avaliação da atividade antioxidante e fotoprotetora do extrato
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UNIVERSIDADE CATÓLICA DOM BOSCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
Avaliação da Atividade Antioxidante e Fotoprotetora do extrato etanólico de Campomanesia adamantium
(Cambess.) O. Berg
Autora: Juliana Prati Salvador Orientador: Dr. Ludovico Migliolo
Co-orientador: Dr. Cristiano Marcelo Espínola Carvalho
Campo Grande Mato Grosso do Sul
Abril – 2015
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UNIVERSIDADE CATÓLICA DOM BOSCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
Avaliação da Atividade Antioxidante e Fotoprotetora do extrato etanólico de Campomanesia adamantium
(Cambess.) O. Berg
Autora: Juliana Prati Salvador Orientador: Dr. Ludovico Migliolo
Co-orientador: Dr. Cristiano Marcelo Espínola Carvalho
"Dissertação apresentada, como parte das exigências para obtenção do título de MESTRE EM BIOTECNOLOGIA, no Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Católica Dom Bosco - Área de concentração: Biotecnologia Aplicada à Saúde”.
Campo Grande Mato Grosso do Sul
Abril – 2015
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“É muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas,
mesmo expondo-se ao fracasso, do que alinhar-se com os pobres de
espírito, que nem gozam muito nem sofrem muito, porque vivem numa
penumbra cinzenta, onde não conhecem nem vitória, nem derrota.”
(Theodore Roosevelt)
v
Dedico esse trabalho a Deus, por fazer-me forte e persistente, por
ser fiel e derramar sua graça sobre mim diariamente, a Ele toda honra e
Glória; ao meu marido Daniel Salvador, pela extrema paciência e amor
que teve e pela força que me deu quando senti vontade de desistir; aos
meus filhos Luís Paulo e Rafael, por ser minha principal fonte de
inspiração; aos meus pais, em especial à minha mãe Ana Regina, por
todos os sacrifícios que fizeram desde o dia que entrei na escola até
hoje; Ao meu avô, Roberto Ribeiro – in memoriam, por ter me
incentivado à leitura desde pequena e ter influenciado e marcado para
sempre a minha vida com sucesso e independência e a minha avó
Honorina – in memoriam, por ter me ensinado na prática como a
organização e o planejamento pode tornar tudo mais simples, nesses
breves mais intensos anos em que vivemos juntas.
vi
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao meu marido Daniel Salvador, por estar sempre presente e ser
meu principal incentivador e aos meus filhos Luís Paulo e Rafael, por alegrarem
meus dias e tornarem tudo mais leve. A existência de vocês é o que justifica tudo;
A minha mãe, Ana Regina, pelo amor e disponibilidade; pelas orações
constantes, pelo zelo com os meus filhos; ao meu pai, Paulo Roberto, a quem amo e
respeito incondicionalmente; ao meu irmão Felipe.
Á minha sogra Liane, pelo carinho de mãe que tem comigo. Como agradecer
todos os momentos de doação, preocupação e orações?
À minha amiga-irmã Romilda de Mattos Arce, colega neste mestrado e parceira
de vida. Obrigada por todos os momentos, bons e ruins, que passamos juntas. Por
ter tornado esses anos mais leves e divertidos. Seria muito mais difícil sem você;
Ao Prof. Dr. Ludovico Migliolo, meu orientador, pela disponibilidade em ler e
reler o meu trabalho, propondo correções e adequações que me auxiliaram na
construção da dissertação;
Ao Prof. Dr. Cristiano Marcelo Espínola Carvalho, meu co-orientador, por ter
aceitado me conduzir neste trabalho. Agradeço pela disponibilidade em me atender
em todos os momentos em que necessitei e por me auxiliar diante das dificuldades
pelas quais passei nestes dois anos de convivência;
À Prof.ª Dra. Mami Yano, pelo auxílio no delineamento experimental da
pesquisa, preparo dos extratos vegetais e metodologia dos testes que realizei;
vii
À Prof.ª Dra. Josimara Nolasco Rondon, pela disponibilidade e auxilio na coleta
e identificação das espécies vegetais que estudei; pelas orientações em relação às
pesquisas científicas, pelo apoio, incentivo e sugestões dadas;
À Prof.ª Ma. Karla Rejane de Andrade Porto, pelo grande incentivo e auxilio
durante a execução dos experimentos e no delineamento das metodologias;
À Prof.ª Drª Rosemary Matias, pelo auxilio na execução dos testes de atividade
antioxidante e prospecção fitoquímica;
Ao Prof. Dr. Luís Carlos Vinha Ítavo, pelo auxilio na moagem dos galhos e
folhas das plantas estudadas;
À Prof.ª Drª Ana Lúcia Alves de Arruda, pelo incentivo à minha entrada no
programa de mestrado, por apresentar-me ao universo da farmacognosia e por estar
sempre me apoiando e incentivando, independente das circunstâncias;
Ao Prof. Dr. Patrik Oening Rodrigues pelas contribuições que fez em relação à
metodologia e por disponibilizar a estrutura do laboratório de farmacognosia da
UFMS para a realização de alguns testes de prospecção fitoquímica;
Ao Prof. Dr. Artur Maia, pelas sugestões propostas ao texto final;
À Carolina Frattini Moura, pelo auxilio nos testes de prospecção fitoquimica e
na construção dos gráficos, pelo apoio e incentivo, pela amizade e parceria;
Ao Digelson e Carlos de Jesus, pelo auxilio na coleta das plantas;
À Maria Helena, técnica do laboratório, pela paciência e pelo auxílio na
identificação das vidrarias e materiais que utilizamos no laboratório;
Aos professores e colegas do mestrado em Biotecnologia, pelos momentos
partilhados e pelo crescimento pessoal e profissional a mim proporcionado;
A CAPES, pelo auxilio financeiro e bolsa concedida.
A todos muito obrigada!
viii
BIOGRAFIA DO AUTOR
Juliana Prati Salvador, filha de Paulo Roberto Duarte Prati e Ana Regina
Prati, nasceu em Ilha Solteira – SP, no dia 01 de Dezembro de 1978.
Concluiu a graduação em Fisioterapia pela Universidade Católica Dom
Bosco (UCDB) no ano de 2002, passando a atuar profissionalmente na área. Em
2006, concluiu especialização Lato Sensu em Fisioterapia Dermato-funcional
aplicada à cirurgia plástica pela Universidade Federal de Mato Grosso do Sul –
(UFMS), cursando na sequencia diversos aprimoramentos profissionais na área.
Proprietária da clínica de fisioterapia Spazio Salute, desde 2006, possui
experiência profissional em fisioterapia dermato funcional (assistência pós-operatória
em cirurgia plástica, queimados, disfunções tissulares faciais e corporais).
Desde 2010, é docente do curso de graduação tecnológica em estética e
cosmetologia da UNIGRAN Capital, tendo ministrado diversas disciplinas. É atual
gestora do curso de especialização Lato Sensu em Estética e Imagem Pessoal e
Dermoestética Clinica da instituição, ministrando aulas com temáticas afins a sua
área de formação.
Em 2012 foi certificada pelo Conselho Federal de Fisioterapia (COFFITO),
como especialista profissional em Fisioterapia Dermato-funcional através de prova
de títulos. No mesmo ano, ingressou como mestranda no programa de Biotecnologia
da Universidade Católica Dom Bosco (UCDB), pesquisando na área de
farmacognosia.
ix
SUMÁRIO
Página
LISTA DE FIGURAS ix
LISTA DE TABELAS xi
LISTA DE QUADROS xii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS xiii
RESUMO xiv
ABSTRACT xv
1. INTRODUÇÃO 1
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 3
2.1 Pele e Melanogênese 3
2.2 Fototipos Cutâneos 8
2.3 Radiação solar e índice ultravioleta 10
2.4 Radicais livres, oxidação e dano celular 12
2.5 Envelhecimento cutâneo: fotoenvelhecimento 13
2.6 Câncer de pele 14
2.7 Filtros solares e fotoprotetores 15
2.7.1 Fator de proteção solar (FPS) 17
2.8 Metabólitos secundários: compostos fenólicos e flavonóides 19
2.9 Família Myrtaceae: gênero Campomanesia 23
2.9.1 Espécie Campomanesia adamantium (Cambess.) O. Berg 25
3. OBJETIVOS 28
3.1 Objetivo geral 28
3.2 Objetivos específicos 28
4. MATERIAL E MÉTODOS 29
4.1 Coleta e identificação do material botânico 29
4.2 Preparação do extrato etanólico das folhas e galhos de C. adamantium 29
4.3 Triagem fitoquímica do extrato de folhas e galhos de C. adamantium 30
x
4.3.1 Teste para fenóis e taninos 30
4.3.2 Teste para taninos 31
4.3.3 Teste para flavonóides (flavonóis, flavonas e xantonas) 31
4.3.4 Teste para flavonóides (antocianidinas, antocianinas e flavonóis) 31
4.3.5 Teste para flavonóides (leucoantocianidinas, catequinas e flavonas) 32
4.3.6 Saponinas 32
4.3.7 Cumarinas 32
4.3.8 Glicosídeos cardiotônicos 33
4.3.9 Teste para esteróides e triterpenóides 33
4.4 Determinação dos fenóis totais pelo método Folin-Ciocalteu’s 33
4.5 Determinação dos flavonóides totais 34
4.6 Determinação do pH 34
4.7 Determinação da condutividade elétrica 34
4.8 Cromatografia em camada delgada (CCD) 34
4.9 Atividade antioxidante pelo seqüestro de radicais DPPH 36
4.10 Espectrofotometria na região do ultravioleta 37
4.11 Cálculo do FPS 37
4.12 Ensaio de inibição da tirosinase 39
4.12.1 Quelação com íons Cu2+ 39
4.13 Toxicidade frente à Artemia salina 40
5. RESULTADOS 41
5.1 Caracterização físico-química dos extratos etanólicos de folhas e
galhos de C. adamantium
41
5.2 Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 42
5.3 Atividade antioxidante pelo seqüestro de radicais DPPH 44
5.4 Espectrofotometria na região do R-UV 45
5.5 Inibição da enzima Tirosinase 46
5.6 Teste de toxicidade frente a A. salina 49
6. DISCUSSÃO 50
CONSIDERAÇÕES FINAIS 58
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 60
xi
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1 Corte histológico da pele humana e suas camadas, sendo E: epiderme (tecido epitelial); D: derme (tecido conjuntivo); N: núcleo; SC: estrato córneo; EG: estrato granuloso, ES: estrato espinhoso, sGE: estrato germinativo; VS: vaso sanguíneo.
3
Figura 2 Desenho esquemático de um corte de pele fina, mostrando na epiderme, os queratinócitos organizados em quatro estratos celulares. Por entre os queratinócitos, observa-se a presença dos melanócitos, células de Merkel e de Langerhans. Abaixo da epiderme, observa-se uma pequena área da derme.
4
Figura 3 Desenho esquemático da pele, evidenciando as camadas da derme e fibras. Acima da derme, observa-se a epiderme.
5
Figura 4 Desenho esquemático do melanócito em que pode observar os elementos constitutivos da célula
5
Figura 5 Mecanismo de regulação para produção de melanina em etapas: degradação da tirosina e formação da dopaquinona, formação do dopacromo e da feomelanina e formação da eumelanina a partir do dopacromo.
6
Figura 6 Desenho esquemático da sinalização do α-MSH via MC1-R e formação de eumelanina e feomelanina, sendo α-MSH: hormônio estimulante de melanócitos do tipo α; MC1-R: receptor de hormônios melanócito estimulantes; AC: adenilciclase; ATP: adenosina trifosfato AMPc: adenosina monofosfato cíclico.
8
Figura 7 Figura ilustrativa do espectro de onda e absorção da radiação ultravioleta (R-UV) na pele, indicando a profundidade de penetração na pele de cada tipo de radiação solar, sendo UV-C: radiação ultravioleta C; UV-B: radiação ultravioleta B; UV-A: radiação ultravioleta A.
10
Figura 8 Sinais característicos do fotoenvelhecimento 14
Figura 9 Melanoma cutâneo 15
Figura 10 Ciclo biossintético dos metabólitos secundários das plantas, em que se pode visualizar as duas principais rotas metabólicas: ácido chiquímico e AcetilCoA.
20
xii
Figura 11 Estrutura química de compostos fenólicos simples (ácido fênico) e complexo (teaflavina)
20
Figura 12 Estrutura química básica de um flavonóide 22
Figura 13 Estrutura quimica de algumas classes de flavonóides. 22
Figura 14 Características de algumas Myrtaceae brasileiras. A=córtex esfoliante; B=canais oleíferos presentes em folhas; C=folhas opostas; D–F=tipos de inflorescência; G=fruto carnoso do tipo baga
24
Figura 15 C. adamantium. Pode ser observada a característica arbustiva desta espécie e a forma e coloração dos frutos (A) folhas (B), flores (C)
25
Figura 16 Absorbância média do extrato etanólico das folhas (cinza) e galhos (hachurado) de C. adamantium no espectro da radiação UV-A e UV-B (290nm a 400 nm). O eixo x corresponde aos comprimentos de onda em que a varredura foi realizada e o eixo Y corresponde à absorbância média de cada extrato etanólico.
45
Figura 17 Absorbância média do extrato etanólico das folhas (linha contínua) e galhos (linha pontilhada) de C. adamantium no espectro da radiação UV-B.
45
Figura 18 Percentual de ação dos extratos etanólicos de folhas e galhos de C. adamantium e do ácido kójico em relação à enzima tirosinase (100%) na leitura 475 nm nos tempos 0 (cinza chumbo); 30 (cinza claro) e 60 minutos (hachurado).
47
Figura 19 Concentração média da absorbância na mistura do ácido kójico e dos extratos etanólicos das folhas (preto) e galhos (hachurado) de C. adamantium (v:v) na faixa entre 290 a 400 nm.
47
Figura 20 Concentração média da absorbância na mistura do ácido kójico e dos extratos etanólicos das folhas (preto) e galhos (hachurado) de C. adamantium (v:v) na quelação do cobre, na faixa entre 290 a 400 nm.
48
Figura 21 Concentração média da absorbância do ácido Kójico e dos extratos etanólicos das folhas (preto) e galhos (hachurado) de C. adamantium (v:v) frente a presença de EDTA na faixa entre 290 a 400 nm.
48
xiii
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1
Classificação de fototipos cutâneos segundo Fitzpatrick (1975), e as características individuais (cor da pele, olhos e cabelos, reação ao sol e sensibilidade à R-UV para cada fototipo (I a VI)
9
Tabela 2
Percentual de absorção da R-UVB frente ao valor de FPS
18
Tabela 3 Níveis de proteção solar em relação ao fototipo cutâneo e ao valor de FPS de um protetor solar
19
Tabela 4
Principais subclasses de flavonóides e seus representantes
23
Tabela 5
Resultados das analises fitoquímicas dos extratos etanólicos das folhas e galhos de C.adamantium, fenóis totais, flavonóides, pH e condutividade elétrica.
41
Tabela 6
Resultado da cromatografia por arraste a vapor para o extrato etanólico das folhas e galhos de C. adamantium.
43
Tabela 7
Atividade antioxidante dos extratos etanólicos das folhas e galhos de C. adamantium.
44
Tabela 8
Atividade antioxidante CE50 dos extratos etanólicos das folhas e galhos de C. adamantium e do padrão ácido ascórbico.
44
Tabela 9 FPS do extrato etanólico das folhas e galhos de C. adamantium.
46
Tabela 10 Valores médios de toxidade dos extratos das folhas e dos galhos de C. adamantium sobre A.salina.
49
xiv
LISTA DE QUADROS
Página
Quadro 1 Alterações observadas na coloração do meio a serem avaliadas para o teste para antocianidinas, antocianinas e flavonóides.
31
Quadro 2 Alterações observadas na coloração do meio a serem avaliadas para o teste para leucoantocianidinas, catequinas e flavonas.
