UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE – UFRN

CENTRO DE TECNOLOGIA – CT

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA – DEQ

VITOR FERNANDES DIAS LOPES

OBTENÇÃO DO EXTRATO DA RUMEX ACETOSA COM ETANOL

PRESSURIZADO

NATAL-RN

2017

VITOR FERNANDES DIAS LOPES

OBTENÇÃO DO EXTRATO DA RUMEX ACETOSA COM ETANOL

PRESSURIZADO

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN, como parte dos requisitos para obtenção do título de Bacharel em Engenharia Química.

Orientador: Prof. Dr. Humberto Neves Maia de Oliveira

Co-orientador: Dr. Ênio Rafael de Medeiro Santos

NATAL-RN

2017

Resumo

Os compostos oxidantes são indicados por diversos estudos como responsáveis por

diversas doenças degenerativas no corpo humano, como envelhecimento e doenças

cardiovasculares. No intuito de cessar seus efeitos e inibi-los, os antioxidantes

apresentam um papel fundamental. Estes são, em geral, compostos fenólicos e podem

ser de origem sintética ou natural, estes últimos são geralmente metabolizados pelo

organismo de plantas. A Rumex acetosa é uma delas, a qual apresenta uma vasta gama

destes compostos na sua raiz, despertando o interesse de pesquisas cientificas no âmbito

de extraí-los. Para que isso ocorra de forma limpa, rápida e eficaz, foi escolhida a

extração com líquido pressurizado (ELP) com etanol como solvente, a qual consiste na

pressurização deste líquido em altas temperaturas, de modo que permaneça em estado

líquido, melhorando a solubilização do analito de interesse. Este trabalho visa estudar a

influência da vazão do solvente e do tempo de extração no rendimento do processo,

solubilidade do substrato no solvente, poder antioxidante e teor de fenóis totais, através

das curvas cinéticas de extração, método do sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-

hidrazil, DPPH e método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau, respectivamente. O

rendimento variou proporcionalmente com a vazão e o tempo de extração, de 7,27 % a

10,81 %. Contudo, a solubilidade dos compostos no solvente não permaneceu na mesma

ordem de grandeza em todas as extrações, variando entre 0,0418 g/g e 0,0721 g/g, assim

como a composição de fenóis totais e o poder antioxidante (medido como EC50) das

amostras, os quais se apresentaram, também, todos na mesma ordem de grandeza,

variando de 149,80 mg/g a 181,63 mg/g; e 18,32 µg/mL a 22,84 µg/mL,

respectivamente. Isso demonstra que todas as vazões, na faixa estudada, estão

promovendo a saturação do analito no solvente.

Palavras chave: Rumex acetosa. Extração com líquidos pressurizados. Solubilidade

Atividade antioxidante.

Abstract

The oxidant compounds are indicated by many studies as responsible for various

degenerative diseases in the human body, as aging and cardiovascular issues. Aiming to

inhibit and cease its effects, the antioxidants have a fundamental role. Those are at

large, phenolic compounds and can have a synthetic or natural origin, with the last ones

being, in general, metabolized by the organism of plants. One of them is Rumex

acetosa, which presents a large amount of those compounds in its roots, arousing

interest in scientific researches to extract them. To accomplish this in a clean, fast and

effective way, pressurized liquid extraction (PLE) with ethanol as solvent was chosen,

which consists in pressurize the liquid at high temperatures, causing it to remain in the

liquid state, enhancing the solubilization of the interest analyte. This work aims to study

the influence of the flow rate of solvent and time of extraction in the process’ yield,

solubilization of substrate in the solvent, antioxidant power, and total phenolic content,

through kinetics extraction graphics, method of capture of the 2,2-difenil-1-picril-

hidrazil, DPPH radical and spectrophotometric method of Folin-Ciocalteau,

respectively. The yield varied proportionally with the flow rate and time of extraction

from 7,27 % to 10,81 %. However, the solubility of the compounds in the solvent

remained basically the same order of magnitude in all the extractions, varying from

0,0418 g/g to 0,0721 g/g, the same way as the total phenolic content and antioxidant

power (measured as EC50) of the samples, which also remained all in the same order of

magnitude, varying from 149,80 mg/g to 181,63 mg/g and 181,63 µg/mL to 18,32

µg/mL, respectively. This shows that all flow rates, in the range studied, are promoting

the saturation of the analyte in the solvent.

Keywords: Rumex acetosa. Pressurized Liquid Extraction. Solubility. Antioxidant

activity.

Sumário

1. Introdução............................................................................................................1

2. Revisão Bibliográfica...........................................................................................2

2.1. Rumex acetosa...............................................................................................2

2.2. Extração com Líquido Pressurizado (ELP)...................................................2

2.2.1. Curva cinética e etapas de extração......................................................3

2.2.2. Vazão e Solubilidade............................................................................4

2.3. Antioxidantes................................................................................................5

2.4. Métodos de Análise.......................................................................................6

2.4.1. Método espectrométrico Folin-Ciocalteau..........................................6

2.4.2. Método do sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazil, DPPH..7

3. Materiais e Métodos...........................................................................................8

3.1. Preparação da matéria-prima.........................................................................8

3.2. Extração com Líquido Pressurizado .............................................................8

3.3. Preparo da solução das amostras.................................................................10

3.4. Obtenção do rendimento, da curva cinética da extração e solubilidade......10

3.5. Determinação da atividade antioxidante (EC50)..........................................10

3.6. Determinação do teor de fenóis totais (TFT)...............................................12

4. Resultados e Discussões.....................................................................................14

4.1. Rendimento e Solubilidade..........................................................................14

4.2. Teor de Fenóis Totais..................................................................................16

4.3. Atividade Antioxidante................................................................................17

5. Conclusão............................................................................................................20

