro 2006)

Figura III ndash Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) (Adaptado de Snell 1984)

A baixa proporccedilatildeo de elastina eacute responsaacutevel pela baixa elasticidade do tendatildeo

sendo que seu comprimento aumenta em apenas 8 a 10 antes de atingir o ponto

de ruptura total (Figura IV) (Butler et al 1978) Isso eacute importante para funccedilatildeo do

tendatildeo pois se ele fosse mais elaacutestico poderia alongar-se com a contraccedilatildeo

muscular em vez de transmitir forccedila ao osso

A presenccedila de aacutegua e glicosaminoglicanos contribui para manter o espaccedilamento

entre as fibras de colaacutegeno facilitando o deslizamento entre elas E juntamente

com as fibras de colaacutegeno e elastina conferem ao tendatildeo sua propriedade

viscoelaacutestica na qual o tecido retorna ao seu tamanho original depois de algum

tempo apoacutes ser submetido a certo niacutevel de forccedila de deformaccedilatildeo (Taylor et al 1990) Alguns tendotildees apresentam zonas de hipovascularizaccedilatildeo (Carr 1989) embora

todos sejam nutridos suficientemente para promover o processo reparativo

Entretanto este processo eacute lento devido agrave baixa taxa metaboacutelica Dessa forma se

o tendatildeo natildeo tiver um tempo adequado de recuperaccedilatildeo capaz de equilibrar o

processo de siacutentese e degradaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno ele estaraacute entatildeo sujeito

a lesotildees (Riley 2004)

15

Figura IV ndash Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress (Adaptado de Butler et al 1978)

Tendinose

Atualmente haacute uma tendecircncia de diagnosticar clinicamente todas as lesotildees no

tendatildeo como tendinopatia reservando os termos tendinite tendinose eou

paratendinite apenas para anaacutelises histopatoloacutegicas (Maffulli et al 1998) No

entanto eacute certo que as lesotildees agudas que apresentam infiltrado inflamatoacuterio reativo

se comportam de maneira distinta das lesotildees crocircnicas degenerativas tanto na

gecircnese da doenccedila quanto na propedecircutica Portanto criteacuterios cliacutenicos mais precisos

satildeo necessaacuterios para que natildeo ocorram procedimentos terapecircuticos incorretos

A tendinose eacute generalizadamente caracterizada por degeneraccedilatildeo intratendiacutenea

e desorganizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno Macroscopicamente se apresenta como

uma degeneraccedilatildeo mucoacuteide com o tecido friaacutevel desorganizado e de cor

acastanhada Microscopicamente confirma-se que esta estrutura apresenta

desorganizaccedilatildeo e microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade com

arredondamento dos nuacutecleos (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento significativo de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo a quantidade de

colaacutegeno tipo I (Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) neovascularizaccedilatildeo (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1999 Szomor et al 2006) e apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007) Outras caracteriacutesticas patoloacutegicas

comumente presentes satildeo as adiposes fibrocartilaginoses e metaplasias oacutesseas

(Kannus amp Jozsa 1991 Riley et al 1996) Aleacutem dessas alteraccedilotildees morfoloacutegicas

pode-se observar um aumento da produccedilatildeo de glutamato (Alfredson et al 1999 Alfredson et al 2001) e uma maior expressatildeo de IGF-1 (Olesen et al 2006 Scott et al 2007) e oacutexido niacutetrico (Szomor et al 2006)

Os altos niacuteveis do neurotransmissor excitatoacuterio glutamato estatildeo relacionados

com a sensaccedilatildeo dolorosa (Alfredson et al 2001) A maior expressatildeo de IGF-1 eacute

considerada responsaacutevel por estimular a siacutentese de colaacutegeno a proliferaccedilatildeo celular

e o acuacutemulo de glicosaminoglicanos em resposta agraves cargas no entanto natildeo se sabe

se essa eacute uma resposta adaptativa ou patoloacutegica (Olesen et al 2006) Jaacute o papel

do oacutexido niacutetrico natildeo estaacute completamente claro Tem se associado altos niacuteveis dessa

16

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

Referecircncias Bibliograacuteficas

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aetiopathogenesis of tendinopathy is it the over-stimulation or the under-

stimulation of tendon cells Int J Exp Pathol 2007 88 217ndash226

45

Lista de graacuteficosPaacutegina

Graacutefico I Evoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos

trecircs intervalos de tempo 30Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 31Graacutefico III Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e

controle ao decorrer do protocolo 31Graacutefico IV Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao

decorrer do protocolo 32Graacutefico V Evoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo

experimental ao decorrer do protocolo 32Graacutefico VI Evoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e

controle nos trecircs intervalos de tempo 33

9

Lista de tabelasPaacutegina

Tabela I Meacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e

experimental 29Tabela II Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo

controle e experimental 31Tabela III Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo

controle e experimental 32Tabela IV Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo

controle e experimental 34

10

Lista de abreviaturas e siglas

AgNOR Regiatildeo Organizadora de Nucleacuteolo corado pela Prata

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e TecnoloacutegicoCO2 Dioxido de carbonoCOX-2 Ciclooxigenase-2DNA Do inglecircs Deoxyribonucleic Acid - Aacutecido desoxirribonucleacuteicoFAPEMIG Fundaccedilatildeo de Amparo a Pesquisa de Minas GeraisFLAP Do inglecircs 5-Lipoxygenase-activating ProteinHE Hematoxilina-eosinaH2O2 Peroacutexido de hidrogecircnioGAG GlicosaminoglicanoIA Iacutendice ApoptoacuteticoIGF-1 Fator de crescimento insuliacutenicoIL InterleucinaIBRAMED Induacutestria Brasileira de Equipamentos MeacutedicosICB Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas MEC Matriz extra-celularMMPs Metaloproteinases de matrizPG ProstaglandinaTUNEL Do inglecircs Terminal deoxynucleotidyl Transferase Urydine Nick End

Labeling - Marcaccedilatildeo in situ da fragmentaccedilatildeo do genoma com transferase

terminal de deoxinucleotiacutedioUFMG Universidade Federal de Minas Geraismicrom microcircmetros

11

Sum aacute rio Paacutegina

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo 13

Tendinose 16

Modelos de induccedilatildeo a tendinose 19

Objetivos 22

Material e meacutetodos

Distribuiccedilatildeo dos grupos 23

Anaacutelise histoloacutegica 24

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetrica 25

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HE 25

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red 26

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian Blue 27

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNOR 27

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNEL 28

Anaacutelise estatiacutestica 28

Resultados 29

Discussatildeo 37

Conclusatildeo 44

Referecircncias Bibliograacuteficas 45

Apecircndice I (Selecionado entre os melhores pocircsteres do I Encontro de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Patologia da UFMG)55

Apecircndice II (Modelos experimentais de induccedilatildeo agrave tendinose por esforccedilo repetitivo - Revisatildeo de literatura)56

Apecircndice III (Experimental model of Achilles Tendinosis` induction A morphometrical study)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

12

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo

O tendatildeo eacute um conjunto de fibras colaacutegenas compactas que conectam o muacutesculo

ao osso Possui aproximadamente 70 de aacutegua com boa parte associada aos

glicosaminoglicanos da matriz extracelular (Riley et al 1994) Jaacute o colaacutegeno seu

constituinte baacutesico representa ateacute 95 do peso seco do tendatildeo sendo que uma

grande proporccedilatildeo se refere ao tipo I e o restante (menos de 10) ao tipo III

(Gross 1992 Rufai et al 1995) Aleacutem desses constituintes estaacute presente cerca

de 2 de elastina (Eyden amp Tzaphlidou 2001) e pequena quantidade de

colaacutegeno tipo IV (Ahtikoski et al 2003)

O colaacutegeno eacute formado pelo tropocolaacutegeno que por sua vez eacute formado por trecircs

cadeias peptiacutedicas helicoidais e espiraladas (Rich amp Crick 1961) (Figura I) Eacute

interessante ressaltar que a moleacutecula de tropocolaacutegeno eacute cerca de dez vezes

mais resistente que o tendatildeo (forccedila de resistecircncia secccedilatildeo transversa) Isso

porque as ligaccedilotildees intra-moleculares formam interaccedilotildees mais fortes do que as

interaccedilotildees inter-moleculares (Gustavson 1956) Dessa maneira as lesotildees

acontecem principalmente no niacutevel inter-molecular

Considerando as ligaccedilotildees inter-moleculares o colaacutegeno tipo I apresenta

interaccedilotildees mais resistentes agraves tensotildees com ligaccedilotildees estaacuteveis e natildeo-redutiacuteveis

que natildeo se organizam dinamicamente Por outro lado o colaacutegeno tipo III

apresenta interaccedilotildees menos resistentes agraves tensotildees com poucas ligaccedilotildees estaacuteveis

e redutiacuteveis que tecircm a capacidade de se organizar dinamicamente (Viidik et al 1982) O colaacutegeno tipo IV natildeo contribui para as caracteriacutesticas mecacircnicas do

tendatildeo

13

Figura I ndash Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 (Adaptado de Junqueira amp Carneiro 2004)

As moleacuteculas de tropocolaacutegeno se agrupam em feixes primaacuterios para formar as

microfibrilas e fibrilas (Figura II) Os grupos de feixes primaacuterios unem-se para

formar os fasciacuteculos ou feixes secundaacuterios essas satildeo as menores unidades

funcionais do tendatildeo (Khan et al 1999) Envolvendo os fasciacuteculos encontra-se

uma camada de tecido conectivo denominada endotendatildeo Essa camada conteacutem

estruturas nervosas vasculares e linfaacuteticas Agrupando os endotendotildees e

envolvendo o tendatildeo propriamente dito se encontra o epitendatildeo e mais

externamente o paratendatildeo que eacute a camada mais vascularizada Este uacuteltimo

pode se tornar uma camada dupla preenchida por liquido sinovial (bursa) em

tendotildees sujeitos a fricccedilatildeo

O arranjo em paralelo dessas fibras de colaacutegeno eacute adaptado para a funccedilatildeo do

tendatildeo que controla cargas tensionais unidirecionais De maneira distinta os

ligamentos possuem um arranjo entrelaccedilado pois podem controlar cargas

tensionais em vaacuterias direccedilotildees (Figura III) (Snell 1984)

14

Figura II ndash Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo (Adaptado de Silva amp Castro 2006)

Figura III ndash Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) (Adaptado de Snell 1984)

A baixa proporccedilatildeo de elastina eacute responsaacutevel pela baixa elasticidade do tendatildeo

sendo que seu comprimento aumenta em apenas 8 a 10 antes de atingir o ponto

de ruptura total (Figura IV) (Butler et al 1978) Isso eacute importante para funccedilatildeo do

tendatildeo pois se ele fosse mais elaacutestico poderia alongar-se com a contraccedilatildeo

muscular em vez de transmitir forccedila ao osso

A presenccedila de aacutegua e glicosaminoglicanos contribui para manter o espaccedilamento

entre as fibras de colaacutegeno facilitando o deslizamento entre elas E juntamente

com as fibras de colaacutegeno e elastina conferem ao tendatildeo sua propriedade

viscoelaacutestica na qual o tecido retorna ao seu tamanho original depois de algum

tempo apoacutes ser submetido a certo niacutevel de forccedila de deformaccedilatildeo (Taylor et al 1990) Alguns tendotildees apresentam zonas de hipovascularizaccedilatildeo (Carr 1989) embora

todos sejam nutridos suficientemente para promover o processo reparativo

Entretanto este processo eacute lento devido agrave baixa taxa metaboacutelica Dessa forma se

o tendatildeo natildeo tiver um tempo adequado de recuperaccedilatildeo capaz de equilibrar o

processo de siacutentese e degradaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno ele estaraacute entatildeo sujeito

a lesotildees (Riley 2004)

15

Figura IV ndash Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress (Adaptado de Butler et al 1978)

Tendinose

Atualmente haacute uma tendecircncia de diagnosticar clinicamente todas as lesotildees no

tendatildeo como tendinopatia reservando os termos tendinite tendinose eou

paratendinite apenas para anaacutelises histopatoloacutegicas (Maffulli et al 1998) No

entanto eacute certo que as lesotildees agudas que apresentam infiltrado inflamatoacuterio reativo

se comportam de maneira distinta das lesotildees crocircnicas degenerativas tanto na

gecircnese da doenccedila quanto na propedecircutica Portanto criteacuterios cliacutenicos mais precisos

satildeo necessaacuterios para que natildeo ocorram procedimentos terapecircuticos incorretos

A tendinose eacute generalizadamente caracterizada por degeneraccedilatildeo intratendiacutenea

e desorganizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno Macroscopicamente se apresenta como

uma degeneraccedilatildeo mucoacuteide com o tecido friaacutevel desorganizado e de cor

acastanhada Microscopicamente confirma-se que esta estrutura apresenta

desorganizaccedilatildeo e microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade com

arredondamento dos nuacutecleos (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento significativo de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo a quantidade de

colaacutegeno tipo I (Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) neovascularizaccedilatildeo (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1999 Szomor et al 2006) e apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007) Outras caracteriacutesticas patoloacutegicas

comumente presentes satildeo as adiposes fibrocartilaginoses e metaplasias oacutesseas

(Kannus amp Jozsa 1991 Riley et al 1996) Aleacutem dessas alteraccedilotildees morfoloacutegicas

pode-se observar um aumento da produccedilatildeo de glutamato (Alfredson et al 1999 Alfredson et al 2001) e uma maior expressatildeo de IGF-1 (Olesen et al 2006 Scott et al 2007) e oacutexido niacutetrico (Szomor et al 2006)