32
Quadro 3 Reveladores utilizados para a CCD dos extratos etanólicos das folhas e galhos de C. adamantium
35
Quadro 4 Relação efeito eritemogênico (EE) versus intensidade da radiação (I) conforme o comprimento de onda (ƛ)
38
xv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AC – Adenilciclase (AC)
α-MSH – Hormônio estimulante de melanócitos do tipo α (melanocortina)
AMPc – Adenosina monofosfato cíclico
ASP – Proteína sinalizadora AGOUTI
ATP – Adenosina trifosfato
CCD – Cromatografia da camada delgada
CLAE – Cromatografia liquida de alta eficiência
DHI – Dopa, 5,6 diidroxiindol
DHICA – 5,6 diidroxiindol-2-ácido carboxílico
DME – Dose mínima eritematosa
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
DOPA – Dioxifenilalanina
DPPH – 2-difenil-1-picrilhidrazila
EDTA – ácido etilenodiamino tetracético dissódico
ERO – Espécie Reativa de Oxigênio
FPS – Fator de proteção solar
FT – Fenóis totais
MC1-R – receptor de MSH
MgO – Óxido de magnésio
MSH – Hormônios melanócito estimulantes
PABA – ácido 4-aminobenzóico (paraminobenzóico)
RI – Radiação Infravermelha
R-UV – Radiação Ultravioleta
UV-A – Radiação Ultravioleta A
UV-A 1 – Radiação Ultravioleta A1
UV-A 2 – Radiação Ultravioleta A2
UV-B – Radiação Ultravioleta B
UV-C – Radiação Ultravioleta C
xvi
RESUMO
O uso de protetores solares é a principal abordagem cosmética para prevenção dos sinais de fotoenvelhecimento e do câncer de pele desencadeados pela radiação ultravioleta (R-UV). O desenvolvimento de produtos mais eficientes, com altos fatores de proteção, menor quantidade de agentes sintéticos, valores de mercado mais acessíveis e com menor potencial irritante tem despertado o interesse de muitos pesquisadores. A incorporação de extratos vegetais ricos em compostos fenólicos a formulações fotoprotetoras tem sido estudada pelo complexo de substâncias antioxidantes que esses compostos fornecem à pele e por sua capacidade de absorção da R-UV. Esse estudo teve como objetivo realizar uma avaliação preliminar do extrato etanólico de folhas e galhos de Campomanesia adamantium com vistas às suas atividades antioxidante e fotoprotetora. Foram preparados extratos etanólicos de amostras de folhas e galhos de C. adamantium coletadas na reserva particular da Universidade Católica Dom Bosco (UCDB) no mês de abril de 2014 no município de Campo Grande – MS. O material foi submetido a uma triagem fitoquímica qualitativa por meio de testes colorimétricos; teor de fenóis e flavonóides totais; determinação do pH e da condutividade elétrica; cromatografia em camada delgada (CCD); atividade antioxidante por DPPH; verificação da absorção no R-UV; cálculo do fator de proteção solar (FPS); teste de inibição da enzima tirosinase e avaliação do teor de toxicidade pelo ensaio com Artemia salina. Após a análise dos dados deste estudo foi possível concluir que os extratos etanólicos das folhas e galhos de C. adamantium estudados apresentam compostos fenólicos, sobretudo taninos, cumarinas e flavonóides, havendo uma maior concentração de taninos e flavonóides nos galhos, o que sugere atividade antioxidante e possuem alta absorção nos comprimentos de onda da R-UV indicando atividade fotoprotetora. A atividade antioxidante foi confirmada pelo ensaio com o radical livre DPPH e padrão ácido ascórbico. Os extratos apresentaram valores de proteção solar altos para as folhas (FPS 21) e para os galhos (FPS 23), quando comparados a outras espécies citadas na literatura, podendo ser introduzidos em formulações fotoprotetoras para aumentar o fator de proteção solar. As amostras não demonstraram capacidade de inibição da enzima tirosinase e apresentaram toxicidade frente a A. salina. Palavras-Chave: radiação solar; protetores solares; fator de proteção solar; compostos fenólicos; extratos vegetais; Myrtaceae.
xvii
ABSTRACT
The use of sunscreens is the main cosmetic approach to prevent of photoaging and signs of skin cancer triggered by reactions caused by ultraviolet radiation (UV-R). The development of more efficient products with high protection factors, fewer synthetic agents, most affordable market prices and less irritation potential has attracted the interest of many researchers. The incorporation of plant extracts rich in phenolic compounds photoprotective formulations has been studied by complex antioxidants such compounds provide skin and the absorption capacity of the R-UV. This study aimed to carry out a preliminary assessment of ethanol extract of leaves and Campomanesia adamantium branches with a view to their antioxidant and photoprotective activity. Ethanol extracts were prepared from samples of leaves and twigs of C. adamantium collected in the private reserve of the Dom Bosco Catholic University (UCDB) in April 2014 in Campo Grande - MS. The material was subjected to a qualitative phytochemical screening by colorimetric test; content of total phenols and flavonoids; measuring the pH and electric conductivity; thin layer chromatography (TLC); antioxidant activity by DPPH; Verification of absorption in UV-R; calculation of the sun protection factor (SPF); inhibition of the enzyme tyrosinase test and evaluation of toxicity for the test on Artemia salina. After analyzing the data from this study it was concluded that the ethanol extracts of leaves and C. adamantium studied branches present phenolic compounds, especially tannins, coumarins and flavonoids, with a higher concentration of tannins and flavonoids in the branches, which suggests antioxidant activity and have high absorption in the R-UV wavelengths indicating photoprotective activity. The antioxidant activity was confirmed by testing with the free radical DPPH and standard ascorbic acid. The extracts showed high sun protection values to the leaves (SPF 21) and the branches (SPF 23), when compared to other species described in the literature and may be introduced in photoprotective formulations to increase the sun protection factor. The samples showed no inhibition capacity of the enzyme tyrosinase and presented front toxicity to A. salina . Key-Words: solar radiation; sunscreening agents, sun protection factor, phenolic compounds, plant extracts, Myrtaceae.
1
1. INTRODUÇÃO
A radiação ultravioleta (R-UV) desencadeia reações químicas na pele humana,
provocando danos celulares, degenerando fibras de colágeno e elastina, induzindo o
espessamento epidérmico e levando ao fotoenvelhecimento e a lesões benignas,
pré-malignas ou malignas de pele (BALOGH et al., 2011).
O câncer de pele é considerado um problema de saúde pública para o Brasil
levando em consideração a sua grande abrangência epidemiológica, social e
econômica. O número de doentes tem crescido anualmente, de acordo com
estimativa realizada pelo Instituto Nacional de Câncer (INCA). O risco estimado para
novos casos de câncer de pele é de 100 casos novos a cada 100 mil homens e 82 a
cada 100 mil mulheres, em 2015 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).
O uso de protetores solares é a principal abordagem preventiva aos sinais do
fotoenvelhecimento e do câncer de pele. Porém, alguns produtos comercializados
atualmente, além de possuírem elevado preço de venda, podem desencadear
reações adversas na pele como dermatites de contato, alergias e mutagenicidade,
pelo uso de altas concentrações de filtros químicos (VELASCO et al., 2011;
NASCIMENTO, 2014). Certas substâncias, como a benzofenona-2, frequentemente
utilizada em filtros químicos foram inclusive retiradas do mercado por seu efeito
fototóxico e risco à saúde dos usuários (ANVISA, 2012).
O desenvolvimento de produtos mais eficientes, com altos fatores de proteção,
menor quantidade de agentes sintéticos, menor potencial irritante e valores de
mercado mais acessíveis tem despertado o interesse de muitos pesquisadores
(DAL`BELO, 2008; PINTO et al., 2012).
Existe na literatura uma correlação positiva bem estabelecida entre a
intensidade da R-UV sobre as plantas e a produção de compostos fenólicos como
flavonóides, taninos e terpenóides, produtos do metabolismo secundário. É fato que
as diversas classes de flavonóides possuem a capacidade de fotoproteção das
plantas por absorverem a radiação solar, mantendo a integridade dos tecidos, além
de atuarem como antioxidantes (GOBBO-NETO e LOPES, 2007).
2
Nesse sentido, extratos vegetais de espécies ricas em compostos fenólicos,
têm sido estudados como agentes redutores do estresse oxidativo e dos danos ao
DNA induzidos pela R-UV. Já existe a incorporação de extratos vegetais nas
formulações dermocosméticas, sobretudo nas fotoprotetoras, devido ao complexo de
substâncias antioxidantes que fornecem à pele, neutralizando radicais livres,
reestabelecendo a hemostasia tissular, além de agregar valor comercial, pelo fato de
ser um produto natural (MANSUR, 2011).
Diante da preocupação da OMS com o aumento do número de pessoas com
câncer de pele e da busca pela prevenção aos sinais de envelhecimento, essa
pesquisa teve por objetivo realizar uma avaliação preliminar do extrato etanólico de
folhas e galhos de C. adamantium (Cambess.) O. Berg com vistas às suas
atividades antioxidante e fotoprotetora, considerando que a atividade fotoprotetora
desta planta ainda não foi descrita e compostos de ação fotoprotetora foram
encontrados em outras Myrtaceae, sinalizando possível potencial biotecnológico
para o desenvolvimento de formulações dermocosméticas para esse fim.
3
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Pele e Melanogênese
A pele ou cútis é o principal componente do sistema tegumentar, sendo
considerada um grande órgão de proteção que reveste praticamente todo o corpo,
varia em espessura e cor nas diferentes regiões do corpo e de acordo com as
características raciais e a idade do indivíduo, exercendo inúmeras funções
fisiológicas importantes. Distribui-se em duas camadas intimamente ligadas, sendo a
epiderme, formada por tecido epitelial, a mais superficial e a derme, formada por
tecido conjuntivo, a mais profunda (figura 1) (BELTRAMINI, 2011).
Figura 1 – Corte histológico da pele humana e suas camadas, sendo E: epiderme (tecido epitelial); D: derme (tecido conjuntivo); N: núcleo; SC: estrato córneo; EG: estrato granuloso, ES: estrato espinhoso, sGE: estrato germinativo; VS: vaso sanguíneo. Fonte: Neto, 2014.
4
A epiderme é a camada mais superficial da pele, caracterizada por possuir
pouca substância intercelular e por ser avascular, dependendo de tecidos próximos
para ser oxigenada e nutrida. A célula típica é o queratinócito, rica em queratina,
responsável pela renovação epitelial. Além dos queratinócitos, existem ainda na
epiderme as células de Merkel (envolvidas no processo de sensibilidade tátil); as
células de Langherans (exercem papel protetor da pele) e os melanócitos (células
produtoras de melanina). A epiderme possui, em geral, quatro estratos ou camadas:
córnea, granulosa, espinhosa e basal (figura 2) (BELTRAMINI, 2011).
Figura 2 – Desenho esquemático de um corte de pele fina, mostrando na epiderme, os queratinócitos organizados em quatro estratos celulares. Por entre os queratinócitos, observa-se a presença dos melanócitos, células de Merkel e de Langerhans. Abaixo da epiderme, observa-se uma pequena área da derme. Fonte: Sholl-Franco et al., 2010.
A derme, por sua vez, é ricamente vascularizada e inervada, possuindo
abundante substância intercelular e fibras conjuntivas promotoras da sustentação e
elasticidade da pele. Está subdividida em duas camadas (papilar e reticular)
possuindo fibroblastos, responsáveis pela síntese de fibras colágenas e reticulares e
pelas fibras do sistema elástico (oxitalânicas, elaunínicas e elásticas). As fibras
oxitalânicas são constituídas por feixes de microfibrilas, sendo resistentes à tração
(não possuem elastina); as elaunínicas são formadas por fibrilina e por elastina
dispostas irregularmente entre os feixes de microfibrilas, tendo certa elasticidade; já
as fibras elásticas possuem grande quantidade de elastina, principais responsáveis
pela elasticidade da pele (figura 3) (SHOLL-FRANCO et al., 2010).
5
Figura 3 – Desenho esquemático da pele, evidenciando as camadas da derme e fibras. Acima da derme, observa-se a epiderme. Fonte: Sholl-Franco et al., 2010.
Na pele, as células dendríticas denominadas melanócitos (figura 4) são as
responsáveis pela produção de melanina, principal pigmento da coloração da pele.
Essas células são fenotipicamente muito importantes e possuem o corpo celular
localizado no extrato basal da epiderme e vários prolongamentos dispostos entre os
queratinócitos das camadas espinhosa e granulosa. Os melanócitos não se
multiplicam e estão distribuídos na proporção de 1:10 em relação aos queratinócitos,
sendo sua quantidade semelhante nos indivíduos. A densidade de melanócitos varia
quanto à localização, reduzindo entre 6 e 8% por década de vida (MIOT et al., 2009).
Figura 4 – Desenho esquemático do melanócito em que pode observar os elementos constitutivos da célula Fonte: Sholl-Franco et al., 2010.
6
A melanina é um pigmento castanho com alta massa molecular e quanto mais
concentrado, mais escuro. A produção e distribuição são determinadas
geneticamente. Exerce funções de termorregulação, antibiótica e de fotoproteção.
Existem dois tipos de melanina: as eumelaninas (tonalidade entre marrom e preto) e
as feomelaninas (tonalidade entre amarelo e vermelho). No interior dos melanócitos,
a melanina produzida é armazenada em estruturas denominadas melanossomas
(corpúsculos intracelulares específicos) (MANSUR, 2011).
A melanogênese (figura 5) tem inicio pela tirosina, um aminoácido essencial,
que, na presença de oxigênio molecular, sofre atuação química de uma enzima
específica denominada tirosinase e é oxidada em DOPA. Posteriormente, a DOPA é
convertida em dopaquinona A tirosinase é uma enzima sintetizada no retículo
endoplasmático rugoso e no complexo de Golgi no interior dos melanossomos,
sendo fundamental no processo de melanogênese da pele e que age na presença
de íons cobre (SOUZA, 2011).
Figura 5 – Mecanismo de regulação para produção de melanina em etapas: degradação da tirosina e formação da dopaquinona, formação do dopacromo e da feomelanina e formação da eumelanina a partir do dopacromo. Fonte: Autora, 2014
A partir desta etapa, a presença ou ausência da cisteína, determina a
sequencia dos eventos. Na presença da cisteína, a dopaquinona oxida as
cisteinildopas e produz feomelanina (Sholl-Franco et al., 2010). Após a cisteinildopa
ser depletada, inicia-se a produção da eumelanina por meio da conversão da
7
dopaquinona em ciclodopa e essa, em dopacromo. Uma via de degradação do
dopacromo forma a DHI em maior quantidade e a outra forma DHICA em menor
quantidade e na sequência, a eumelanina. Os melanócitos sintetizam taxas
diferentes de cada tipo de melanina (eumelanina e feomelanina) e o fenótipo final da
cor da pele e dos cabelos resulta da proporção entre elas (MIOT et al., 2009).
A síntese e a deposição de melanina nos melanossomas ocorre em quatro
estágios sequenciais: o estágio I contém estruturas despigmentadas, sem melanina;
no estágio II, os melanócitos são ovais, com alta atividade da tirosinase; no estágio
III ocorre uma deposição moderada de melanina e ainda existe bastante atividade da
tirosinase e no IV, último estágio, os melanócitos estão repletos de pigmento e a
tirosinase está menos ativa. Quando os melanossomas estão cheios de pigmento,
esses são transferidos aos queratinócitos vizinhos, que promovem a migração do
pigmento até as camadas superiores da epiderme. Esse processo de produção e
distribuição da melanina é denominado melanogêsese (MIOT et al., 2009).
Além da radiação ultravioleta (R-UV), outros fatores estão envolvidos no
processo e regulação da quantidade e qualidade da melanina produzida pelos
melanócitos, incluindo α-MSH (hormônio estimulante de melanócitos do tipo α ou
melanocortina), MC1-R (receptor de MSH – hormônios melanócito estimulantes) e
ASP (proteína sinalizadora AGOUTI). O α-MSH é um tridecapeptídeo gerado por
clivagem proteolítica da propiomelanocortina (POMC), na glândula pituitária e na
pele (MIOT et al., 2009).
Os queratinócitos humanos, os melanócitos e as células de Langerhans são
capazes de sintetizar α-MSH. Existem evidências de que esse hormônio esteja
envolvido na função do melanócito. A MCR1-R e seu antagonista, a AGOUTI
também estão envolvidos na regulação qualitativa (eumelanina e feomelanina) e
quantitativa da pigmentação de mamíferos. O α-MSH ativa a adenilciclase (AC) por
meio do MC1-R, ativando e aumentando o nível da adenosina monofosfato cíclico
(AMPc) intracelular, resultando em produção do pigmento escuro de eumelanina
(figura 6). A ativação do MC1-R interfere nas quantidades produzidas de
feomelanina e eumelanina, e a redução de sua atividade pode estar associada a
cabelos ruivos ou loiros (VOISEY, CARROLL e VAN DAAL, 2003).