6. Referências.........................................................................................................21

Índice de Figuras

Figura 2.1: Rumex acetosa ("Azedinha). Fonte:

(http://rawedibleplants.blogspot.com.br/2013/12/common-sorrel-rumex-acetosa.html)..2

Figura 2.2: Exemplo de curva cinética de extração, apresentando o ajuste linear para as

curvas das etapas CER e FER. Fonte: Santos (2017)........................................................4

Figura 2.3: Mecanismo de ação dos antioxidantes, em que ROO• e R• são radicais livres

estabilizados pelo antioxidante AH, o qual gera os compostos ROOH e RH e A•,

estáveis. Fonte: Casagrande (2014)...................................................................................5

Figura 2.4: Ração do Molibdênio (um dos componentes do reagente de Folin-

Ciocalteau) e ácido gálico em meio alcalino, causando redução do Mo+6 para Mo+5,

acarretando em mudança de cor do meio. Fonte: Oliveira, et al (2009)............................6

Figura 2.5: Reação do DPPH com BHT (antioxidante sintético). Fonte: Santos (2015)..7

Figura 3.1: Raíz seca da Rumex acetosa. Fonte: Santos (2013)........................................8

Figura 3.2: Esquema da unidade de ELP, em que V-1, V-2: válvulas agulha

macrométricas; V-3: válvula agulha micrométrica; R-1: frasco com etanol; R-2: coletor

de extrato; P-1: bomba de solvente; E-1 coluna extratora; B-1: banho termostatizado; T-

1: termopar; M-1: manômetro. Fonte: Santos (2017)........................................................9

Figura 4.1: Curva cinética das extrações de rendimento versus tempo...........................14

Figura 4.2: Curvas cinéticas das extrações, mostrando a massa acumulada de extrato

versus massa utilizada de solvente..................................................................................15

Figura 4.3: Curvas cinéticas das extrações, mostrando a massa acumulada de extrato

versus massa utilizada de solvente, com os ajustes lienar para as retas das etapas CER e

FER das extrações de 150 bar e 80 ° C com: 0,5 mL/min e 3h (a); 1,5 mL/min e 3h (b);

2,0 mL/min e 4h (c); e 3,0 mL/min e 4h (c)....................................................................16

Figura 4.4: Curvas de AS (%) versus concentração com suas respectivas equações da

reta, par as extrações 1 (150 bar; 80 °C; 0,5 ml/min; 3h) (a); 2 (150 bar; 80 °C; 1,5

ml/min; 3h) (b); 3 (150 bar; 80 °C; 2,0 ml/min; 4h) (c) e 150 bar; 80 °C; 3,0 ml/min; 4h

(d).....................................................................................................................................18

Índice de Tabelas

Tabela 3.1: Volumes de diluição para as soluções de amostras e obtenção das curvas de

AS (%).............................................................................................................................11

Tabela 3.2: Volumes de diluição para a obtenção da curva padrão de àcido gálico......12

Tabela 3.3: Volumes de diluição das amostras...............................................................13

Tabela 4.1: Rendimento e solubilidade de cada extração nas condições estudadas.......16

Tabela 4.2: Absorbâncias médias obtidas nos ensaios de Folin-Ciocalteau e os

resultados de EAG e TFT para o extrato de cada extração.............................................17

Tabela 4.3: Concentração final corrigida dos ensaios de DPPH, juntamente com os

resultados de absorbância média e os cálculos de AS (%)..............................................17

Tabela 4.4: Resultados de EC50 para cada extração.......................................................19

1

1. Introdução

Os radicais livres e as substâncias oxidantes são indicados, por várias

evidências, como os grandes responsáveis por doenças degenerativas, como o

envelhecimento, câncer, doenças cardiovasculares, catarata, declínio do sistemas

imune, disfunções cerebrais, aterosclerose, inflamações, entre outras (Santos,

2013; Shahidi et. al, 2015; Sousa et. al; 2007). Sua produção é controlada

através dos antioxidantes, os quais podem ter origem endógena, ou adquiridos

através de dieta alimentar ou medicamentos e atuam estabilizando, ou

desativando os radicais livres antes que ataquem as células (Sousa et. al; 2007).

Antioxidantes podem ser sintéticos ou naturais. Os primeiros são obtidos

através de manipulação química, mas estão caindo em desuso devido ao fato de

apresentarem riscos à saúde. Portanto, as pesquisas por fontes naturais desse tipo

de substância vêm crescendo nos últimos anos. Eles são comumente encontrados

em plantas, frutas, vegetais, cereais, grãos, entre outros, e podem ser isolados

como compostos puros para uso nutracêutico e farmacêutico (Shahidi et. al,

2015). Os compostos fenólicos são antioxidantes poderosos gerados

naturalmente pelo metabolismo de plantas (Stalikas, 2007).

Assim, a “Azedinha” (Rumex acetosa) é uma herbácea encontrada em

clima temperado da Europa, Ásia e no Brasil nas regiões entre Minas Gerais e

Rio Grande do Sul (Ministério da agricultura, pecuária e abastecimento, 2010) e

de grande interesse, porque apresenta uma vasta gama de compostos fenólicos

(Kemper, 1999).

Para a obtenção de maneira limpa, rápida e simples, e sem deteriorar os

compostos bioativos sensíveis pela presença de oxigênio e luz, a extração com

líquido pressurizado (ELP) é uma das mais utilizadas para a obtenção desses

compostos (Herrero, 2015; Nieto et. al, 2010). A técnica consiste no uso de

solvente a alta pressão e temperatura, de modo que se mantenha no estado

líquido (Herrero, 2015). As condições de operação como temperatura, pressão,

solvente utilizado e vazão podem alterar o rendimento da extração e a

seletividade do analito (Mustafa et. al, 2011).

