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INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL

SUSTENTÁVEL

EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO DE SELÊNIO, VITAMINA E E ÓLEO DE GIRASSOL NAS RESPOSTAS IMUNOFISIOLÓGICAS

DE VACAS JERSEY EM LACTAÇÃO

Tássia Sant’Ana Samóra

Nova Odessa - SP Fevereiro de 2014

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GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO

SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS

INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL

SUSTENTÁVEL

Efeito da suplementação de selênio, vitamina E e óleo de

girassol nas respostas imunofisiológicas de vacas Jersey em

lactação

Tássia Sant’Ana Samóra

Orientador (a): Dra. Lenira El Faro

Co-orientador (a): Dra. Márcia Saladini Vieira Salles

Nova Odessa - SP Fevereiro de 2014

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação do Instituto de Zootecnia, APTA/SAA, como parte dos requisitos para obtenção do título

de Mestre em Produção Animal Sustentável.

Ficha catalográfica elaborada pelo

Núcleo de Informação e Documentação do Instituto de Zootecnia Bibliotecária: Tatiane Helena Borges de Salles CRB 8/8946

S191e Samóra, Tássia Sant´ana Efeito da suplementação de selênio, vitamina E e óleo de

girassol nas respostas imunofisiológicas de vacas Jersey em lactação / Tássia Sant´ana Samóra.

Nova Odessa, SP: [s.n.], 2014. 55 f.: il.

Dissertação (Mestrado) – Instituto de Zootecnia. APTA/SAA,

Nova Odessa.

Orientador: Dra. Lenira El Faro Co-orientador: Dra. Márcia Saladini Vieira Salles

1. Suplementação selênio. 2. Oléo de Girassol. 3. Raça Jersey. 4.

Vitamina E. 5. Lactação. I. El Faro, Lenira II. Salles, Márcia Saladini Vieira III. Titulo.

CDD 636.211

GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO SECRETARIA DA AGRICULTURA E ABASTECIMENTO

AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS

INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL

CERTIFICADO DE APROVAÇÃO

TÍTULO: EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO DE SELÊNIO, VITAMINA

E E ÓLEO DE GIRASSOL NAS RESPOSTAS

IMUNOFISIOLÓGICAS DE VACAS JERSEY EM LACTAÇÃO

AUTOR: Tássia Sant’Ana Samóra

Orientador: Dra. Lenira El Faro

Co-orientadora: Dra. Márcia Saladini Vieira Salles

Aprovado como parte das exigências para obtenção de título de MESTRE em

Produção Animal Sustentável, pela Comissão Examinadora:

Dra. Lenira El Faro

Instituto de Zootecnia – APTA/SAA

Luiz Carlos Roma Júnior Agência Paulista de Tecnologia e Agronegócios – APTA/SAA

Fábio Prudêncio de Campos Instituto de Zootecnia – APTA/SAA

Data da realização: 06 de Fevereiro de 2014

Presidente da Comissão Examinadora Prof. Dra. Lenira El Faro

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Aos meus pais, Carlos e Meire, e ao meu irmão João Carlos, por todo o apoio, compreensão e amor.

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AGRADECIMENTOS

À minha Família, pelo apoio, pelo investimento e pelo amor incondicional.

À Márcia Saladini Vieira Salles e Lenira El Faro, pela confiança, paciência

e por todos os conselhos e ensinamentos.

Ao Dr. Fernando André Salles pela colaboração nas análises estatísticas.

Ao Dr. Luiz Carlos Roma Junior e aos meus amigos da fazenda Suelen,

Dani e Lucien, pelo enorme e fundamental auxílio na execução do projeto, sem

vocês eu não conseguiria.

À Dra. Alice Maria Melville Paiva Della Libera e sua equipe pela

colaboração nas análises laboratoriais.

Aos meus amigos Tamiris, Silmara, Natália, Taís, Gabriela, Alexandre e

Camila, pela força e por serem meus irmãos de coração nas horas que

precisei.

Ao Instituto de Zootecnia juntamente com seus funcionários e a todo o

corpo docente, por contribuírem no meu crescimento profissional.

Aos funcionários da APTA - Ribeirão Preto, pelo esforço e pela ajuda na

realização do experimento.

À CAPES pela concessão da bolsa e a FAPESP pelo financiamento e

auxilio para realização do projeto.

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SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS................................................ xi

RESUMO.............................................................................................. xiii

ABSTRACT........................................................................................... xv

1 INTRODUÇÃO ................................................................................. 17

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................ 19

2.1 Sistema imune…….………………………………….….………….. 19

2.1.2 Glândula mamária….…......................................................... 22

2.2 Antioxidantes ….……..…............................................................. 23

2.2.1 Selênio...................................……......................................... 25

2.2.2 Vitamina E............................................................................. 27

2.3 Óleo de girassol.. ….……............................................................ 29

3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................ 31

3.1 Animais, tratamentos e delineamento experimental ................... 31

3.2 Manejo experimental e coleta de dados...................................... 32

3.3 Análises bromatológicas.............................................................. 36

3.4 Análises no leite.......................................................................... 37

3.5 Análises no sangue..................................................................... 37

3.5.1 Análises hematológicas......................................................... 37

3.5.2 Determinação da glutationa peroxidase................................ 38

3.5.3 Atividade da glutationa reduzida........................................... 39

3.5.4 Atividade antioxidante total.................................................... 39

3.5.5 Índice de peroxidação lipídica avaliado pelo teor de malondialdeído..................................................................................... 39

3.5.6 Avaliação da função fagocítica e de produção intracelular de espécies reativas de oxigênio.......................................................... 40

3.5.7 Análises de selênio e vitamina E............................................ 41

3.6 Análise estatística......................................................................... 42

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................. 43

4.1 Selênio no sangue................................................................................ 43

4.2 Avaliação do estresse oxidativo........................................................... 44

4.2.1 Quantificação da glutationa peroxidase (GSH-Px)......................... 45

4.2.2 Quantificação da glutationa reduzida (GSH).................................. 46

4.2.3 Atividade antioxidante total plasmática (AAT)................................ 47

4.2.4 Índice de peroxidação lipídica avaliado pelo teor de malondialdeído (MDA)................................................................................... 47

4.3 Hemograma.......................................................................................... 50

4.4 Avaliação funcional dos leucócitos polimorfonucleares do sangue...................................................................................................... 53

4.4.1 Avaliação da população de células PMN CH138+ do sangue........................................................................................................... 53

4.4.2 Avaliação da fagocitose da E. coli pelas células PMN CH138+ do sangue.......................................................................................................... 54

4.4.3 Avaliação da fagocitose do S. aureus pelas células PMN CH138+ do sangue..................................................................................................... 57

4.5 CCS e exame bacteriológico................................................................ 58

5 CONCLUSÕES.......................................................................................... 61

REFERÊNCIAS............................................................................................. 62

xi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AAT: Atividade antioxidante total

CCS: Contagem de células somáticas

EE: Extrato etéreo

ERO: Espécie reativa de oxigênio

FDA: Fibra em detergente ácido

FDN: Fibra em detergente neutro

CMS Consumo de matéria seca

Gr: Glutationa redutase

GSH: Glutationa reduzida

GSH-Px: Glutationa peroxidase

GSSG: Glutationa oxidada

Hb: Hemoglobina

MDA Malondialdeído

MM: Matéria mineral

MS: Matéria seca

PB: Proteína Bruta

PL: Produção de leite

PMN: Células polimorfonucleares

Se Selênio

TBARS: Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

TrxR: Tioredoxina redutase

UI: Unidades internacionais

xiii

TÍTULO: Efeito da suplementação de selênio, vitamina E e óleo de girassol nas respostas imunofisiológicas de vacas Jersey em lactação

RESUMO: O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos da suplementação de selênio, vitamina E e óleo de girassol sobre as respostas imunofisiológicas de vacas em lactação. Foram utilizadas 28 vacas da raça Jersey distribuídas em um delineamento experimental de blocos casualisados (início, meio e final de lactação) durante 94 dias na APTA Regional – Pólo Centro Leste da cidade de Ribeirão Preto - SP. As vacas receberam os seguintes tratamentos: dieta controle; dieta controle + vitamina E + selênio; dieta com óleo de girassol; dieta com óleo de girassol + vitamina E + selênio. Efeitos específicos dos tratamentos foram testados através de contrastes ortogonais (efeito dos antioxidantes, do óleo e da interação entre os dois). Amostras de sangue foram coletadas para avaliações de estresse oxidativo (pelo teor de malondialdeído, concentração de glutationa reduzida, atividade da glutationa peroxidase e pela atividade antioxidante total) e da resposta imune (pela avaliação hematológica, quantificação da função fagocítica e produção intracelular de peróxido de hidrogênio de leucócitos polimorfonucleares). A adição do selênio e da vitamina E na dieta mostrou melhorar o sistema imunológico das vacas devido ao aumento dos níveis enzimáticos da glutationa peroxidase e da quantidade de células leucocitárias ativas no sangue dos animais. A adição de óleo de girassol mostrou melhorar a atividade fagocitária dos leucócitos polimorfonucleares no sangue dos animais. Palavras-chave: antioxidante, glutationa, células polimorfonucleares,

fagocitose, peróxido.