Os altos niacuteveis do neurotransmissor excitatoacuterio glutamato estatildeo relacionados

com a sensaccedilatildeo dolorosa (Alfredson et al 2001) A maior expressatildeo de IGF-1 eacute

considerada responsaacutevel por estimular a siacutentese de colaacutegeno a proliferaccedilatildeo celular

e o acuacutemulo de glicosaminoglicanos em resposta agraves cargas no entanto natildeo se sabe

se essa eacute uma resposta adaptativa ou patoloacutegica (Olesen et al 2006) Jaacute o papel

do oacutexido niacutetrico natildeo estaacute completamente claro Tem se associado altos niacuteveis dessa

16

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

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45

Lista de tabelasPaacutegina

Tabela I Meacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e

experimental 29Tabela II Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo

controle e experimental 31Tabela III Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo

controle e experimental 32Tabela IV Meacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo

controle e experimental 34

10

Lista de abreviaturas e siglas

AgNOR Regiatildeo Organizadora de Nucleacuteolo corado pela Prata

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e TecnoloacutegicoCO2 Dioxido de carbonoCOX-2 Ciclooxigenase-2DNA Do inglecircs Deoxyribonucleic Acid - Aacutecido desoxirribonucleacuteicoFAPEMIG Fundaccedilatildeo de Amparo a Pesquisa de Minas GeraisFLAP Do inglecircs 5-Lipoxygenase-activating ProteinHE Hematoxilina-eosinaH2O2 Peroacutexido de hidrogecircnioGAG GlicosaminoglicanoIA Iacutendice ApoptoacuteticoIGF-1 Fator de crescimento insuliacutenicoIL InterleucinaIBRAMED Induacutestria Brasileira de Equipamentos MeacutedicosICB Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas MEC Matriz extra-celularMMPs Metaloproteinases de matrizPG ProstaglandinaTUNEL Do inglecircs Terminal deoxynucleotidyl Transferase Urydine Nick End

Labeling - Marcaccedilatildeo in situ da fragmentaccedilatildeo do genoma com transferase

terminal de deoxinucleotiacutedioUFMG Universidade Federal de Minas Geraismicrom microcircmetros

11

Sum aacute rio Paacutegina

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo 13

Tendinose 16

Modelos de induccedilatildeo a tendinose 19

Objetivos 22

Material e meacutetodos

Distribuiccedilatildeo dos grupos 23

Anaacutelise histoloacutegica 24

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetrica 25

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HE 25

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red 26

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian Blue 27

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNOR 27

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNEL 28

Anaacutelise estatiacutestica 28

Resultados 29

Discussatildeo 37

Conclusatildeo 44

Referecircncias Bibliograacuteficas 45

Apecircndice I (Selecionado entre os melhores pocircsteres do I Encontro de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Patologia da UFMG)55

Apecircndice II (Modelos experimentais de induccedilatildeo agrave tendinose por esforccedilo repetitivo - Revisatildeo de literatura)56

Apecircndice III (Experimental model of Achilles Tendinosis` induction A morphometrical study)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

12

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo

O tendatildeo eacute um conjunto de fibras colaacutegenas compactas que conectam o muacutesculo

ao osso Possui aproximadamente 70 de aacutegua com boa parte associada aos

glicosaminoglicanos da matriz extracelular (Riley et al 1994) Jaacute o colaacutegeno seu

constituinte baacutesico representa ateacute 95 do peso seco do tendatildeo sendo que uma

grande proporccedilatildeo se refere ao tipo I e o restante (menos de 10) ao tipo III

(Gross 1992 Rufai et al 1995) Aleacutem desses constituintes estaacute presente cerca

de 2 de elastina (Eyden amp Tzaphlidou 2001) e pequena quantidade de

colaacutegeno tipo IV (Ahtikoski et al 2003)

O colaacutegeno eacute formado pelo tropocolaacutegeno que por sua vez eacute formado por trecircs

cadeias peptiacutedicas helicoidais e espiraladas (Rich amp Crick 1961) (Figura I) Eacute

interessante ressaltar que a moleacutecula de tropocolaacutegeno eacute cerca de dez vezes

mais resistente que o tendatildeo (forccedila de resistecircncia secccedilatildeo transversa) Isso

porque as ligaccedilotildees intra-moleculares formam interaccedilotildees mais fortes do que as

interaccedilotildees inter-moleculares (Gustavson 1956) Dessa maneira as lesotildees

acontecem principalmente no niacutevel inter-molecular

Considerando as ligaccedilotildees inter-moleculares o colaacutegeno tipo I apresenta

interaccedilotildees mais resistentes agraves tensotildees com ligaccedilotildees estaacuteveis e natildeo-redutiacuteveis

que natildeo se organizam dinamicamente Por outro lado o colaacutegeno tipo III

apresenta interaccedilotildees menos resistentes agraves tensotildees com poucas ligaccedilotildees estaacuteveis

e redutiacuteveis que tecircm a capacidade de se organizar dinamicamente (Viidik et al 1982) O colaacutegeno tipo IV natildeo contribui para as caracteriacutesticas mecacircnicas do

tendatildeo

13

Figura I ndash Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 (Adaptado de Junqueira amp Carneiro 2004)

As moleacuteculas de tropocolaacutegeno se agrupam em feixes primaacuterios para formar as

microfibrilas e fibrilas (Figura II) Os grupos de feixes primaacuterios unem-se para

formar os fasciacuteculos ou feixes secundaacuterios essas satildeo as menores unidades

funcionais do tendatildeo (Khan et al 1999) Envolvendo os fasciacuteculos encontra-se

uma camada de tecido conectivo denominada endotendatildeo Essa camada conteacutem

estruturas nervosas vasculares e linfaacuteticas Agrupando os endotendotildees e

envolvendo o tendatildeo propriamente dito se encontra o epitendatildeo e mais

externamente o paratendatildeo que eacute a camada mais vascularizada Este uacuteltimo

pode se tornar uma camada dupla preenchida por liquido sinovial (bursa) em

tendotildees sujeitos a fricccedilatildeo

O arranjo em paralelo dessas fibras de colaacutegeno eacute adaptado para a funccedilatildeo do

tendatildeo que controla cargas tensionais unidirecionais De maneira distinta os

ligamentos possuem um arranjo entrelaccedilado pois podem controlar cargas

tensionais em vaacuterias direccedilotildees (Figura III) (Snell 1984)

14

Figura II ndash Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo (Adaptado de Silva amp Castro 2006)

Figura III ndash Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) (Adaptado de Snell 1984)

A baixa proporccedilatildeo de elastina eacute responsaacutevel pela baixa elasticidade do tendatildeo

sendo que seu comprimento aumenta em apenas 8 a 10 antes de atingir o ponto

de ruptura total (Figura IV) (Butler et al 1978) Isso eacute importante para funccedilatildeo do

tendatildeo pois se ele fosse mais elaacutestico poderia alongar-se com a contraccedilatildeo

muscular em vez de transmitir forccedila ao osso

A presenccedila de aacutegua e glicosaminoglicanos contribui para manter o espaccedilamento

entre as fibras de colaacutegeno facilitando o deslizamento entre elas E juntamente

com as fibras de colaacutegeno e elastina conferem ao tendatildeo sua propriedade

viscoelaacutestica na qual o tecido retorna ao seu tamanho original depois de algum

tempo apoacutes ser submetido a certo niacutevel de forccedila de deformaccedilatildeo (Taylor et al 1990) Alguns tendotildees apresentam zonas de hipovascularizaccedilatildeo (Carr 1989) embora

todos sejam nutridos suficientemente para promover o processo reparativo

Entretanto este processo eacute lento devido agrave baixa taxa metaboacutelica Dessa forma se

o tendatildeo natildeo tiver um tempo adequado de recuperaccedilatildeo capaz de equilibrar o

processo de siacutentese e degradaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno ele estaraacute entatildeo sujeito

a lesotildees (Riley 2004)

15

Figura IV ndash Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress (Adaptado de Butler et al 1978)

Tendinose

Atualmente haacute uma tendecircncia de diagnosticar clinicamente todas as lesotildees no

tendatildeo como tendinopatia reservando os termos tendinite tendinose eou

paratendinite apenas para anaacutelises histopatoloacutegicas (Maffulli et al 1998) No

entanto eacute certo que as lesotildees agudas que apresentam infiltrado inflamatoacuterio reativo

se comportam de maneira distinta das lesotildees crocircnicas degenerativas tanto na

gecircnese da doenccedila quanto na propedecircutica Portanto criteacuterios cliacutenicos mais precisos

satildeo necessaacuterios para que natildeo ocorram procedimentos terapecircuticos incorretos

A tendinose eacute generalizadamente caracterizada por degeneraccedilatildeo intratendiacutenea

e desorganizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno Macroscopicamente se apresenta como

uma degeneraccedilatildeo mucoacuteide com o tecido friaacutevel desorganizado e de cor

acastanhada Microscopicamente confirma-se que esta estrutura apresenta

desorganizaccedilatildeo e microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade com

arredondamento dos nuacutecleos (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento significativo de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo a quantidade de

colaacutegeno tipo I (Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) neovascularizaccedilatildeo (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1999 Szomor et al 2006) e apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007) Outras caracteriacutesticas patoloacutegicas

comumente presentes satildeo as adiposes fibrocartilaginoses e metaplasias oacutesseas

(Kannus amp Jozsa 1991 Riley et al 1996) Aleacutem dessas alteraccedilotildees morfoloacutegicas

pode-se observar um aumento da produccedilatildeo de glutamato (Alfredson et al 1999 Alfredson et al 2001) e uma maior expressatildeo de IGF-1 (Olesen et al 2006 Scott et al 2007) e oacutexido niacutetrico (Szomor et al 2006)

Os altos niacuteveis do neurotransmissor excitatoacuterio glutamato estatildeo relacionados

com a sensaccedilatildeo dolorosa (Alfredson et al 2001) A maior expressatildeo de IGF-1 eacute

considerada responsaacutevel por estimular a siacutentese de colaacutegeno a proliferaccedilatildeo celular

e o acuacutemulo de glicosaminoglicanos em resposta agraves cargas no entanto natildeo se sabe

se essa eacute uma resposta adaptativa ou patoloacutegica (Olesen et al 2006) Jaacute o papel

do oacutexido niacutetrico natildeo estaacute completamente claro Tem se associado altos niacuteveis dessa

16

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

Referecircncias Bibliograacuteficas

Ahtikoski AM Koskinen SOA Virtanen P Kovanen V Risteli J Takala TES

Type IV collagen in rat skeletal muscle during immobilization in shortened and

lengthened positions Acta Physiol Scand 2003 177 473-481

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High levels of glutamate but not prostaglandin E2 in chronic Achilles tendon

pain Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc 1999 7(6) 378-381

Alfredson H Forsgren S Thorsen K Lorentzon R In vivo microdialysis and

immunohistochemical analyses of tendon tissue demonstrated high amounts of

free glutamate and glutamate NMDAR1 receptors but no signs of

inflammation in Jumperrsquos knee J Orthop Res 2001 19(5) 881-886

Allen GM Tauro PG Ostlere SJ Proximal patellar tendinosis and

abnormalities of patellar tracking Skeletal Radiol 1999 28(4) 220-223

Archambault JM Hart DA Herzog W Response of rabbit Achilles tendon to

chronic repetitive loading Connect Tissue Res 2001 42(1) 13-24

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aetiopathogenesis of tendinopathy is it the over-stimulation or the under-

stimulation of tendon cells Int J Exp Pathol 2007 88 217ndash226

45

Lista de abreviaturas e siglas

AgNOR Regiatildeo Organizadora de Nucleacuteolo corado pela Prata

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e TecnoloacutegicoCO2 Dioxido de carbonoCOX-2 Ciclooxigenase-2DNA Do inglecircs Deoxyribonucleic Acid - Aacutecido desoxirribonucleacuteicoFAPEMIG Fundaccedilatildeo de Amparo a Pesquisa de Minas GeraisFLAP Do inglecircs 5-Lipoxygenase-activating ProteinHE Hematoxilina-eosinaH2O2 Peroacutexido de hidrogecircnioGAG GlicosaminoglicanoIA Iacutendice ApoptoacuteticoIGF-1 Fator de crescimento insuliacutenicoIL InterleucinaIBRAMED Induacutestria Brasileira de Equipamentos MeacutedicosICB Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas MEC Matriz extra-celularMMPs Metaloproteinases de matrizPG ProstaglandinaTUNEL Do inglecircs Terminal deoxynucleotidyl Transferase Urydine Nick End

Labeling - Marcaccedilatildeo in situ da fragmentaccedilatildeo do genoma com transferase

terminal de deoxinucleotiacutedioUFMG Universidade Federal de Minas Geraismicrom microcircmetros

11

Sum aacute rio Paacutegina

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo 13

Tendinose 16

Modelos de induccedilatildeo a tendinose 19

Objetivos 22

Material e meacutetodos

Distribuiccedilatildeo dos grupos 23

Anaacutelise histoloacutegica 24

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetrica 25

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HE 25

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red 26

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian Blue 27

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNOR 27

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNEL 28

Anaacutelise estatiacutestica 28

Resultados 29

Discussatildeo 37

Conclusatildeo 44

Referecircncias Bibliograacuteficas 45

Apecircndice I (Selecionado entre os melhores pocircsteres do I Encontro de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Patologia da UFMG)55

Apecircndice II (Modelos experimentais de induccedilatildeo agrave tendinose por esforccedilo repetitivo - Revisatildeo de literatura)56

Apecircndice III (Experimental model of Achilles Tendinosis` induction A morphometrical study)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

12

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo

O tendatildeo eacute um conjunto de fibras colaacutegenas compactas que conectam o muacutesculo

ao osso Possui aproximadamente 70 de aacutegua com boa parte associada aos

glicosaminoglicanos da matriz extracelular (Riley et al 1994) Jaacute o colaacutegeno seu

constituinte baacutesico representa ateacute 95 do peso seco do tendatildeo sendo que uma

grande proporccedilatildeo se refere ao tipo I e o restante (menos de 10) ao tipo III