Ademais, o estudo da otimização do método de extração dos compostos

fenólicos antioxidantes da Rumex acetosa é de grande importância para a

sociedade, pois busca alternativas mais econômicas, limpas e eficazes, para se

produzir compostos importantes e benéficos à saúde humana.

Dessa forma, este trabalho tem o objetivo de utilizar a ELP com etanol

como método de obtenção dos compostos fenólicos antioxidantes da raiz da

Rumex acetosa e avaliar suas curvas cinéticas, no intuito de analisar a influência

da vazão e do tempo de extração em seus rendimentos e solubilidades. Além

disso, será quantificada e avaliada a atividade antioxidante e os fenóis totais de

cada extração.

2

2. Revisão Bibliográfica 2.1 Rumex acetosa

É uma herbácea perene da família Plygonaceae conhecida popularmente

por “azedinha”, mede cerca de 20 cm de altura, é composta de folhas verdes e

sagitadas, com flores avermelhadas formando uma panícula. A planta é natural

das regiões de clima temperado (geralmente entre 5 e 30°C) da Europa e Ásia, e

é considerada exótica no Brasil, sendo cultivada entre os estados de Minas

Gerais e Rio Grande do Sul (Ministério da agricultura, pecuária e abastecimento,

2010; Franzener 2013; Souto 2010).

Suas folhas e raízes possuem componentes importantes para quesitos

nutricionais e medicinais (Franzener, 2013), como por exemplo oxalatos,

taninos, derivados do antraceno, quinoides e flavonoides (Kemper, 1999). Seu

uso está relacionado, principalmente, a concentração de taninos antioxidantes, a

qual está ligada com o tratamento medicinal de irritações na pele e diarreia

(Bicker, 2009), além de também ser usada como diurético, tônico da primavera e

ingrediente para remédio de câncer (Kemper, 1999), embora o alto teor de ácido

oxálico limite seu uso por aqueles que sofrem de doenças renais (Santos, 2016).

A Figura 2.1 mostra as folhas da “Azedinha” com suas flores.

Figura 2.1: Rumex acetosa ("Azedinha). Fonte:

(http://rawedibleplants.blogspot.com.br/2013/12/common-sorrel-rumex-acetosa.html)

2.2 Extração com Líquido Pressurizado (ELP)

A técnica foi primeiramente introduzida na conferência Pittcon pela

empresa Dionex em 1995 pelo nome de extração com solvente acelerado (ASE)

3

(Mustafa, 2011). Hoje também é conhecida como Extração com líquido

pressurizado (ELP), extração com solvente-quente pressurizado (PHSE) e

extração com fluido pressurizado (PFE). Este processo consiste no uso de

solventes pressurizados em altas temperaturas, sempre abaixo do seu ponto de

ebulição, de forma que permaneçam no estado líquido (Herrero, 2015), sendo

considerada uma técnica simples, rápida, pouco complicada e fácil de aprender

(Nieto et. al, 2010). Sob estas condições a taxa de transferência de massa entre

analito e solvente é incrementada, pois aumentam sua solubilidade, diminuindo

a viscosidade e tensão superficial do líquido, assim conseguindo uma maior

penetração na matriz, alcançando áreas mais profundas e aumentando a

superfície de contato (Herrero, 2015).

Na maioria dos casos, ELP exige pouco volume de solvente e um tempo

menor de extração comparado a outros métodos (Herrero, 2015), além de ser

considerada uma técnica “verde”, ou seja, que não prejudica tanto o meio

ambiente, uma vez que usa solventes menos nocivos ao meio ambiente

(comparados a outros já utilizados) tais como álcoois (metanol e etanol), alcanos

(Heptano e hexano) ou água. A escolha do solvente depende do analito desejado,

sendo necessária sua excelente solubilização no líquido, enquanto os outros

compostos indesejados devem ter nenhuma ou pouca solubilização (Mustafa,

2011).

ELP é conduzida em um ambiente livre de oxigênio e luz (Stalikas,

2007), portanto é ideal e tem sido amplamente empregado na extração de

compostos bioativos sensíveis de plantas, diminuindo sua degradação (Herrero,

2015). Estudos mostram que este método leva vantagens em relação aos

métodos convencionais, uma vez que é mais econômico em relação ao solvente

e material utilizado, rápido e possui um rendimento melhor ou aproximado a

estes (Mustafa, 2011). Contudo, a sua limitação consiste no fato da seletividade

do analito de interesse não ser tão eficaz quanto pode ser desejado dependendo

do objetivo da extração, incluindo a possibilidade de conter interferentes, e a

ocorrência de sua diluição (Nieto et. al, 2010).

2.2.1 Curva cinética e etapas da extração

A curva cinética característica da extração é obtida plotando um

gráfico da massa acumulada de extrato seco em função da massa de solvente

acumulado, ou do tempo. Esta curva apresenta todas as etapas da extração

(Santos, 2013) e é uma resposta ao fluxo de solvente entrando no extrator.

Ela se mostra mais eficaz na comparação de experimento com mesmos

substratos e equipamentos, uma vez que é altamente influenciável pelos

parâmetros do processo (Oliveira, 2010).

A extração pode ser dividida em três etapas: CER, FER e DF, as

quais estão descritas abaixo.

Na etapa CER (constant extraction rate), a taxa de extração é

constante e predomina-se a transferência de massa através da convecção,

sendo o soluto disponível na interfase sólido/fluido, ou seja, na superfície

4

externa das partículas. Esta etapa pode corresponder a 50% do rendimento

total (Oliveira, 2010; Santos, 2013).

Já na etapa FER (falling extraction rate), a taxa de extração é

decrescente e ocorre a transferência de massa difusional, além da convectiva.