xv

TITLE: Effect of selenium, vitamin E and sunflower oil in imunophysiology responses of lactating Jersey cows

ABSTRACT The aim of this study was to verify the effect of selenium, vitamin E and sunflower oil on imunophysiology responses of lactating cows. An experiment was performed with 28 Jersey cows were used in an experimental randomized block design (early , middle and late lactation ) for 94 days in the APTA Regional – Pólo Centro Leste - city of Ribeirão Preto – SP. Cows received the following treatments: control diet , control diet + vitamin E + selenium ; diet with sunflower oil , sunflower diet + vitamin E + selenium oil. Blood samples were collected for evaluation of oxidative stress (by malondialdehyde content, concentration of reduced glutathione, activity of glutathione peroxidase and total antioxidant activity) and immune response (for hematological evaluation, quantification of the phagocytic function and intracellular production of hydrogen peroxide from polymorphonuclear leukocytes). The addition of selenium and vitamin E in the diet shown to improve the immune system of cows due to increased levels of glutathione peroxidase enzyme and the amount of active leukocytes in the blood of animals. The addition of sunflower oil showed improves the phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in the blood of animals. Keywords: antioxidant, glutathione, polymorphonuclear cells, phagocytosis, peroxide.

17

1. INTRODUÇÃO

Estudos zootécnicos têm demonstrado que inadequados status

antioxidantes ou estresse oxidativo em vacas contribui para uma baixa função

do sistema imune, aumentando os riscos de doenças e diminuição da produção

de leite. Dentro deste contexto, a adição de antioxidantes na dieta dos animais

vem sendo bastante estudada já que a nutrição é um importante modulador da

função imune e pode muitas vezes ser o limitante do balanço entre a saúde e a

doença (KLASING, 2001).

A adição de vitamina E, selênio ou β-caroteno pode melhorar o status

antioxidante, com melhora na função imune do organismo do animal e com a

redução da incidência de mastite e da retenção de placenta (GOFF, 2006).

Além disso, a administração de selênio associado à vitamina E para vacas em

lactação, além de aumentar a concentração de ambos no leite também tem

efeito positivo sobre sua estabilidade oxidativa (NICHOLSON et al., 1991).

A vitamina E, reconhecida como nutriente essencial para todas as

espécies animais, pode prevenir a degradação peroxidativa de gordura das

18

células animais e a formação de radicais livres (HATFIELD et al, 1999; LIU et

al, 1995).

Diante do exposto, este trabalho teve o objetivo de estudar os efeitos da

suplementação de selênio, vitamina E e óleo de girassol nas respostas

imunofisiológicas de vacas Jersey em lactação.

19

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Sistema imune

Os estudos na área de imunologia experimental são mais desenvolvidos

para as espécies de roedores e humanos porém, é possível extrapolar muito

desses princípios fundamentais para espécie bovina (DAY e SCHULTZ., 2011).

A resposta imunitária é definida como “fenômeno resultante da interação

específica entre as células do sistema imune com o antígeno” (World Health

Organization., 1970). Ao longo da vida de um animal é natural que ele tenha

contato com diversos tipos de patógenos e microrganismos causadores de

doenças. A diferença entre um animal saudável, com capacidade de crescer e

ganhar peso de forma rentável, de um animal enfermo e que não responde a

vacinas e medicamentos (tornando-se dispendioso) é justamente a forma como

o seu sistema imune responde frente aos desafios patológicos (HUNSAKER et

al., 2002).

As respostas imunitárias são classificada como “inata” (não-específica) e

“adaptativa” (específica). O sistema imune inato é imediato e de baixa duração.

20

Esse tipo de sistema é ativo em locais susceptíveis ao primeiro contato com o

patógeno (pele, tratos respiratório e gastrointestinal, mucosas e glândula

mamária). Essas barreiras físicas possuem mecanismos prontamente

disponíveis capazes de liberar secreções ricas em moléculas microbicidas

como enzimas, pequenos peptídeos antimicrobianos e anticorpos. Alguns tipos

de leucócitos também participam da primeira linha de defesa do organismo

fagocitando os organismos invasores, como é o caso dos macrófagos,

neutrófilos, as células NK (natural killer) e uma subpopulação de linfócitos T.

O sistema imune adaptativo é adquirido após o animal ter o contato com

o patógeno (de forma natural ou artificial) e é composto por células linfóides

(linfócitos T e linfócitos B) ou células de memória. Esse tipo de imunidade é

adquirida com o tempo e é muito efetiva no controle de infecções e doenças

(DAY e SCHULTZ., 2011).

O sangue dos animais é composto pelos glóbulos vermelhos (hemácia

ou eritrócito), plaquetas e leucócitos (glóbulos brancos). Os leucócitos são

células de defesa produzidas pela medula óssea a partir das células-tronco e

são divididos em polimorfonucleares (mastócitos, neutrófilos, eosinófilos e

basófilos) e mononucleares (monócitos/macrófagos, linfócitos B e linfócitos T)

(TURGEON, 2014)

Os macrófagos são células mononucleadas que originam-se a partir da

maturação dos monócitos. Suas principais funções são reconhecer e

apresentar o antígeno para o linfócito, secretar citocinas que influenciam

respostas dos sistemas imunes inato e adaptativo e fagocitar organismos

invasores, células mortas e alguns complexos imunes e antígenos. Os

neutrófilos constituem a maior parte dos leucócitos polimorfonucleares

circulantes do sangue cuja função é migrar para os sítios de infecção mediados

por citocinas para fagocitar os organismos invasores (ZABRISKIE., 2009).

Os eosinófilos são reguladores da homeostase que impedem a

propagação excessiva da inflamação. Possuem papel no mecanismo de defesa

dos animais contra alguns estágios larvais de parasitas helmintos. Os basófilos

são encontrados em poucas quantidades na corrente sanguínea e possuem

altas concentrações de heparina e histamina em seus grânulos possuindo

21

papel importante em reações de hipersensibilidade e alergias (TURGEON,

2009).

Os ruminantes possuem algumas particularidades no seu sistema

imunológico em relação aos ratos e humanos. Na sua circulação, há um

equilíbrio entre os neutrófilos e as células mononucleares. Outra peculiaridade

dos ruminantes é sua tolerância a uma ampla variedade de adjuvantes

farmacêuticos (excipientes) que causam efeitos colaterais em outras espécies.

Esses componentes permitem uma resposta imune mais ampla e duradoura

nos animais, como o “óleo/água” usado na fabricação de fármacos (HURLEY.,

2006).

Estudos têm demonstrado que durante e após o período de transição é

comum a ocorrência de imunossupressão devido ao estresse em vacas

leiteiras e consequentemente o aumento da incidência de doenças (GOFF e

HORST., 1997). Esse fato ocorre devido aos grandes desafios metabólicos que

ocorrem nesse período pois, vacas de leite geralmente se encontram em

balanço energético negativo (BEN) e em déficit de nutrientes, tais como

vitaminas e minerais (SANTOS e SANTOS., 1998).

A diminuição de consumo de matéria seca associado a alta demanda de

nutrientes para a formação do colostro e nutrição do feto, provocam redução

dos níveis séricos de vitaminas e minerais com propriedades antioxidantes,

como o zinco, selênio, vitamina E e vitamina C. A redução sérica desses

componentes estão associados ao aumento do estresse oxidativo e redução da

atividade leucocitária, comprometendo o sistema imunológico, aumentando o

risco de doenças e diminuindo a produção de leite dos animais (WEISS et al.,

1995).

A saúde do rebanho leiteiro deve ser acompanhada através dos

parâmetros hematológicos sanguíneos frente aos processo fisiológicos de cada

fase do ciclo produtivo dos animais (TAYLOR et al., 2000). É comum verificar

alterações nesses parâmetros, por exemplo, durante a gestação onde o

número de eritrócitos e o volume sanguíneo aumentam devido à manutenção

de uma adequada circulação útero-placentária para o desenvolvimento do feto

(HYTTEN., 1995).