(Gross 1992 Rufai et al 1995) Aleacutem desses constituintes estaacute presente cerca

de 2 de elastina (Eyden amp Tzaphlidou 2001) e pequena quantidade de

colaacutegeno tipo IV (Ahtikoski et al 2003)

O colaacutegeno eacute formado pelo tropocolaacutegeno que por sua vez eacute formado por trecircs

cadeias peptiacutedicas helicoidais e espiraladas (Rich amp Crick 1961) (Figura I) Eacute

interessante ressaltar que a moleacutecula de tropocolaacutegeno eacute cerca de dez vezes

mais resistente que o tendatildeo (forccedila de resistecircncia secccedilatildeo transversa) Isso

porque as ligaccedilotildees intra-moleculares formam interaccedilotildees mais fortes do que as

interaccedilotildees inter-moleculares (Gustavson 1956) Dessa maneira as lesotildees

acontecem principalmente no niacutevel inter-molecular

Considerando as ligaccedilotildees inter-moleculares o colaacutegeno tipo I apresenta

interaccedilotildees mais resistentes agraves tensotildees com ligaccedilotildees estaacuteveis e natildeo-redutiacuteveis

que natildeo se organizam dinamicamente Por outro lado o colaacutegeno tipo III

apresenta interaccedilotildees menos resistentes agraves tensotildees com poucas ligaccedilotildees estaacuteveis

e redutiacuteveis que tecircm a capacidade de se organizar dinamicamente (Viidik et al 1982) O colaacutegeno tipo IV natildeo contribui para as caracteriacutesticas mecacircnicas do

tendatildeo

13

Figura I ndash Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 (Adaptado de Junqueira amp Carneiro 2004)

As moleacuteculas de tropocolaacutegeno se agrupam em feixes primaacuterios para formar as

microfibrilas e fibrilas (Figura II) Os grupos de feixes primaacuterios unem-se para

formar os fasciacuteculos ou feixes secundaacuterios essas satildeo as menores unidades

funcionais do tendatildeo (Khan et al 1999) Envolvendo os fasciacuteculos encontra-se

uma camada de tecido conectivo denominada endotendatildeo Essa camada conteacutem

estruturas nervosas vasculares e linfaacuteticas Agrupando os endotendotildees e

envolvendo o tendatildeo propriamente dito se encontra o epitendatildeo e mais

externamente o paratendatildeo que eacute a camada mais vascularizada Este uacuteltimo

pode se tornar uma camada dupla preenchida por liquido sinovial (bursa) em

tendotildees sujeitos a fricccedilatildeo

O arranjo em paralelo dessas fibras de colaacutegeno eacute adaptado para a funccedilatildeo do

tendatildeo que controla cargas tensionais unidirecionais De maneira distinta os

ligamentos possuem um arranjo entrelaccedilado pois podem controlar cargas

tensionais em vaacuterias direccedilotildees (Figura III) (Snell 1984)

14

Figura II ndash Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo (Adaptado de Silva amp Castro 2006)

Figura III ndash Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) (Adaptado de Snell 1984)

A baixa proporccedilatildeo de elastina eacute responsaacutevel pela baixa elasticidade do tendatildeo

sendo que seu comprimento aumenta em apenas 8 a 10 antes de atingir o ponto

de ruptura total (Figura IV) (Butler et al 1978) Isso eacute importante para funccedilatildeo do

tendatildeo pois se ele fosse mais elaacutestico poderia alongar-se com a contraccedilatildeo

muscular em vez de transmitir forccedila ao osso

A presenccedila de aacutegua e glicosaminoglicanos contribui para manter o espaccedilamento

entre as fibras de colaacutegeno facilitando o deslizamento entre elas E juntamente

com as fibras de colaacutegeno e elastina conferem ao tendatildeo sua propriedade

viscoelaacutestica na qual o tecido retorna ao seu tamanho original depois de algum

tempo apoacutes ser submetido a certo niacutevel de forccedila de deformaccedilatildeo (Taylor et al 1990) Alguns tendotildees apresentam zonas de hipovascularizaccedilatildeo (Carr 1989) embora

todos sejam nutridos suficientemente para promover o processo reparativo

Entretanto este processo eacute lento devido agrave baixa taxa metaboacutelica Dessa forma se

o tendatildeo natildeo tiver um tempo adequado de recuperaccedilatildeo capaz de equilibrar o

processo de siacutentese e degradaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno ele estaraacute entatildeo sujeito

a lesotildees (Riley 2004)

15

Figura IV ndash Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress (Adaptado de Butler et al 1978)

Tendinose

Atualmente haacute uma tendecircncia de diagnosticar clinicamente todas as lesotildees no

tendatildeo como tendinopatia reservando os termos tendinite tendinose eou

paratendinite apenas para anaacutelises histopatoloacutegicas (Maffulli et al 1998) No

entanto eacute certo que as lesotildees agudas que apresentam infiltrado inflamatoacuterio reativo

se comportam de maneira distinta das lesotildees crocircnicas degenerativas tanto na

gecircnese da doenccedila quanto na propedecircutica Portanto criteacuterios cliacutenicos mais precisos

satildeo necessaacuterios para que natildeo ocorram procedimentos terapecircuticos incorretos

A tendinose eacute generalizadamente caracterizada por degeneraccedilatildeo intratendiacutenea

e desorganizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno Macroscopicamente se apresenta como

uma degeneraccedilatildeo mucoacuteide com o tecido friaacutevel desorganizado e de cor

acastanhada Microscopicamente confirma-se que esta estrutura apresenta

desorganizaccedilatildeo e microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade com

arredondamento dos nuacutecleos (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento significativo de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo a quantidade de

colaacutegeno tipo I (Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) neovascularizaccedilatildeo (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1999 Szomor et al 2006) e apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007) Outras caracteriacutesticas patoloacutegicas

comumente presentes satildeo as adiposes fibrocartilaginoses e metaplasias oacutesseas

(Kannus amp Jozsa 1991 Riley et al 1996) Aleacutem dessas alteraccedilotildees morfoloacutegicas

pode-se observar um aumento da produccedilatildeo de glutamato (Alfredson et al 1999 Alfredson et al 2001) e uma maior expressatildeo de IGF-1 (Olesen et al 2006 Scott et al 2007) e oacutexido niacutetrico (Szomor et al 2006)

Os altos niacuteveis do neurotransmissor excitatoacuterio glutamato estatildeo relacionados

com a sensaccedilatildeo dolorosa (Alfredson et al 2001) A maior expressatildeo de IGF-1 eacute

considerada responsaacutevel por estimular a siacutentese de colaacutegeno a proliferaccedilatildeo celular

e o acuacutemulo de glicosaminoglicanos em resposta agraves cargas no entanto natildeo se sabe

se essa eacute uma resposta adaptativa ou patoloacutegica (Olesen et al 2006) Jaacute o papel

do oacutexido niacutetrico natildeo estaacute completamente claro Tem se associado altos niacuteveis dessa

16

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

Referecircncias Bibliograacuteficas

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lengthened positions Acta Physiol Scand 2003 177 473-481

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aetiopathogenesis of tendinopathy is it the over-stimulation or the under-

stimulation of tendon cells Int J Exp Pathol 2007 88 217ndash226

45

Sum aacute rio Paacutegina

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo 13

Tendinose 16

Modelos de induccedilatildeo a tendinose 19

Objetivos 22

Material e meacutetodos

Distribuiccedilatildeo dos grupos 23

Anaacutelise histoloacutegica 24

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetrica 25

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HE 25

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red 26

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian Blue 27

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNOR 27

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNEL 28

Anaacutelise estatiacutestica 28

Resultados 29

Discussatildeo 37

Conclusatildeo 44

Referecircncias Bibliograacuteficas 45

Apecircndice I (Selecionado entre os melhores pocircsteres do I Encontro de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Patologia da UFMG)55

Apecircndice II (Modelos experimentais de induccedilatildeo agrave tendinose por esforccedilo repetitivo - Revisatildeo de literatura)56

Apecircndice III (Experimental model of Achilles Tendinosis` induction A morphometrical study)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

12

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo

O tendatildeo eacute um conjunto de fibras colaacutegenas compactas que conectam o muacutesculo

ao osso Possui aproximadamente 70 de aacutegua com boa parte associada aos

glicosaminoglicanos da matriz extracelular (Riley et al 1994) Jaacute o colaacutegeno seu

constituinte baacutesico representa ateacute 95 do peso seco do tendatildeo sendo que uma

grande proporccedilatildeo se refere ao tipo I e o restante (menos de 10) ao tipo III

(Gross 1992 Rufai et al 1995) Aleacutem desses constituintes estaacute presente cerca

de 2 de elastina (Eyden amp Tzaphlidou 2001) e pequena quantidade de

colaacutegeno tipo IV (Ahtikoski et al 2003)

O colaacutegeno eacute formado pelo tropocolaacutegeno que por sua vez eacute formado por trecircs

cadeias peptiacutedicas helicoidais e espiraladas (Rich amp Crick 1961) (Figura I) Eacute

interessante ressaltar que a moleacutecula de tropocolaacutegeno eacute cerca de dez vezes

mais resistente que o tendatildeo (forccedila de resistecircncia secccedilatildeo transversa) Isso

porque as ligaccedilotildees intra-moleculares formam interaccedilotildees mais fortes do que as

interaccedilotildees inter-moleculares (Gustavson 1956) Dessa maneira as lesotildees

acontecem principalmente no niacutevel inter-molecular

Considerando as ligaccedilotildees inter-moleculares o colaacutegeno tipo I apresenta

interaccedilotildees mais resistentes agraves tensotildees com ligaccedilotildees estaacuteveis e natildeo-redutiacuteveis

que natildeo se organizam dinamicamente Por outro lado o colaacutegeno tipo III

apresenta interaccedilotildees menos resistentes agraves tensotildees com poucas ligaccedilotildees estaacuteveis

e redutiacuteveis que tecircm a capacidade de se organizar dinamicamente (Viidik et al 1982) O colaacutegeno tipo IV natildeo contribui para as caracteriacutesticas mecacircnicas do

tendatildeo

13

Figura I ndash Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 (Adaptado de Junqueira amp Carneiro 2004)

As moleacuteculas de tropocolaacutegeno se agrupam em feixes primaacuterios para formar as

microfibrilas e fibrilas (Figura II) Os grupos de feixes primaacuterios unem-se para

formar os fasciacuteculos ou feixes secundaacuterios essas satildeo as menores unidades

funcionais do tendatildeo (Khan et al 1999) Envolvendo os fasciacuteculos encontra-se

uma camada de tecido conectivo denominada endotendatildeo Essa camada conteacutem

estruturas nervosas vasculares e linfaacuteticas Agrupando os endotendotildees e

envolvendo o tendatildeo propriamente dito se encontra o epitendatildeo e mais

externamente o paratendatildeo que eacute a camada mais vascularizada Este uacuteltimo

pode se tornar uma camada dupla preenchida por liquido sinovial (bursa) em

tendotildees sujeitos a fricccedilatildeo

O arranjo em paralelo dessas fibras de colaacutegeno eacute adaptado para a funccedilatildeo do

tendatildeo que controla cargas tensionais unidirecionais De maneira distinta os

ligamentos possuem um arranjo entrelaccedilado pois podem controlar cargas

tensionais em vaacuterias direccedilotildees (Figura III) (Snell 1984)

14

Figura II ndash Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo (Adaptado de Silva amp Castro 2006)

Figura III ndash Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) (Adaptado de Snell 1984)

A baixa proporccedilatildeo de elastina eacute responsaacutevel pela baixa elasticidade do tendatildeo

sendo que seu comprimento aumenta em apenas 8 a 10 antes de atingir o ponto

de ruptura total (Figura IV) (Butler et al 1978) Isso eacute importante para funccedilatildeo do

tendatildeo pois se ele fosse mais elaacutestico poderia alongar-se com a contraccedilatildeo

muscular em vez de transmitir forccedila ao osso

A presenccedila de aacutegua e glicosaminoglicanos contribui para manter o espaccedilamento

entre as fibras de colaacutegeno facilitando o deslizamento entre elas E juntamente

com as fibras de colaacutegeno e elastina conferem ao tendatildeo sua propriedade

viscoelaacutestica na qual o tecido retorna ao seu tamanho original depois de algum

tempo apoacutes ser submetido a certo niacutevel de forccedila de deformaccedilatildeo (Taylor et al 1990) Alguns tendotildees apresentam zonas de hipovascularizaccedilatildeo (Carr 1989) embora

todos sejam nutridos suficientemente para promover o processo reparativo

Entretanto este processo eacute lento devido agrave baixa taxa metaboacutelica Dessa forma se

o tendatildeo natildeo tiver um tempo adequado de recuperaccedilatildeo capaz de equilibrar o

processo de siacutentese e degradaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno ele estaraacute entatildeo sujeito

a lesotildees (Riley 2004)

15

Figura IV ndash Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress (Adaptado de Butler et al 1978)

Tendinose

Atualmente haacute uma tendecircncia de diagnosticar clinicamente todas as lesotildees no

tendatildeo como tendinopatia reservando os termos tendinite tendinose eou

paratendinite apenas para anaacutelises histopatoloacutegicas (Maffulli et al 1998) No

entanto eacute certo que as lesotildees agudas que apresentam infiltrado inflamatoacuterio reativo

se comportam de maneira distinta das lesotildees crocircnicas degenerativas tanto na

gecircnese da doenccedila quanto na propedecircutica Portanto criteacuterios cliacutenicos mais precisos

satildeo necessaacuterios para que natildeo ocorram procedimentos terapecircuticos incorretos