Isto deve-se ao fato do extrato na interface sólido/fluido se esgotar,

promovendo o aumento da resistência à transferência de massa. Nessa etapa,

o rendimento pode ultrapassar os 70% do rendimento total (Oliveira, 2010;

Santos, 2013).

Por fim, na última etapa, a etapa DC (diffusion-cotrolled), onde há

predominantemente a transferência de massa por difusão, de modo que a

resistência à transferência de massa é muito elevada e a taxa de extração é

praticamente nula (Oliveira, 2010; Santos, 2013).

A curva é importante para o estudo de parâmetros do processo,

como tempo de extração, caracterização das etapas, determinação da

solubilidade, modelagem da transferência de massa e aumento de escala

(Oliveira, 2010). Um exemplo de curva cinética com as retas ajustadas para a

etapa CER e FER está representado na Figura 2.2.

Figura 2.2: Exemplo de curva cinética de extração, apresentando o ajuste linear para as

curvas das etapas CER e FER. Fonte: Santos (2017).

2.2.2 Vazão e Solubilidade

A solubilidade é a razão entre a massa de extrato pela massa de

solvente consumido (Queiroz, 1993). Na etapa CER, a taxa constante de

extração é controlada pela solubilidade do equilíbrio, podendo corresponder

à metade da extração (Santos, 2013). Nesta etapa, a saturação está

5

relacionada à vazão do solvente, uma vez que o tempo de residência do

solvente na coluna, deve garantir um tempo de contato mínimo, com a

matéria-prima, para que isso aconteça (Galvão, 2009).

Portanto, para cada condição de operação, há uma faixa de vazões

que permite essa saturação (Queiroz, 1993). As vazões mais elevadas tendem

a aumentar a taxa da extração, já que a razão entre quantidade de solvente e

massa de matéria-prima é aumentada, favorecendo o contato entre eles

(Santos, 2017). Porém, se muito elevadas, não permitirão que o solvente

permaneça o tempo certo na coluna para solubilizar o extrato, podendo até

gerar um rendimento maior, mas sem extrair os compostos de interesse

(Queiroz, 1993).

Para o cálculo da solubilidade, foi utilizado o método de Draper e

Smith, já utilizado por Galvão (2009), Queiroz (1993) e Santos (2013), de

modo que se estimam duas retas, em um gráfico massa de extrato acumulada

versus massa de solvente utilizada, correspondentes as etapas CER e FER,

como as retas da Figura 2.2 (Queiroz, 1993). Então, o coeficiente angular da

reta da etapa CER corresponde à solubilidade do extrato no solvente e a

interseção entre as duas retas é o tempo final desta etapa e inicio da etapa

FER (Santos, 2013).

2.3 Antioxidantes

Antioxidantes são compostos que podem retardar, prevenir ou inibir a

oxidação de materiais, diminuindo o estresse oxidativo (estado onde a

capacidade antioxidante endógena é superada, levando a oxidação de

macromoléculas, como enzimas e lipídeos). (Dai et al., 2010). O aparecimento

excessivo de radicais pode causar danos a células e tecidos do corpo humano,

além de acelerar o processo de envelhecimento e o aparecimento de células

cancerígenas. Assim, os antioxidantes reduzem estes efeitos, já que conseguem

doar elétrons ou átomos de Hidrogênio e cessar a formação de radicais livres e

reações de oxidação em cadeia. (Oliveira, 2010), como mostrado na Figura 2.3.

Figura 2.3: Mecanismo de ação dos antioxidantes, em que ROO• e R• são radicais livres

estabilizados pelo antioxidante AH, o qual gera os compostos ROOH e RH e A•,

estáveis. Fonte: Casagrande (2014).

Eles podem ser naturais ou sintéticos, sendo que os sintéticos apresentam

restrições no uso em alimentos, pelo fato de serem considerados carcinogênicos.

Em vista disso, a busca pelos naturais vem crescendo, principalmente dos

extraídos de plantas. Uma espécie antioxidante amplamente utilizada e

encontrado nelas são os compostos fenólicos, os quais são substancias que

6

possuem anel aromático com um ou mais substituinte hidroxílico (Oliveira,

2010) e funcionam como aceptores de radicais livres e quebradores de cadeia,

cessando a atividade oxidante. (Dai et al., 2010).

2.4 Métodos de Análises

2.4.1 Método espectrofotométrico Folin-Ciocalteau

A quantidade de fenóis totais é uma importante medida na

quantificação do poder antioxidante de uma amostra e amplamente usada na

determinação dessa medida em extratos de plantas, frutas, cereais e legumes

(Shahid et. al, 2015). Entre os métodos utilizados para este fim, o método

espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau (F-C) é um dos mais

extensivamente utilizados. (Sousa et. al, 2007). Inicialmente, o

procedimento foi desenvolvido por Folin e Ciocalteau para a quantificação

de tirosina (Folin & Ciocalteau, 1927; Santos, 2013) e posteriormente foi

adaptado por Singleton e Rossi, em 1965, para a avaliação de fenóis totais

em vinhos (Singleton & Rossi, 1965; Santos, 2013), se tornando uma análise

de rotina para a determinação de atividade antioxidante de alimentos e

extratos de plantas (Shahidi, et. al, 2015).

A análise consiste no uso de uma mistura de ácido

fosfomolibídico e fosfotuguístico como reagente, onde o molibdênio e o

tungstênio se encontram no estado de oxidação +6 (Sousa et. al, 2007). Em

meio alcalino e na presença de agentes redutores, eles são reduzidos ao

estado +5 (Figura 2.4), onde apresentarão coloração azul com absorbância

máxima em 765nm. Os compostos fenólicos conseguem doar o elétron

necessário para a redução (Shahidi, et. al, 2015), portanto, a coloração da

substancia permite a determinação da concentração dessas substâncias

(Sousa et. al, 2007). Na maioria dos casos, para esta quantificação são

utilizadas análises espectrofotométricas (Santos, 2013).