22

Durante o parto, também é possível verificar o aumento do número de

leucócitos, principalmente dos neutrófilos que só diminuem depois de 24 horas

após o parto (JAIN., 1993). Porém, devido a secreção de glicocorticóides nesse

período de estresse, a expressão de moléculas como a L-selectina pelos

neutrófilos fica reduzida, fazendo com que a capacidade de migração para os

locais de infecção seja prejudicada e consequentemente reduza a função

imunológica dos animais (INGVARTSEN et al., 2003).

2.1.1 Glândula mamária

A glândula mamária é um órgão extremamente importante do ponto de

vista econômico e a mastite é uma das doenças mais cruciais relacionada com

a lactação e a diminuição da produção de leite (KEHRLI et al., 2001).

A imunidade da glândula mamária, definida como a proteção e a

resistência à doença infecciosa, é facilitada através de uma variedade de

fatores imunes e não imunes (SORDILLO, 2002). Dentre os fatores imunes da

glândula mamária, encontram-se as células polimorfonucleares (PMN), os

linfócitos e os macrófagos (WARDLEY et al., 1976; RYSANEK et al., 1999). As

células polimorfonucleares (PMN) como, por exemplo, os neutrófilos são

consideradas a primeira linha de defesa contra os patógenos da glândula

mamária (MEHRZAD., 2001).

Os neutrófilos são produzidos na medula óssea, entram na circulação

sanguínea e migram através das paredes de vasos capilares para o lúmen da

glândula mamária (SLADEK e RYSANEK., 2001), mediados pelas citocinas

(ex: interleucinas) produzidas pelos macrófagos residentes (BANNERMAN.,

2004), onde fagocitam as bactérias invasoras. Além disso, os neutrófilos são

capazes de produzir compostos bactericidas como, por exemplo, o peróxido de

hidrogênio intracelular e espécies reativas de oxigênio que contribuem para a

morte de patógenos (TIZARD., 2002). Após a eliminação dos patógenos, os

neutrófilos sofrem apoptose e são fagocitados pelos macrófagos (SLADEK e

RYSANEK., 2000 e 2001).

A susceptibilidade às infecções patogênicas da glândula mamária varia

de acordo com o estado fisiológico dos animais, podendo aumentar

23

aproximadamente 75% no terço final da gestação (FOX., 2010) e durante o

início de lactação (MEHRZAD et al., 2001).

A ação da ordenha mecânica aumenta a diapedese de células

polimorfonucleares do sangue para a glândula mamária aumentando, assim, as

suas concentrações no leite (PAAPE et al, 1985). Além dos neutrófilos, outras

células, responsáveis pela defesa da glândula mamária, são encontradas no

leite bovino tais como os linfócitos, eosinófilos, macrófagos e celulas epiteliais

(PAAPE et al, 1963).

O recrutamento dessas células à glândula mamária infectada aumenta a

contagem de células somáticas (CCS) do leite (MEHRZAD et al., 2001) e, nos

casos de mastite, as PMN podem aumentar acima de 90 % (KOESS e

HAMANN, 2008; SOUZA et al., 2009).

Os principais patógenos encontrados em casos clínicos de mastite e

responsáveis pelo aumento de contagem de células somáticas no leite são o

Staphylococcus aureus e Escherichia coli (BANNERMAN et al., 2004). Porém,

outros tipos de bactérias como o Streptococcus agalactiae, Staphylococcus spp

coagulase negativo, Corynobacterium bovis e os coliformes também são

facilmente encontrados (SOUZA et al., 2009).

Portanto, a melhor forma de se analisar a saúde da glândula mamária, é

realizando a contagem de células somáticas (CCS) (SOUZA et al., 2009) em

conjunto com o exame bacteriológico do leite dos animais (BLAGITZ, 2011).

2.2 Antioxidantes

Utilizar a nutrição para melhorar a resistência imunológica dos animais

ou diminuir a intensidade das infecções é uma área de pesquisa importante

(SCALETTI et al., 1999), e os antioxidantes possuem um papel essencial

dentro deste contexto.

A maior parte do O2, produzido durante o catabolismo dos nutrientes

ingeridos na dieta, é direcionado para a síntese de energia na mitocôndria das

células (cadeia respiratória) e reduzido à água (O2 + + 4H+ + 4e-

2H2O)

(BARBOSA et al., 2010). Ao longo da cadeia, além da geração de prótons para

a síntese de ATP, há a redução do restante do O2 em espécies reativas de

24

oxigênio (EROs) como os superóxidos (O2•

-

), peróxidos de hidrogênio (H2O2), e

grupos hidroxila livres (OH-) (HALLIWELL., 1995).

As EROs em excesso causam a peroxidação lipídica dos ácidos graxos

das membranas celulares provocando ruptura dessas membranas, mutações

no DNA, oxidação dos lipídios insaturados, formação de resíduos químicos

(como o malondialdeído) e comprometimento dos componentes da matriz

extracelular (HALLIWELL e GUTTERIDGE., 1989)

O organismo possui sistemas antioxidantes enzimáticos e não

enzimáticos de eliminação de radicais livres quando estes estão em quantidade

excessiva no organismo. Os antioxidantes não enzimáticos são, em sua

maioria, absorvidos pela dieta como por exemplo o selênio, zinco, vitamina E e

vitamina A. Já os antioxidantes enzimáticos (ou endógenos) são produzidos

pelo próprio organismo como é o caso da glutationa peroxidase (enzima

selênio-dependente) e superóxido dismutase (KUSS, 2005). A superóxido

dismutase age sobre a transformação do radical superóxido em peróxido de

hidrogênio enquanto a glutationa peroxidase, enzima selênio dependente,

degrada os hidroperóxidos (MANSON e AKESSON, 2000).

Quando esses sistemas antioxidativos não são eficientes, o animal pode

apresentar um quadro de estresse oxidativo, que está relacionado com o

aparecimento de doenças como mastite, edema de úbere e retenção de

placenta em vacas (LAUZON et al., 2006). A suplementação com antioxidantes

na dieta de vacas leiteiras, como o selênio e a vitamina E, além de reduzir o

estresse oxidativo, pela retirada dos peróxidos e redução da peroxidação dos

ácidos graxos das células, também possui efeito positivo nos mecanismos de

defesa da glândula mamária contra a mastite (SMITS et al., 1997; WEISS e

WYATT, 2002) pois, na ocorrência dessa doença há liberação de radicais livres

quando os patógenos são fagocitados pelas células de defesa do organismo

causando lesões no epitélio mamário e diminuição da secreção do leite

(BARBANO et al, 2006).

Os antioxidantes são capazes de prolongar a fase de iniciação

(impedindo a geração de EROs ou sequestrando essas espécies) como é o

caso da glutationa peroxidase, ou inibir a fase de propagação da oxidação

25

(removendo os radicais peroxilas), mas, não podem prevenir completamente

esse evento (JORDÃO et al., 1998).

2.2.1 Selênio

O selênio é um semi-metal que pode existir em vários estados de

oxidação, o que lhe permite formar uma série de compostos. Segundo

McDowell (1992), o papel do selênio na nutrição animal foi descoberto quando

se observou que a suplementação evitava necrose hepática em ratos. Após

essa constatação, também foi relatada a prevenção de distrofia muscular

quando bovinos e ovinos foram suplementados com selênio.

A suplementação de selênio diminui infecções mamárias em vacas de

leite como também reduz a duração dos sintomas de mastite clínica. A relação

entre a suplementação de Se e a incidência de mastites estão relacionadas

com o efeito positivo do Se na função do sistema imunológico do animal

(GERLOFF, 1992). Paschoal et al. (2003) suplementando vacas no pré-parto e

em lactação com o dobro da dosagem de Se recomendada para esta categoria

animal, observaram uma diminuição na contagem de células somáticas do leite

concluindo que este mineral pode ser utilizado como ferramenta para

maximizar a resposta imune do animal.

A absorção de selênio em ruminantes se dá principalmente no duodeno.

A absorção em ruminantes é inferior a dos animais não-ruminantes, pois o

selênio pode ser reduzido a compostos insolúveis no rúmen (McDOWELL,

1992). O requerimento de Se para todas as categorias de bovino de leite é de

0,3 mg de Se/kg de MS (NRC, 2001). A concentração de Se no leite é

aumentada quando as vacas são alimentadas com uma suplementação do

mineral e este aumento pode ter efeito positivo na saúde dos bezerros e nos

humanos (NRC, 2005).