8
Figura 6 – Desenho esquemático da sinalização do α-MSH via MC1-R e formação de eumelanina e feomelanina, sendo α-MSH: hormônio estimulante de melanócitos do tipo α; MC1-R: receptor de hormônios melanócito estimulantes; AC: adenilciclase; ATP: adenosina trifosfato AMPc: adenosina monofosfato cíclico. Fonte: Miot, 2009.
2.2 Fototipos Cutâneos
O termo fototipo cutâneo se refere a faixas de classificação da pele de um
indivíduo considerando características físicas como cor dos olhos, cabelo e pele e a
sensibilidade à exposição solar. A escala de fototipos cutâneos, desenvolvida em
1975, pelo médico dermatologista americano, Thomas B. Fitzpatrick permite avaliar
o risco de fotodano e câncer de pele, sendo mundialmente utilizada em avaliações
dermatológicas e estudos científicos. Possui seis graus que categorizam a pele em
fototipos de I a VI (Tabela 1) (SUZUKI et al., 2011).
A cor da pele de um indivíduo pode ser designada como constitutiva,
geneticamente determinada, não submetida à ação das radiações ultravioletas (R-
UV); ou facultativa, influenciada pela fotoexposição ou doenças pigmentares. A cor
facultativa retrata a possibilidade geneticamente determinada de bronzeamento de
um indivíduo frente à R-UV. Dessa forma, o grau de escurecimento é geneticamente
determinado sendo o referencial para a divisão da pele em padrões de respostas
adaptativas, denominadas fototipos (FITZPATRICK e MOSHER, 1983).
9
Tabela 1 – Classificação de fototipos cutâneos segundo Fitzpatrick (1975), e as características individuais (cor da pele, olhos e cabelos, reação ao sol e sensibilidade à R-UV para cada fototipo (I a VI)
Fototipo Característica
individual
Cor da
pele
Reação ao sol Sensibilidade
à R-UV
I Pele clara, olhos azuis,
sardentos
Branca Queima facilmente
Nunca bronzeia
Muito sensível
II Pele clara, olhos azuis,
verdes ou castanhos
claros, cabelos louros
ou ruivos
Branca Queima
facilmente,
bronzeia muito
pouco
Sensível
III Olhos claros ou não
Cabelos mais escuros
Morena
clara
Queima e bronzeia
moderadamente
Normal
IV Pele morena clara,
cabelos castanhos
escuros e olhos escuros
Morena
média
Queima pouco,
bronzeia com
facilidade
Normal
V Cabelos e olhos
escuros, pele morena
Morena
escura
Queima
raramente,
bronzeia bastante
Pouco
sensível
VI Negra Negra Nunca queima Insensível
Fonte: adaptado de Suzuki et al., 2011
Indivíduos com fototipos I e II, com altos índices de feomelanina, possuem maior
risco para os fotodanos, inclusive o desencadeamento de neoplasias cutâneas, pelo
grande potencial da feomelanina em gerar radicais livres, em resposta à R-UV. Já
indivíduos mais pigmentados tendem a se queimar menos e bronzear mais do que
indivíduos mais claros porque a eumelanina absorve e dispersa a R-UV atenuando
sua penetração na pele e reduzindo sua fototoxicidade (PURIM e LEITE, 2010).
10
2.3 Radiação solar e índice ultravioleta
A radiação solar compreende todo o espectro eletromagnético, sendo a faixa
de comprimento de onda ultravioleta a de maior interesse por seu potencial
carcinogênico, imunossupressor e de interferência ao DNA (UITTO, 2001).
Cada tipo de onda atua de modo particular no fotoenvelhecimento. A radiação
infravermelha (RI) transmite energia na forma de calor elevando a temperatura da
pele para mais de 40 ˚C, alterando seu equilíbrio e gerando eritema,
hiperpigmentação, descamação, atrofia epidérmica e telangiectasias. A luz visível
também contribui para a produção de radicais livres e, assim, induz a danos
indiretos ao DNA, além de induzir a pigmentação (VELASCO et al., 2011)
A R-UV pode ser subdividida em três intervalos: UV-A (entre 320 a 400 nm);
UV-B (entre 290 a 320 nm) e UV-C (entre 100 a 280 nm) (figura 7). A intensidade da
radiação e o comprimento de onda da luz solar dependem de fatores como altitude,
latitude, estação do ano, condições atmosféricas e horário (UITTO, 2001; PETRI,
2005; BALOGH et al., 2011).
Figura 7 – Figura ilustrativa do espectro de onda e absorção da radiação ultravioleta (R-UV) na pele, indicando a profundidade de penetração na pele de cada tipo de radiação solar, sendo UV-C: radiação ultravioleta C; UV-B: radiação ultravioleta B; UV-A: radiação ultravioleta A. Fonte: Pupo, 2014.
11
A radiação UV-A, é responsável pela maioria dos sinais do envelhecimento
extrínseco, estando em igual intensidade independente do horário do dia ou estação
do ano. É indutora de processos oxidativos e ao ser absorvida, reage com o oxigênio
molecular, produzindo radicais livres capazes de induzir reações inflamatórias na
pele e danos ao DNA, além de degeneração às fibras colágenas e elásticas da pele.
A radiação UV-A é classificada em UV-A1 (entre 340 a 400 nm) e UV-A2 (entre 320
a 340 nm). Essa subdivisão decorre da semelhança entre a UV-A2 e a UV-B, por
seu efeito eritematogênico. A UV-A1 possui uma maior profundidade de penetração
agindo diretamente na derme (SOUZA, FISCHER e SOUZA, 2004).
A radiação UV-B atinge concentradamente a epiderme, sendo a principal
responsável pela maioria dos efeitos carcinogênicos na pele pelos danos diretos ao
DNA e fotoimunossupressão. Provoca eritema, queimaduras, espessamento do
estrato córneo e melanogênese, sendo principal agente do bronzeamento. É mais
intensa entre 10 AM e 4 PM (SOUZA, FISCHER e SOUZA, 2004).
A UV-C é um tipo de radiação altamente danosa e cancerígena, uma vez que
seu espectro de radiação coincide com o pico de absorção pelo DNA (260 nm). Por
sua curta penetração na epiderme, não é tão efetiva no estímulo à melanogênese. A
maior parte é filtrada pela camada de ozônio, porém, em certas regiões em que a
camada de ozônio apresenta falhas, parte dessa radiação atinge a superfície da
terra (PETRI, 2005).
Embora exerça um papel determinante, os efeitos danosos da luz sobre a pele
humana não podem ser atribuídos somente aos R-UV, uma vez que a interação
entre diferentes faixas de comprimentos de onda, como a luz visível e a
infravermelha, também influencia no desenvolvimento desses efeitos (PETRI, 2005).
Os efeitos agudos desencadeados pela exposição solar prolongada são de
caráter inflamatório (vermelhidão, dor ao toque, edemas locais, elevação dos níveis
de leucotrienos e prostaglandinas) e o bronzeamento, que é uma resposta endógena
da pele aos efeitos deletérios do sol, por meio do aumento da síntese de melanina
para proteger a pele das lesões solares. Os efeitos cumulativos crônicos levam ao
fotoenvelhecimento e carcinogênese (MANSUR, 2011; VELASCO et al., 2011).
A UV-A age indiretamente, ativando fatores envolvidos na transcrição do DNA
e causando mutações no DNA mitocondrial. A UV-B provoca danos diretos ao DNA
e mutações. Essa interação cria fotoprodutos que podem estar relacionados a
lesões cutâneas e desencadear câncer de pele (VELASCO et al., 2011).
12
Além disso, as R-UV são quase totalmente absorvidas pelos queratinócitos na
epiderme e penetram em profundidades variáveis na derme sendo influenciadas por
fatores individuais, raciais (coloração) e anatômicos (espessura da camada córnea).
A melanina é decisiva no mecanismo de absorção da luz solar, atuando como um
filtro óptico que capta a energia e estabiliza os radicais livres originados pela
radiação. Dessa maneira, indivíduos com fototipos cutâneos mais altos, possuem
uma maior fotoproteção endógena (SOUZA et al., 2005).
No ser humano, existem mecanismos naturais de proteção que são
desencadeados frente à exposição repetitiva aos R-UV, que incluem: secreção
sudorípara com ácido ascórbico, vitamina E e ácido urocânico, estimulo a
melanogênese e espessamento da camada córnea da epiderme. Esses mecanismos
protegem a pele até um determinado ponto em que os estímulos nocivos se
sobressaem sobre as estratégicas orgânicas (VELASCO et al., 2011).
2.4 Radicais livres, oxidação e dano celular
A exposição solar prolongada induz à formação de radicais livres na pele, como
as espécies reativas de oxigênio (ERO). Essas espécies estão envolvidas em
diversos processos bioquímicos, sendo fundamentais para a homeostase celular,
porém, a condição ideal é aquela em que há um equilíbrio entre a formação e a
remoção destes radicais. Em excesso, as ERO estabelecem um estado pró-
oxidante, ocasionando um estresse oxidativo orgânico (MANSUR, 2011).
Quimicamente, o termo oxidação consiste na perda de elétrons por um átomo
ou molécula que, diante desta condição, ficam instáveis e reativos. Na busca pelo
reequilíbrio, interferem em estruturas do interior da célula danificando-as e alterando
sua função. Estudos apontam as ERO formadas na pele pela exposição solar como
responsáveis pelos danos cutâneos causados pelo fotoenvelhecimento, uma vez
que interagem com os cromóforos intracelulares, ocasionando danos temporários ou
permanentes ao DNA, além de interferirem na degradação do tecido conjuntivo
(RIBEIRO, 2004; SARTORI, LOPES e GUARATINI, 2010).
A formação das ERO pela exposição solar e consequente formação do
estresse oxidativo estão associadas a vários processos de carcinogênese (indução
de alterações estruturais do DNA, mutações e transformação de tumores benignos
em malignos) (GUARATINI et al., 2009).
13
Existem substâncias, denominadas antioxidantes, capazes de agir nas ERO,
impedindo sua formação ou desativando-as antes que danifiquem o meio celular. Os
antioxidantes podem ser produzidos pelo próprio organismo (endógenos) como é o
caso dos hormônios estradiol e melatonina ou podem advir do consumo de
alimentos, como é o caso das vitaminas, carotenóides e compostos fenólicos
presentes em certas frutas e vegetais (SARTORI, LOPES e GUARATINI, 2010).
A atividade antioxidante dos compostos fenólicos, tais como os flavonóides,
deve-se a sua estrutura química, que possibilita a neutralização ou seqüestro de
radicais livres e quelação de metais de transição, agindo na iniciação e na
propagação do processo oxidativo. Os intermediários formados pela ação de
compostos fenólicos antioxidantes são relativamente estáveis pela ressonância do
anel aromático presente na estrutura destas substâncias (GUARATINI et al., 2009).
2.5 Envelhecimento cutâneo: fotoenvelhecimento
O envelhecimento é um processo natural e progressivo, tempo-dependente,
que implica em alterações celulares, com diminuição da função orgânica, tornando o
indivíduo mais predisposto a doenças e a morte. Fatores externos podem acelerar o
envelhecimento cronológico, provocando danos à pele. Dentre esses fatores, o de
maior importância é a exposição solar (fotoenvelhecimento). A maioria dos efeitos da
R-UV é conseqüência das reações inflamatórias e oxidantes desencadeadas na pele
pelas reações fotoquímicas (UITTO, 2001; BALOGH et al., 2011).
O fotoenvelhecimento é cumulativo e influenciado pelo nível de exposição solar
e pelo fototipo cutâneo do indivíduo. As R-UV provocam alterações histológicas
como o adelgaçamento da epiderme e o achatamento da junção dermoepidérmica
tornando os queratinócitos mais resistentes a apoptose e mais susceptíveis a
mutações de DNA tornando susceptível à carcinogênese (VELASCO et al., 2011).
Ocorre uma desorganização generalizada no metabolismo do colágeno, com
produção reduzida e degradação aumentada. O número de melanócitos reduz e sua
densidade é alterada, o que favorece o surgimento de discromias (alterações de
pigmentação da pele). A pele envelhecida pelo sol apresenta coloração amarelada,
com pigmentação irregular, enrrugada, atrófica, inelástica, desidratada e susceptível
a lesões neoplásicas (figura 8) (BARG, 2011).
14
Figura 8 – Sinais característicos do fotoenvelhecimento Fonte: Schmidt, 2010.
As discromias desencadeadas pela R-UV tem sua origem na alteração da
produção e distribuição da melanina e na interferência da produção da enzima
tirosinase, envolvida na melanogênese. Em função dos efeitos hiperpigmentantes
desta enzima, a busca por compostos inibidores de sua ação na pele tem sido
pesquisados e possuem grande potencial biotecnológico (SCHIMIDT, 2010).
2.6 Câncer de pele
O câncer de pele é considerado o tipo de câncer mais incidente na população
brasileira na atualidade, fato que têm preocupado autoridades de saúde pública e
motivado muitas campanhas de prevenção e diagnóstico precoce da doença
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).
Dentre os tumores de pele, o melanoma (figura 9), embora seja o menos
incidente (cerca de 4% dos casos), é o tumor mais importante por representar mais
de 79% das mortes. Fatores constitucionais como o fototipo cutâneo e antecedentes
familiares estão envolvidos no desencadeamento da doença, porém, a exposição
cumulativa a R-UV é considerada o principal deflagrador, por seus efeitos
mutagênicos ao DNA celular (URIST e SOONG, 2005; ALMEIDA, ALMEIDA e
MICHALANY, 2001).
Em geral, o melanoma cutâneo é de fácil diagnóstico e é curável em estágios
iniciais. Estima-se que pelo menos um terço dos novos casos de câncer poderia ser
evitado através da prevenção precoce através do uso correto e regular de
fotoproteção solar (DIMATOS et al., 2009).
15
Figura 9 – Melanoma cutâneo Fonte: Rezze, Sá e Neves, 2006.
Extratos vegetais de algumas espécies têm sido estudados em relação aos
seus efeitos frente às células tumorais melanocíticas. Extratos das cascas da
espécie pau-para-tudo (Rauwolfia sellowii Müll Arg; Apocynaceae) apresentaram
propriedades citotóxicas sobre os melanócitos, sugerindo potencial na terapêutica do
melanoma (SIENNA, 2008). Extratos do guaraná (Paullinia cupana var Mart. Sorbilis;
Sapindaceae), foram avaliados em modelo experimental de metástases de
melanoma B16/F10 e mostraram efeito no controle do crescimento tumoral,
sugerindo ação potencial para o tratamento do câncer de pele (FUKUMASO et al.,
2008).
2.7 Filtros solares e fotoprotetores
Os fotoprotetores são preparações cosméticas para uso tópico sobre a pele,
que atenuam os efeitos danosos da exposição as R-UV, agindo de maneira
preventiva no desencadeamento de disfunções estéticas como rugas e discromias,
características do fotoenvelhecimento. Uma vez que o Brasil está geograficamente
situado em uma zona de alta incidência de R-UV, seu uso correto e regular é
considerado uma medida eficiente e de baixo custo para prevenção do câncer de
pele, inclusive dos melanomas (CABRAL, PEREIRA e PARTATA, 2011).
16
Os fotoprotetores estão inseridos na classe terapêutica dos emolientes
(formulações destinadas a restaurar a hidratação da pele, exercendo efeito protetor
contra a desidratação da epiderme). No Brasil, são classificados como cosméticos e
podem ser categorizados em duas classes: orgânicos, quando existem compostos
orgânicos em sua composição e inorgânicos quando há a presença de óxidos
metálicos (GUARATINI et al., 2009).
Usualmente, os filtros solares orgânicos, comercialmente denominados filtros
químicos, possuem compostos aromáticos com grupos carboxílicos que são capazes
de absorver a R-UV e transformá-la em radiações menores e inofensivas à pele.
Entre os representantes desta classe estão a benzofena-3; o butil-metoxi-dibenzoil-
metano e o PABA (ácido paraminobenzóico) (PETRI, 2005; FLOR, DAVOLOS e
CORREA, 2007).