Figura 2.4: Ração do Molibdênio (um dos componentes do reagente de Folin-

Ciocalteau) e ácido gálico em meio alcalino, causando redução do Mo+6 para Mo+5,

acarretando em mudança de cor do meio. Fonte: Oliveira, et al (2009).

7

As vantagens do método são sua simplicidade, reprodutibilidade e

robustez. Porém, as condições da reação, como pH, temperatura e tempo de

reação, afetam bastante o resultado final, devendo ser controladas para a

obtenção de resultados mais confiáveis (Shahidi, et. al, 2015). O tempo

médio para a reação é de duas horas, podendo ser reduzido com o

aquecimento da amostra (Santos, 2013). O ácido gálico é usualmente usado

como padrão e, em vista disso, o resultado é expresso em equivalente em

ácido gálico (Shahidi, et. al, 2015).

2.4.2 Método do sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-

hidrazil, DPPH

O DPPH é um radical livre estável a temperatura ambiente, o qual

apresenta uma coloração violeta quando em solução com etanol e possui

absorção máxima em 517nm (Oliveira, 2010). Este composto é amplamente

utilizado em testes da capacidade antioxidante de soluções, já que se pode

considera-la como a capacidade de doar elétron, ou seja, o poder de redução,

e esta substancia é capaz de receber elétrons para a sua neutralização (Shahid

et al, 2015).

Quando o radical DPPH recebe um elétron ou um hidrogênio,

torna-se mais estável e sua absorção diminui (Oliveira, 2010), causando

alteração na cor visível, a qual a intensidade da descoloração é um indicador

da capacidade antioxidante. A leitura deve ser feita através de um

espectrofotômetro UV (Shahid et al, 2015). A Figura 2.5 demonstra como

um antioxidante fenólico (BHT) consegue estabilizar o radical livre presente

no DPPH.

Figura 2.5: Reação do DPPH com BHT (antioxidante sintético). Fonte:

Santos (2015).

8

3. Materiais e Métodos

3.1 Preparação da matéria-prima

A matéria-prima utilizada nos experimentos foi a raiz da Rumex acetosa,

obtida pela empresa Trisâmya Produtos Naturais e Ervas Medicinais, localizada

em Santa Catarina, Brasil. As amostras são de lote único e foram colhidas em

2015 (maio-agosto) sendo secas ao sol e com auxílio de estufa a gás.

Figura 3.1: Raíz seca da Rumex acetosa. Fonte: Santos (2013).

Para serem utilizadas nos experimentos, a matéria-prima bruta foi

submetida a um processo de trituração em um liquidificador doméstico (Arno,

modelo MPAC, Brasil) e posteriormente processada através de peneiramento em

um sistema vibratório (Bertel, modelo 1868, Caieiras, SP, Brasil) durante 15

minutos, onde foram separadas pelo tamanho de suas partículas, sendo

selecionadas as de tamanho médio 1,42 mm, correspondentes a -10/+20 Mesh

(Série Tyler, Wheeling, USA).

3.2 Extração com líquidos pressurizados

Para a extração com líquido pressurizado, utilizamos o resultado de

maior rendimento de Santos (2017) para estabelecermos a pressão e a

temperaturas de todos os experimentos, de 150 bar e 80 °C, respectivamente.

Assim, foram realizados 4 experimentos para avaliação da influência da vazão

no rendimento do processo, variando-a em 0,5 ml/min, 1,5 ml/min, 2,0 ml/min e

3,0 ml/min. Sendo os experimentos de 2,0 ml/min e 3,0 ml/min realizados em

um tempo total de 4 horas e os demais em 3 horas.

9

O experimento se dá com uma unidade de extração esquematizada na

Figura 3.2. O aparato consiste em uma coluna extratora de 145 cm³

(comprimento de 30,7 cm e diâmetro interno de 2,45 cm); bomba de HPLC

(Serie III, LabAlliance, USA); banho termostático (Marconi, MA-184,

Piracicaba, Brasil); válvulas, manômetros e indicadores de pressão e

temperatura.

Figura 3.2: Esquema da unidade de ELP, em que V-1, V-2: válvulas agulha

macrométricas; V-3: válvula agulha micrométrica; R-1: frasco com etanol; R-2: coletor

de extrato; P-1: bomba de solvente; E-1 coluna extratora; B-1: banho termostatizado; T-

1: termopar; M-1: manômetro. Fonte: Santos (2017).

O processo tem início com o “empacotamento manual” da amostra na

coluna. Para isso são recortadas telas de proteção e acopladas a parte de baixo

da coluna. Depois é inserido algodão (algodão hidrofílico, Nevoa, 100%

algodão), aproximadamente 30 g de matéria prima e esferas de vidro até

completar o volume da coluna, nesta ordem. Após isso, é fechada com a tela de

cima e acoplada à unidade.

Montada a coluna, acopla-se a o banho termostático já em 80 °C e

bombeia-se o solvente etanol (Synth, Álcool etílico P.A.) até atingir a pressão

de trabalho com as válvulas V-2 e V-3 fechadas. Após 30 minutos para a

estabilização das condições de operação, abre-se cuidadosamente tais válvulas e

tem início a extração, sendo controlada a pressão manualmente através da

válvula V-3.

As coletas de extrato foram realizadas em tempos de 10, 25, 40, 60, 80,

100, 120, 140, 160, 180 minutos, nas extrações de 3 horas; também em 210 e

240 minutos, nas extrações de 4 horas. Os frascos eram previamente pesados

minutos antes da coleta e após a coleta postos diretamente em uma estufa

(Marconi, modelo MA 035) a 60 °C para secagem do solvente.