No organismo animal o selênio é incorporado a várias enzimas, das

quais a mais importante é a glutationa peroxidase (GPx). Omaye e Tappel

(1974) encontraram relação semilogarítmica entre a atividade desta enzima em

diversos tecidos de frangos e a quantidade de selênio da dieta. Desde então,

esta é a função mais importante do selênio nos vertebrados e, a atividade da

26

glutationa peroxidase é considerada um dos melhores indícios da quantidade

de selênio no organismo e de sua utilização. As ações bioquímicas do selênio e

da vitamina E são de complementação no mecanismo fisiológico do organismo.

A vitamina E aumenta a retenção de selênio e previne a auto-oxidação de

lipídeos no interior das membranas celulares, evitando a formação de

peróxidos, contudo, somente a glutationa peroxidase pode destruir os

peróxidos já formados.

A ação das enzimas glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase

(Gr) está relacionada com redução e oxidação da glutationa. A glutationa

peroxidase é uma enzima que contém quatro átomos de selênio (HOLBEN,

1999). Ela usa a glutationa reduzida (GSH), um tripeptídeo presente no citosol,

para doar elétrons para hidroperóxidos, produzindo água (Equação 1). A

glutationa oxidada (GSSG) é reciclada, voltando ao seu estado reduzido (GSH)

pela ação da glutationa redutase (Equação 2) (FETTMAN, 1991). A

regeneração de GSH a partir da GSSG é dependente da disponibilidade de

NADPH, oriundo da via das pentoses (MURRAY et al. 1998). Segundo Sen

(1997), a diminuição da emissão de NADPH poderia resultar no aumento de

GSSG e diminuição de GSH.

Experimentos têm demonstrado um efeito sinérgico entre o selênio e a

vitamina E no metabolismo dos lipídios. A explicação reside na relação da

forma oxidada e reduzida da glutationa (GSSG e GSH), e consequente

modificação da atividade da enzima HMG-CoA redutase (3-hidroxi-3metil-

glutaril-CoA), que é a principal responsável pelo controle da síntese de

colesterol. O selênio em conjunto com a vitamina E age no equilíbrio entre GSH

e GSSG por fazer parte da glutationa peroxidase (GPx), o que pode relacionar

a suplementação de selênio e vitamina E com o metabolismo de colesterol

(GOFF, 2006).

Muitas das funções fisiológicas do selênio são diretamente atribuíveis à

sua presença nas selenoproteínas. Por exemplo, a síntese de DNA depende da

27

presença de selênio no sítio catalítico da enzima tioredoxina redutase (TrxR)

(PAPP et al., 2007). Essa enzima é da mesma família da glutationa redutase

(GR) e são importantes na redução das EROs e na proteção celular

(CAPACHO, 2012).

A vitamina E atua como antioxidante lipossolúvel, mantendo a

integridade da membrana dos glóbulos de gordura, sendo esta, o maior sítio de

degradação lipídica. Por outro lado, o selênio tem grande atuação como

antioxidante hidrossolúvel. Desta forma, a vitamina E e o selênio estão

envolvidos na proteção celular contra o ataque de espécies reativas de

oxigênio. A complementaridade de funções entre o selênio e a vitamina E

sugere que a suplementação com um dos elementos pode reduzir, mas não

eliminar, o requerimento do outro (SURAI, 2006).

2.2.2 Vitamina E

A vitamina E é um dos antioxidantes lipossolúveis mais abundantes

encontrados no plasma de células dos mamíferos superiores (RIGOTTI, 2007).

Esta vitamina tem sido reconhecida como um nutriente essencial para o

crescimento e saúde de todas as espécies animais (LIU et al, 1995).

As diversas formas da vitamina E encontradas na natureza derivam do

tocoferol e do tocotrienol. Existem quatro tipos de variações (α, β, γ e δ) tanto

para os tocoferóis quanto para os tocotrienóis que se diferenciam apenas pela

localização do grupo metila no anel aromático (McDowell, 1996).

O α-tocoferol é a forma biológica mais ativa da vitamina E e a mais

encontrada nos alimentos. Na forragem fresca, por exemplo, os níveis de

vitamina E variam de 80 a 200 UI/kg de MS e diminuem quando a planta é

cortada. Na silagem, as concentrações da vitamina decrescem conforme o

tempo de armazenamento. A silagem contém cerca de 20 a 80% menos alfa-

tocoferol do que a forragem fresca (NRC, 2001).

A vitamina E é absorvida pelo intestino e estocada principalmente no

fígado e tecido adiposo sendo encontrada em quantidades variáveis também

em outros tecidos. Os níveis recomendados pelo NRC (2001) para bovinos em

28

lactação ou reprodutores é de 0,8 UI/ kg de PV (aproximadamente 20 UI/kg de

MS).

Entre suas funções, a vitamina E atua como antioxidante em sistemas

biológicos, é componente estrutural das células musculares, participa da

biossíntese de prostaglandina e melhora a resposta imune (ZEOULA e

GERON, 2006).

De acordo com Hatfield et al. (1999), a vitamina E pode prevenir a

degradação peroxidativa de gordura das células animais e a formação de

radicais livres. Lynch et al. (1999), verificaram que bovinos recebendo dietas

suplementadas com vitamina E, aumentaram os níveis de α-tocoferol na carne

e no leite.

O α-tocoferol neutraliza os radicais livres antes que a oxidação se

propague entre ácidos graxos altamente insaturados em membranas celulares

e subcelulares. O anel cromanol do α-tocoferol é colocado entre os grupos dos

fosfolipídeos e a cadeia lateral fitol interage com as cadeias de ácidos graxos

insaturados dos fosfolipídeos através de interações de Van der Walls no interior

da membrana (BUCKLEY et al., 1995).

A deficiência de vitamina E pode influenciar no aparecimento de distrofia

muscular em animais jovens, também conhecida por “doença do músculo

branco”. Os animais apresentam fraqueza, dificuldade de caminhar e de engolir

alimentos já que os músculos da língua também são afetados (McDowell,

1996).

De acordo com Hogan et al (1992), a diminuição das concentrações de

vitamina E no soro sanguíneo pode estar relacionada com a diminuição da

fagocitose dos neutrófilos e consequentemente na redução da função imune no

período do periparto. Fato este que está intimamente ligado ao desempenho

produtivo e reprodutivo do animal (MALLARD et al., 1998).

A suplementação da vitamina E associada ao selênio protegem os

leucócitos e macrófagos durante a fagocitose (BADWEY e KARNOVSKY.,

1980), aumentam a resistência imunológica dos animais contra infecções virais

(BECK et al., 1994), e influenciam na incidência e, ou, duração da mastite

clínica (SMITH et al., 1984).

29

2.3 Óleo de Girassol

As gorduras e óleos são nutrientes essenciais na alimentação de

vacas por serem a fonte mais concentrada de energia e pelo produto de sua

fermentação (acetato) ser a fonte primária para síntese dos ácidos graxos do

leite (EATON et al., 1998).

O alto requerimento energético em vacas de alta produção e em início

de lactação pode levar os animais a um quadro de estresse oxidativo pois, o

requerimento energético é alto nesse período enquanto que o consumo de

alimentos geralmente não é suficiente para suprir essa demanda. Há, portanto,

a ocorrência de balanço energético negativo devido a grande lipólise das

reservas de gordura (CASTILHO et al., 2006). Para minimizar esse problema, é

comum adição de gorduras e óleos na dieta de vacas leiteiras, principalmente

os ricos em ácidos graxos poli-insaturados (como o ômega-3 e ômega-6) pois

esses, além de serem boas fontes de energia também são incorporados no

leite usado na alimentação humana.

O óleo de girassol é obtido a partir das sementes do girassol (Helianthus

annuus L.) e possui altos teores de ácidos graxos poli-insaturados (importantes

na redução dos níveis de colesterol do sangue) e de vitamina E (45 mg/100g)

(PIIRONEN et al., 2000). Apresenta cerca de 10 % de gorduras saturadas, 24%

de gorduras monoinsaturadas e podendo chegar até 66% de gorduras poli-

insaturadas, sendo este, em sua maior parte, em forma de ácido linoleico

(ácido graxo essencial para o desempenho de algumas funções fisiológicas do

organismo) (FREITAS et al., 1998).

O fornecimento de dietas altamente concentradas, entretanto, deve ser limitada

e respeitando sempre o teor de fibra de uma dieta pois, o excesso de gordura

na dieta pode prejudicar alguns microrganismos do rúmen responsáveis pela

fermentação ruminal. A redução do consumo de matéria seca, da digestão da

fibra e do teor de gordura do leite são sinais de que a fermentação ruminal está

prejudicada (JENKINS, 1993). Além disso, dietas altamente energéticas

também são facilmente oxidadas tornando os tecidos animais suscetíveis à

peroxidação lipídica (SHIOTA et al., 1999).