Os filtros inorgânicos, por sua vez, são comercialmente denominados filtros
físicos, refletem a radiação UV-B e, em menor grau, a radiação UV-A, por meio da
formação de um filme de partículas inertes sobre a pele. São principalmente
representados por dois óxidos: oxido de zinco (ZnO) e dióxido de titânio (TiO2), em
veiculo apropriado. Essa classe de fotoprotetores é considerada a mais segura e
eficaz com baixo potencial irritativo (FLOR, DAVOLOS e CORREA, 2007).
Como opção aos filtros solares orgânicos ou inorgânicos sintéticos, foi proposto
por Proserpio e colaboradores em 1976, o uso de extratos naturais como agentes
antissolares por meio da visualização de uma analogia estrutural dos metabólitos
secundários presentes em plantas com as estruturas bases de filtros solares
sintéticos, levando a um aumento do seu fator de proteção (PROSERPIO, 1976). Os
compostos fenólicos, sobretudo os flavonóides, possuem alto potencial antioxidante
atuando sobre os radicais livres, além de exercerem absorção da R-UV; atividade
anti-inflamatória e emoliente (PEREIRA, 2007).
Vários pesquisadores têm estudado a associação de extratos vegetais de
espécies ricas em compostos fenólicos para aumentar o fator de proteção solar de
fotoprotetores, com resultados satisfatórios. Entre as espécies avaliadas podem ser
citadas a hamamelis (Hamamelis virginiana L.; Hamamelidaceae), a camomila
(Matricaria recutita L.; Asteraceae), a castanha-da-índia (Aesculus hippocastanum
L.; Hippocastanaceae), a cáscara sagrada (Rhamnus prushiana DC.; Rhamnaceae),
a canela (Cinnamomum zeylanicum Blume.; Lauraceae) (RAMOS et al.; 1996).
Extratos do Ginkgo biloba (Ginkgo biloba L.; Ginkgoaceae) (PINTO et al., 2012); da
17
acerola (Malpighia glabra L; Malpighiaceae) (SOUZA, CAMPOS e PACKER, 2013) e
da erva-mate (Ilex paraguariensis A. St.-Hil; Aquifoliaceae) (BARG, 2010) também
aumentam o fator de proteção solar quando incorporados a fotoprotetores.
Para uso tópico sobre a pele, o filtro solar é incorporado a um veículo e passa a
ser denominado protetor solar ou fotoprotetor. O produto final deve possuir algumas
características, tais como: ser química, fotoquímica e termicamente inerte, atóxico,
hipoalergênico, com baixo potencial irritante; possuir solubilidade apropriada; não
ser absorvido pela pele sem alterar sua cor e ser compatível com a formulação e
material de acondicionamento (FLOR, DAVOLOS e CORREA, 2007).
A tendência atual do mercado cosmético é o uso associado de filtros solares
orgânicos e inorgânicos combinados em um mesmo produto de amplo espectro de
absorção R-UV, gerando potentes fotoprotetores, além da incorporação de óleos e
extratos vegetais que aumentam o fator de proteção solar e neutralizam radicais
livres, exercendo ação antioxidante (CABRAL, PEREIRA e PARTATA, 2011).
2.7.1 Fator de proteção solar (FPS)
A eficácia dos filtros solares pode ser determinada por metodologias in vitro e
in vivo, por meio da obtenção do valor de FPS, e está relacionada à radiação UV-B,
uma vez que é a faixa do espectro solar responsável pelo eritema (vermelhidão) da
pele. Para determinar o FPS in vivo, a relação entre o tempo necessário para a R-
UV provocar uma reação eritematosa mínima é avaliada por meio do cálculo da
dose mínima eritematosa (DME) em uma pele com e sem fotoprotetor (equação 1).
O resultado é expresso em minutos e indica o tempo que o indivíduo pode se expor
ao sol sem eritema (SOUZA et al., 2005; BORELI, 2007).
FPS = DEM da pele protegida
DEM da pele desprotegida
................................................(1)
Onde:
FPS = fator de proteção solar; DEM = dose eritematosa mínima.
1 Equação para cálculo do fator de proteção solar de um protetor solar in vivo
18
Os valores de FPS comerciais variam entre 6 a 100 e sua eficiência está
relacionada a fatores que devem ser observados: quantidade de produto a ser
utilizado, correta espalhabilidade, tempo entre as reaplicações, características da
pele (hidratação e espessura), tipo de fotoprotetor (orgânico ou inorgânico) e
condições ambientais (horário, altitude, longitude e estação do ano) (FLOR,
DAVALOS e CORREA, 2007).
Especialistas sugerem que a quantidade ideal de produto, aplicado 20 minutos
antes da fotoexposição, seja de 2,5 a 5,0mL para rosto e pescoço; 5,0 a 7,5mL para
braços e ombros; 5,0 a 7,5mL para tórax e abdômen e 10 a 12,5mL para pernas e
pés (POLONINI, RAPOSO e BRANDÃO, 2011; DUTRA et al., 2013).
Em 1993, o FDA (Food and Drug Administration) publicou uma recomendação
de que o FPS fosse limitado a 30, com base em estudos experimentais que
demonstraram, por meio de espectrofotometria que o ganho proporcional de
absorbância em relação ao aumento do valor do FPS é reduzido drasticamente
quando seu valor fica acima de 30 (tabela 2) (SCHALKA e REIS, 2011).
Porém, o uso do FPS 30 como valor máximo recomendado tem sido discutido
na literatura uma vez que estudos indicam que a quantidade de energia que passa
através do protetor solar de FPS 60 e atinge a pele é a metade daquela transmitida
pelo protetor de FPS 30, de modo que a proteção oferecida pelo produto de FPS 60
é o dobro daquela oferecida pelo produto com FPS 30, além do fato de que o FPS
quantifica apenas a proteção contra a queimadura solar, não sendo possível
determinar o percentual de proteção contra o desenvolvimento de neoplasias
cutâneas (SCHALKA e REIS, 2011).
Tabela 2 – Percentual de absorção da R-UVB frente ao valor de FPS
FPS Radiação UVB absorvida (%)
02 50,0%
08 87,5%
10 90,0%
16 93,6%
20 95,0%
25 95,7%
32 96,9%
45 97,8%
64 98,4%
Fonte: adaptada de Pupo, 2015
19
Em 2007, considerando esses aspectos, o FDA recomendou a elevação do
limite superior do valor do FPS para 50 e que a prescrição do valor do FPS seja
proposta dentro de uma faixa de proteção que considera o fototipo do indivíduo
(tabela 3) (SCHALKA e REIS, 2011).
Filtros solares com FPS acima de 50 devem ser utilizados com cautela por
terem risco aumentado para o desencadeamento de efeitos adversos como irritação
da pele, reações alérgicas de contato e fotoinstabilidade (LOPES, CRUZ e
BATISTA, 2012; NASCIMENTO, 2014).
Tabela 3 – Níveis de proteção solar em relação ao fototipo cutâneo e ao valor de FPS de um protetor solar
Nível de Proteção Fototipo cutâneo Valor de FPS
Máximo I a II >50
Alto II a III 30-50
Médio IV a V 15-30
Baixo V a VI 2-15
Fonte: adaptado de Schalka e Reis, 2011.
2.8 Metabólitos secundários: compostos fenólicos e flavonóides
O metabolismo secundário não está relacionado diretamente aos processos
essenciais à vida vegetal e comum a todas as espécies, porém, é importante para a
sobrevida, exercendo atividades biológicas em resposta aos estímulos de agressão
ambiental sobre a planta (PEREIRA e CARDOSO, 2012).
A origem de grande parte dos metabólitos secundários é no metabolismo da
glicose (figura 10) por meio de vias de dois intermediários: o acetato (ciclo do ácido
cítrico, via mevalonato e produtos da condensação do acetato) e o ácido chiquímico
(compostos aromáticos). Os metabólitos secundários podem ser encontrados livres
em sua forma (agliconas) ou podem estar unidos a uma ou mais unidades de açúcar
(SIMÕES et al., 2007).
20
Figura 10 – Ciclo biossintético dos metabólitos secundários das plantas, em que se pode visualizar as duas principais rotas metabólicas: ácido chiquímico e AcetilCoA. Fonte: adaptado de Simões et al., 2007.
Dentre os metabólitos secundários, os compostos fenólicos possuem papel de
destaque pelas inúmeras propriedades biológicas e terapêuticas sugeridas por
pesquisadores em todo o mundo. Os compostos fenólicos estão amplamente
distribuídos no reino vegetal e apresentam estruturas variadas, desde as mais
simples às mais complexas, como por exemplo: ácido fênico e a teaflavina,
respectivamente, sendo caracterizados por apresentar um anel aromático, onde, um
hidrogênio é substituído por uma hidroxila (figura 11) (ROCHA, 2011).
Estrutura do ácido fênico (fenol) mais simples dos compostos fenólicos, sendo
OH: grupamento hidroxila.
Estrutura do polifenol teaflavina, encontrado no chá verde, que apresenta estrutura complexa.
Figura 11 – Estrutura química de compostos fenólicos simples (ácido fênico) e complexo (teaflavina). Fonte: Marcucci, Woisky e Salatino, 2011.
21
Os compostos fenólicos são subdivididos em dois tipos: compostos
amplamente distribuídos (derivados dos ácidos cinâmicos e benzóicos, cumarinas,
flavonóides, taninos e ligninas); e compostos de distribuição restrita, que não
existem no estado livre na natureza, apenas sob a forma de ésteres ou
heterosídeos. Possuem intensa absorção na região do UV e são bastante oxidáveis
por meio de enzimas, luz e calor. Além disso, os compostos fenólicos conferem
sabor, coloração e odor a diversos vegetais (DEGÁSPARI, 2004).
Muitos estudos atribuem aos compostos fenólicos, especialmente aos
flavonóides, a capacidade de captar radicais livres, exercendo ação antioxidante,
além de possuírem propriedades antibacterianas e antivirais, sugerindo que doenças
relacionadas com estresse oxidativo possam ser retardadas por meio de sua
ingestão regular (DEGÁSPARI, 2004).
Os flavonóides são uma classe de polifenóis abundante entre os metabólitos
secundários das plantas, estando presente na maior parte dos vegetais como
pigmentos associados à função de defesa aos raios ultravioleta. Também exercem
ação antibacteriana e antifúngica nas plantas (PEREIRA e CARDOSO, 2012).
Entre as propriedades farmacológicas dos flavonóides estão à ação
antioxidante e prevenção do estresse oxidativo, a atuação sobre as lipoproteínas de
baixa densidade (LDL) prevenindo a arteriosclerose, além de atividades biológicas
importantes como antitumoral, antiulcerogênica, anti-hemorrágicas e
antinflamatórias. Desta forma, pesquisadores associam a ingesta de flavonóides à
longevidade e redução na incidência de doenças cardíacas e cardiovasculares
mediadas por estresse oxidativo (SIMÕES et al., 2007; PASCOAL, 2012).
Em relação à estrutura química, os flavonóides possuem dois anéis aromáticos
ligados por três átomos de carbono (C6-Cn-C6). Em sua maioria possuem 15 átomos
de carbono, constituído de duas fenilas ligadas por uma cadeia de carbonos entre
elas (figura 12). Pode-se identificar flavonóides nas diversas partes da planta
(sementes, cascas, frutos, folhas e raízes) em formas e concentrações diferentes
(DORNAS et al., 2007; SIMÕES et al., 2007).
22
Figura 12 – Estrutura química básica de um flavonóide. Fonte: adaptado de Marcucci, Woisky e Salatino, 2011.
De acordo com sua estrutura química (figura 13), os flavonóides podem ser
organizados em quatro diferentes classes: a) flavonas e flavonóis; b) flavanonas e
flavanonóis; c) flavanas, leoconantocianidinas e protoantocianidinas e d) chalconas.
(tabela 4). Essas classes diferem entre si pelo tipo de ligações, quantidade de
grupos hidroxila e presença ou ausência de cetonas e produzem pimentos de
coloração diferentes (PEREIRA e CARDOSO, 2012).
Figura 13 – Estrutura quimica de algumas classes de flavonóides. Fonte: Cerqueira, Medeiros e Augusto, 2011.
A atividade antioxidante dos flavonóides está relacionada à sua estrutura
química e a sua reatividade como agente doador de prótons, estabilidade do radical
flavonoil formado, reatividade frente a outros antioxidantes, capacidade de quelar
metais de transição, solubilidade e inteiração com as membranas celulares
(SARTORI, LOPES e GUARATINI, 2010).
23
A tabela 4 resume as principais subclasses de flavonóides, suas colorações e
exemplos de flavonóides representativos.
Tabela 4 – Principais subclasses de flavonóides e seus representantes
Sub Classe Coloração Exemplo de flavonóide
Flavona Amarelo Claro Apiginena, Lueolina
Flavonol Amarelo Claro Quercetina, Rutina
Flavanona Incolor ou amarelo Hesperidina, naringerina
Antocianidina Azul, vermelho e violeta Cianidina
Chalconas Amarela Mareína, Okaina
Fonte: adaptado de Simões et al., 2007
2.9 Família Myrtaceae: gênero Campomanesia
A família Myrtaceae constitui uma das maiores famílias pertencente à ordem
Myrtales, possuindo 150 gêneros e cerca de 3.600 espécies, distribuídas nas
regiões tropicais e subtropicais do mundo, com centros de diversidade na região
neotropical e na Austrália. No Brasil, está representada por 23 gêneros e
aproximadamente 1000 espécies que caracteristicamente possuem tronco de casca
lisa e que se renova a cada etapa de crescimento (LORENZI et al., 2006).
Esta família possui duas grandes subfamílias: Myrtoideae cujos maiores
gêneros são Eugenia (600 espécies), Myrcia (300 espécies) e Syzygium (200
espécies); e Leptospermoideae cujos maiores gêneros são Eucalyptus (500
espécies) e Melaleuca (100 espécies) (CERQUEIRA et al., 2009). As espécies de
Myrtaceae (figura 14) são plantas arbustivas ou arbóreas que possuem diversas
alturas, variando desde pequenos arbustos até grandes árvores. Gêneros
conhecidos na flora brasileira são: Psidium, Myrcia, Eugenia e Campomanesia
(CERQUEIRA et al., 2009; CONCEIÇÃO e ARAGÃO, 2010).
É grande o interesse econômico pelas espécies da família Myrtaceae no Brasil
uma vez que várias fornecem frutos de gosto agradável para alimentação, são
fontes para o fornecimento de madeira e possuem potencial ornamental. Possuem
propriedades biológicas e terapêuticas para o controle de doenças inflamatórias,
reumáticas e renais, justificadas pela presença frequente de metabólitos secundários
(LORENZI et al., 2006; CERQUEIRA et al., 2009).
24
Figura 14 – Características de algumas Myrtaceae brasileiras. A = córtex esfoliante; B = canais oleíferos presentes em folhas; C = folhas opostas; D – F: tipos de inflorescência; G = fruto carnoso do tipo baga Fonte: Oliveira, 2009.
Diversas atividades biológicas foram relatadas em várias espécies da família
Myrtaceae, como hipogligemiante na myrcia (Myrcia bella Cambess) e no jamelão
(Syzygium cumini L. Skells); antibacteriana na murta (Myrtus communis L.); e
gastroprotetora na cereja do mato (Eugenia involucrada DC) e na jaca (Artocarpus
heterophyllus Lam).
O gênero Campomanesia pertence à subtribo Myrtinae, sendo composto por
espécies arbóreas e arbustivas, distribuídas amplamente do Norte da Argentina a
Trindade e da Costa do Brasil ao Peru, Equador e Colômbia. As árvores estão
presentes nas florestas subtropicais e tropicais do Leste do Brasil, Norte da
Argentina e nos Andes, já os arbustos ocorrem nos cerrados do interior do Brasil.
Possui cerca de 30 espécies, 24 delas no Brasil. As plantas arbóreas medem entre 8
25
a 15 m, podendo chegar a 25 m, e as arbustivas, entre 0,80 e 1,5 m, usualmente em
moitas. Durante o período de inverno, ocorre caducifolia e, na primavera, as plantas
florescem e rebrotam (OLIVEIRA, SANTANA e SANTOS, 2011).
Suas flores são pequenas, brancas e hermafroditas. A floração ocorre entre
agosto a novembro e a frutificação entre setembro a novembro, começando a
produzir frutos em média um a dois anos depois do plantio. Seus frutos redondos e
amarelados. Polpa amarelada, suculenta, com muitas sementes. A principal forma
de multiplicação das espécies do gênero Campomanesia é feita por sementes
(OLIVEIRA, SANTANA e SANTOS, 2011; LORENZI et al., 2006).