10

3.3 Preparo das soluções das amostras

Para a realização das análises de fenóis totais e atividade antioxidante, foi

necessário o preparo de soluções alcoólicas dos extratos secos. Para isso, foram

solubilizados em etanol todos os extratos secos dos pontos coletados em seus

respectivos frascos e, após total solubilização, unidos todos em uma placa petri

e colocados para secar em uma estufa a 60 °C.

Posterior a total secagem, pesou-se cerca de 20 mg da amostra e diluiu-a

com etanol em um balão de 10 ml, para uma concentração aproximada de 2

mg/mL. Então, homogeneizou-se as amostras em um agitador (Phoenix AP56) e

estocou-as em um frasco âmbar ao abrigo de luz.

3.4 Obtenção do rendimento, da curva cinética da extração e

da solubilidade

Para o cálculo do rendimento das extrações, foram pesados todos os

frascos após total secagem e comparado seu peso com o do frasco antes da

extração, obtendo assim a massa de extrato em cada frasco. Somando, esses

resultados, obtemos a massa total de extrato (mextrato) e dividindo pela massa de

matéria prima inserida na coluna (mmatéria-prima) obtemos o rendimento da

extração, de acordo com a equação 1.

Já para a obtenção da curva cinética, calculamos o rendimento em cada

tempo pré-determinado, somando as massas dos frascos até este e dividindo por

mmatéria-prima. Então, plotamos um gráfico de massa de extrato versus massa de

solvente consumido.

Para o cálculo da solubilidade utilizou-se o método de Draper e Smith, já

aplicado por Queiroz (1993), Galvão (2009), Souza (2001) e Santos (2017), que

consiste no ajuste da curva cinética em duas retas de coeficientes angulares

diferentes, uma para a etapa CER e outra para a etapa FER, de modo que haja

uma interseção entre elas, a qual corresponde ao tempo final da etapa CER

(tCER). O coeficiente angular da reta correspondente à etapa CER equivale à

solubilidade do analito no solvente (grama de extrato/grama de solvente).

3.5 Determinação da atividade antioxidante (EC50)

A determinação do poder antioxidante se deu através do Método do

sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazil, DPPH, que consiste, na prática,

no preparo de duas soluções: solução de DPPH e soluções alcoólicas diluídas de

extrato seco.

A solução de DPPH é preparada com 11,80 mg deste reagente diluídos

em um balão de 500 mL com etanol, para obtenção de uma concentração de 23,6

11

μg/mL. A solução agitada é transferida para um frasco âmbar e protegida com

alumínio para o abrigo de luz, devido a ser fotossensível.

Após isso, foram feitas as análises das soluções das amostras. As

soluções a serem lidas no espectrofotômetro (VARIAN, modelo 50 conc) em um

comprimento de onda de 517 nm, foram obtidas efetuando as diluições da

Tabela 3.1 para cada solução de amostra das extrações, reagindo por 30 minutos

em banho ultrassônico.

Tabela 3.1: Volumes de diluição para as soluções de amostras e obtenção das curvas de

AS (%).

Concentração estimada

para soluções de amostra

2 mg/mL

(μg/mL)

Volume de

amostra

(μL)

Volume de

etanol

(μL)

Volume de

solução de

DPPH

(μL)

3,33 10 590 5400

10,00 30 570 5400

20,00 60 540 5400

33,33 100 500 5400

A partir dos resultados de absorbância obtidos para as diluições, em

duplicata, obteve-se a absorbância média e calculou-se a porcentagem de captura

do radical DPPH (AS (%)), através da equação 2, ou seja, a quantidade de DPPH

da solução controle pelos antioxidantes da amostra.

Após estes cálculos, é obtida uma reta para cada amostra de AS (%)

versus concentração, e sua equação fornece o resultado de EC50 quando AS(%)

equivale a 50 %, ou seja, concentração de amostra necessária para inibir em 50

% a atividade dos radicais de DPPH. Portanto, menores valores de EC50

implicam em um maior poder antioxidante da amostra.

3.6 Determinação do teor de fenóis totais (TFT)

A determinação da quantidade de fenóis totais se deu através do método

espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau, descrito no item 2.4.1. Na prática, o

método consiste no preparo de soluções reacionárias que ocorrem com mudança

de cor e podem ser lidas em um espectrofotômetro com absorbância em um

comprimento de luz de 760 nm.

Para isso foram utilizadas três soluções: solução aquosa de carbonato de

sódio a 15% em massa, preparada pela diluição de 3,75 g de Na2CO3 em 25 mL

de água destilada; solução de ácido gálico a 0,5 mg/mL, obtida através da

diluição de 10 mg do ácido em 10 mL de água destilada e diluindo 5 mL desta

12

solução, em 10 mL de água destilada para obtenção da solução de 0,5 mg/mL; e

por fim, as soluções das amostras, preparadas conforme o item 3.3.

Para determinar a concentração de fenóis totais em função da

absorbância, foi-se necessário o preparo de uma curva de calibração, utilizando

a solução de ácido gálico como padrão. Esta curva, foi obtida por Santos

(2017), nas mesmas condições e no mesmo espaço físico do presente trabalho,

portanto será utilizada aqui. As quantidades de reagentes estão descritas na

Tabela 3.2, abaixo:

Tabela 3.2: Volumes de diluição para a obtenção da curva padrão de àcido Gálico.

Concentração final

das soluções de

Ác. Gálico

(μg/mL)

Volume de

solução de Ác.