A tendinose eacute generalizadamente caracterizada por degeneraccedilatildeo intratendiacutenea

e desorganizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno Macroscopicamente se apresenta como

uma degeneraccedilatildeo mucoacuteide com o tecido friaacutevel desorganizado e de cor

acastanhada Microscopicamente confirma-se que esta estrutura apresenta

desorganizaccedilatildeo e microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade com

arredondamento dos nuacutecleos (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento significativo de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo a quantidade de

colaacutegeno tipo I (Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) neovascularizaccedilatildeo (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1999 Szomor et al 2006) e apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007) Outras caracteriacutesticas patoloacutegicas

comumente presentes satildeo as adiposes fibrocartilaginoses e metaplasias oacutesseas

(Kannus amp Jozsa 1991 Riley et al 1996) Aleacutem dessas alteraccedilotildees morfoloacutegicas

pode-se observar um aumento da produccedilatildeo de glutamato (Alfredson et al 1999 Alfredson et al 2001) e uma maior expressatildeo de IGF-1 (Olesen et al 2006 Scott et al 2007) e oacutexido niacutetrico (Szomor et al 2006)

Os altos niacuteveis do neurotransmissor excitatoacuterio glutamato estatildeo relacionados

com a sensaccedilatildeo dolorosa (Alfredson et al 2001) A maior expressatildeo de IGF-1 eacute

considerada responsaacutevel por estimular a siacutentese de colaacutegeno a proliferaccedilatildeo celular

e o acuacutemulo de glicosaminoglicanos em resposta agraves cargas no entanto natildeo se sabe

se essa eacute uma resposta adaptativa ou patoloacutegica (Olesen et al 2006) Jaacute o papel

do oacutexido niacutetrico natildeo estaacute completamente claro Tem se associado altos niacuteveis dessa

16

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

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stimulation of tendon cells Int J Exp Pathol 2007 88 217ndash226

45

Introduccedilatildeo

Fisiologia do tendatildeo

O tendatildeo eacute um conjunto de fibras colaacutegenas compactas que conectam o muacutesculo

ao osso Possui aproximadamente 70 de aacutegua com boa parte associada aos

glicosaminoglicanos da matriz extracelular (Riley et al 1994) Jaacute o colaacutegeno seu

constituinte baacutesico representa ateacute 95 do peso seco do tendatildeo sendo que uma

grande proporccedilatildeo se refere ao tipo I e o restante (menos de 10) ao tipo III

(Gross 1992 Rufai et al 1995) Aleacutem desses constituintes estaacute presente cerca

de 2 de elastina (Eyden amp Tzaphlidou 2001) e pequena quantidade de

colaacutegeno tipo IV (Ahtikoski et al 2003)

O colaacutegeno eacute formado pelo tropocolaacutegeno que por sua vez eacute formado por trecircs

cadeias peptiacutedicas helicoidais e espiraladas (Rich amp Crick 1961) (Figura I) Eacute

interessante ressaltar que a moleacutecula de tropocolaacutegeno eacute cerca de dez vezes

mais resistente que o tendatildeo (forccedila de resistecircncia secccedilatildeo transversa) Isso

porque as ligaccedilotildees intra-moleculares formam interaccedilotildees mais fortes do que as

interaccedilotildees inter-moleculares (Gustavson 1956) Dessa maneira as lesotildees

acontecem principalmente no niacutevel inter-molecular

Considerando as ligaccedilotildees inter-moleculares o colaacutegeno tipo I apresenta

interaccedilotildees mais resistentes agraves tensotildees com ligaccedilotildees estaacuteveis e natildeo-redutiacuteveis

que natildeo se organizam dinamicamente Por outro lado o colaacutegeno tipo III

apresenta interaccedilotildees menos resistentes agraves tensotildees com poucas ligaccedilotildees estaacuteveis

e redutiacuteveis que tecircm a capacidade de se organizar dinamicamente (Viidik et al 1982) O colaacutegeno tipo IV natildeo contribui para as caracteriacutesticas mecacircnicas do

tendatildeo

13

Figura I ndash Moleacutecula de tropocolaacutegeno composta por trecircs cadeias peptiacutedicas sendo duas do tipo α1 e uma do tipo α2 (Adaptado de Junqueira amp Carneiro 2004)

As moleacuteculas de tropocolaacutegeno se agrupam em feixes primaacuterios para formar as

microfibrilas e fibrilas (Figura II) Os grupos de feixes primaacuterios unem-se para

formar os fasciacuteculos ou feixes secundaacuterios essas satildeo as menores unidades

funcionais do tendatildeo (Khan et al 1999) Envolvendo os fasciacuteculos encontra-se

uma camada de tecido conectivo denominada endotendatildeo Essa camada conteacutem

estruturas nervosas vasculares e linfaacuteticas Agrupando os endotendotildees e

envolvendo o tendatildeo propriamente dito se encontra o epitendatildeo e mais

externamente o paratendatildeo que eacute a camada mais vascularizada Este uacuteltimo

pode se tornar uma camada dupla preenchida por liquido sinovial (bursa) em

tendotildees sujeitos a fricccedilatildeo

O arranjo em paralelo dessas fibras de colaacutegeno eacute adaptado para a funccedilatildeo do

tendatildeo que controla cargas tensionais unidirecionais De maneira distinta os

ligamentos possuem um arranjo entrelaccedilado pois podem controlar cargas

tensionais em vaacuterias direccedilotildees (Figura III) (Snell 1984)

14

Figura II ndash Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo (Adaptado de Silva amp Castro 2006)

Figura III ndash Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) (Adaptado de Snell 1984)

A baixa proporccedilatildeo de elastina eacute responsaacutevel pela baixa elasticidade do tendatildeo

sendo que seu comprimento aumenta em apenas 8 a 10 antes de atingir o ponto

de ruptura total (Figura IV) (Butler et al 1978) Isso eacute importante para funccedilatildeo do

tendatildeo pois se ele fosse mais elaacutestico poderia alongar-se com a contraccedilatildeo

muscular em vez de transmitir forccedila ao osso

A presenccedila de aacutegua e glicosaminoglicanos contribui para manter o espaccedilamento

entre as fibras de colaacutegeno facilitando o deslizamento entre elas E juntamente

com as fibras de colaacutegeno e elastina conferem ao tendatildeo sua propriedade

viscoelaacutestica na qual o tecido retorna ao seu tamanho original depois de algum

tempo apoacutes ser submetido a certo niacutevel de forccedila de deformaccedilatildeo (Taylor et al 1990) Alguns tendotildees apresentam zonas de hipovascularizaccedilatildeo (Carr 1989) embora

todos sejam nutridos suficientemente para promover o processo reparativo

Entretanto este processo eacute lento devido agrave baixa taxa metaboacutelica Dessa forma se

o tendatildeo natildeo tiver um tempo adequado de recuperaccedilatildeo capaz de equilibrar o

processo de siacutentese e degradaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno ele estaraacute entatildeo sujeito

a lesotildees (Riley 2004)

15

Figura IV ndash Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress (Adaptado de Butler et al 1978)

Tendinose

Atualmente haacute uma tendecircncia de diagnosticar clinicamente todas as lesotildees no

tendatildeo como tendinopatia reservando os termos tendinite tendinose eou

paratendinite apenas para anaacutelises histopatoloacutegicas (Maffulli et al 1998) No

entanto eacute certo que as lesotildees agudas que apresentam infiltrado inflamatoacuterio reativo

se comportam de maneira distinta das lesotildees crocircnicas degenerativas tanto na

gecircnese da doenccedila quanto na propedecircutica Portanto criteacuterios cliacutenicos mais precisos

satildeo necessaacuterios para que natildeo ocorram procedimentos terapecircuticos incorretos

A tendinose eacute generalizadamente caracterizada por degeneraccedilatildeo intratendiacutenea

e desorganizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno Macroscopicamente se apresenta como

uma degeneraccedilatildeo mucoacuteide com o tecido friaacutevel desorganizado e de cor

acastanhada Microscopicamente confirma-se que esta estrutura apresenta

desorganizaccedilatildeo e microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade com

arredondamento dos nuacutecleos (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento significativo de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo a quantidade de

colaacutegeno tipo I (Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) neovascularizaccedilatildeo (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1999 Szomor et al 2006) e apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007) Outras caracteriacutesticas patoloacutegicas

comumente presentes satildeo as adiposes fibrocartilaginoses e metaplasias oacutesseas

(Kannus amp Jozsa 1991 Riley et al 1996) Aleacutem dessas alteraccedilotildees morfoloacutegicas

pode-se observar um aumento da produccedilatildeo de glutamato (Alfredson et al 1999 Alfredson et al 2001) e uma maior expressatildeo de IGF-1 (Olesen et al 2006 Scott et al 2007) e oacutexido niacutetrico (Szomor et al 2006)

Os altos niacuteveis do neurotransmissor excitatoacuterio glutamato estatildeo relacionados

com a sensaccedilatildeo dolorosa (Alfredson et al 2001) A maior expressatildeo de IGF-1 eacute

considerada responsaacutevel por estimular a siacutentese de colaacutegeno a proliferaccedilatildeo celular

e o acuacutemulo de glicosaminoglicanos em resposta agraves cargas no entanto natildeo se sabe

se essa eacute uma resposta adaptativa ou patoloacutegica (Olesen et al 2006) Jaacute o papel

do oacutexido niacutetrico natildeo estaacute completamente claro Tem se associado altos niacuteveis dessa

16

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

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45

As moleacuteculas de tropocolaacutegeno se agrupam em feixes primaacuterios para formar as

microfibrilas e fibrilas (Figura II) Os grupos de feixes primaacuterios unem-se para

formar os fasciacuteculos ou feixes secundaacuterios essas satildeo as menores unidades

funcionais do tendatildeo (Khan et al 1999) Envolvendo os fasciacuteculos encontra-se

uma camada de tecido conectivo denominada endotendatildeo Essa camada conteacutem

estruturas nervosas vasculares e linfaacuteticas Agrupando os endotendotildees e

envolvendo o tendatildeo propriamente dito se encontra o epitendatildeo e mais

externamente o paratendatildeo que eacute a camada mais vascularizada Este uacuteltimo

pode se tornar uma camada dupla preenchida por liquido sinovial (bursa) em

tendotildees sujeitos a fricccedilatildeo

O arranjo em paralelo dessas fibras de colaacutegeno eacute adaptado para a funccedilatildeo do

tendatildeo que controla cargas tensionais unidirecionais De maneira distinta os

ligamentos possuem um arranjo entrelaccedilado pois podem controlar cargas

tensionais em vaacuterias direccedilotildees (Figura III) (Snell 1984)

14

Figura II ndash Organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno no tendatildeo (Adaptado de Silva amp Castro 2006)

Figura III ndash Arranjo das fibras de colaacutegeno nos tendotildees (A) e nos ligamentos (B) (Adaptado de Snell 1984)

A baixa proporccedilatildeo de elastina eacute responsaacutevel pela baixa elasticidade do tendatildeo

sendo que seu comprimento aumenta em apenas 8 a 10 antes de atingir o ponto

de ruptura total (Figura IV) (Butler et al 1978) Isso eacute importante para funccedilatildeo do

tendatildeo pois se ele fosse mais elaacutestico poderia alongar-se com a contraccedilatildeo

muscular em vez de transmitir forccedila ao osso

A presenccedila de aacutegua e glicosaminoglicanos contribui para manter o espaccedilamento

entre as fibras de colaacutegeno facilitando o deslizamento entre elas E juntamente

com as fibras de colaacutegeno e elastina conferem ao tendatildeo sua propriedade

viscoelaacutestica na qual o tecido retorna ao seu tamanho original depois de algum

tempo apoacutes ser submetido a certo niacutevel de forccedila de deformaccedilatildeo (Taylor et al 1990) Alguns tendotildees apresentam zonas de hipovascularizaccedilatildeo (Carr 1989) embora

todos sejam nutridos suficientemente para promover o processo reparativo

Entretanto este processo eacute lento devido agrave baixa taxa metaboacutelica Dessa forma se

o tendatildeo natildeo tiver um tempo adequado de recuperaccedilatildeo capaz de equilibrar o

processo de siacutentese e degradaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno ele estaraacute entatildeo sujeito

a lesotildees (Riley 2004)

15

Figura IV ndash Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress (Adaptado de Butler et al 1978)

Tendinose

Atualmente haacute uma tendecircncia de diagnosticar clinicamente todas as lesotildees no

tendatildeo como tendinopatia reservando os termos tendinite tendinose eou

paratendinite apenas para anaacutelises histopatoloacutegicas (Maffulli et al 1998) No

entanto eacute certo que as lesotildees agudas que apresentam infiltrado inflamatoacuterio reativo

se comportam de maneira distinta das lesotildees crocircnicas degenerativas tanto na

gecircnese da doenccedila quanto na propedecircutica Portanto criteacuterios cliacutenicos mais precisos

satildeo necessaacuterios para que natildeo ocorram procedimentos terapecircuticos incorretos

A tendinose eacute generalizadamente caracterizada por degeneraccedilatildeo intratendiacutenea

e desorganizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno Macroscopicamente se apresenta como

uma degeneraccedilatildeo mucoacuteide com o tecido friaacutevel desorganizado e de cor

acastanhada Microscopicamente confirma-se que esta estrutura apresenta

desorganizaccedilatildeo e microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade com

arredondamento dos nuacutecleos (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento significativo de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo a quantidade de

colaacutegeno tipo I (Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) neovascularizaccedilatildeo (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1999 Szomor et al 2006) e apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007) Outras caracteriacutesticas patoloacutegicas

comumente presentes satildeo as adiposes fibrocartilaginoses e metaplasias oacutesseas

(Kannus amp Jozsa 1991 Riley et al 1996) Aleacutem dessas alteraccedilotildees morfoloacutegicas

pode-se observar um aumento da produccedilatildeo de glutamato (Alfredson et al 1999 Alfredson et al 2001) e uma maior expressatildeo de IGF-1 (Olesen et al 2006 Scott et al 2007) e oacutexido niacutetrico (Szomor et al 2006)