2.9.1 Espécie Campomanesia adamantium (Cambess.) O. Berg
Campomanesia adamantium (Cambess.) O. Berg (figura 15), é uma espécie
arbustiva de ramos elípticos com cerca de 1,5 a 3,0 m de altura e copa
desorganizada. Ocorre no cerrado, do sul ao sudeste do Brasil, Argentina, Uruguai e
Paraguai (VALLILO et al., 2008).
Figura 15 – C. adamantium. Pode ser observada a característica arbustiva desta espécie e a forma e coloração dos frutos (A) folhas (B), flores (C). Fonte: Kuhlmann, 2012.
A B
C C
26
O tronco é tortuoso e ramificado desde a base, tem casca amarelada e
descamante em placas finas. As folhas são simples, opostas, oblongas (mais longa
que larga), glabrescentes (com quase nenhum pelo na folha madura) no caso de C.
adamantium com medidas que variam de 4,5 a 6,8 cm de comprimento por 1,5 a 2,3
cm de largura (GOGOSZ et al., 2010).
As flores nascem em ramos dicásios agrupados em pedúnculos longos ou
curtos, e cada flor mede de 1,0 a 1,5 cm de comprimento, são actinomorfas (com
vários planos passando num mesmo eixo), com cálice (invólucro esterno) com 5
lobos e corola (invólucro interno) com 5 pétalas brancas livres (KLAFKE et al., 2010).
Seus frutos são bagas arredondadas com casca fina de 1,5 a 2,6 cm de
diâmetro e com polpa saborosa, amadurecendo a partir de novembro. O epicarpo
maduro é amarelo, doce, suculento e aromático, abrigando de duas a seis sementes
ovaladas envoltas em mucilagem (VALLILO et al., 2008).
Embora sua frutificação seja expressiva, a maioria desses frutos não é
coletada, sendo consumidos por diversas espécies de pássaros e mamíferos
(SANTOS et al., 2010). Na alimentação humana, seu fruto pode ser ingerido in
natura, ou na forma de doces, sorvetes, geléias, licores, aguardentes e sucos
(GOGOSZ et al., 2010).
Os frutos in natura de C. adamantium apresentam baixo valor calórico (57
kcal.100 g-1) e altos teores de potássio, fósforo, magnésio, ferro, cobre e chumbo
relacionados à composição do solo de origem e à biodisponibilidade dos elementos
para absorção pela raiz da planta. O pH aproximado é de 3,9. A polpa apresenta 3,8,
0,1 e 1,0% de fibra bruta, lipídeos e proteínas respectivamente. O teor de vitamina C
é de 233,5mg.100g-1, o que corresponde a seis vezes o teor de vitamina C da laranja
(SANTOS et al., 2010).
Sua madeira é usada na produção de instrumentos musicais, agrícolas, cercas,
lenha e carvão. Por sua exuberante floração e frutificação, os frutos desta espécie
são atrativos para os pássaros, e contribuem para a manutenção dos ecossistemas.
Também é utilizada para plantio em pomares, praças e na recuperação de áreas
degradadas (GOGOSZ et al., 2010).
As folhas de C. adamantium são popularmente utilizadas, por meio de infusão,
como agente antidiarréico, depurativo do fígado, anti-inflamatório, anti-pirético,
antisséptico das vias urinárias e no tratamento da hipertensão, diabetes,
hipercolesterolemia e doenças reumáticas, fato relevante no sentido de que é muito
27
mais provável encontrar atividade biológica em plantas orientadas pelo seu uso na
medicina popular (YUNES e CALIXTO, 2001; CAMPOS et al., 2012)
Em estudos anteriores, o extrato vegetal liofilizado de suas folhas apresentou
atividade antimicrobiana em relação à Staphylococcus aureus; Salmonella
cholerasuis e Candida albicans, além de mostrar atividade citotóxica nos ensaios da
letalidade com Artemia salina (MARKMAN, 2002). Foram alcançados resultados
favoráveis também em relação à redução das taxas de colesterol (KLAFKE et al.,
2010). Outros estudos da atividade biológica de extratos das folhas desta planta
mostram que a mesma exibe propriedades hipoglicemiante e preventiva de úlceras
gástricas (MARTINEZ, SAVEGNAGO e LENARDÃO, 2011).
Estudos fitoquímicos por cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE), em
extratos das folhas de C. adamantium indicaram a presença de flavonóides
(quercetina, miricitrina e rutina) (SCHMEDA-HIRSCHMANN, 1995), taninos e
saponinas (SOUZA-MOREIRA et al., 2011). O extrato etanólico acidificado da folha
de C. xanthocarpa foi avaliado pelo método do radical ABTS para verificar sua
atividade antioxidante e foram encontrados elevados teores de compostos fenólicos
(SOUZA, CAMPOS e PACKER, 2013).
Os constituintes majoritários do óleo essencial das folhas de C. adamantium
são monoterpenos e sesquiterpenos, dos quais se destacam o (E)-nerolidol (28,8 %)
e o linalol (17,2 %). Porém, essa composição química pode variar de acordo com a
época de coleta, clima e solo (MARTINEZ, SAVEGNAGO e LENARDÃO, 2011). Foi
evidenciada a atividade antioxidante deste óleo por métodos in vitro por meio do
mecanismo de neutralização de radicais livres (MARKMAN, 2002).
A diversidade de plantas do cerrado brasileiro tem se apresentado como uma
rica fonte de princípios ativos oferecendo inúmeros produtos com importante
atividade biológica, destacando-se as propriedades antioxidantes. Há uma tendência
do mercado mundial pela incorporação desses extratos em formulações
dermocosméticas, agregando valor aos produtos e facilitando sua aceitação pelo
consumidor por fornecerem substâncias funcionais capazes de neutralizar radicais
livres e restabelecer a homeostasia da pele (RIVELI et al., 2008).
28
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar as atividades fitoquimica preliminar, antioxidante e fotoprotetora dos
extratos etanólicos das folhas e galhos de Campomanesia adamantium.
3.2 Objetivos específicos
Realizar a prospecção fitoquímica do extrato etanólico das folhas e galhos
de C. adamantium, buscando avaliar a presença de metabólicos
secundários de ação antioxidante, como compostos fenólicos;
Quantificar o teor de fenóis totais e flavonóides dos extratos das folhas e
galhos de C. adamantium;
Determinar o pH e a condutividade elétrica dos extratos etanólicos das
folhas e galhos de C. adamantium;
Avaliar a capacidade antioxidante dos extratos das folhas e galhos de C.
adamantium pelo método DPPH;
Avaliar a capacidade de absorção no espectro UV-A e UV-B dos extratos
das folhas e galhos de C. adamantium e calcular o fator de proteção solar
pelo método de Mansur et al. (1986);
Avaliar a ação dos extratos das folhas e galhos de C. adamantium sob a
inibição da enzima tirosinase;
Avaliar a toxicidade dos extratos das folhas e galhos de C. adamantium por
meio do ensaio com A. salina.
29
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Coleta e identificação do material botânico
Amostras de folhas e galhos de C. adamantium, foram coletadas sob as
seguintes coordenadas geográficas: S 20º 24´ 58.3” – W 54º 36’ 58.6”, em uma
altitude de 587m. na reserva particular da Universidade Católica Dom Bosco (UCDB)
no mês de abril de 2014 no município de Campo Grande, Mato Grosso do Sul.
Após a coleta, as amostras foram encaminhadas ao Herbário da Universidade
Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS) para identificação botânica da espécie,
realizada pela Profª. Ma. Vali Joana Pott, com o nº de registro CGMS 48492.
4.2 Preparação do extrato etanólico das folhas e galhos de C. adamantium
Após a coleta, o material foi separado em folhas e galhos e colocado em estufa
com circulação de ar forçada MVC-981F (Lawes®) a 40º C por três dias para
secagem, no Laboratório de Biotecnologia da Universidade Católica Dom Bosco
(UCDB).
As folhas e galhos secos foram pesados separadamente em balança ELP-25
(Balmak®). A massa seca das folhas foi de 1,42 kg e dos galhos de 0,84kg. Logo
após, o material foi triturado em liquidificador (Philips®). Foi adicionado álcool etílico
hidratado 92,8˚% (1:20), como solvente, por três dias. Os extratos foram filtrados e
acondicionados em frascos de vidro âmbar. Parte dos extratos brutos foi
concentrado, utilizando o rotaevaporador MA120 (Tecnal®).
Os extratos etanólicos das folhas e galhos de C. adamantium foram
submetidos a uma triagem fitoquímica qualitativa para avaliar a presença de fenóis,
taninos, flavonóides, cumarinas, triterpenóides, esteróides, saponinas, glicosídeos
cardiotônicos e alcalóides. O conteúdo de fenóis foi determinado pelo método Folin-
Ciocalteu´s e o teor de flavonóides foi avaliado tendo como padrão a quercetina.
30
O pH dos extratos etanólicos das folhas e galhos de C. adamantium foi
avaliado utilizando potenciômetro digital DM-20 (Digimed®), e a condutividade
elétrica foi aferida com condutivimetro DM3 (Digimed®).
A cromatografia em camada delgada (CCD) dos extratos etanólicos das folhas
e galhos de C. adamantium foi realizada buscando identificar as classes dos
compostos presentes nas amostras. Foi realizada a avaliação da absorção dos
extratos etanólicos de C. adamantium no espectro R-UV e posteriormente, o fator de
proteção solar (FPS) foi calculado pelo método de Mansur e colaboradores (1986)
Os extratos etanólicos das folhas e galhos de C. adamantium foram ainda
submetidos ao teste de inibição da enzima tirosinase; avaliação da atividade
antioxidante pelo método DPPH e ao teste de toxicidade frente à A. salina.
4.3 Triagem fitoquímica do extrato etanólico de folhas e galhos de C.
adamantium
Foram realizados testes colorimétricos nos extratos etanólicos das folhas e
galhos de C. adamantium para investigar qualitativamente a presença dos seguintes
metabólitos secundários: fenóis, taninos, flavonóides, cumarinas, triterpenóides,
esteróides, saponinas, glicosídeos cardiotônicos (compostos com ação altamente
específica e potente sobre o músculo cardíaco) e alcalóides, segundo metodologia
citada por Matos (2009) e por Silva e colaboradores (2010). As análises foram
executadas em triplicata e os resultados foram comparados e contrastados
observando alteração de cor e precipitação de partículas.
4.3.1 Teste para fenóis e taninos
A um volume de 3 mL do extrato etanólico de folhas e galhos de C.
adamantium foi adicionado três gotas de solução de cloreto férrico (FeCl3). Após
agitação vigorosa, verificou-se a variação de cor ou a formação de precipitação
abundante e escura. Em outro tubo de ensaio foi preparado o teste controle para a
presença de fenóis e taninos, usando 3 mL de água e 3 gotas de FeCl3. A formação
de coloração variável entre azul e vermelho, indicou presença de fenóis comparada
com o teste controle. Precipitado escuro de tonalidade azul indicou presença de
taninos hidrolisáveis e precipitado verde, a presença de taninos condensados.
31
4.3.2 Teste para taninos
A um volume de 2 mL do extrato etanólico de folhas e galhos de C.
adamantium foi adicionado 10% de cloreto de sódio (NaCl) e solução de gelatina a
1% (Galena), gota a gota. O teste foi considerado positivo para taninos ao formar
precipitado ou turvação.
4.3.3 Teste para flavonóides (flavonóis, flavonas e xantonas)
A presença de flavonóides foi avaliada pela Reação de Shinoda (Silva et al.,
2010). A um volume de 2 mL do extrato etanólico de folhas e galhos de C.
adamantium foi adicionado 2 mL de ácido clorídrico (HCl) concentrado (PA A.C.S
Sal-R) e 0,5 cm de magnésio (Mg) em fita. O teste foi considerado positivo quando o
produto da reação desenvolveu coloração rósea a vermelha. Após o fim da
efervescência, foi observada, por comparação, a mudança na cor da mistura da
reação em tubos previamente acidulados. O aparecimento ou intensificação da cor
vermelha indicou a presença de flavonóis, flavonas e/ou xantonas livres.
4.3.4 Teste para flavonóides (antocianidinas, antocianinas e flavonóis)
Foram preparados três tubos de ensaio com 3 mL do extrato etanólico de
folhas e galhos de C. adamantium em cada um. O primeiro foi acidulado até pH 3,
com ácido acético (C2H4O2); o segundo e o terceiro tubo foram alcalinizados até o
pH 8,5 e 11 respectivamente, usando solução de hidróxido de sódio (NaOH) a 5%. A
mudança na coloração do material foi analisada segundo quadro 1.
Quadro 1 – Alterações observadas na coloração do meio a serem avaliadas para o teste para antocianidinas, antocianinas e flavonóides.
Classes de substâncias
Coloração do meio
Ácido
(pH 3,0)
Alcalino
(pH 8,5)
Alcalino
(pH 11)
Antocianidinas e Antocianinas Vermelho Lilás Azul púrpura
Flavonois - - Vermelho púrpura
Fonte: Matos, 2009.
32
4.3.5 Teste para flavonóides (leucoantocianidinas, catequinas e flavonas)
Foram preparados dois tubos de ensaio com 3 mL de extrato etanólico de
folhas e galhos de C. adamantium em cada um. O primeiro tubo foi acidificado por
adição de HCl para que seu pH estivesse entre 1,0 e 3,0 e o segundo tubo foi
alcalinizado com NaOH a 5% para que seu pH estivesse em torno de 11,0. Os tubos
foram levados à placa de aquecimento à 38º C por 3 min em um Becker com água
destilada. A mudança na coloração do material foi analisada segundo quadro 2.
Quadro 2 – Alterações observadas na coloração do meio a serem avaliadas para o teste para leucoantocianidinas, catequinas e flavonas.
Classes de substâncias
Coloração do meio
Ácido (pH 1,0 a 3,0) Alcalino (pH 11)
Leucoantocianidinas Vermelho -
Catequinas Pardo-amarelado -
Flavonas - Vermelho-laranja
Fonte: Matos, 2009.
4.3.6 Saponinas
Em um tubo de ensaio com 3 mL do extrato etanólico de folhas e galhos de C.
adamantium, foi acrescentado 5 mL de água destilada. O tubo foi agitado em Vortex
VM 3000 (Gemmy Industrial) por 3 min e após a agitação, observou-se a formação
ou não de espuma persistente e abundante (colarinho), o que indicou a presença de
saponinas.
4.3.7 Cumarinas
Em um tubo de ensaio com 3 mL do extrato etanólico de folhas e galhos de C.
adamantium, adicionou-se 1mL de solução alcalina de NaOH a 5%. O aparecimento
de coloração amarela indicou resultado positivo para a presença de cumarinas.
33
4.3.8 Glicosídeos cardiotônicos
Avaliados pela reação de Keller-Kiliani (Silva et al., 2010). A um volume de 3
mL do extrato etanólico de folhas e galhos de C. adamantium foi adicionado 1 mL de
ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado, contendo sais férricos. O teste foi considerado
positivo quando ocorreu a formação de um anel vermelho pardo.
4.3.9 Teste para esteróides e triterpenóides
Avaliados pela reação de Liberman-Buchard (Silva et al., 2010). Adicionou-se
15 mL do extrato etanólico de folhas e galhos de C. adamantium em um funil de
separação e 15 mL de água destilada, para formar uma solução hidroalcoólica e
possibilitar a extração líquido:liquido (v:v) com diclorometano. Foi adicionado 1 mL
de anidrido acético (C4H6O3), agitado e adicionado três gotas de ácido sulfúrico
(H2SO4) concentrado, na capela. Após agitação suave foi observado o
desenvolvimento de cores. Azul escuro seguido de verde foi considerado indicativo
da presença de esteroides livres. A cor parda até vermelha indicou a presença de
triterpenóides pentacíclicos livres.
4.4 Determinação dos fenóis totais pelo método Folin-Ciocalteu’s
O teor de fenóis totais do extrato etanólico de folhas e galhos de C.
adamantium foi mensurado utilizando metodologia adaptada de Sousa e
colaboradores (2007), empregando o Método Folin-Ciocalteu’s. Foram analisadas
100 mg de cada amostra em espectrofotômetro Evolution60 (Thermo Scientific®) na
região de 750 nm, por interpolação da absorbância das amostras por meio da curva
de calibração (y = 0,0763x - 0,0227; R² = 0,9991) construída com padrões de ácido
gálico (10 a 300.μg.mL-1). O delineamento experimental foi de três repetições para
cada concentração e o cálculo das médias foi acompanhado do desvio padrão.