31

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Animais, tratamentos e delineamento experimental

O experimento foi realizado na APTA Regional – Pólo Centro Leste

localizada na cidade de Ribeirão Preto, SP nos meses de setembro a

dezembro com duração total de 94 dias. As médias de temperatura máxima e

mínima registradas no período foram de 31,6ºC e 18,0ºC respectivamente

(média de pluviosidade: 3,50 mm). Os 14 dias iniciais foram de adaptação dos

animais às instalações, à alimentação e às pessoas que auxiliaram no manejo

experimental.

O delineamento experimental foi em blocos inteiramente casualizados,

distribuídas em início (até 100 dias), meio (100 – 180 dias) e fim (> 180 dias)

de lactação, com medidas repetidas no tempo. O experimento foi conduzido

com 28 vacas leiteiras da raça Jersey, peso vivo médio de 365,50 ± 42,05 kg e

produção média de leite de 11,02 ± 2,17 kg, alocadas aleatoriamente em baias

individuais de 5,2 m x 2,6 m (6,76 m2 de sombra) nos seguintes tratamentos:

32

- Dieta controle (C);

- Dieta controle + vitamina E + selênio orgânico (CA);

- Dieta com óleo de girassol (O);

- Dieta com óleo de girassol + vitamina E + selênio orgânico (OA).

3.2 Manejo experimental e coleta de dados

A produção de leite foi monitorada diariamente sendo a ordenha

realizada duas vezes ao dia (6:00 e 15:00 horas) em sala do tipo espinha de

peixe. As medidas gerais de higiene consistiram em pré e pós “dipping” com

anti-séptico e secagem com papel toalha. A detecção da mastite clínica foi

realizada diariamente através do teste da caneca de fundo preto, antes de cada

ordenha dos animais. Os animais eram ordenhados por lote de tratamento.

A produção média de leite dos animais durante o período experimental

foi de 9,89; 9,69; 9,64 e 9,67 kg/dia para os animais dos tratamentos C, CA, O

e OA respectivamente (EPM = 0,75).

As vacas foram alimentadas com dieta total contendo 50% de volumoso

(42% de silagem de milho e 8% de feno de coast-cross) e 50% de concentrado,

com base na matéria seca. As dietas foram formuladas para atender as

exigências nutricionais recomendadas pelo NRC (Jersey em lactação, PV: 400

kg, PL: 15 kg/dia, CMS: 14,19 kg/dia ou 3,55% do PV), (2005). A fonte de

selênio utilizada foi o selênio orgânico (levedura) e a fonte de vitamina E

utilizada foi o acetato de alfa tocoferol. Os ingredientes utilizados para

composição das dietas experimentais encontram-se na Tabela 1.

33

Tabela 1. Ingredientes e composição das dietas experimentais, sendo os valores expressos em

porcentagem da matéria-seca.

Tratamentos2

Ingredientes

C

CA

O

OA

Silagem de milho 42,00 42,00 42,00 42,00 Feno de coast-cross 8,00 8,00 8,00 8,00 Fubá de milho 20,00 20,00 16,00 16,00 Farelo de soja 18,00 18,00 18,00 18,00 Farelo de trigo 4,00 4,00 4,00 4,00 Ureia 0,90 0,90 0,90 0,90 Sal Comum 0,50 0,49 0,50 0,49 Premix Mineral1 1,00 1,00 1,00 1,00 Sulfato de Amônia 0,04 0,04 0,04 0,04 Bicarbonato de sódio 0,53 0,53 0,53 0,53 Óleo de Girassol - - 4,00 4,00 Selênio (mg/kg) - 3,50 - 3,50 Vitamina E (UI/dia) - 2000 - 2000 1

Composição por kg do produto: Enxofre (S) 80g, Magnésio (Mg) 20g, Potássio (K), 20g, Manganês (Mn) 1000mg, Zinco (Zn) 2500 mg, Cobre (Cu) 1500mg, Cobalto (Co) 100mg, Iodo (I) 80 mg, Selênio (Se) 20 mg, Cálcio (Ca) 180g, Fósforo (P) 90 g, Flúor (F) máx. 300mg. 2

Tratamentos: C (Controle), C + A (Controle + selênio + vitamina E), O (Óleo de Girassol), O + A (Óleo de girassol + selênio + vitamina E).

A composição das dietas totais fornecida aos animais durante o período

experimental pode ser vista na Tabela 2.

34

Tabela 2. Composição das dietas experimentais, sendo os valores expressos em porcentagem

da matéria-seca.

Composição

Dieta Total1

Dieta C Dieta CA Dieta O Dieta OA

MS 62,39 62,58 62,65 62,69

PB 20,30 18,71 18,37 20,32

EE 2,51 2,51 4,27 4,14

MM 7,00 8,03 7,94 7,84

FDN 34,87 34,96 34,65 34,74

FDA 20,36 20,40 20,79 20,68

NFDN 9,7 10,25 9,67 9,58

NFDA 7,53 7,81 8,23 7,58

Celulose 17,05 16,87 17,29 17,19

Lignina 2,85 2,94 2,90 2,92

Energia (cal/g) 4033,38 3997,37 4082,07 4094,70

Hemicelulose 14,50 14,57 13,87 14,07

Ca (g/kg) 12,33 9,17 9,50 9,24

P (g/kg) 4,23 5,70 4,72 5,56

Mg (g/kg) 2,58 2,68 2,77 2,56

S (g/kg) 2,54 3,33 3,00 3,16

K (g/kg) 9,11 9,07 8,85 8,92

Se (mg/kg) 0,18 2,98 0,23 3,16

Fe (mg/kg) 680,32 821,13 743,15 813,30

Cu (mg/kg) 36,61 78,86 72,75 89,54

Zn (mg/kg) 120,66 193,67 176,56 186,61

Mn (mg/kg) 85,70 112,88 114,59 112,88 1Dieta Total (Concentrado + Silagem + Feno): Dieta C (Controle), Dieta C + A (Controle +

selênio + vitamina E), Dieta O (Óleo de Girassol), Dieta O + A (Óleo de girassol + selênio + vitamina E).

Para o início da adaptação de 14 dias, foi realizada a pesagem e a

vermifugação dos animais. Neste período as vacas foram alimentadas com a

dieta total sendo utilizado apenas o concentrado do tratamento controle. No

final da adaptação e primeiro dia dos tratamentos, foram coletadas amostras de

sangue e leite (Tempo 0). Durante toda a fase experimental foram fornecidos

água e alimento à vontade. De acordo com o consumo do período de

adaptação, a quantidade de alimento foi ajustada de modo a minimizar as

sobras de ração e, assim, a seleção da porção ingerida pelos animais. O

consumo foi monitorado diariamente através de pesagens dos alimentos antes

35

do fornecimento e das sobras no dia seguinte, estabelecendo um mínimo de

5% e máximo de 10% de sobras. O cálculo da matéria seca da silagem, feno e

concentrado foi feito semanalmente para ajuste de fornecimento de alimento.

Para as análises bromatológicas, amostras de feno, silagem e de cada um dos

concentrados foram coletadas semanalmente em sacos plásticos e

posteriormente congeladas. Foram feitas amostras compostas mensais de

cada um desses componentes.

O consumo médio de matéria seca dos animais durante o período

experimental foi de 11,06; 9,84; 10,51 e 9,74 kg/dia para os animais dos

tratamentos C, CA, O e OA respectivamente (EPM = 0,67).

Amostras de leite foram coletadas semanalmente para análise de

contagem de células somáticas (CCS) e enviadas ao Laboratório Clínica do

Leite da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ/USP).

Para as amostras de leite do exame bacteriológico e de sangue para os

parâmetros imunológicos foram realizadas 4 coletas em cada animal antes do

início da suplementação (tempo 0), aos 28 dias de suplementação (tempo 1),

aos 54 dias de suplementação (tempo 2) e aos 80 dias de suplementação

(tempo 3) de acordo com as amostragens representadas na Figura 1.

Para o exame bacteriológico, uma amostra por teto de cada um dos

animais foram coletadas de forma asséptica e em frascos estéreis, de acordo

com o National Mastitis Council (HARMON et al., 1990), e posteriormente

congeladas para envio ao laboratório.

Para os parâmetros imunológicos, foram coletadas amostras de sangue

através da veia mamária de todas as vacas em tubos vacutainer.

Figura 1. Esquema de coleta de sangue e leite, onde “L” indica coleta de leite e “S” indica coleta de sangue.