Gálico a

0,5mg/mL

(μL)

Volume de

água destilada

(μL)

Volume do

reagente Folin-

Ciocalteu

(μL)

Volume de

solução de

Na2CO3 a 15%

(μL)

1,0 20 9180 200 600

2,5 50 9150 200 600

5,0 100 9100 200 600

7,5 150 9050 200 600

10,0 200 9000 200 600

12,5 250 8950 200 600

15,0 300 8900 200 600

20,0 400 8800 200 600

Após a obtenção da curva de calibração e a obtenção da relação

concentração e absorbância, preparou-se as soluções, diluídas com os volumes

de reagentes conforme a Tabela 3.3 e deixou reagir por duas horas ao abrigo de

luz.

Tabela 3.3: Volumes de diluição das amostras.

Concentração final

estimada para soluções

de amostras de

2 mg/ml

(μg/ml)

Volume de

amostra

(μL)

Volume de

água

destilada

(μL)

Volume de

reagente Folin-

Ciocalteu

(μL)

Volume de

solução de

carbonato de

cálcio 15%

25 125 9075 200 600

Após a obtenção da absorbância em duplicata de cada amostra, obteve-se

a absorbância média e através da equação da curva padrão, obteve-se o

equivalente em ácido gálico em µg/mL (EAG). Com isso, o teor de fenólicos

totais (TFT), pode ser calculado segundo a equação 3, pela razão do EAG com a

concentração final das soluções das amostras após a diluição.

13

14

4. Resultados e discussões

4.1 Rendimento e Solubilidade

Com base no peso de cada frasco da extração, foi possível averiguar a

massa acumulada em cada tempo e o rendimento (segundo a equação 1). A

massa de solvente total utilizada é obtida através da multiplicação da vazão pelo

tempo e densidade do etanol nas condições de extração. Assim, pode-se obter

alguns gráficos para análise da influência da vazão e de tempo no processo de

extração com líquido pressurizado.

Ao plotar o rendimento em função do tempo, vê-se que quanto maior o

tempo de extração e a vazão do solvente, maior o rendimento da extração.

Observa-se esta tendência na Figura 4.1, onde em um mesmo período de tempo,

o rendimento da maior vazão é sempre maior, e prolongando-se o tempo de

extração, o rendimento continua a aumentar.

Figura 4.1: Curva cinética das extrações de rendimento versus tempo

Este comportamento pode ser explicado pelo fato de que com maior

vazão, há uma maior quantidade de massa de solvente para solubilizar a

matéria-prima, gerando um maior contato entre o etanol e os solutos (Santos,

2017). Já em relação ao tempo, caso continue-se a extração, o soluto continua a

ser extraído através dos mecanismos difusionais, tendendo ao contínuo aumento

da massa extraída até que entre na etapa DC, onde a taxa de extração é

praticamente nula (Queiroz, 1993).

Quanto à solubilidade pode ser entendida melhor analisando as Figuras

4.2 e 4.3, as quais representam o gráfico massa acumulada versus massa total de

solvente e os gráficos obtidos através dos métodos de Draper e Smith para com

as duas retas das etapas CER e FER, com suas respectivas equações.

7,27

8,46

9,89

10,81

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270

REN

DIM

ENTO

(%

)

TEMPO (MIN)

150bar; 80 °C; 0,5 mL/min; 3h

150bar; 80 °C; 1,5 mL/min; 3h

150bar; 80 °C; 2,0 mL/min; 4h

150bar; 80 °C; 3,0 mL/min; 4h

15

Observa-se visualmente pela Figura 4.2 que para a faixa de vazão

estudada, a solubilidade do soluto em etanol permanece praticamente constante,

uma vez que as curvas estão aparentemente sobrepostas, principalmente na etapa

CER, tendendo a possuir inclinações próximas e, consequentemente, uma razão

massa de soluto por massa de solvente também próximas. Isso pode ser

confirmado pelas equações das retas plotadas na Figura 4.3, onde temos a faixa

de solubilidade variando entre 0,0418 g/g e 0,0721 g/g, (de acordo com a Tabela

4.1) o que representa uma variação pouco distinta. Isso confirma que o solvente

está sendo extraído em equilíbrio e saturado com o soluto (Santos, 2017). Em

vazões superiores a esta faixa, pode ser que não ocorra a saturação, devido a um

tempo de contato menor com a matéria-prima e consequentemente, reduza a

eficiência da extração (Queiroz, 1993).

Figura 4.2: Curvas cinéticas das extrações, mostrando a massa acumulada de

extrato versus massa utilizada de solvente

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 100 200 300 400 500 600 700

MA

SSA

AC

UM

ULA

DA

DE

EXTR

ATO

(G)

MASSA DE SOLVENTE (G)

150bar; 80 °C; 0,5 mL/min; 3h

150bar; 80 °C; 1,5 mL/min; 3h

150bar; 80 °C; 2,0 mL/min; 4h

150bar; 80 °C; 3,0 mL/min; 4h

16

Figura 4.3: Curvas cinéticas das extrações, mostrando a massa acumulada de

extrato versus massa utilizada de solvente, com os ajustes lienar para as retas das

etapas CER e FER das extrações de 150 bar e 80 ° C com: 0,5 mL/min e 3h (a);

1,5 mL/min e 3h (b); 2,0 mL/min e 4h (c); e 3,0 mL/min e 4h (c).

Tabela 4.1: Rendimento e solubilidade de cada extração nas condições estudadas

Extração Rendimento (%) Solubilidade (g/g)

150 bar; 80 °C; 0,5 mL/min; 3h 7,27 0,0721

150 bar; 80 °C; 1,5 mL/min; 3h 8,46 0,0551

150 bar; 80 °C; 2,0 mL/min; 4h 9,89 0,0418

150 bar; 80 °C; 3,0 mL/min; 4h 10,81 0,056

4.2 Teor de Fenóis Totais

O TFT foi obtido pelo método descrito no item 3.6 e os resultados das

absorbâncias obtidas nos ensaios, bem como os cálculos da concentração final

corrigida das amostras após a diluição, EAG e TFT estão descritos na Tabela

4.2.