34
4.5 Determinação dos flavonóides totais
Para quantificação dos flavonóides do extrato etanólico de folhas e galhos de
C. adamantium, utilizou-se como padrão a quercetina (0,5 mg.mL-1) para construção
da curva de calibração nas concentrações de: 200; 300; 400; 550; 700; 800 μg.mL-1
(y= 0,132 x + 0,0353 R² = 0,9949) (SOBRINHO et al., 2008). As análises foram
realizadas em espectrofotômetro Evolution60 (Thermo Scientific®) no comprimento de
onda de 420 nm. Foram realizadas três repetições para cada concentração e o
cálculo das médias foi acompanhado do desvio padrão.
4.6 Determinação do pH
Para avaliação do potencial hidrogeniônico foi utilizado potenciômetro digital
DM-20 (Digimed ®). Foram realizadas três repetições para cada amostra do extrato
etanólico das folhas e galhos de C. adamantium. O cálculo das médias foi
acompanhado do desvio padrão.
4.7 Determinação da condutividade elétrica
Para avaliação da condutividade elétrica foi utilizado condutivímetro da marca
DM3 (Digimed ®). Foram realizadas três repetições para cada amostra do extrato
etanólico das folhas e galhos de C. adamantium. O cálculo das médias foi
acompanhado do desvio padrão.
4.8 Cromatografia em camada delgada (CCD)
A determinação do perfil cromatográfico dos extratos etanólicos das folhas e
galhos de C. adamantium por CCD foi realizada por meio da técnica de
cromatografia por adsorção em placa. Como reagentes e soluções foram utilizados
para a primeira fase móvel (8:2): hexano (CH₃CH₂) e acetato de etila (C4H8O2); para
a segunda fase móvel (9:1): clorofórmio (CHCl3) e metanol (CH4O) e para a terceira
fase móvel (6,5:3,0:0,5) (v:v:v): clorofórmio; metanol e água. Os reveladores
utilizados estão descritos no quadro 3.
35
Quadro 03 – Reveladores utilizados para a CCD dos extratos etanólicos das folhas e galhos de C. adamantium.
Compostos a avaliar Revelador Componentes
Flavonóides Sulfato cérico Sulfato cérico (Ce (SO4)2)
Água destilada q.s.p. 100 mL
Taninos e fenóis Cloreto
férrico
Cloreto férrico (FeCl3) 5%
Água destilada q.s.p. 100 mL
Terpenos Lieberman
Burchard
Ácido sulfúrico (H2SO4) 0,1 mL
Anidrido acético (C4H6O3) 5 mL
Alcalóides Drangerdoff Carbonato de bismuto (Bi2O2(CO3)) 5 g
Iodeto de potássio (KI) 25 g
Ácido clorídrico (HCL)12 mL
Fonte: Autora, 2015.
Com bastão de vidro foi retirada uma pequena quantidade do extrato etanólico
das folhas e posteriormente dos galhos de C. adamantium e transferido para um
tubo de ensaio. Foi adicionado 1 mL de álcool etílico para dissolução do extrato e
em seguida agitou-se em vórtex VM 3000 (Gemmy Industrial). As placas de
cromatografia foram cortadas com 5 cm de altura, sendo sua largura determinada
pelo tamanho do Becker utilizado. Os extratos foram pipetados uma vez na placa de
cromatografia. A placa com o extrato foi colocada nas fases móveis presentes nos
Becker, que permaneceram tampados.
O revelador adequado a cada fase foi borrifado nas placas contendo as
amostras em quantidade suficiente para preenchê-las e após a secagem, procedeu-
se a leitura das corridas e cálculo do fator de retenção (Rf) segundo a equação 2:
Rf = 𝐷𝑀𝐸
𝐷𝑀𝑆.
.................................................(2)
Onde:
RF = fator de retenção; DME = deslocamento móvel do extrato; DMS =
deslocamento móvel do solvente.
2 Equação para cálculo do fator de retenção para a CCD
36
4.9 Atividade antioxidante pelo seqüestro de radicais DPPH
A capacidade antioxidante dos extratos etanólicos das folhas e galhos de C.
adamantium foi avaliada pela presença do radical livre estável DPPH (2,2-difenil-
1picril-hidrazil), segundo método descrito por Silvério, Castro e Miranda (2013).
Como padrão positivo foi utilizado o ácido L-ascórbico C6H8O6 (Vitamina C) por
sua comprovada ação antioxidante (WEILER, 2010). O ácido L-ascórbico é um
composto hidrossolúvel vital para o funcionamento celular e que age como
antioxidante em muitos processos celulares, especialmente na pele. Inibe a
melanogênese convertendo doopaquinona em DOPA, impedindo a formação da
melanina (MANELA-AZULAY, 2003; SILVÉRIO, CASTRO e MIRANDA, 2013).
Uma alíquota de 2,0 mg de DPPH foi dissolvida em 100 mL de etanol,
resultando em uma solução de concentração 20 mg.L-1 (500 µM), com absorbância
em torno de 0,4 U. Alíquotas de volumes entre 0 e 1000 µL das soluções estoque da
amostra do extrato etanólico de folhas e galhos de C. adamantium e de ácido L-
ascórbico foram transferidas. Foi adicionado etanol, até completar o volume em 1
mL. Em seguida, foram adicionados 4 mL de DPPH. As misturas foram deixadas em
repouso em local escuro, por 30 minutos, e suas absorbâncias medidas a 517 nm.
Soluções de compensação foram feitas usando apenas etanol no lugar da
solução de DPPH e serviram como controle negativo. Todas as medidas foram
realizadas em três experimentos independentes, cada um em triplicata, e os
resultados foram expressos em mg.L-1 como média e desvio padrão.
A capacidade antioxidante foi calculada pela equação abaixo como sendo o
percentual de DPPH sequestrado em cada concentração (equação 3):
% 𝐷𝑃𝑃𝐻 𝑠𝑒𝑞 =𝐴𝑏𝑠 (𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒) − [ 𝐴𝑏𝑠 (𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎) − 𝐴𝑏𝑠 (𝑐𝑜𝑚𝑝𝑒𝑛𝑠𝑎çã𝑜)]
𝐴𝑏𝑠 (𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒) 𝑋 100
....(3)
3 Equação para cálculo do DPPH
37
Os dados obtidos foram usados para calcular a porcentagem de atividade
antioxidante (%AA), que corresponde à quantidade de DPPH consumida pelo
antioxidante. Posteriormente, foi calculada a concentração eficiente (CE50),
entendida como a quantidade de antioxidante necessária para decrescer a
concentração inicial de DPPH em 50%. Esse índice é relevante porque quanto maior
o consumo de DPPH por uma amostra, menor será a sua CE50 e maior a sua
atividade antioxidante (SOUSA et al., 2007).
4.10 Espectrofotometria na região do ultravioleta
A espectrofotometria de absorção no espectro da R-UV (nas absorbâncias 290
a 400 nm) dos extratos etanólicos das folhas e galhos de C. adamantium foi
realizada em espectrofotômetro Evolution60 (Thermo Scientific ®). Foram realizadas
três repetições e o cálculo das médias foi acompanhado do desvio padrão.
4.11 Cálculo do FPS
Para determinar o FPS in vitro foi utilizado o método de Mansur e
colaboradores (1986), para uma avaliação rápida e eficaz, apresentando excelente
correlação com resultados in vivo, sendo amplamente citado e discutido na literatura
(MANSUR et al., 1986; RIBEIRO, 2004; ARAUJO e SOUZA, 2008; ROSA et al.,
2008; VIOLANTE et al., 2009; VELASCO et al., 2011; MANSUR, 2011; SOUZA,
CAMPOS e PACKER, 2013).
O extrato etanólico das folhas e galhos de C. adamantium foi submetido à
leitura em espectrofotômetro Evolution60 (Thermo Scientific ®) para a determinação
das absorbâncias na faixa de comprimento de onda de 290 a 320 nm (faixa da
radiação UV-B), sendo a absorbância mensurada a cada 5 nm. Após a varredura, os
dados foram submetidos à equação abaixo proposta por Mansur e colaboradores
(1986), que relaciona o efeito eritematogênico e a intensidade da radiação (EE X I)
(equação 4).
38
𝐹𝑃𝑆 = 𝐹𝐶 . Σ 290320 . 𝐸𝐸(𝜆). 𝑎𝑏𝑠 (𝜆)) .
...................(4)
Onde:
FPS = fator de proteção solar; FC = fator de correção (=10), determinado de acordo
com dois filtros solares de FPS conhecidos de tal forma que um creme contendo 8%
de homossalato resultasse no FPS 4; EE(ƛ) = efeito eritemogênico da radiação de
comprimento de onda (ƛ); I (ƛ) = a intensidade da luz solar no comprimento de onda
(ƛ) e Abs (ƛ) = a absorbância da formulação no comprimento de onda (ƛ).
Os valores de EE (ƛ) e I (ƛ), descritos no quadro 4, foram calculados por Sayre
e colaboradores (1979), citado por Borghetti e Knorst (2006).
Quadro 04 – Relação efeito eritemogênico (EE) versus intensidade da radiação (I) conforme o comprimento de onda (ƛ)
I (nm) EE x I
290 0,0150
295 0,0817
300 0,2874
305 0,3278
310 0,1864
315 0,0839
320 0,0180
S 1,0000
Fonte: Borghetti e Knorst, 2006.
4 Equação para cálculo do FPS segundo método de Mansur e colaboradores (1986).
39
4.12 Ensaio de inibição da tirosinase
A atividade da tirosinase foi determinada por meio do ensaio descrito por
Silvério, Castro e Miranda (2013). O inibidor utilizado como controle positivo foi o
ácido Kójico (5-hidroxi-hidroximetil-β-pirona). Essa substância é um agente natural
obtido do fungo Aspergillus oryzae e age inibindo a atividade da enzima tirosinase,
sendo comercialmente utilizado em formulações dermocosméticas como
despigmentante, pois impede a formação de melanina, pela captura de íons cobre
necessária a atividade da tirosinase (OLIVEIRA et al., 2007; SOUZA, 2011).
Para cada amostra foram preparadas 3 soluções: uma contendo 500 µL de
tampão fosfato (pH 7,0), 2 mL de tirosinase de cogumelo (Agaricus bisporus) (200
U.mL-1) adquirida da Sigma Chemical e 50 µL da amostra da solução com extrato
etanólico das folhas ou dos galhos de C. adamantium (1000 ppm); outra contendo
500 µL de tampão fosfato (pH 7,0), 2 mL da tirosinase de cogumelo (200 U.mL-1) e
50 µL de etanol e outra contendo 500 µL de tampão fosfato (pH 7,0), 2 mL de
tirosinase de cogumelo (200 U.mL-1) e 50 µL de ácido Kójico (1000 ppm).
Após 5 min de preparo, 2 mL de solução de 2 mM de L-tirosina foram
adicionados a cada solução teste. A absorção a 475 nm foi monitorada em função
do tempo (30 e 60 min). A variação da absorbância foi comparada na presença e
ausência dos extratos etanólicos das folhas e galhos de C. adamantium para
verificar a ocorrência de inibição da tirosinase.
4.12.1 Quelação com íons Cu2+
O termo quelante é aplicado ao composto químico formado por um íon metálico
unido por várias ligações covalentes a uma estrutura heterocíclica de compostos
orgânicos como aminoácidos ou peptídeos. O cobre é um elemento químico
classificado como metal de transição, que pode ser quelado pela tirosinase como
inibidor incompetitivo (CHANG, 2009).
Conforme proposto por Silvério, Castro e Miranda (2013), a capacidade
quelante em relação aos íons Cu2+ do extrato etanólico das folhas e galhos de C.
adamantium foi avaliada por medidas de absorbância na faixa entre 260 a 500 nm.
40
Inicialmente foi encubado 500 µL da solução do extrato etanólico das folhas e
galhos de C. adamantium (1000 ppm), 500 µL da solução de ácido kójico (1000
ppm) e 2 mL de tampão fosfato (pH 6,5) sendo obtido 2 amostras. Em seguida, foi
realizada a leitura da absorbância na faixa entre 260 a 500 nm. Após a leitura foi
adicionado 100 µL da solução de sulfato de cobre (CuSO4) às amostras e foi
verificada novamente a absorbância.
Após, foi adicionado 100 µL da solução de EDTA (250 µM). O EDTA (ácido
etilenodiamino tetracético dissódico) é um poderoso oxidante que potencializa a
quelação de metais (SATO et al., 2010). Foi realizada novamente a leitura de
absorbância verificando a ocorrência de alteração das medidas anteriores.
4.13 Toxicidade frente à Artemia salina
Foram utilizados náupilos do 2° estágio, obtidos de cistos de A. salina
eclodidos em solução salina após 48 hs, sob iluminação parcial. Os testes
preliminares foram realizados em várias concentrações: 0,5; 0,25, 0,125; 0,062 e
0,031 mg.mL-1 a partir de uma solução estoque de 0,5 mg.mL-1, preparada
adicionando-se 0,015 g do extrato etanólico das folhas e galhos de C. adamantium
em um volume final de 30 mL de solução salina a 1% de dimetilsulfóxido (CH₃)₂SO
(DMSO). Em cada concentração, foram utilizados 10 náupilos. Os testes foram
realizados em quadruplicata. Como controle branco foi utilizado a água declorada e
como controle negativo a rotenona (C23H22O6), substância química inodora usada
como inseticida que ocorre naturalmente nas raízes e talos de muitas plantas
(ROBERTSON e SMITH-VANI, 2008).
Em todos os testes, as larvas foram deixadas em contato com as soluções dos
extratos etanólicos das folhas e galhos de C. adamantium por 24h. Em seguida, foi
determinado o número de mortos e sobreviventes e realizada a contagem dos
indivíduos mortos. Os dados foram expressos em percentual de mortalidade.
Os dados de mortalidade foram obtidos por meio de três ensaios, cada um com
quatro réplicas para cada concentração e seus respectivos controles negativo
apenas com solução salina e positivo com rotenona foram submetidos ao método
Probit (McLAUGHLIN, ROGERS e ANDERSON, 1998), pelo software Leora ® e a
análise foi estabelecida pelas faixas de correlação de 0,90; 0,95 e 0,99 definindo
então os valores das concentrações letais para 10, 50 e 90%.
41
5. RESULTADOS
5.1 Caracterização físico-química dos extratos etanólicos de folhas e galhos de
C. adamantium.
Os resultados da prospecção fitoquímica para os extratos etanólicos das folhas
e galhos de C.adamantium estão apresentados na tabela 5.
Tabela 5 – Resultados das analises fitoquímicas dos extratos etanólicos das folhas e galhos de C.adamantium, fenóis totais, flavonóides, pH e condutividade elétrica.
TESTES C. adamantium
ETOHfolhas ETOHgalhos
Fenóis e Taninos + +
Taninos ++ +++
Flavonóides ++ +++
Antocianidinas, antocianinas + +
Leucoantocianidinas, catequinas e flavonas + +
Cumarinas +++ ++
Triterpenóides - -
Esteróides - -
Saponinas ++ +
Glicosídeos cardiotônicos + ++
Alcalóides - -
C. F. Totais mg.g-1 (ácido gálico) 12,78 ± 0,53 3,51 ± 0,18
Fl. mg.g-1 (quercetina) 9,63 ± 0,01 0,54 ± 0,00
pH 5,30 ± 0,01 5,43 ± 0,06
Condutividade (μS cm-1) 17,92 ± 0,08 21,67 ± 0,07
ETOHfolhas= extrato etanólico das folhas de C. adamantium; ETOHgalhos= extrato etanólico dos galhos C. adamantium. Pequena intensidade (+), média (++), grande (+++) e, inexistente (-). C.F.= compostos fenólicos; Fl= flavonóides. Os resultados numéricos estão acompanhados do desvio padrão. Fonte: autora, 2015.
42
Foi detectada a presença de compostos fenólicos (fenóis, taninos condensados
e hidrolisáveis e flavonóides) tanto no extrato etanólico das folhas como nos galhos
de C. adamantium, com uma maior concentração de taninos e flavonóides nos
galhos. O teste específico para taninos, com adição de gelatina e cloreto de sódio,
indicou a presença do composto nos extratos etanólicos das folhas e galhos de C.
adamantium, havendo maior concentração nos galhos em relação às folhas.