As amostras de sangue foram avaliadas para hemograma, quantificação

de glutationa peroxidase (GSH-Px), quantificação de glutationa reduzida

36

(GSH), quantificação da atividade antioxidante total (AAT), quantificação do

malondialdeído (MDA), avaliação da capacidade fagocítica de leucócitos

polimorfonucleares, avaliação da capacidade de liberação de espécies reativas

de oxigênio intracelular de leucócitos polimorfonucleares e avaliação da

atividade funcional de leucócitos polimorfonucleares.

Para as análises de selênio e vitamina E no sangue, foram realizadas 3

coletas em cada animal antes da suplementação (tempo 0), aos 40 dias de

suplementação (tempo 1) e aos 80 dias de suplementação (tempo 2).

Todas as coletas de sangue e leite eram realizadas no período da

manhã logo após a ordenha.

Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação

Animal do Instituto Biológico e possui número do protocolo CETEA-IB 113/11.

3.3 Análises bromatológicas

As análises dos alimentos foram realizadas no Laboratório de Análises

Bromatologicas e Minerais do Instituto de Zootecnia (IZ-APTA). Logo após a

colheita, as amostras dos alimentos foram pesadas e secas em estufa com

circulação forçada de ar a 65˚C, durante 72 horas para determinação de

matéria pré-seca. Em seguida, as amostras foram moídas em moinho com

peneira de orifício 2 mm, retirando-se uma sub-amostra para análises de

matéria seca (MS), proteína bruta (PB), extrato etéreo (EE), matéria mineral

(MM), energia bruta (EB), cálcio (Ca) e fósforo (P), de acordo com AOAC

(1990). Também foram realizadas as análises de fibra em detergente neutro

(FDN) e fibra em detergente ácido (FDA), conforme Van Soest et al., (1991). O

N-FDN e N-FDA foi analisado de acordo com Sniffen et al., (1992). As análises

para selênio foram realizadas de acordo com Olson et al., (1975) através de

leitura fluorimétrica.

37

3.4 Análises no leite

Amostras de leite foram coletadas semanalmente para análise de

contagem de células somáticas (CCS). As amostras eram coletadas após a

ordenha completa do período da manhã em frascos plásticos de 50 ml

contendo uma pastilha conservante Bronopol® e enviadas ao Laboratório

Clínica do Leite da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz

(ESALQ/USP).

O exame bacteriológico do leite foi realizado no Laboratório de

Imunologia Clínica da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP.

A análise bacteriolόgica foi realizada pela cultura do leite em placas de Petri

contendo meio de ágar sangue de carneiro 5 % desfibrinado a 37 °C por 48-72

horas, seguido pelo teste de Gram, características de colônia e testes

bioquímicos (LENNETTE et al., 1985).

Foram atribuídos escores para cada um dos agentes encontrados nas

amostras analisadas, sendo amostra negativa (0) e amostra positiva (1) para

Staphylococcus sp, Streptococcus sp e Corynebacterium sp.

3.5 Análises no sangue

3.5.1 Análises hematológicas

Foram colhidas, de cada animal, amostras de sangue em tubos

vacutainer com EDTA. O número total de leucócitos e de eritrócitos foram

mensurados pela contagem automática (ABC Vet® - ABXTM) e a contagem

diferencial foi realizada por esfregaços sanguíneos para a diferenciação do

padrão leucocitário ao microscópio com aumento de 400 X.

A normalidade do hemograma foi feita segundo critérios estabelecidos

para a espécie (Quadros 1 e 2).

Quadro 1. Valores do hemograma de bovinos sadios, utilizados como referência no presente

estudo (KRAMER et al., 2000; DIVERS; PEEK, 2008).

38

Hemácias

(106/mL)

Plaquetas

(103/mL)

Hemoglobina

(g/dl)

Valores 5,0-7,2 210-710 8,3-11,9

Quadro 2. Valores do leucograma de bovinos sadios, em número absoluto e contagem

diferencial relativa, utilizados como referência no presente estudo (KRAMER et al., 2000;

DIVERS; PEEK, 2008).

Unidade Leucócitos totais

Neutrófilos Linfócitos Eosinófilos Monócitos Basófilos

103/μL 5,6 – 12,7 1,1 – 5,7 2,3 – 9,3 0,0 – 2,0 0,0 – 6,0 0 – 0,2

% - 15 - 47 45 - 75 0 - 20 2 - 7 0 - 2

A determinação da concentração de hemoglobina (Hb) do concentrado

de hemácias deu-se por espectrofotometria utilizando kit comercial (Labtest,

Santa Luzia, Brasil, ref 43), utilizando o reagente de Drabkin’s. Para tal 20 µL

do sobrenadante do concentrado de hemácias diluído na proporção 1:1 foram

adicionados a 5 mL de reagente de Drabkin’s, e realizada a leitura em

espectrofotômetro a 540 nm.

3.5.2 Determinação da Glutationa Peroxidase


vacutainer com heparina. A determinação da atividade da glutationa peroxidase

(GSH-Px) eritrocitária foi realizada por kit comercial (RANSEL® Laboratories,

Randox, Crumlin, UK, cat n° RS505, SC692), como descrito por Paglia e

Valentine (1967).

Para a determinação desta enzima, o concentrado de hemácias foi

previamente armazenado a -80 °C, sendo analisada em período máximo de 21

dias. O resultado da concentração de GSH-Px foi expresso em unidades de

enzima por grama de hemoglobina.

39

3.5.3 Atividade da Glutationa reduzida

A atividade da glutationa reduzida (GSH) foi determinada por método

colorimétrico, descrito por BEUTLER et.al. (1963). Para tal 200 μL de sangue

periférico ou soluções padrão, nas concentrações de 20, 50 e 100 mg/dL para

determinação da curva de concentração, foram adicionadas a 1,8 mL de água

deionizada. Em seguida, foram acrescentados 3,0 mL de solução precipitante

(1,67 g de ácido metafosfórico glacial, 0,20 g de EDTA, 30,0 g de NaCl, em 100

mL de água deionizada). Após 5 minutos, foram centrifugadas as amostras por

05 minutos a 1800g.

Posteriormente, 200 μL do sobrenadante foram adicionados a 0,8 mL de

solução fosfato (42,6 g de NaHPO, em 1.000 mL de água deionizada).

Finalmente, foi acrescentado 100 μL de ácido ditionitrobenzóico (1,0 g de

citrato de sódio, 40,0 mg de ácido ionitrobenzóico, em 100 mL de água

deionizada). As leituras foram feitas em espectrofotômetro digital, marca

Micronal® - modelo B34211, em comprimento de onda de 412 nm.

3.5.4 Atividade antioxidante total

.A atividade antioxidante total plasmática (AST) foi realizada por kit

comercial (RANSEL® Laboratories, Randox, Crumlin, UK) de acordo com o

protocolo descrito pelo fabricante.

3.5.5 Índice de peroxidação lipídica avaliado pelo teor de malondialdeído

A determinação da concentração de malondialdeído no plasma foi

quantificada pelo ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

(TBARS) conforme previamente descrito por Esterbauer e Cheeseman (1990).

O referido método se baseia na reação do malondialdeído com o ácido

tiobarbitúrico, em meio aquecido, quando este é submetido ao posterior

resfriamento e mensurado em absorbância com comprimento de onda de 532

nm.

40

Primeiramente, pipetou-se 500 μL de soro sanguíneo ou soluções

padrão, nas concentrações de 1, 4 e 6 μM para determinação da curva de

concentração. Posteriormente, adicionou-se 1 mL de ácido tricloroacético a 10

%. Estas amostras foram então submetidas à centrifugação por 15 minutos a

1800g.

Após a centrifugação, 750 μL de ácido tiobarbitúrico a 1 % dissolvido em

solução de hidróxido de sódio a 0,05 M foram adicionadas a 750 μL das

amostras, que foram então incubadas por 10 minutos em água fervente (100

°C), e imediatamente após resfriados em banho de gelo. A leitura das amostras

foi realizada por espectrofotometria em comprimento de onda de 532 nm.

3.5.6 Avaliação da função fagocítica e da produção intracelular de

espécies reativas de oxigênio


vacutainer com heparina. Os ensaios para a avaliação da fagocitose de

Staphylococcus aureus e Escherichia coli conjugadas a Alexa Fluor 594 e

produção intracelular de peróxido de espécies reativas de oxigênio (ERO) da

população de células polimorfonucleares foi realizado conforme proposto por

HASUI et al. (1989) com algumas modificações, que utilizaram amostras de

sangue humano e por Smits, Burvenich e Heyneman (1997) e Kampen et al.