Os altos niacuteveis do neurotransmissor excitatoacuterio glutamato estatildeo relacionados

com a sensaccedilatildeo dolorosa (Alfredson et al 2001) A maior expressatildeo de IGF-1 eacute

considerada responsaacutevel por estimular a siacutentese de colaacutegeno a proliferaccedilatildeo celular

e o acuacutemulo de glicosaminoglicanos em resposta agraves cargas no entanto natildeo se sabe

se essa eacute uma resposta adaptativa ou patoloacutegica (Olesen et al 2006) Jaacute o papel

do oacutexido niacutetrico natildeo estaacute completamente claro Tem se associado altos niacuteveis dessa

16

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

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45

A baixa proporccedilatildeo de elastina eacute responsaacutevel pela baixa elasticidade do tendatildeo

sendo que seu comprimento aumenta em apenas 8 a 10 antes de atingir o ponto

de ruptura total (Figura IV) (Butler et al 1978) Isso eacute importante para funccedilatildeo do

tendatildeo pois se ele fosse mais elaacutestico poderia alongar-se com a contraccedilatildeo

muscular em vez de transmitir forccedila ao osso

A presenccedila de aacutegua e glicosaminoglicanos contribui para manter o espaccedilamento

entre as fibras de colaacutegeno facilitando o deslizamento entre elas E juntamente

com as fibras de colaacutegeno e elastina conferem ao tendatildeo sua propriedade

viscoelaacutestica na qual o tecido retorna ao seu tamanho original depois de algum

tempo apoacutes ser submetido a certo niacutevel de forccedila de deformaccedilatildeo (Taylor et al 1990) Alguns tendotildees apresentam zonas de hipovascularizaccedilatildeo (Carr 1989) embora

todos sejam nutridos suficientemente para promover o processo reparativo

Entretanto este processo eacute lento devido agrave baixa taxa metaboacutelica Dessa forma se

o tendatildeo natildeo tiver um tempo adequado de recuperaccedilatildeo capaz de equilibrar o

processo de siacutentese e degradaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno ele estaraacute entatildeo sujeito

a lesotildees (Riley 2004)

15

Figura IV ndash Comportamento biomecacircnico dos ligamentos e tendotildees ao stress (Adaptado de Butler et al 1978)

Tendinose

Atualmente haacute uma tendecircncia de diagnosticar clinicamente todas as lesotildees no

tendatildeo como tendinopatia reservando os termos tendinite tendinose eou

paratendinite apenas para anaacutelises histopatoloacutegicas (Maffulli et al 1998) No

entanto eacute certo que as lesotildees agudas que apresentam infiltrado inflamatoacuterio reativo

se comportam de maneira distinta das lesotildees crocircnicas degenerativas tanto na

gecircnese da doenccedila quanto na propedecircutica Portanto criteacuterios cliacutenicos mais precisos

satildeo necessaacuterios para que natildeo ocorram procedimentos terapecircuticos incorretos

A tendinose eacute generalizadamente caracterizada por degeneraccedilatildeo intratendiacutenea

e desorganizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno Macroscopicamente se apresenta como

uma degeneraccedilatildeo mucoacuteide com o tecido friaacutevel desorganizado e de cor

acastanhada Microscopicamente confirma-se que esta estrutura apresenta

desorganizaccedilatildeo e microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade com

arredondamento dos nuacutecleos (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento significativo de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo a quantidade de

colaacutegeno tipo I (Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) neovascularizaccedilatildeo (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1999 Szomor et al 2006) e apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007) Outras caracteriacutesticas patoloacutegicas

comumente presentes satildeo as adiposes fibrocartilaginoses e metaplasias oacutesseas

(Kannus amp Jozsa 1991 Riley et al 1996) Aleacutem dessas alteraccedilotildees morfoloacutegicas

pode-se observar um aumento da produccedilatildeo de glutamato (Alfredson et al 1999 Alfredson et al 2001) e uma maior expressatildeo de IGF-1 (Olesen et al 2006 Scott et al 2007) e oacutexido niacutetrico (Szomor et al 2006)

Os altos niacuteveis do neurotransmissor excitatoacuterio glutamato estatildeo relacionados

com a sensaccedilatildeo dolorosa (Alfredson et al 2001) A maior expressatildeo de IGF-1 eacute

considerada responsaacutevel por estimular a siacutentese de colaacutegeno a proliferaccedilatildeo celular

e o acuacutemulo de glicosaminoglicanos em resposta agraves cargas no entanto natildeo se sabe

se essa eacute uma resposta adaptativa ou patoloacutegica (Olesen et al 2006) Jaacute o papel

do oacutexido niacutetrico natildeo estaacute completamente claro Tem se associado altos niacuteveis dessa

16

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

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45

Tendinose

Atualmente haacute uma tendecircncia de diagnosticar clinicamente todas as lesotildees no

tendatildeo como tendinopatia reservando os termos tendinite tendinose eou

paratendinite apenas para anaacutelises histopatoloacutegicas (Maffulli et al 1998) No

entanto eacute certo que as lesotildees agudas que apresentam infiltrado inflamatoacuterio reativo

se comportam de maneira distinta das lesotildees crocircnicas degenerativas tanto na

gecircnese da doenccedila quanto na propedecircutica Portanto criteacuterios cliacutenicos mais precisos

satildeo necessaacuterios para que natildeo ocorram procedimentos terapecircuticos incorretos

A tendinose eacute generalizadamente caracterizada por degeneraccedilatildeo intratendiacutenea

e desorganizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno Macroscopicamente se apresenta como

uma degeneraccedilatildeo mucoacuteide com o tecido friaacutevel desorganizado e de cor

acastanhada Microscopicamente confirma-se que esta estrutura apresenta

desorganizaccedilatildeo e microruptura das fibras de colaacutegeno hipercelularidade com

arredondamento dos nuacutecleos (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento significativo de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo a quantidade de

colaacutegeno tipo I (Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) neovascularizaccedilatildeo (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1999 Szomor et al 2006) e apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007) Outras caracteriacutesticas patoloacutegicas

comumente presentes satildeo as adiposes fibrocartilaginoses e metaplasias oacutesseas

(Kannus amp Jozsa 1991 Riley et al 1996) Aleacutem dessas alteraccedilotildees morfoloacutegicas

pode-se observar um aumento da produccedilatildeo de glutamato (Alfredson et al 1999 Alfredson et al 2001) e uma maior expressatildeo de IGF-1 (Olesen et al 2006 Scott et al 2007) e oacutexido niacutetrico (Szomor et al 2006)

Os altos niacuteveis do neurotransmissor excitatoacuterio glutamato estatildeo relacionados

com a sensaccedilatildeo dolorosa (Alfredson et al 2001) A maior expressatildeo de IGF-1 eacute

considerada responsaacutevel por estimular a siacutentese de colaacutegeno a proliferaccedilatildeo celular

e o acuacutemulo de glicosaminoglicanos em resposta agraves cargas no entanto natildeo se sabe

se essa eacute uma resposta adaptativa ou patoloacutegica (Olesen et al 2006) Jaacute o papel

do oacutexido niacutetrico natildeo estaacute completamente claro Tem se associado altos niacuteveis dessa

16

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

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45

moleacutecula a processos degradativos mas tambeacutem tem se demonstrado repostas

cicatriciais Provavelmente o oacutexido niacutetrico tem um papel duplo que eacute determinado

pela sua concentraccedilatildeo (Szomor et al 2006)Clinicamente a tendinose se apresenta sensiacutevel agrave palpaccedilatildeo com dor nos

movimentos resistidos e incapacidade nas atividades relacionadas (Glazebrook et

al 2007) aleacutem de alteraccedilotildees nos exames de imagem especiacuteficos (Warden 2007) tais como Ultra-Som e Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica Como a doenccedila em seu

estaacutegio inicial eacute assintomaacutetica (Lake et al 2008) ela pode evoluir silenciosamente

e levar o tendatildeo a uma ruptura parcial ou total

Eacute importante ressaltar que natildeo se confirma a presenccedila de ceacutelulas inflamatoacuterias

em amostras colhidas tanto em humanos (Kalebo et al 1990 Kahn et al 1998) quanto em modelos experimentais (Glazebrook et al 2007 Scott et al 2007 Archambault et al 2007) Apesar de alguns genes proacute-inflamatoacuterios tais como

FLAP e COX-2 apresentarem expressatildeo aumentada em estaacutegio inicial da induccedilatildeo

em um modelo experimental (Perry et al 2005) eles retornaram aos niacuteveis

fisioloacutegicos nos estaacutegios mais avanccedilados

De acordo com essas consideraccedilotildees pode-se dizer que as tendinoses satildeo

condiccedilotildees predominantemente degenerativas e natildeo inflamatoacuterias Segundo Khan et

al (2000) se repetitivos mecanismos de sobrecarga podem causar microrupturas e

desgaste nas fibras tendinosas dando origem a degeneraccedilotildees locais com ausecircncia

de ceacutelulas inflamatoacuterias entatildeo essa patologia pode ser denominada como uma

tendinose

As lesotildees no tendatildeo foram a causa de mais de dois milhotildees de consultas nos

Estados Unidos em 2001 (Li et al 2007) Sendo que a tendinose representa

aproximadamente a metade de todas as patologias relacionadas ao trabalho nesse

paiacutes (Nakama et al 2006) No entanto a etiologia dessa doenccedila ainda natildeo eacute muito

clara sendo na maioria das vezes o resultado final de vaacuterios processos ndash

multifatorial (Organograma I) (Silva amp Campos 2006)

17

Carga tensilexcessiva

Erros de treinamento teacutecnicas eou equipamentos inadequados

Deacuteficit de flexibilidade Desequiliacutebrio muscular

Desalinhamento segmentar

Resultante de todos os fatoresOrganograma I ndash Etiologia multifatorial da tendinose

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

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45

Os fatores constituintes da lesatildeo podem ser intriacutensecos eou extriacutensecos Os

fatores intriacutensecos estatildeo relacionados com a funccedilatildeo exercida idade forccedila

muscular flexibilidade irrigaccedilatildeo peculiar atrito e compressotildees contra estruturas

adjacentes e com o trajeto anatocircmico e suas alteraccedilotildees Por exemplo 50 dos

casos de tendinose patelar proximal estatildeo significativamente associadas com o

movimento patelar anormal (Allen et al 1999) Jaacute os fatores extriacutensecos estatildeo

relacionados agraves doenccedilas sistecircmicas tabagismo erros no treinamento influecircncia

hormonal utilizaccedilatildeo de antibioacuteticos e principalmente agraves atividades por esforccedilos

repetitivos (overuse)

Overuse eacute um processo de esforccedilos repetitivos que pode ocasionar lesotildees

microtraumaacuteticas no tendatildeo Quando essas lesotildees superam a habilidade das

ceacutelulas tendinosas de regenerar o tecido haacute um desequiliacutebrio na taxa de

renovaccedilatildeo (turnover) do colaacutegeno com consequumlente degeneraccedilatildeo da matriz

tecidual (Jarvinen et al 1997) De acordo com Kannus (1997) o principal fator

causal da tendinose satildeo as lesotildees por overuse sendo que 30 a 50 de todas

as lesotildees no esporte apresentam essa etiologia (Sandmeir amp Renstrom 1997) com uma prevalecircncia de 14 da tendinose em atletas de elite (Lian et al 2007)Em 1995 Archambault et al propuseram uma representaccedilatildeo esquemaacutetica da

possiacutevel interaccedilatildeo entre o tendatildeo e o processo das lesotildees por overuse

18

Organograma II Representaccedilatildeo esquemaacutetica do processo das lesotildees por overuse no tendatildeo (adaptado de Archambault et al 1995)

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

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stimulation of tendon cells Int J Exp Pathol 2007 88 217ndash226

45

Tendo em vista essa alta incidecircncia e considerando que o tratamento

conservador pode durar ateacute seis meses (Khan et al 1999) haacute a necessidade de

um embasamento mais consistente sobre a patofisiologia da tendinose (Maganaris et al 2004 Scott et al 2007) Para isso os modelos de induccedilatildeo em animais

devem ser padronizados e sistematizados no que diz respeito a sua eficaacutecia

Modelos de induccedilatildeo agrave tendinose

Os modelos experimentais satildeo frequentemente utilizados e tecircm grande valor

dentro do cenaacuterio cientiacutefico pois permitem anaacutelises nos niacuteveis orgacircnicos teciduais

celulares e moleculares das doenccedilas (Lake et al 2008) Aleacutem disso o sucesso de

todo tratamento fiacutesico eou farmacoloacutegico depende direta ou indiretamente das

pesquisas realizadas com animais

Natildeo existe nenhum animal que possui as mesmas caracteriacutesticas dos

humanos ou seja natildeo haacute nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo ourordquo (Warden 2007) Entretanto os ratos tecircm sido bem utilizados em alguns modelos apresentando

resultados favoraacuteveis (Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Glazebrook et al 2007) Aleacutem disso eles satildeo mais faacuteceis de

manusear em uma cirurgia ou na extirpaccedilatildeo de um tecido e satildeo menos agressivos

que os camundongos

O sucesso de um modelo experimental depende diretamente da reproduccedilatildeo de

resultados consistentes com as condiccedilotildees humanas (Warden 2007) Nesse sentido

os modelos quiacutemicos de tendinose que utilizaram colagenase citocinas carreginina

ou prostaglandinas apresentaram resultados consistentes com a tendinite No

entanto natildeo tiveram sucesso como modelo para tendinose

Por outro lado os modelos que submeteram os animais a sobrecargas

repetidas no tendatildeo por longos periacuteodos apresentaram resultados mais

caracteriacutesticos da tendinose Entre esses alguns utilizaram contraccedilatildeo induzida por

eletro-estimuladores (Backman et al 1990 Messner et al 1999 Archambault et

al 2001 Nakama et al 2005) enquanto outros realizaram contraccedilatildeo muscular

ativa para a sobrecarga imposta (Sommer 1987 Carpenter et al 1998 Soslowsky et al 2000 Soslowsky et al 2002 Huang et al 2004) Apesar dos

modelos que utilizaram contraccedilatildeo induzida por eletro-estimulaccedilatildeo serem mais

padronizados em relaccedilatildeo ao nuacutemero de contraccedilotildees e agrave carga imposta ao tendatildeo