17

Tabela 4.2: Absorbâncias médias obtidas nos ensaios de Folin-Ciocalteau e os

resultados de EAG e TFT para o extrato de cada extração.

Amostra Absorbância

média

Concentração

final corrigida

(μg/mL)

EAG

(µg/mL)

TFT

(mgEAG/gextrato)

1 (0,5 ml/min; 3h) 0,4489 25 4,54 181,63

2 (1,5 ml/min; 3h) 0,4592 30,125 4,64 154,06

3 (2,0 ml/min; 4h) 0,4712 29 4,76 164,06

4 (3,0 ml/min; 4h) 0,42675 28,875 4,33 149,80

Pelos resultados vê-se que os o TFT das amostras estão na mesma ordem

de grandeza, além de não seguir um padrão proporcional à vazão. Isso pode ser

explicado pelo fato da solubilidade ser praticamente a mesma para a faixa de

vazão trabalhada (como mostra a Tabela 4.1), portanto, mesmo que a extração

apresente maiores rendimentos a maiores vazões, o composto de interesse é

solubilizado e extraído praticamente na mesma quantidade (quantidade de

saturação) em todas as extrações (Queiroz, 1993).

Além disso, o tempo também não influenciou no teor, como vemos que

as extrações de 4 horas possuem TFT próximos das extrações de 3 horas. Uma

hipótese para isso é que devido à etapa CER representar cerca de 60% do

rendimento da extração (Santos, 2017), os compostos fenólicos sejam extraídos

nesta etapa, ou seja, no início da extração, onde, como discutido anteriormente,

são solubilizados praticamente da mesma forma.

4.3 Atividade Antioxidante (EC50)

A atividade antioxidante (EC50) foi obtida segundo o método descrito no

item 3.5. A concentração final corrigida da diluição, bem como a absorbância

média obtida nos ensaios, a absorbância de controle do DPPH puro e a AS %

estão apresentadas na Tabela 4.3.

Tabela 4.3: Concentração final corrigida dos ensaios de DPPH, juntamente com os

resultados de absorbância média e os cálculos de AS (%).

ABS controle 0,6028

Extração

Concentração

final corrigida

(μg/mL)

Absorbância

média AS (%)

1 (0,5 ml/min; 3h) 3,33 0,47 21,68

1 (0,5 ml/min; 3h) 10,00 0,38 36,79

1 (0,5 ml/min; 3h) 20,00 0,27 55,91

1 (0,5 ml/min; 3h) 33,33 0,16 74,12

2 (1,5 ml/min; 3h) 4,02 0,47 22,38

2 (1,5 ml/min; 3h) 12,05 0,38 37,43

2 (1,5 ml/min; 3h) 24,10 0,26 57,23

18

2 (1,5 ml/min; 3h) 40,17 0,17 72,26

3 (2,0 ml/min; 4h) 3,87 0,46 24,45

3 (2,0 ml/min; 4h) 11,60 0,36 40,38

3 (2,0 ml/min; 4h) 23,20 0,24 59,88

3 (2,0 ml/min; 4h) 38,67 0,14 76,73

4 (3,0 ml/min; 4h) 3,85 0,48 20,38

4 (3,0 ml/min; 4h) 11,55 0,40 33,66

4 (3,0 ml/min; 4h) 23,10 0,28 52,99

4 (3,0 ml/min; 4h) 38,50 0,17 71,70

A partir dos resultados de AS %, foram plotadas as retas e suas equações

para cada extração conforma a Figura 4.4.

Figura 4.4: Curvas de AS (%) versus concentração com suas respectivas equações da

reta, par as extrações 1 (150 bar; 80 °C; 0,5 ml/min; 3h) (a); 2 (150 bar; 80 °C; 1,5

ml/min; 3h) (b); 3 (150 bar; 80 °C; 2,0 ml/min; 4h) (c) e 150 bar; 80 °C; 3,0 ml/min; 4h

(d).

19

Com as equações dos gráficos da Figura 4.4, para cada extração, calcula-

se o EC50 quando y (AS%) equivaler a 50 %. Os valores de EC50 para cada

extração estão na Tabela 4.4.

Tabela 4.4: Resultados de EC50 para cada extração.

Extração EC50

(µg/mL)

150 bar; 80 °C; 0,5 ml/min; 3h 18,32

150 bar; 80 °C; 1,5 ml/min; 3h 22,03

150 bar; 80 °C; 2,0 ml/min; 4h 19,09

150 bar; 80 °C; 3,0 ml/min; 4h 22,84

Os resultados de da Tabela 4.4 exibem uma mesma ordem de grandeza

para o EC50 em todas as extrações. Isso indica que, analogamente ao TFT, os

compostos com atividade antioxidantes são extraídos em sua maioria na etapa

CER, onde possuem solubilidades semelhantes e, portanto, são extraídos em

quantidades similares (quantidade de saturação), não sendo influenciados pelas

vazões da faixa estudada ou pelo tempo de extração.

20

5. Conclusão

Os resultados obtidos neste trabalho averiguaram que a vazão e o tempo de

processo têm grande influência no rendimento da extração, de modo que é

diretamente proporcional a estes parâmetros. No entanto, os ensaios de teor de

fenólicos totais e atividade antioxidante inferiram que os parâmetros estudados não

possuem ligação com a qualidade do extrato, uma vez que os resultados se

apresentaram muito semelhantes em todas as extrações. Este comportamento é

explicado pela curva cinética que mostrou uma solubilidade de analito similar na

etapa CER em toda a faixa de vazão trabalhada, demonstrando que os componentes

fenólicos antioxidantes são extraídos praticamente na mesma quantidade de

saturação em todos os casos estudados.

21

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