(2004) que avaliaram amostras de sangue bovino.

Para a identificação das células polimorfonucleares (CH138+) do sangue

foi utilizado o anticorpo monoclonal mouse IgM anti-bovine CH138A e o

anticorpo monoclonal secundário goat anti-mouse IgM conjugado ao

fluorocromo Aloficocianina (APC), expostos no Quadro 3.

41

Calibração

Ensaio "A" Só células do sangue (branco)

Ensaio "B" Células + DCFH-FITC

Ensaio "C" Células + E. coli

Ensaio "D" Células + S. aureus

Ensaio "E" Células + CH138

Experimento

Ensaio "F" Só células do sangue (branco)

Ensaio "G" Células + DCFH-FITC + CH138-IgM

Ensaio "H" Células + E. coli + CH138-IgM

Ensaio "I" Células + S. aureus + CH138-IgM

Ensaio "J" Células + DCFH-FITC + E. coli + CH138-IgM

Ensaio "K" Células + DCFH-FITC + S. aureus + CH138-IgM Quadro 3. Protocolo dos tubos de calibração e tubos de experimento, segundo conteúdo (células sanguíneas, anticorpos monoclonais primários e secundários) para realização da quantificação da liberação de peróxido de hidrogênio e de fagocitose das amostras de sangue no Citômetro de fluxo.

Inicialmente foi adicionado um µL do respectivo anticorpo primário e

seguido de incubação por 30 minutos em temperatura ambiente. Após este

período, foram adicionados 1.000 µL de PBS e novamente centrifugados. Em

seguida foram ressuspendidos em 100 µL de PBS e adicionou-se dois µL do

respectivo anticorpo secundário. Após 30 minutos de incubação em

temperatura ambiente, sob a ausência da luminosidade, foram adicionados

1.000 µL de PBS em cada tubo e centrifugados a 1.200 rpm por 8 minutos. Ao

final, foram ressuspendidos em 300 µL de PBS e as amostras foram adquiridas

pelo Citômetro de fluxo.

Para cada amostra de sangue, vinte mil eventos foram adquiridos e

analisados pelo programa CELLQUEST® (Becton Dickinson Immunocytometry

SystemsTM).

3.5.7 Análise de selênio

As análises para selênio foram realizadas no Laboratório de Minerais da

Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da USP de acordo com

Olson et al., (1975) através de leitura fluorimétrica das amostras. O nível sérico

de selênio dos animais no período precedente a suplementação (dia 0) foi de

0,072 ppm.

42

3.6 Análise estatística

O experimento consistiu de um arranjo fatorial de tratamentos 2x2

(tratamentos: controle; controle + antioxidantes; óleo de girassol e óleo de

girassol + antioxidantes) distribuídos em um delineamento experimental de

blocos casualizados (início, meio e final de lactação). Amostras de sangue

foram coletadas no início, aos 28, 54 e 80 dias. Todas as variáveis-resposta

foram testadas para a normalidade de seus resíduos por meio do PROC

UNIVARIATE do SAS. As variáveis cuja distribuição dos resíduos foram

consideradas normais (selênio sérico e GSH-Px) foram submetidas à análise

de variância em um delineamento de medidas repetidas no tempo pelo PROC

MIXED (Littel et al., 2006) utilizando-se o método de Kenward-Roger para

cálculo do denominador dos graus de liberdade dos efeitos fixos, e estrutura de

covariância autoregressiva de primeira ordem, de acordo com os critérios de

informação de Akaike e bayesianos. No modelo experimental foram incluídos

os valores iniciais de cada variável como co-variáveis, assim como os efeitos

dos blocos, dos tratamentos e dos tempos e suas interações. Efeitos

específicos dos tratamentos foram testados através de contrastes ortogonais

pré-planejados com um grau de liberdade, assim como os desdobramentos dos

efeitos quando da existência de interações significativas entre os tratamentos e

os tempos. As variáveis-resposta (GSH, AAT, MDA, hemograma, CCS,

avaliação funcional de células polimorfonucleares e avaliação de liberação de

peróxido de hidrogênio de células polimorfonucleares) cujos resíduos não

apresentaram distribuição normal foram ranqueadas pelo PROC RANK, e os

escores assim obtidos, testados por meio de análise de variância pelo PROC

GLM (Littel, Stroup e Freund, 2002), com análises separadas para cada um dos

períodos experimentais. Efeitos dos tratamentos e suas interações foram

testados com um grau de liberdade por meio de contrastes ortogonais. Para

todos os testes foram adotados os níveis de significância: significativo (quando

P ≤ 0,05) e tendência (quando 0,05 < P ≥ 0,10).

43

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Selênio no sangue

Os níveis séricos do selênio aos 40 e aos 80 dias após a suplementação

estão apresentados na Figura 2. Houve aumento significativo (P = 0,001) do

selênio no sangue das vacas suplementas com antioxidantes durante o período

experimental. Pode-se observar que no do experimento os níveis séricos de

selênio nos diferentes tratamentos foram semelhantes (0,072 ppm), estes

mostram que as vacas não se encontravam com deficiência do mineral, uma

vez que os animais devem apresentar um valor mínimo de 0,060 ppm

(ZANETTI, 1998).

Os resultados obtidos neste experimento são superiores aos

encontrados por Zanetti (1998) e Paschoal (2003) que utilizou suplementação

de 5 mg Se/dia, comprovando que a concentração do selênio no plasma

sanguíneo está relacionada com a concentração do selênio na dieta de vacas

em lactação (WEISS et al., 1990).

44

A suplementação com o mineral é importante uma vez que sua

concentração é deficiente na maior parte dos grãos e pastagens (e

consequentemente nos alimentos conservados) do estado de São Paulo.

Entretanto, deve-se evitar níveis elevados do consumo deste mineral uma vez

que seu nível de toxicidade é próximo da exigência (1,9 – 8,3 mg/Se PV).

Porém, os níveis de selênio acima do recomendado, no presente estudo, não

apresentaram qualquer risco de toxicidade aos animais pois se encontravam

dentro dos limites.

Figura 2: Média dos níveis de selênio no sangue das vacas dos tratamentos C (controle), CA

(controle + antioxidantes), O (óleo de girassol) e OA (óleo de girassol + antioxidantes) durante

o período experimental.

*Efeito significativo (P = 0,001) para antioxidantes

4.2 Avaliação do estresse oxidativo

O estresse oxidativo é um distúrbio no equilíbrio do sistema oxidante e

pró-oxidante das células, ou seja, quando ocorre maior quantidade de eventos

oxidativos, o sistema tende para o lado pró-oxidativo (afetando o nível de

antioxidantes do organismo e, em casos severos, na morte celular). Sua

avaliação se deu pela quantificação da enzima glutationa peroxidase,

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0 40 80

Se

no

sa

ng

ue (

pp

m)

Dias

C C+A O O+A

45

quantificação da glutationa reduzida, atividade antioxidante total do sangue e

teor de produção do malondialdeído.

4.2.1 Quantificação da glutationa peroxidase (GSH-Px)

Houve efeito significativo da adição de antioxidantes (P = 0,0021)

(Figura 3) e do tempo (P = 0,0001) no aumento dos níveis de glutationa

peroxidase (GSH-Px) séricos durante o período experimental. As médias da

enzima GSH-Px no sangue das vacas, no tempo, foram de 87,88; 79,35; 68,70

U/g Hb (EP = 2,90). Foi possível observar que houve uma relação positiva

entre a atividade da GSH-Px e a ingestão constante, acima das

recomendações, de selênio na dieta. Esses resultados indicam que a atividade

da GSH-Px eritrocitária é considerada um dos melhores indícios da quantidade

de selênio no organismo e de sua utilização (OMAYE e TAPPEL.,1974).

Figura 3: Média dos níveis de selênio no sangue das vacas dos tratamentos C (controle), CA

(controle + antioxidantes), O (óleo de girassol) e OA (óleo de girassol + antioxidantes) durante

o período experimental.

*Efeito significativo (P = 0,0021) para antioxidantes

Os resultados obtidos no presente estudo foram inferiores aos

encontrados por Ceballos (2003), que ao fornecer sal mineral com selênio na

dieta de vacas Holandesas em lactação encontrou valores eritrocitários de

GSH-Px superiores a 181,00 U/g Hb. Resultados semelhantes foram

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

C CA O OA

GS

H-P

x (U

/g H

b)

Tratamentos

46

encontrados pelo mesmo autor em trabalho recente (Ceballos et al, 2010) onde

vacas no pré-parto receberam dose única de injeção de selenato de bário

(fonte inorgânica) e atingiram níveis de GSH-Px de até 235,00 U/g Hb. O

mesmo autor considera como atividade marginal níveis da atividade enzimática

inferiores a 100 U/g Hb.