19

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

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45

eles apresentaram pouca similaridade agrave evoluccedilatildeo da tendinose em humanos uma

vez que os animais estatildeo sob anestesia e todo o metabolismo se encontra alterado

Aleacutem disso nesses modelos os animais estatildeo livres das forccedilas de reaccedilatildeo impostas

pelo solo que eacute um importante fator biomecacircnico capaz de contribuir para a induccedilatildeo

das lesotildees por esforccedilo repetitivo Jaacute os modelos de tendinose que utilizaram induccedilatildeo

ativa atraveacutes de esforccedilos repetitivos demonstraram ser mais fisioloacutegicos seguros e

praacuteticos remetendo com mais fidedignidade ao que realmente acontece no

desenvolvimento cliacutenico da doenccedila sem nenhum sofrimento aparente aos animais

(Silva et al 2008)Soslowsky et al (2000) propuseram um modelo para induccedilatildeo agrave tendinose do

supra-espinhoso em trinta e seis ratos machos Sprague-Dawley com peso meacutedio de

521 gramas O protocolo consistia em corrida em uma esteira adaptada para ratos

com decliacutenio de 10ordm numa velocidade de 17mmin (028 ms ou 1 kmh) por 16

semanas 5 vezes semanais 1 hora por dia Este protocolo foi aplicado apoacutes 2

semanas de treino em velocidade e tempo menores para adaptaccedilatildeo dos ratos agrave

corrida e agrave esteira As anaacutelises foram realizadas na quarta oitava e deacutecima sexta

semana com um n=12 para todos esses grupos e n=10 para o grupo controle De

acordo com esse trabalho alteraccedilotildees histopatoloacutegicas e biomecacircnicas foram

encontradas jaacute na quarta semana As alteraccedilotildees histopatoloacutegicas consistiram em um

aumento da matriz celular e uma perda na organizaccedilatildeo longitudinal das fibras de

colaacutegeno Apesar dessas alteraccedilotildees terem sido discretas elas satildeo compatiacuteveis com

os achados em tendinoses humanas Aleacutem disso um aumento contiacutenuo da aacuterea de

secccedilatildeo transversa (plt001) dos tendotildees foi observado As alteraccedilotildees biomecacircnicas

consistiram em dano agrave elasticidade e diminuiccedilatildeo da carga suportada ateacute o ponto de

ruptura (plt0007) Esses resultados sugerem que o exerciacutecio por overuse sem

alteraccedilotildees intriacutensecas ou extriacutensecas induzidas realizado por 16 semanas eacute um

fator etioloacutegico para o desenvolvimento da tendinose em supra-espinhoso de ratos

Huang et al (2004) utilizaram o modelo proposto por Soslowsky et al (2000) para induccedilatildeo da tendinose em tendotildees de Aquiles de trinta ratos machos Sprague-

Dawley Sendo assim os mesmos paracircmetros metodoloacutegicos de induccedilatildeo foram

abordados com a pequena diferenccedila de o primeiro grupo experimental ter sido

analisado na segunda semana e natildeo na quarta No entanto a intenccedilatildeo de obter os

mesmos resultados em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees geomeacutetricas e das propriedades

biomecacircnicas foi falha pois nenhuma das alteraccedilotildees observadas foi significativa

20

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

Referecircncias Bibliograacuteficas

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aetiopathogenesis of tendinopathy is it the over-stimulation or the under-

stimulation of tendon cells Int J Exp Pathol 2007 88 217ndash226

45

Uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio de 10ordm para priorizar a

contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural De certa forma essa relaccedilatildeo eacute apropriada

quando se diz respeito agrave induccedilatildeo da tendinose do supra-espinhoso como foi visto

por Soslowsky et al (2000) Entretanto essa relaccedilatildeo parece natildeo ter implicaccedilatildeo nos

tendotildees de Aquiles Ou seja para diferentes tendotildees protocolos distintos de

induccedilatildeo devem ser utilizados com mudanccedilas na frequumlecircncia intensidade eou

duraccedilatildeo da exposiccedilatildeo ao exerciacutecio desencadeante

Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi avaliar microscoacutepica e

morfometricamente os diversos eventos envolvidos na patogenia e evoluccedilatildeo da

tendinose de Aquiles utilizando um modelo de induccedilatildeo por contraccedilatildeo ativa agrave

sobrecarga imposta em ratos machos adultos

21

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

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45

ObjetivosGeral

I O objetivo desse trabalho foi descrever analisar e sistematizar os eventos

patoloacutegicos envolvidos na gecircnese e evoluccedilatildeo da tendinose de Aquiles

utilizando um modelo para induccedilatildeo por overuse em ratos machos Wistar

Especiacuteficos

II Adaptar o modelo de induccedilatildeo agrave tendinose proposto Soslowsky et al (2000) ao tendatildeo de Aquiles

III Analisar microscoacutepica e morfometricamente a evoluccedilatildeo da tendinose de

Aquiles em ratos machos Wistar relacionando a cascata de alteraccedilotildees com a

patogenia

IV Avaliar a celularidade bem como a ativaccedilatildeo e a apoptose celular na

tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

V Quantificar a composiccedilatildeo da matriz extracelular no que se refere ao processo

de colagenizaccedilatildeo o percentual de micro-rupturas e a quantidade de

glicosaminoglicanos na tendinose de Aquiles de ratos machos Wistar

22

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

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45

Material e meacutetodosDistribuiccedilatildeo dos gruposPara viabilizaccedilatildeo dessa pesquisa foram necessaacuterios trinta ratos machos Wistar

com 12 semanas de idade e peso inicial padronizado entre 220 e 240 gramas

para que natildeo houvesse sobrecarga adicional em nenhum animal Primeiramente

os trinta ratos foram divididos aleatoriamente em Grupo experimental (n=15) e

Grupo controle (n=15) Posteriormente cada grupo foi dividido nos seguintes

intervalos de tempo quatro oito e dezesseis semanas Sendo que em cada

intervalo cinco animais do grupo experimental e cinco do grupo controle seratildeo

analisados (Organograma III)

O grupo experimental realizou o protocolo de Soslowsky et al (2000) adaptado para tendatildeo de Aquiles Portanto a sobrecarga imposta consistiu em

corrida por quatro oito e dezesseis semanas cinco vezes por semana durante 80

minutos diaacuterios com velocidade de 268 mmin sendo os primeiros 10 minutos em

velocidade progressiva e os uacuteltimos 10 em regressiva A progressatildeo da velocidade

no iniacutecio determinou o aquecimento para a praacutetica do exerciacutecio e a regressatildeo no

final determinou a diminuiccedilatildeo do metabolismo de maneira gradual (Figura V)

Wistar machosn = 30

Grupo Experimentaln = 15

Grupo Controlen = 15

4ordf Semanan = 5

4ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

8ordf Semanan = 5

16ordf Semanan = 5

23

Organograma III Desenho de estudo do experimento

BA

Figura V ndash Visatildeo anterior (A) e lateral (B) dos animais correndo

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

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stimulation of tendon cells Int J Exp Pathol 2007 88 217ndash226

45

Os ratos correram em uma esteira (WESLO - Cadence 840) especialmente

adaptada com capacidade para ateacute oito animais Eles permaneciam em um

compartimento de vidro com separaccedilatildeo individual na qual tinha material metaacutelico

em sua parte posterior A esse material foi acoplado um eletro-estimulador

(IBRAMED - Neurodyn) que utilizado em baixa intensidade foi responsaacutevel por

impedir que o animal parasse de correr Aleacutem disso a esteira tambeacutem foi

posicionada com uma inclinaccedilatildeo de 10ordm (Figura VI) O protocolo foi aplicado

posteriormente a um treinamento de duas semanas nas mesmas condiccedilotildees exceto

a velocidade que foi de 134 mmin

O grupo controle realizou atividades cotidianas tais como andar alimentar e

dormir Eacute importante ressaltar que em suas gaiolas natildeo houve dispositivo que

pudesse submeter os animais agrave atividade fiacutesica

Todos os grupos tiveram livre acesso a aacutegua e comida

Anaacutelise histoloacutegicaOs animais foram submetidos agrave eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 para

que os tendotildees de Aquiles direito e esquerdo fossem extirpados O projeto foi

aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal (CETEA) da UFMG e o

nuacutemero do parecer eacute 18906

Apoacutes a confirmaccedilatildeo da eutanaacutesia por verificaccedilatildeo dos dados vitais todo o

triacuteceps sural foi dissecado e a extirpaccedilatildeo se deu ao niacutevel da inserccedilatildeo no calcacircneo e

da junccedilatildeo miotendiacutenea Apoacutes essa etapa os tendotildees foram fixados em formol

24

A BFigura VI ndash Visatildeo lateral (A) e posterior (B) da esteira adaptada especialmente para os ratos

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

39

Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

40

Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

41

Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

42

trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

43

Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

44

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45

tamponado neutro a 10 por 48 a 72 horas e processados manualmente da

seguinte maneira

- aacutelcool 70 - aacutelcool 80 - aacutelcool 90- aacutelcool absoluto I - aacutelcool absoluto II

- xilol - parafina (banho)

- inclusatildeo em parafina

O tendatildeo foi posicionado longitudinalmente no processo de inclusatildeo em

parafina Em seguida foram obtidas vaacuterias secccedilotildees de 5microm de cada tendatildeo incluiacutedo

em parafina para coloraccedilatildeo Foram realizadas as coloraccedilotildees de Hematoxilina-Eosina

(HE) Picrosirius Red Alcian Blue AgNOR e a reaccedilatildeo de TUNEL

Paracircmetros e estrateacutegia morfomeacutetricaApoacutes a coloraccedilatildeo as imagens de cada lacircmina foram captadas por uma cacircmera

digital (Sony DSC-W7 72 Mega Pixels) no microscoacutepio de luz Olympus BX41 com

objetivas planacromaacutetica de 10 e 40x Em seguida as imagens foram transferidas

para o computador para realizar a morfometria Para cada alteraccedilatildeo ocorrida nas

vaacuterias coloraccedilotildees estudadas foi realizada uma abordagem morfomeacutetrica diferente

dependendo do objetivo da marcaccedilatildeo Para a quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica das

aacutereas utilizou-se o programa Kontron KS300 versatildeo 20 (Kontron Elektronics Carl

Zeiss) Para a quantificaccedilatildeo das ceacutelulas utilizou-se o programa Media Cybernetics

Image Pro-Plus (Media Cybernetics - Version 45029)

Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica do tendatildeo atraveacutes da HEPara a quantificaccedilatildeo das alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo foi realizado a

coloraccedilatildeo de HE Essa avaliaccedilatildeo teve como objetivo identificar os achados

caracteriacutesticos das tendinoses de humanos tais como hipercelularidade e micro-

rupturas (Schepsis et al 2002) Desta maneira foi obtida uma imagem digitalizada

de um campo histoloacutegico em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x

da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo para realizar a quantificaccedilatildeo

densitomeacutetrica da celularidade e das micro-rupturas O mesmo criteacuterio foi usado

25

1 hora cada

30 minutos cada

para ambos os grupos controle e experimental excluindo as imagens da ecircntese e

da junccedilatildeo miotendiacutenea

Para quantificar a celularidade foi elaborado o seguinte iacutendice celular (IC)

Para quantificar o percentual de micro-rupturas dividiu-se a aacuterea de lacunas

intertisciais entre as fibras de colaacutegeno pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo de acordo

com a seguinte foacutermula

Avaliaccedilatildeo dos tipos de colaacutegeno atraveacutes do Picrosirius Red Para a quantificaccedilatildeo dos diferentes tipos de colaacutegeno da matriz extracelular do

tendatildeo se utilizou o Picrosirius Red um composto aniocircnico que distingue a

espessura e densidade das fibras de colaacutegeno pela coloraccedilatildeo emitida sob a luz

polarizada Enquanto as fibras finas dissociadas tiacutepicas do colaacutegeno tipo III satildeo

esverdeadas as fibras mais grossas fortemente associadas do colaacutegeno tipo I

emitem cores com comprimento de ondas maiores como vermelho e amarelo

(Kesler et al 2000) De cada lacircmina corada em Picrosirius Red foi obtida uma imagem digitalizada

em microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x utilizando-se de filtros

de luz polarizada da regiatildeo central do eixo longitudinal do tendatildeo Apoacutes a captura

realizou-se a binarizaccedilatildeo da imagem real (Figura VII) para possibilitar o somatoacuterio

das regiotildees ocupadas por fibras que conteacutem ldquopixelsrdquo da mesma densidade A

metodologia empregada para segmentaccedilatildeo das imagens definiccedilatildeo das condiccedilotildees

morfomeacutetricas e obtenccedilatildeo das medidas foram descritas por Caliari (1997) A

quantificaccedilatildeo das aacutereas ocupadas pelos diferentes tipos de colaacutegeno se deu da

seguinte maneira

26

IC = (sum de tenoacutecitos aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

micro-rupturas = (sum lacunas intersticiais aacuterea relativa do tendatildeo) x100

Aacuterea de colaacutegeno = (sum regiotildees com fibras de mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

Avaliaccedilatildeo dos glicosaminoglicanos atraveacutes do Alcian BluePara quantificar o percentual de glicosaminoglicanos realizou-se a coloraccedilatildeo de