Dentre as classes de flavonóides pesquisadas, foram encontrados flavonóis,
flavonas, xantonas, antocianidinas, antocianinas, leucoantocianidinas, catequinas e
flavonas nos dois extratos etanólicos estudados de C. adamantium (folhas e galhos).
Foram obtidos resultados positivos quanto à presença de saponinas, sendo
detectada espuma à agitação nos dois extratos etanólicos de C. adamantium (folhas
e galhos). Cumarinas também foram encontradas nos extratos etanólicos de C.
adamantium (folhas e galhos) sendo a maior concentração no extrato das folhas.
Glicosídios cardiotônicos foram predominantes no extrato etanólico dos galhos,
embora também tenham sido detectados em menor quantidade no extrato etanólico
das folhas de C. adamantium. Triterpenóides não foram encontrados no extrato
etanólico de C. adamantium.
O conteúdo de fenóis totais expresso por mg.g-1 (ácido gálico) foi de 12,78 ±
0,53 para o extrato das folhas de C. adamantium e 3,51 ± 0,18 para os galhos. O
conteúdo de flavonóides expresso em mg.g-1 (quercetina) foi de 9,63 ± 0,01 para as
folhas de C. adamantium e de 0,54 ± 0,00 para os galhos.
O pH médio do extrato etanólico das folhas de C. adamantium foi de 5,30 ±
0,01 e dos galhos de 5,43 ± 0,06. Ambos indicaram leve tendência à acidez. Para a
condutividade elétrica média, os valores foram de 17,92 ± 0,08 para o extrato das
folhas de C. adamantium e de 21,67 ± 0,07 para o extrato etanólico dos galhos.
5.2 Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
A cromatografia em camada delgada para o extrato etanólico das folhas e dos
galhos de C. adamantium revelou a presença de flavonóides, fenóis ou taninos e
terpenos, conforme detalha a Tabela 6.
No extrato das folhas de C. adamantium foram identificadas sete classes de
flavonóides. Em relação aos fenóis ou taninos, também foram localizados sete
compostos diferentes. Foram observadas cinco classes de terpenos.
43
No extrato dos galhos de C. adamantium foram identificadas duas classes de
flavonóides; duas classes de fenóis ou taninos e quatro classes de terpenos.
Tabela 6 – Resultado da cromatografia por arraste a vapor para o extrato etanólico das folhas e galhos de C. adamantium.
CCD para o extrato etanólico das folhas de C. adamantium
CCD para o extrato etanólico dos galhos de C. adamantium
Hex = hexano; AcTEOH = acetato de etila; CH2Cl2 = diclorometano; MeOH = Metanol; H2O = água; Rf = fator de correção. Fonte: autora, 2015.
44
5.3 Atividade antioxidante pelo seqüestro de radicais DPPH
A porcentagem de atividade antioxidante (%AA) corresponde à quantidade de
DPPH consumida pelo antioxidante. A %AA dos extratos etanólicos das folhas e
galhos de C. adamantium em diferentes concentrações estão expressos na tabela 7.
Tabela 7 – Atividade antioxidante dos extratos etanólicos das folhas e galhos de C. adamantium.
Concentração
(g)
AA (%)
ETOHfolhas
AA (%)
ETOHgalhos
0,1 93,91 93,90
0,2 93,15 93,87
0,3 91,15 93,79
0,4 84,71 93,65
0,5 85,10 91,57
0,6 84,86 92,84
0,7 83,09 94,41
0,8 82,07 92,49
0,9 81,26 92,34
1,0 80,88 88,43
ETOHfolhas = extrato etanólico das folhas de C. adamantium; ETOHgalhos= extrato etanólico dos galhos C. adamantium; AA(%)=atividade antioxidante. Fonte: autora, 2015.
Os valores de CE50 (quantidade de antioxidante necessária para decrescer a
concentração inicial de DPPH em 50%) para os extratos etanólicos de folhas e
galhos de C. adamantium estão apresentados na Tabela 8.
Tabela 8 – Atividade antioxidante CE50 dos extratos etanólicos das folhas e galhos de C. adamantium e do padrão ácido ascórbico.
Composto avaliado CE50
Ácido L- ascórbico 56,46 0,38
ETOHfolhas 83,27 ±2,49
ETOHgalhos 34, 68 ±0,88
ETOHfolhas = extrato etanólico das folhas de C. adamantium; ETOHgalhos= extrato etanólico dos galhos C. adamantium; CE50=concentração eficiente Fonte: autora, 2015.
45
5.4 Espectrofotometria na região do R-UV
Na varredura espectrofotométrica dos extratos etanólicos das folhas e galhos
de C. adamantium, os dois extratos apresentaram absorção nos comprimentos de
onda da R-UV, conforme demonstra a figura 16.
Figura 16 – Absorbância média do extrato etanólico das folhas (cinza) e galhos (hachurado) de C. adamantium no espectro da radiação UV-A e UV-B (290 nm a 400 nm). O eixo x corresponde aos comprimentos de onda em que a varredura foi realizada e o eixo Y corresponde à absorbância média de cada extrato etanólico.
A figura 17 ilustra a absorbância média dos extratos etanólicos das folhas e
galhos de C. adamantium no espectro da R-UVB (290 nm a 320 nm), uma vez que a
absorbância nessa faixa de radiação é o parâmetro utilizado para cálculo do FPS.
Figura 17 – Absorbância média do extrato etanólico das folhas (linha contínua) e galhos (linha pontilhada) de C. adamantium no espectro da radiação UV-B
46
Os resultados para a determinação do FPS dos extratos etanólicos avaliados
foram calculados segundo a metodologia de Mansur e colaboradores (1986) e
descrita por Rosa e colaboradores (2008) e estão apresentados na Tabela 9.
Tabela 9 – FPS do extrato etanólico das folhas e galhos de C. adamantium.
Comprimento
de onda (nm)
EE X I ABS
ETOHfolhas
FPS
ETOHfolhas
ABS
ETOHgalhos
FPS
ETOHgalhos
290 0,015 2,58 1,44 3,53 2,14
295 0,082 2,68 8,15 3,63 11,99
300 0,287 3,73 39,82 3,73 43,32
305 0,328 4,05 49,34 4,14 54,87
310 0,186 4,38 30,31 4,38 32,97
315 0,084 4,46 13,91 4,59 15,59
320 0,018 4,11 2,75 4,278 3,11
FPS (Médio) 20,82 ≈ 21 23,43 ≈ 23
ETOHfolhas= extrato etanólico das folhas de C. adamantium; ETOHgalhos= extrato etanólico dos galhos C. adamantium. EE X I = Relação efeito eritemogênico (EE) X intensidade da radiação (I) conforme o comprimento de onda (ƛ); ABS = absorbância; FPS = fator de proteção solar. Fonte: autora, 2015.
Para o extrato das folhas de C. adamatium foi obtido o valor médio de FPS de
21 e para o extrato dos galhos o valor médio de FPS de 23.
5.5 Inibição da enzima Tirosinase
O resultado do teste de inibição da enzima tirosinase dos extratos etanólicos
das folhas e dos galhos de C. adamantium está expresso na figura 18. Não houve
inibição significativa da tirosinase dos extratos etanólicos quando comparados ao
controle positivo, obtendo valores médios de absorbância superiores ao ácido
Kójico.
47
Figura 18 – Percentual de ação dos extratos etanólicos de folhas e galhos de C. adamantium e do ácido kójico em relação à enzima tirosinase (100%) na leitura 475nm nos tempos 0 (cinza chumbo); 30 (cinza claro) e 60 minutos (hachurado).
Como objetivo de avaliar o mecanismo de ação dos extratos etanólicos de C.
adamantium foi verificado o perfil de absorção da solução de ácido Kójico com os
extratos. Resultados expressos na figura 19.
Figura 19 – Concentração média da absorbância na mistura do ácido kójico e dos extratos etanólicos das folhas (preto) e galhos (hachurado) de C. adamantium (v:v) na faixa entre 290 a 400 nm.
48
Ao adicionar o cobre às soluções, foi verificado um aumento do perfil de
absorção do extrato das folhas e diminuição da absorbância média do extrato dos
galhos, indicando que possuem características diferentes de ação. No extrato dos
galhos ocorreu a redução da absorção com a adição do cobre. No extrato das folhas
foi observado o aumento dos picos máximos de absorção (figura 20).
Figura 20 – Concentração média da absorbância na mistura do ácido kójico e dos extratos etanólicos das folhas (preto) e galhos (hachurado) de C. adamantium (v:v) na quelação do cobre, na faixa entre 290 a 400 nm.
Ao adicionar EDTA, o extrato das folhas de C. adamantium manteve o perfil de
absorção sem elevação significativa em relação à adição de cobre anteriormente
realizada. No extrato dos galhos foi observado aumento na absorção (figura 21).
Figura 21 – Concentração média da absorbância do ácido kójico e dos extratos etanólicos das folhas (preto) e galhos (hachurado) de C. adamantium (v:v) frente a presença de EDTA na faixa entre 290 a 400 nm.
49
5.6 Teste de toxicidade frente a A. salina
Os extratos etanólicos das folhas e dos galhos de C. adamantium
apresentaram toxicidade. Valores tóxicos abaixo de 100 mg.mL-1 são considerados
concentrações letais para 50% das populações expostas (CL50) (MEYER et al.,
1982; LHULLIER, HORTA e FALKENBERG, 2006). As concentrações letais foram
0,106 e 0,065 mg.mL-1 para os respectivos extratos etanólicos das folhas e galhos
(tabela 10).
Tabela 10 – Valores médios de toxidade dos extratos das folhas e dos galhos de C. adamantium sobre A.salina.
Concentração
letal
Valor médio (mg.mL-1)
ETOHfolhas
Valor médio (mg.mL-1)
ETOHgalhos
CL10 0,014 0,007
CL50 0,106 0,065
CL90 0,810 0,600
ETOHfolhas = extrato etanólico das folhas de C. adamantium; ETOHgalhos= extrato etanólico dos galhos C. adamantium; CL=concentração letal. Fonte: autora, 2015.
Ao verificar a dispersão entre os valores obtidos na correlação de 95%
(p<0,05), na comparação da concentração do extrato e dos valores do controle
padrão, o valor do Chi-Q foi de 17,1786 para as folhas e 13,9399 para os galhos
com uma dispersão relativa. A variação entre os valores definidos para
concentrações dentro de cada grupo, dos respectivos extratos, ficaram em 0,78 e
0,63 bem próxima a unidade, e a variação individual em relação a reta foi
1,415±0,195 e 1,325±0,198.
.
50
6. DISCUSSÃO
Substâncias fotoprotetoras naturais, que possam atuar sinergicamente com os
filtros químicos amplamente empregados, são uma alternativa para aumentar a
segurança e a eficiência dos fotoprotetores. O uso de altas concentrações de filtros
químicos, ainda que possuam alta absorção frente a R-UV, implica em um risco
aumentado para o surgimento de reações adversas como dermatites, toxicidade,
irritações cutâneas e a indução de mutagenicidade (NASCIMENTO, SANTOS e
AGUIAR, 2014).
Dessa maneira, a busca por espécies vegetais ricas em compostos fenólicos,
sobretudo flavonóides, tornou-se alvo de estudo de muitos pesquisadores pela
semelhança entre esses compostos e os filtros químicos, mostrando uma intensa
absorção das R-UV, além de exercerem atividade antioxidante (ROSA et al., 2008;
NASCIMENTO et al., 2009; PESSUTO et al., 2009)
Muitas atividades biológicas relacionadas à presença de compostos fenólicos
foram descritas para C. adamantium, entre elas antimicrobiana e antiulcerogênica
(MARKMAN, 2002); antioxidante (COUTINHO et al., 2008); hipoglicemiante
(KLAFKE et al., 2010) e anti-inflamatória (FERREIRA et al., 2013), o que motivou a
pesquisa da atividade fotoprotetora dessa espécie considerando que ainda não foi
descrita e compostos de ação fotoprotetora foram encontrados em plantas da
mesma família, sinalizando um potencial biotecnológico para o desenvolvimento de
dermocosméticos.
Nos testes qualitativos de prospecção fitoquimica dos extratos etanólicos das
folhas e dos galhos de C. adamantium, foram identificados compostos fenólicos
(fenóis, taninos condensados e hidrolisáveis e flavonóides), havendo uma maior
concentração de taninos e flavonóides nos galhos. Diversas classes de flavonóides
(flavonóis, flavonas, xantonas, antocianidinas, antocianinas, leucoantocianidinas,
catequinas e flavonas) também foram identificadas nos dois extratos etanólicos
estudados de C. adamantium (folhas e galhos), o que sugere atividade antioxidante
e fotoprotetora para as amostras avaliadas.
51
Saponinas foram identificadas nos extratos etanólicos de folhas e galhos de C.
adamantium, estando em maior quantidade no extrato das folhas. Esses compostos
possuem propriedades detergentes e, no organismo humano, exercem atividade
antioxidante e ação citotóxica atuando contra células tumorais (PEREIRA e
CARDOSO, 2012).
Cumarinas antioxidantes foram identificadas nos extratos etanólicos de folhas e
galhos de C. adamantium, estando em quantidade abundante no extrato das folhas.
Esses compostos exercem ação antioxidante e anti-inflamatória, podendo ser
agregados em cosméticos (MUNHOZ et al., 2012).
Barbosa (2015) realizou um estudo com o extrato etanólico das folhas e galhos
da C. sessiliflora e por meio de uma triagem fitoquímica qualitativa identificou a
presença de compostos fenólicos havendo uma concentração maior de taninos e
flavonóides nos galhos em relação às folhas. Foram encontrados flavonóis, flavonas,
xantonas, antocianidinas, antocianinas, leucoantocianidinas, catequinas, flavonas,
saponinas, cumarinas e glicosídios cardiotônicos. A presença destes compostos
sugere atividade antioxidante para as amostras avaliadas, indicando que diferentes
espécies do gênero Campomanesia, se mostram ricas em compostos fenólicos.
Neste estudo, o conteúdo de compostos fenólicos totais expresso por mg.g-1
(ácido gálico) foi de 12,78 ± 0,53 para o extrato das folhas e 3,51 ± 0,18 para os
galhos. Pascoal (2012) encontrou índice ainda maior (35,04) com o mesmo ensaio
em extrato etanólico das folhas de C. adamantium.
O conteúdo de flavonóides expresso em mg.g-1, tendo como referência o
padrão quercetina foi de 9,63 ± 0,01 para as folhas de C. adamantium e de 0,54 ±
0,00 para os galhos. Nascimento (2014) encontrou um teor de flavonóides totais de
75,6 para o extrato etanólico das folhas de C.adamantium utilizando a rutina como
padrão positivo.
Para o pH médio não ocorreu diferença significativa entre o extrato das folhas
(5,30 ± 0,01) e galhos de C. adamantium (5,43 ± 0,06). Ambos indicaram leve
tendência à acidez. O pH é uma parâmetro importante para formulações a base de
extratos vegetais e a acidez dos extratos sugere a presença de substâncias como
compostos fenólicos e derivados, que possuem caráter ácido (BORELLA e
CARVALHO, 2011).
52
O pH levemente ácido dos extratos etanólicos de folhas e galhos de C.
adamantium está próximo ao pH fisiológico da pele, o que pode ser considerado um
fator positivo para a elaboração de um futuro produto final. Além disso, a
característica do pH ácido é um dado determinante na escolha dos adjuvantes
empregados na formulação cosmecêutica, influenciando na estabilidade das
formulações (NUNES, SILVA e REZENDE, 2003).
Para a condutividade elétrica média, houve diferença significativa entre os
extratos, sendo a das folhas de C. adamantium (17,92 ± 0,08) e dos galhos (21,67 ±
0,07). Esse dado é relevante ao considerar a perspectiva futura da elaboração de
um dermocosmético para aplicação através de iontoforese cutânea.
A cromatografia em camada delgada do extrato etanólico das folhas e galhos
de C. adamantium, revelou a presença de flavonóides, fenóis ou taninos e terpenos
nas amostras avaliadas. No extrato dos galhos de C. adamantium foram
identificadas duas bandas com mesmo fator de correção encontrado nas folhas, o
que provavelmente indica que sejam de mesma classe. Em relação aos fenóis ou
taninos, também foram localizados dois compostos de fator de correção coincidente
com as folhas. Pode ser observada a presença de quatro classes de terpenos,
sendo duas semelhantes às folhas.