Alcian Blue em um pH de 25 com contra-coloraccedilatildeo nuclear em Vermelho neutro De

cada lacircmina corada foi obtida uma imagem digitalizada de um campo histoloacutegico em

microscoacutepio de luz com objetiva planacromaacutetica de 10x da regiatildeo central do eixo

longitudinal do tendatildeo A quantificaccedilatildeo densitomeacutetrica se deu atraveacutes da

identificaccedilatildeo das regiotildees ocupadas pelos glicosaminoglicanos que possuiacuteam

ldquopixelsrdquo da mesma densidade Apoacutes subsequente binarizaccedilatildeo a aacuterea dessas regiotildees

foi somada e divida pela aacuterea ocupada pelo tendatildeo obtendo o percentual de

glicosaminoglicanos de acordo com a foacutermula

Avaliaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes do AgNORPara quantificar a expressatildeo da ativaccedilatildeo celular foi realizado a coloraccedilatildeo de

AgNOR O objetivo dessa coloraccedilatildeo foi identificar as regiotildees organizadoras de

nucleacuteolos atraveacutes da impregnaccedilatildeo pela prata pois cada gracircnulo de AgNOR pode

ser considerado como uma unidade ativa de transcriccedilatildeo do DNA (Ploton et al 1986) A quantificaccedilatildeo da marcaccedilatildeo dessas unidades foi feita a partir de imagens

digitalizadas obtidas de amostras dos campos histoloacutegicos em microscoacutepio de luz

com objetiva planacromaacutetica de 40x Para o iacutendice de ativaccedilatildeo celular (IAC)

realizou-se a meacutedia aritmeacutetica das AgNORs de 100 fibroblastos de campos

selecionados aleatoriamente dos trecircs intervalos considerados tanto no grupo

experimental quanto no grupo controle

27

Figura VII ndash Binarizaccedilatildeo de uma imagem do tendatildeo

de GAGs = (sum regiotildees com mesmo pixel aacuterea relativa do tendatildeo) x 100

IAC = sum regiotildees organizadoras de nucleacuteolo de 100 fibroblastos 100

Avaliaccedilatildeo da apoptose atraveacutes da reaccedilatildeo de TUNELPara quantificar a marcaccedilatildeo das ceacutelulas em apoptose foi realizada a reaccedilatildeo de

TUNEL Essa reaccedilatildeo tem como objetivo detectar in situ a fragmentaccedilatildeo do genoma

na apoptose (Gavrieli et al 1992) A teacutecnica combina princiacutepios histoquiacutemicos e

imuno-histoquiacutemicos e eacute aplicada em corte de tecido embebido em parafina

identificando ceacutelulas apoptoacuteticas Os nucleotiacutedeos marcados inseridos satildeo

posteriormente identificados como grumos amarronzados (Gavrieli et al 1992) a

partir da reaccedilatildeo da diaminobenzidina com a peroxidase Para tal foi utilizado o kit da

Oncogene (DNA Fragmentation Detection Kit)

A quantificaccedilatildeo das ceacutelulas apoptoacuteticas levou em consideraccedilatildeo a morfologia

sugestiva da apoptose (Vasconcelos 2001) Os corpos apoptoacuteticos quando

inuacutemeros e proacuteximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma

uacutenica ceacutelula em apoptose Quando distantes entre si foram considerados como

resultado de apoptose em ceacutelulas diferentes e contabilizados como tal

Anaacutelise estatiacutestica Os resultados foram apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo ou mediana

conforme tenham obtido respectivamente uma distribuiccedilatildeo normal ou natildeo pelo

teste de Kolmogorov-Smirnov Para os resultados que demonstraram normalidade

foi utilizado o teste t de Student para comparar dois grupos dentro do mesmo

intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs intervalos dentro

grupo experimental ou controle a anaacutelise de variacircncia ANOVA com poacutes-teste de

muacuteltipla comparaccedilatildeo Newman Keuls Para os resultados que natildeo demonstraram

normalidade foi utilizado o teste t natildeo parameacutetrico para comparar dois grupos

dentro do mesmo intervalo de tempo e para comparar os resultados dos trecircs

intervalos dentro grupo experimental ou controle o teste de Kruskal Wallis com

poacutes-teste de muacuteltipla comparaccedilatildeo de Dunn Os valores de Plt005 foram

considerados significativos

28

Resultados

Para as alteraccedilotildees histopatoloacutegicas do tendatildeo duas anaacutelises morfomeacutetricas

envolvendo celularidade e organizaccedilatildeo das fibras de colaacutegeno foram realizadas

atraveacutes da HE Os resultados de ambas as anaacutelises demonstraram distribuiccedilatildeo

normal

A densidade celular aumentou nos grupos experimentais (Figura VIII) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela I) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico I)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 061 plusmn 005 (Aa) 092 plusmn 006 (Ba) lt 0018 semanas 058 plusmn 006 (Aa) 085 plusmn 004 (Ba) lt 00516 semanas 053 plusmn 006 (Aa) 082 plusmn 004 (Ba) lt 001

29

A B

Figura VIII ndash Diferenccedila da densidade celular entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da quarta semana HE objetiva de 10x

Tabela IMeacutedia plusmn erro padratildeo da densidade celular no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

As lacunas intersticiais aumentaram nos grupos experimentais como

constatado pela anaacutelise densitomeacutetrica das fibras de colaacutegeno (Figura IX) em todos

os intervalos de tempo Essa diferenccedila foi estatisticamente significativa em cada

intervalo (Tabela II) No entanto natildeo houve diferenccedila significativa dentro dos grupos

experimentais e controles com a evoluccedilatildeo do protocolo (Graacutefico II)

30

A B

Graacutefico IEvoluccedilatildeo da densidade celular no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Figura IX ndash Diferenccedila do percentual de lacunas intersticiais entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana HE objetiva de 10x

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 37 plusmn 079 (Aa) 993 plusmn 155 (Ba) lt 0018 semanas 381 plusmn 087 (Aa) 116 plusmn 259 (Ba) lt 00116 semanas 444 plusmn 056 (Aa) 1213 plusmn 103 (Ba) lt 0001

O colaacutegeno tipo III aumentou no grupo experimental em relaccedilatildeo ao grupo

controle em todos os intervalos de tempo (Graacutefico III) Essa diferenccedila foi

estatisticamente significativa em cada intervalo (Tabela III)

31

ExperimentalControle

Tabela IIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo controle e experimental

Graacutefico II Evoluccedilatildeo do percentual de lacunas intersticiais no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Graacutefico IIIEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo experimental e controle ao decorrer

do protocolo

Tabela IIIMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de colaacutegeno tipo III no grupo controle e experimental

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 657 plusmn 306 (Aa) 434 plusmn 384 (Ba) lt 00018 semanas 671 plusmn 284 (Aa) 5045 plusmn 42 (Bab) lt 0000116 semanas 496 plusmn 132 (Aa) 596 plusmn 241 (Bb) lt 00001

Ao longo dos trecircs intervalos natildeo houve diferenccedila no percentual de colaacutegeno

tipo III e tipo I no grupo controle (Graacutefico IV) No entanto no grupo experimental

houve um aumento significativo de colaacutegeno tipo III da quarta para deacutecima sexta

semana (Plt005) (Graacutefico V) A Figura X evidencia claramente o acuacutemulo de

colaacutegeno tipo III detectado pelas aacutereas esverdeadas com o decorrer do protocolo

32

Graacutefico IVEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo controle ao decorrer do

protocolo

Graacutefico VEvoluccedilatildeo do percentual de colaacutegeno tipo I e tipo III no grupo experimental ao decorrer do

protocolo

Colaacutegeno tipo I Colaacutegeno tipo III

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

O percentual de glicosaminoglicanos aumentou significativamente em todos os

grupos experimentais (Graacutefico VII) em relaccedilatildeo aos controles em todos os periodos

avaliados (Tabela IV) Dentro do grupo experimental os resultados da deacutecima sexta

semana tambeacutem apresentaram diferenccedila estatiacutestica em relaccedilatildeo aos da quarta e

oitava semana (Plt005)

33

BA CFigura X ndash Aumento de colaacutegeno tipo III com o decorrer do protocolo ndash quarta semana (A) oitava

semana (B) e deacutecima sexta semana (C) ndash detectado pelas aacutereas esverdeadas Picrosirius Red sob luz polarizada objetiva de 10x

Graacutefico VIEvoluccedilatildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo experimental e controle nos trecircs

intervalos de tempo

Grupo controleGrupo

experimentalValor de P

4 semanas 397 plusmn 071 (Aa) 833 plusmn 117 (Ba) lt 0018 semanas 419 plusmn 075 (Aa) 912 plusmn 117 (Ba) lt 00116 semanas 384 plusmn 066 (Aa) 1253 plusmn 156 (Bb) lt 001

A Figura XI apresenta diferentes densidades de aacutereas azuladas evidenciado

maior quantidade de glicosaminoglicanos depositados na matriz dos tendotildees do

grupo experimental (B) em relaccedilatildeo ao controle (A)

As regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (AgNOR) aumentaram nos fibroblastos

do grupo experimental (mediana = 4 grumosnuacutecleo) em todos os intervalos de

tempo em relaccedilatildeo ao grupo controle (mediana = 2 grumosnuacutecleo) A diferenccedila entre

os grupos foi considerada estaticamente significativa (Plt00001) embora natildeo tenha

havido diferenccedila entre os periacuteodos do grupo controle e experimental As Figuras XII e XIII demonstram a maior carga de grumos de AgNOR nos nuacutecleos das ceacutelulas do

grupo experimental que no controle Outro fato que chama a atenccedilatildeo eacute a maior

quantidade de ceacutelulas marcadas no grupo experimental que tambeacutem se apresentou

com maior celularidade

34

Tabela IVMeacutedia plusmn erro padratildeo do percentual de glicosaminoglicanos no grupo controle e experimental

BAFigura XI ndash Diferenccedila da deposiccedilatildeo de glicosaminoglicanos evidenciado como aacutereas densamente azuladas entre um tendatildeo controle (A) e experimental (B) da deacutecima sexta semana Alcian Blue

objetiva de 10x

Nota O valor de P e as letras maiuacutesculas correspondem a comparaccedilotildees entre colunas (entre os grupos controle e experimental) e minuacutesculas entre linhas (entre os trecircs intervalos de tempo)

A apoptose foi mais intensa no grupo experimental (Figura XIV) que no

controle No entanto durante o protocolo da reaccedilatildeo grande parte do material que

seria analisado desprendeu-se da lacircmina impossibilitando a contagem da marcaccedilatildeo

pelo pequeno nuacutemero de imagens obtidas Portanto esse eacute uma avaliaccedilatildeo

qualitativa dos resultados

35

Figura XII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo experimental Em detalhe a grande quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

Figura XIII ndash Expressatildeo das AgNORs no grupo controle Em detalhe a pequena quantidade de marcaccedilotildees intranuclear AgNOR objetiva de 40x

36

BAFigura XIV ndash Diferenccedila da quantidade de marcaccedilatildeo para apoptose entre um tendatildeo controle (A) e

experimental (B) TUNEL objetiva de 40x

Discussatildeo

Os resultados obtidos neste trabalho natildeo destoam das caracteriacutesticas

histopatoloacutegicas da tendinose encontradas em humanos e em outros modelos

similares aumento da densidade celular e maior quantidade densitomeacutetrica das

lacunas intersticiais (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) aumento

da presenccedila de colaacutegeno tipo III em relaccedilatildeo agrave quantidade de colaacutegeno tipo I

(Maffulli et al 2000 Ireland et al 2001 Jones et al 2006) aumento da

quantidade de glicosaminoglicanos (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) maior atividade celular (Scott et al 2007) e maior nuacutemero

de ceacutelulas em apoptose (Yuan et al 2002 Yuan et al 2003 Tuoheti et al 2005 Lian et al 2007)

Em relaccedilatildeo agrave densidade celular houve um aumento significativo no grupo

experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt005) e deacutecima sexta (Plt001) semana

quando comparada com o grupo controle No entanto natildeo houve diferenccedila entre os

intervalos de tempo Isso demonstra que jaacute inicialmente haacute um crescimento da

densidade celular que natildeo se altera com a contiacutenua exposiccedilatildeo ao fator agressivo O

aumento da densidade celular entretanto jaacute foi tambeacutem descrito e discutido por

inuacutemeros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007)

Em relaccedilatildeo agraves lacunas intersticiais verificou-se um aumento significativo no

grupo experimental da quarta (Plt001) oitava (Plt001) e deacutecima sexta (Plt0001)

semana sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Pode-se inferir que

essas lacunas representam micro-rupturas entre as fibras de colaacutegeno como jaacute foi

elucidado por outros autores (Khan et al 1998 Soslowsky et al 2000 Cook et

al 2001 Kader et al 2002 Maffulli amp Kader 2002 Soslowsky et al 2002 Maffulli et al 2003 Cook et al 2004 Nakama et al 2005 Glazebrook et al 2007) Portanto essas micro-rupturas natildeo aumentam significativamente com a

permanecircncia da sobrecarga

37

Essas micro-rupturas satildeo consequecircncias da fraqueza mecacircnica do tendatildeo Tal

condiccedilatildeo pode ser confirmada pela grande quantidade de colaacutegeno tipo III (menos

resistente agraves tensotildees) encontrada no grupo experimental da quarta (Plt0001) oitava