Em estudo de Barbosa (2015), foi realizada a cromatografia em camada
delgada do extrato etanólico de folhas e galhos de C. sessiliflora indicando a
presença de quatro diferentes classes de flavonóides, cinco de terpenos e quatro de
alcalóides para o extrato etanólico das folhas. O extrato etanólico dos galhos da
mesma planta apresentou seis diferentes classes de flavonóides, cinco de
compostos fenólicos e três de terpenos.
Utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), Schmeda-
Hirschmann (1995) identificaram classes de flavonóides (miricetrina e rutina) em
folhas de algumas espécies de Campomanesia, como C. guazumifolia, C.
pubescens e C. xanthocarpa.
Coutinho e colaboradores (2008) identificaram cinco flavanonas e quatro
chalconas em extratos etanólicos das folhas de C. adamantium utilizando
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
Pascoal (2012) analisou o extrato bruto etanólico das folhas de C. adamantium
por meio de ionização por eletrospray no modo negativo e evidenciou que as
massas dos constituintes majoritários das amostras coincidiram com as massas das
53
chalconas (2’,4’-diidroxi-6’-metoxichalcona, 2’,4’diidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona e
2’,4’-diidroxi-3’,5’-dimetil-6’-metoxichalcona) e com as massas dos flavonóides
isoquercitrina, quercitrina, quercetina e miricetina. Por meio de CLAE, o mesmo
autor identificou o flavonóide quercetina como principal constituinte do extrato,
caracterizando como um dos responsáveis pela atividade antioxidante das folhas de
C. adamantium.
Os extratos etanólicos de folhas e galhos de C. adamantium apresentaram
atividade antioxidante pelo método DPPH, sendo observado que o extrato etanólico
dos galhos alcançou valores de CE50 menores que o padrão ácido ascórbico.
Coutinho e colaboradores (2008), analisaram a ação antioxidante dos extratos
das folhas de C. adamantium pelo método do DPPH e os extratos apresentaram
atividade antioxidante.
Em estudo de Nascimento (2014), a atividade antioxidante pelo método DPPH
calculada para o extrato etanólico das folhas de C. adamantium foi de 26,09%.
O extrato bruto etanólico das folhas de C. adamantium estudo de Pascoal
(2012), apresentou atividade antioxidante pelo método DPPH (CE50=13) e pelo
ensaio ORAC, confirmando o alto teor de compostos fenólicos totais estimado pelo
método Folin Ciocalteu´s. Em
Grael, Godinho e Santos (2011), pesquisaram extratos das folhas de
C.adamantium preparados com quatro solventes diferentes (acetato de etila,
hexano, etanol e água) e identificaram flavonóides e triterpenos em todos. No extrato
etanólico, encontraram cumarinas, antocianinas e taninos. Todos os extratos
avaliados apresentaram atividade antioxidante evidente frente ao radical livre DPPH.
Um dos fatores que determinam a eficácia de um produto natural como
fotoprotetor é, além da sua composição química, a sua capacidade em absorver o
espectro ultravioleta. Os flavonóides geralmente absorvem em comprimento de onda
na região de 280-315nm, sendo capazes de agir como filtros de R-UV nas plantas,
exercendo proteção contra danos aos tecidos fotossintéticos (BOBIN et al., 1994;
GILABERTE e GONZÁLEZ, 2010; MANSUR, 2011; NASCIMENTO, 2014).
Na varredura espectrofotométrica dos extratos etanólicos das folhas e galhos
de C. adamantium os dois extratos apresentaram absorção nos comprimentos de
onda da R-UV A e B, indicando assim que podem exercer a função de filtros solares.
54
Da mesma forma, a avaliação dos extratos etanólicos das folhas e galhos de C.
sessiliflora, em estudo de Barbosa (2015), indicou absorção nos comprimentos de
onda na região de 290-400 nm, confirmando a ação fotoprotetora da espécie.
Said e colaboradores (2007) estudaram o extrato das folhas do tamanu
(Calophyllum inophyllum L; Calophyllaceae) e relataram resultados positivos de
fotoproteção UVA e UVB, além da presença de flavonóides, tocoferóis e tocotrienois.
Os extratos mostraram atividade antioxidante, com significante redução da produção
de radicais livres.
Segundo a legislação brasileira (RDC 30 de 01/06/2012), um produto para ser
considerado adequado para uso em cosméticos para fotoproteção deve ter FPS
igual ou superior a 6 (BRASIL, 2012). O FPS calculado para o extrato etanólico das
folhas de C. adamantium foi de 21 e para os galhos de 23. A C. sessiliflora, em
estudo de Barbosa (2015) apresentou FPS 20 para o extrato etanólico das folhas e
12 para o extrato etanólico dos galhos, demonstrando que diferentes espécies do
gênero Campomanesia podem exercer atividade de filtro UV.
Os valores de FPS detectados nas espécies de Campomanesia são
considerados altos quando comparadas a outras espécies como a mil-folhas
(Achillea millefolium L.; Asteraceae) que apresentou FPS 2 (ROSA et al., 2008); a
andiroba (Carapa guianensis Aubl.; Meliaceae) que apresentou FPS 6 (FERRARI et
al., 2007); o extrato fluido da própolis concentrado a 40% que apresentou valores de
FPS 12 (RAMOS, SANTOS e DELLAMORA-ORTIZ, 2010) e o extrato etanólico das
folhas de araticum (Annona crassiflora Mart.; Annonaceae) que apresentou FPS de
10 (NASCIMENTO, 2014). O extrato etanólico das folhas do pequi (Caryocar
brasiliense Camb.; Caryocaraceae) apresentou FPS de 22 em estudo de
Nascimento (2014), caracterizando valor similar de FPS ao encontrado no extrato de
C. adamantium e C. sessiliflora.
Estudos indicam que a introdução de compostos antioxidantes em formulações
fotoprotetoras pode aumentar o fator de proteção solar. Nesse sentido, a pesquisa
de novas moléculas para utilização em protetores solares são muito realizadas, com
um interesse crescente para extratos vegetais ricos em compostos fenólicos. O teor
de fenólicos produzidos por uma planta é considerado fator importante de proteção
contra a R-UV, uma vez que a estrutura química destes compostos atuam anulando
os efeitos deletérios de radicais livres produzidos pela exposição solar e dissipam a
energia absorvida sem danificar a pele (GUARATINI et al., 2009).
55
Em estudo de Ramos e colaboradores (1996), com extratos brutos de
hamamelis (Hamamelis virginiana L.; Hamamelidaceae), camomila (Matricaria
recutita L.; Asteraceae), castanha-da-índia (Aesculus hippocastanum L.;
Hippocastanaceae), cáscara sagrada (Rhamnus prushiana DC.; Rhamnaceae) e
canela (Cinnamomum zeylanicum Blume.; Lauraceae), que continham em sua
composição química, substâncias como flavonóides, taninos e antraquinonas,
incorporados a uma formulação contendo 2% de metoxicinamato de octila, levaram
a um aumento no FPS do protetor solar.
Nascimento e colaboradores (2009) avaliaram in vitro a capacidade de
incremento da atividade fotoprotetora em formulação comercial, de dois tipos de
própolis, ricas em flavonóides. Os resultados sugerem sinergismo, indicando que os
extratos poderiam ser utilizados para aumento do FPS das formulações.
Pinto e colaboradores (2012) avaliaram o Ginkgo biloba (Ginkgo biloba L.;
Ginkgoaceae) e encontraram FPS 0,82 para o extrato puro. Porém, ao adicionar o
extrato a um protetor químico (metoxiciinamato de octila a 2,5%), houve um aumento
da atividade fotoprotetora.
Alguns trabalhos mostram que compostos fenólicos presentes em plantas
possuem atividade inibitória da tirosinase, enzima envolvida na melanogênese da
pele (SUGUMARAN, 2002; VICTOR, GELBER e RAO, 2004, SILVA et al., 2010;
SILVÉRIO, CASTRO e MIRANDA, 2013), podendo ser utilizados como
despigmentantes para a pele. Porém, os extratos etanólicos das folhas e dos galhos
de C. adamantium não apresentaram inibição significativa da tirosinase quando
comparados ao ácido kójico, caracterizando que não exercem efeito sobre o
mecanismo de melanogênese.
Barbosa (2015) avaliou extratos etanólicos da folha e dos galhos de C.
sessiliflora e não detectou inibição significativa da tirosinase quando comparada ao
ácido kójico, assim como ocorreu com a C. adamantium.
Uma solução de cobre foi adicionada aos extratos etanólicos das folhas e
caules de C. adamantium para verificar se eles têm a capacidade de agir como
quelantes, implicando em mudanças no perfil de absorção. O termo quelante é
aplicado ao composto formado por um íon metálico unido por várias ligações
covalentes a uma estrutura heterocíclica de compostos orgânicos (aminoácidos,
enzimas ou peptídeos). O cobre é um metal de transição, que pode ser quelado pela
56
tirosinase como inibidor incompetitivo (ligando-se apenas ao complexo enzima-
substrato) (CHANG, 2009).
Ao adicionar o cobre às soluções, foi verificado um aumento do perfil de
absorção do extrato das folhas e diminuição da absorbância média do extrato dos
galhos, indicando que possuem características diferentes de ação. No extrato dos
galhos ocorreu a redução da absorção com a adição do cobre. No extrato das folhas
foi observado o aumento dos picos máximos de absorção.
Isso demonstra que o extrato dos galhos não age por ação de inibidores
incompetitivos como o cobre. A inibição ocorre possivelmente pela presença de
compostos fenólicos presentes no extrato que por possuírem estrutura química
semelhante à da tirosina, que é um substrato da enzima, se apresentam como
substrato alternativo. Entretanto, não sendo oxidados competem com a tirosina
(SILVÉRIO, CASTRO e MIRANDA, 2013).
O extrato das folhas de C. adamantium agiu como o ácido kójico, elevando a
absorção seus picos de absorção na presença do cobre, dando indícios de que age
por inibição incompetitiva.
Ao adicionar EDTA o extrato das folhas de C. adamantium manteve o perfil de
absorção sem elevação significativa em relação à adição de cobre anteriormente
realizada. Já o extrato dos galhos teve um aumento na absorção, o que pode
caracterizar a presença de compostos cromóforos atuantes em faixas da radiação
UV-B e UV-A (CHANG, 2009; SILVÉRIO, CASTRO e MIRANDA, 2013).
Para avaliar a toxicidade dos extratos etanólicos de C.adamantium, foi proposto
o ensaio frente à Artemia salina. A avaliação da letalidade em um organismo animal
menos complexo pode ser usada para um monitoramento simples e rápido durante o
fracionamento de extratos. O ensaio de letalidade tem sido introduzido na rotina de
muitos grupos de pesquisa envolvidos com isolamento, purificação e elucidação
estrutural, já que muitos laboratórios de fitoquímica não estão preparados para
realizar ensaios biológicos, sendo considerado um ensaio preliminar (CAVALCANTE
et al., 2000; LHULLIER, HORTA e FALKENBERG, 2006).
Os extratos das folhas e dos galhos de C. adamantium, neste estudo,
apresentaram toxicidade frente à A. salina, sendo que o dos galhos aumentou a
mortalidade numa concentração menor, sendo considerado o extrato mais tóxico ou
o que apresenta maior conteúdo de compostos ativos capazes de inibir o
desenvolvimento ou crescimento dos naúpilos de artemia.
57
Em outro estudo, a análise dos extratos hexânicos das folhas de C.
adamantium indicam que estes apresentaram atividade antioxidante e não
demonstram toxidez para A. salina (CAMPOS et al., 2012). O extrato hexânico das
folhas de C. pubescens por CG-MS levou a identificação de sesquiterpenos e
triterpenos e o extrato não se mostrou tóxico frente A. salina e apresentou atividade
antioxidante (CARDOSO et al., 2009).
O extrato etanólico das folhas e galhos de C. sessiliflora foi testado por
Barbosa (2015) frente à A. salina. O extrato das folhas foi considerado de elevada
toxicidade e o dos galhos, foi considerado atóxico (BARBOSA, 2015).
Ramos, Cardoso e Yamamoto (2007) avaliaram a toxicidade de extratos
hexânicos das folhas de C. adamantium coletados em três diferentes pontos e
concluíram que estes apresentaram atividade antioxidante e não demonstram
toxidez para A. salina.
Auharek e colaboradores (2013) avaliaram o efeito de toxicidade do extrato
etanólico de folhas de C. xanthocarpa sobre ratas gestantes e não encontraram
evidências de aborto ou alterações no desenvolvimento embriofetal, sugerindo que
não há efeito tóxico sobre a gestação.
Após a análise dos dados deste estudo foi possível concluir que os extratos
etanólicos das folhas e galhos de C.adamantium estudados apresentam compostos
fenólicos, sobretudo taninos, cumarinas e flavonóides, havendo uma maior
concentração de taninos e flavonóides nos galhos, o que sugere atividade
antioxidante e possuem alta absorção nos comprimentos de onda da R-UV
indicando atividade fotoprotetora. Os extratos apresentaram valores de proteção
solar altos para as folhas (FPS 21) e para os galhos (FPS 23), quando comparados
a outras espécies citadas na literatura, podendo ser introduzidos em formulações
fotoprotetoras para aumentar o fator de proteção solar. A atividade antioxidante foi
confirmada pelo ensaio com o radical livre DPPH e padrão ácido ascórbico. O
extrato etanólico dos galhos de C. adamantium apresentou maior quantidade de
compostos fenólicos nos ensaios colorimétricos realizados, maior atividade
antioxidante e maior FPS, porém apresentou toxicidade maior frente à A. salina.
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este estudo avaliou extratos etanólicos das folhas e galhos de C. adamantium
e após a análise dos dados foi possível concluir:
Os ensaios realizados com os extratos etanólicos das folhas e dos galhos de
C. adamantium indicam a presença de compostos fenólicos, sobretudo
taninos, cumarinas e flavonóides, havendo uma maior concentração de
taninos e flavonóides nos galhos, o que sugere atividade antioxidante e
fotoprotetora para as amostras avaliadas.
O pH indicou uma leve tendência à acidez para os dois extratos e uma
proximidade ao pH fisiológico da pele, o que pode ser considerado um fator
positivo no que tange a elaboração de um futuro produto final e sugere a
presença de substâncias como compostos fenólicos e derivados, que
possuem caráter ácido
Foi detectada uma alta condutividade elétrica média para os dois extratos de
C. adamantium avaliados o que pode ser considerado um dado positivo para
a perspectiva futura da elaboração de um dermocosmético para aplicação
através de iontoforese cutânea.
Na varredura espectrofotométrica dos extratos etanólicos das folhas e galhos
de C. adamantium os dois extratos apresentaram absorção nos comprimentos
de onda da R-UV, indicando assim que podem exercer a função de filtros
solares, com FPS calculado para o extrato das folhas de 21 e para o extrato
dos galhos de 23. Os valores de FPS detectados são considerados altos
quando comparados a outras espécies citadas na literatura, podendo ser
introduzidos em formulações fotoprotetoras para aumentar o FPS.
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O extrato etanólico dos galhos de C. adamantium apresentou maior
quantidade de compostos fenólicos nos ensaios colorimétricos realizados,
maior atividade antioxidante e maior FPS, porém apresentou um nível de
toxicidade maior frente à A. salina.
Os extratos etanólicos das folhas e dos galhos de C.adamantium não
apresentaram inibição significativa da tirosinase quando comparados ao ácido
kójico, caracterizando que não exercem efeito sobre o mecanismo de
melanogênese da pele.
Os extratos etanólicos de folhas e galhos de C. adamantium apresentaram
atividade antioxidante pelo método do DPPH, sendo observado que o extrato
etanólico dos galhos de C. adamantium alcançou valores de CE50 menores
que o padrão ácido ascórbico;
Os extratos etanólicos das folhas e dos galhos de C. adamantium
apresentaram fitotoxicidade, sendo que o dos galhos causou maior
mortalidade numa concentração menor, sendo considerado mais tóxico.
Novos ensaios, mais acurados, podem confirmar os resultados obtidos, que
em parte, divergem de outros estudos.
A intenção futura será verificar a aplicabilidade desses extratos em
formulações fotoprotetoras e dermocosméticas.
60
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