(Plt00001) e deacutecima sexta (Plt00001) semana Neste uacuteltimo periacuteodo jaacute ocorria

predominacircncia do colaacutegeno tipo III alcanccedilando quase 60 da quantidade total de

fibras colaacutegenas do tendatildeo e apresentando diferenccedila estatiacutestica com o grupo

experimental da quarta semana (Plt005) Maffulli et al (2000) reportaram que

culturas de fibroblastos provenientes de tendotildees de Aquiles rompidos produzem

mais colaacutegeno tipo III que tendotildees fisioloacutegicos Ireland et al (2001) e Jones et al (2006) tambeacutem demonstraram uma maior expressatildeo gecircnica para o colaacutegeno tipo III

nas tendinoses Isso demonstra que o tecido tem uma tendecircncia a reduzir sua forccedila

de resistecircncia ao estresse contiacutenuo ficando cada vez mais propenso a uma ruptura

parcial ou total

Em relaccedilatildeo aos glicosaminoglicanos houve um aumento significativo no grupo

experimental (Plt001) em todos os intervalos quando comparada com o grupo

controle Este aumento foi gradual com o decorrer do protocolo apresentando

diferenccedila estatiacutestica entre a quarta e a deacutecima sexta semana (Plt005) do grupo

experimental A maior produccedilatildeo de glicosaminoglicanos tambeacutem foi reportada por

outros autores (Riley et al 1994 Potter et al 1995 Fu et al 2007 Scott et al 2007) e ela pode ser considerada uma resposta fundamental para contribuir com a

manutenccedilatildeo das propriedades viscoelaacutesticas do tendatildeo jaacute que natildeo apresenta uma

funccedilatildeo de transmissatildeo de forccedilas (Screen et al 2005) A marcaccedilatildeo da atividade celular atraveacutes da contagem das regiotildees

organizadoras de nucleacuteolo demonstrou um aumento das unidades ativas de

transcriccedilatildeo do DNA no grupo experimental (Plt00001) em relaccedilatildeo ao grupo controle

sem diferenccedila estatiacutestica entre os intervalos de tempo Scott et al (2007) tambeacutem

demonstraram um aumento da atividade celular atraveacutes da proliferaccedilatildeo (mitose) dos

tenoacutecitos Esses resultados vecircm a corroborar com os outros achados desse

trabalho jaacute que um tecido que apresenta ceacutelulas conteacutendo o dobro de unidades

ativas de transcriccedilatildeo em seu nuacutecleo quando comparado com seu fisioloacutegico deveraacute

exibir consequentemente maior densidade celular e maior quantidade de matriz

extracelular nesse caso fibras de colaacutegeno e glicosaminoglicanos

As ceacutelulas apoptoacuteticas aumentaram no grupo experimental em relaccedilatildeo ao

grupo controle No entanto natildeo foi possiacutevel realizar o iacutendice apoptoacutetico pois poucas

38

imagens foram obtidas devido ao desprendimento do material da lacircmina durante o

processo da reaccedilatildeo Estas dificuldades de processamento tambeacutem foram relatadas

por Glazebrook et al (2007) que tiveram problemas com o material durante as

reaccedilotildees imuno-histoquiacutemicas Por outro lado Tuoheti et al (2005) utilizaram a

reaccedilatildeo de TUNEL em tendinoses de supra-espinhoso e obtiveram resultados

positivos para apoptose Eacute provaacutevel que o tendatildeo do rato natildeo se enquadre em

alguns protocolos de imuno-histoquiacutemica pois o tecido eacute sensiacutevel Isso implica a

necessidade de aperfeiccediloar as teacutecnicas para o correto procedimento

Vale agrave pena ressaltar que os tendotildees dos grupos controles apresentaram

caracteriacutesticas histoloacutegicas similares aos padrotildees fisioloacutegicos descrito por Gross (1992) Rufai et al (1995) Soslowsky et al (2000) Nakama et al (2005) Glazebrook et al (2007) e Scott et al (2007)

Os dados aqui obtidos referentes agrave evoluccedilatildeo patoloacutegica da tendinose

sustentam que o tecido estaacute em franca tentativa de recuperaccedilatildeo frente agrave sobrecarga

constante As ceacutelulas que estatildeo em alta atividade nuclear se multiplicam atraveacutes de

mitoses aumentando a densidade celular Essas por sua vez se diferenciam e

produzem maior quantidade de matriz extracelular (colaacutegeno e glicosaminoglicanos)

na expectativa de renovar o tecido Por outro lado a siacutentese e a deposiccedilatildeo

predominantemente de colaacutegeno tipo III refletem uma tentativa frustrada de manter a

homeostase tecidual Aleacutem disso os tenoacutecitos sobrecarregados mecacircnicamente

entram mais frequentemente em apoptose como reflexo do desgaste bioquiacutemico e

mecacircnico (Visentini et al 1998 Scott amp Duronio 2003 Scott et al 2005)Apoptose eacute uma morte celular programada que ocorre de maneira fisioloacutegica

(na embriogecircnese e nas glacircndulas mamaacuterias apoacutes a lactaccedilatildeo) ou patoloacutegica

(sobrecarga mecacircnica hipertermia eou alteraccedilotildees bioquiacutemicas) Nesta o conteuacutedo

intracelular eacute fragmentado sem rupturas da membrana e endocitado por ceacutelulas

vizinhas sem desencadear ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagocitaacuterias Por outro lado a

necrose eacute uma morte celular natildeo programada que ocorre exclusivamente por

agentes patoloacutegicos na qual o conteuacutedo intracelular eacute exposto ao meio externo

desencadeando processo inflamatoacuterio reativo (Pereira 2006) Assim na evoluccedilatildeo

da tendinose a proacutepria morte celular dos tenoacutecitos natildeo estimula uma reaccedilatildeo

inflamatoacuteria pois ela ocorre principalmente por apoptose havendo uma quantidade

miacutenima de ceacutelulas em necrose (Scott et al 2007)

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Outra importante consideraccedilatildeo eacute que as tendinoses como lesotildees

degenerativas reversiacuteveis natildeo envolvem necessariamente acuacutemulo de substacircncias

apenas no meio intracelular como ocorre em outros tecidos (Pereira 2006) Elas

tambeacutem apresentam alteraccedilotildees que modificam o meio extracelular Dessa maneira

observa-se o seguinte paradoxo sobre patogecircnese da tendinose Satildeo lesotildees

celulares que alteram o intertiacutescio Ou satildeo lesotildees da matriz extracelular que alteram

o funcionamento dos tenoacutecitos

Uma interessante hipoacutetese para essa reflexatildeo eacute a mecanotransduccedilatildeo

Mecanotransduccedilatildeo eacute capacidade dos tenoacutecitos em responder agraves cargas a fim de

manter a homeostasia tecidual (Ingber 1997 Ruoslahti 1997) Segundo

Provenzano et al (2002) os fibroblastos exibem invaginaccedilotildees contendo fibrilas de

colaacutegeno que podem transmitir forccedila Essa organizaccedilatildeo afeta diretamente o

mecanismo celular no que diz respeito agrave deformaccedilatildeo ou seja a aplicaccedilatildeo de cargas

capaz de deformar a matriz extracelular pode ser transmitida agrave membrana celular

eou citoesqueleto Dessa maneira uma resposta eacute sinalizada ao nuacutecleo atraveacutes de

um sistema mecano-sensorial de tensigridade capaz de traduzir essas informaccedilotildees

em respostas metaboacutelicas adaptativas ou patoloacutegicas (Wang et al 2006 Arnoczky et al 2007) Sendo assim uma sobrecarga mecacircnica constante e de intensidade

inferior a uma deformaccedilatildeo plaacutestica total pode conduzir uma via de expressatildeo gecircnica

direta com consequentes alteraccedilotildees morfoloacutegicas que levam o tendatildeo a uma

resposta patoloacutegica degenerativa livre de um infiltrado inflamatoacuterio claacutessico (Figura VX)

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Como natildeo haacute um periacuteodo de descanso adequado para adaptaccedilatildeo do tendatildeo no

protocolo do presente trabalho eacute plausiacutevel inferir que a expressatildeo gecircnica conduza o

tecido a alteraccedilotildees degenerativas (Kjaer 2004) tais como aqui apresentadas

Em relaccedilatildeo ao local das lesotildees elas podem ocorrer tanto no corpo do tendatildeo

quanto na sua inserccedilatildeo com o osso (ecircntese) A ecircntese possui uma arquitetura

complexa com obliquumlidade das fibras de colaacutegeno e zonas de transiccedilatildeo tecidual

aleacutem de ser uma regiatildeo rica em condroacutecitos e glicosaminoglicanos Devido agrave

conformaccedilatildeo dessa estrutura foi atribuida a funccedilatildeo de minimizar a concentraccedilatildeo do

estresse na interface de tecido mole e osso (Benjamin et al 2006) Apesar disso as

alteraccedilotildees degenerativas concentram-se principalmente nesse ponto sendo

consequentemente o local mais comum de ruptura (Maganaris et al 2004) Portanto a escolha de obter imagens da regiatildeo central do eixo longitudinal para

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Figura XV ndash Resposta dos tenoacutecitos agrave sobrecarga mecacircnica Essa resposta bioloacutegica apresenta um caraacuteter adaptativo ou patoloacutegico que depende diretamente das

caracteriacutesticas da carga imposta (Adaptado de Wang et al 2006)

morfometria teve o intuito avaliar apenas as lesotildees bem estabelecidas em todo

tendatildeo

Apesar de natildeo haver nenhuma espeacutecie ldquopadratildeo-ourordquo os modelos que

utilizaram ratos apresentaram comportamento tecidual semelhante ao humano

tendo uma boa evoluccedilatildeo das condiccedilotildees da lesatildeo e reproduzindo com fidedignidade

as caracteriacutesticas teciduais patoloacutegicas aleacutem de ser de faacutecil aplicaccedilatildeo Os ratos e

camundongos tambeacutem satildeo os animais mais usados em pesquisa sendo que cerca

de 85 dos artigos da Medline e 705 dos artigos da Lilacs satildeo referentes a esses

roedores (Fagundes amp Taha 2004)Todos os grupos tiveram livre acesso agrave aacutegua e comida pois segundo

Enwemeka et al (1992) a restriccedilatildeo de comida associada a exerciacutecios pode levar

a uma adaptaccedilatildeo morfoloacutegica do tecido predispondo a uma renovaccedilatildeo com fibras

de colaacutegeno de tamanho reduzido

Eacute importante ressaltar no projeto piloto realizado observamos alteraccedilotildees

degenerativas embora natildeo tenha sido possiacutevel executar todas as coloraccedilotildees pois

o tecido tendinoso se mostrou sensiacutevel ao processamento histoloacutegico

automatizado se tornando friaacutevel aos cortes Portanto para esse trabalho

padronizou-se o processamento histoloacutegico manual com o tempo do xilol e da

parafina reduzidos evitando dessa maneira desidrataccedilatildeo excessiva e

desnaturaccedilatildeo das proteiacutenas respectivamente

Haacute uma tendecircncia por parte dos Comites de Eacutetica de orientar a utilizaccedilatildeo da

quantidade miacutenima de animais para os projetos visando a integridade fiacutesica dos

mesmos Corroborando com esse fato as variaacuteveis do presente trabalho

monstraram-se pouco instaacuteveis Sendo assim a pequena quantidade de animais

utilizados foi suficiente para obter precisatildeo e confianccedila nos resultados (Sampaio 1998) Jaacute o meacutetodo de eutanaacutesia atraveacutes da inalaccedilatildeo por CO2 produz efeito

imediato sem aparente sofrimento causando assim o menor dano possiacutevel aos

animais

A biomecacircnica da marcha dos quadruacutepedes apresenta uma caracteriacutestica

propulsora predominantemente nos membros posteriores e uma desaceleradora nos

membros anteriores (Courtine et al 2005) Dessa maneira podemos observar que

uma possiacutevel limitaccedilatildeo do modelo de Huang et al (2004) foi a utilizaccedilatildeo do decliacutenio

de 10ordm para priorizar a contraccedilatildeo excecircntrica do triacuteceps sural pois a biomecacircnica

dessa marcha natildeo reproduziria o efeito desejado Aleacutem disso a proacutepria gravidade

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trabalhava a favor da propulsatildeo dos animais Portanto diferemente de Huang et al (2004) nesse trabalho foi utilizada uma inclinaccedilatildeo de 10 graus da esteira e um

protocolo com velocidade maior A inclinaccedilatildeo foi responsaacutevel por potencializar a

contraccedilatildeo dos muacutesculos dos membros posteriores na fase de impulsatildeo da corrida

Jaacute a velocidade maior foi responsaacutevel por sobrecarregar ainda mais o tendatildeo de

Aquiles pois segundo Magnusson amp Kjaer (2003) a relaccedilatildeo triacuteceps suraltendatildeo eacute

maior que supra-espinhosotendatildeo

Os modelos devem levar em consideraccedilatildeo a especificidade de cada tendatildeo no

que se refere agraves diferenccedilas na anatomia funccedilatildeo mecanismo de lesatildeo eou tamanho

relativo muacutesculotendatildeo pois todas essas caracteriacutesticas podem ser relevantes na

gecircnese da tendinose Aleacutem disso eles devem procurar induzir a lesatildeo da maneira

similar ao que acontece em humanos Dessa maneira os modelos que utilizaram

contraccedilatildeo ativa para induccedilatildeo apresentam maior similaridade ao que realmente

acontece no desenvolvimento cliacutenico da tendinose principalmente naqueles em que

o tendatildeo tem participaccedilatildeo ativa durante a atividade imposta No entanto eacute

importante ressaltar que o esforccedilo repetitivo eacute apenas um potencial fator etioloacutegico

Existem outros fatores natildeo considerados nesse trabalho que tambeacutem afetam as

propriedades biomecacircnicas do tendatildeo tais como imobilizaccedilatildeo envelhecimento e

corticoacuteides

Futuras pesquisas devem investigar os mecanismos moleculares e bioquiacutemicos

envolvidos na patogecircnese bem como o efeito de diversas terapias fiacutesicas e

farmacoloacutegicas para a tendinose de Aquiles

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Conclusatildeo

De acordo com os resultados pode-se observar que o modelo proposto atingiu

o objetivo de descrever analisar e sistematizar os eventos patoloacutegicos envolvidos na

gecircnese da tendinose de Aquiles atraveacutes de um modelo de induccedilatildeo por overuse em

ratos machos Wistar

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