De acordo com Scholz e Hutchinson (1979), a atividade da GSH-Px

depende de disponibilidade de selênio durante o período de desenvolvimento

de toda a população de eritrócitos, ou seja, enquanto as concentrações de

selênio no sangue dos animais pode aumentar ou diminuir de acordo com a

dose de ingestão diária, a atividade da GSH-Px só se altera conforme a

produção e maturação dos eritrócitos (podendo atingir um período de latência

de até 35 dias em bovinos).

4.2.2 Quantificação da glutationa reduzida (GSH)

Não houve efeito individual dos tratamentos (P > 0,05) nos níveis de

GSH do sangue dos animais, porém, houve uma tendência de interação (AxO)

(P = 0,073) aos 54 dias de suplementação (tabela 3), onde nota-se que os

antioxidantes aumentaram os níveis de GSH no sangue das vacas apenas

quando não houve a adição do óleo, nos tratamentos com óleo os valores

foram semelhantes.

A glutationa é o principal composto participante do sistema antioxidante

não enzimático das células. Baixas concentrações de GSH têm sido

relacionadas a doenças ou infecções oportunísticas e maior risco de estresse

oxidativo. A disponibilidade do NADPH pode levar ao aumento da glutationa

oxidada (GSSG) o que torna as células mais susceptíveis ao dano oxidativo

(SHAN et al., 1990). Em situações de estresse oxidativo intenso, o GSH pode

ser perdido de modo irreversível, permanecendo na forma oxidada (UHLIG e

WENDELA, 1992).

Além de proteger contra a peroxidação lipídica e na detoxificação de

aldeídos reativos (como o malondialdeído) a GSH também participa da

regeneração da vitamina E oxidada (JONES et al., 1995).

47

Foi possível observar, no presente estudo, que a adição de antioxidantes

na dieta das vacas influenciou na proteção celular e na manutenção dos níveis

celulares da GSH, porém, a adição do óleo possivelmente aumentou a

peroxidação lipídica das células e o uso da GSH (diminuindo os níveis

celulares desse antioxidante no sangue das vacas tratadas com o óleo).

4.2.3 Atividade antioxidante total plasmática (AAT)

A AAT avalia o conteúdo e o estado antioxidante de um organismo

(estado redox). Não houve diferença significativa (P > 0,05) nos níveis de AAT

do sangue das vacas nos tratamentos, porém, foi possível observar tendência

à interação (AxO) (P = 0,0503) entre os tratamentos aos 54 dias (tabela 3).

Esses resultados mostram que a utilização do antioxidante em conjunto com o

óleo de girassol foi capaz de diminuir os níveis de AAT no sangue das vacas

neste período.

Alguns autores defendem o estudo da AAT ao invés de análises de

antioxidantes específicos, principalmente devido à interação que ocorre entre

eles no sangue (GHISELLI et al., 2000). Espera-se que o conteúdo antioxidante

de um organismo esteja sempre em níveis suficientes para evitar produção de

EROs e dano celular no organismo. Porém, uma diminuição da AAT não é,

necessariamente, indesejável pois pode ocorrer quando há uma diminuição da

produção desses compostos (PRIOR e CAO, 1999). Ou seja, diminuições nos

níveis de AAT podem indicar que o mecanismo de defesa foi eficiente em

cumprir sua função de eliminação de EROs (HALLIWELL E GUTTERIDGE,

2007).

.

4.2.4 Índice de peroxidação lipídica avaliado pelo teor de malondialdeído

(MDA)

Os teores de MDA no sangue das vacas não foi alterado (P > 0,05) entre

os tratamentos durante todo o período experimental. As medianas e os valores

de mínimo e máximo foram de 3,73 (0,00 – 8,49); 3,09 (0,00 – 6,22); 3,11 (0,00

– 9,22) e 3,42 (0,00 – 9,98) nmol/L para os tratamentos C, CA, O e OA

48

respectivamente. O MDA é produto final da peroxidação lipídica e é

considerado um candidato potencial como biomarcador geral de dano oxidativo

em plasma.

Apesar desses resultados indicarem que os antioxidantes não foram

capazes de prevenir ou inibir a formação deste composto, foi possível observar

que, mesmo com a adição de óleo na dieta (em níveis acima do recomendado),

não houve aumento do dano oxidativo nas células devido à peroxidação

lipídica.

O balanço redox de uma certa população pode sofrer influências

genéticas, ambientais e nutricionais sendo de extrema dificuldade a obtenção

de valores de referência absolutos para marcadores específicos em sistemas

vivos (Kadiiska et al., 2005).

49

Tabela 3: Mediana e valores de mínimo – máximo dos níveis de glutationa reduzida (GSH) e atividade antioxidante total plasmática (AAT) do sangue das

vacas durante o período experimental.

Tratamentos Probabilidade2

Variáveis Dias C CA O OA A O AxO

GSH (U/L Hb)

28 3,99 (3,69 - 4,53) 4,01 (3,57 - 4,22) 4,20 (3,72 - 4,88) 4,08 (3,57 - 4,85) ns ns ns

54 3,59 (2,69 - 4,45) 4,83 (3,59 - 6,16) 4,18 (3,65 - 5,35) 4,02 (2,75 - 4,83) ns ns 0,073

80 3,59 (2,63 - 5,32) 3,68 (3,19 - 4,58) 3,65 (2,47 - 4,24) 3,93 (2,91 - 5,82) ns ns ns

AAT (mmol/L)

28 1,14 (1,09 - 1,23) 1,12 (1,09 - 1,20) 1,11 (1,06 - 1,23) 1,13 (0,90 - 1,20) ns ns ns

54 1,13 (0,95 - 1,16) 1,18 (0,98 - 1,22) 1,15 (1,04 - 1,28) 1,11 (0,93 - 1,18) ns ns 0,0503

80 1,04 (0,78 - 1,32) 1,09 (0,98 - 1,17) 1,07 (0,87 - 1,31) 1,00 (0,91 - 1,05) ns ns ns 1Tratamentos: C (Controle), CA (Controle + selênio + vitamina E), O (Óleo de Girassol), OA (Óleo de girassol + selênio + vitamina E).

2Probabilidade (P): efeito dos antioxidantes (A), efeito do óleo de girassol (O) e interação entre os antioxidantes e o óleo de girassol (AxO).

Níveis de significância: significativo quando P ≤ 0,05 e tendência quando 0,05 < P ≥ 0,10.

U/L Hb = unidades por litro de hemoglobina

50

4.3 Hemograma

Os níveis de hemácias, plaquetas e hemoglobina no sangue das vacas

durante todo o período experimental podem ser visto na tabela 4. Os resultados

se encontram de acordo com os valores de referência para bovinos proposto

por Kramer et al (2000).

Tabela 4: Mediana e valores de mínimo – máximo dos parâmetros de hemograma das vacas

durante o período experimental.

Trat1 Hemácias Plaquetas Hemoglobina2

(106/mL) (103/mL) (g/dl)

C 6,64 (3,94 -9,06)

449,00 (43,00 - 968,00)

9,93

CA 6,65 (4,87 - 9,44)

512,00 (45,00 - 909,00)

10,06

O 6,41 (5,44 - 9,17)

553,50 (215,00 - 1244,00)

9,31

OA 6,65 (4,08 - 8,71)

471,50 (216,00 - 1042,00)

9,74

1Tratamentos: C (Controle), CA (Controle + selênio + vitamina E), O (Óleo de Girassol), OA

(Óleo de girassol + selênio + vitamina E). 2Dado paramétrico: representado pela média (EP=0,26).

Houve aumento significativo nos níveis de leucócitos no sangue das

vacas com a adição dos antioxidantes (P = 0,0131) e efeito de interação (AxO,

P = 0,0445) aos 28 dias de suplementação (tabela 5). Quando utilizou-se

adição de óleo na dieta houve uma diminuição dos níveis de leucócitos no

sangue das vacas em comparação aos demais tratamentos, porém quando

adicionado os antioxidantes à dieta com óleo, houve um aumento dos níveis de

leucócito em comparação ao tratamento com óleo de girassol.

Houve tendência de interação (AxO, P = 0,0845) entre os tratamentos

nos níveis de linfócitos no sangue das vacas onde foi possível observar que a

inclusão do óleo de girassol, sem adição dos antioxidantes na dieta, levou à

uma diminuição (P = 0,0845) dos linfócitos no sangue das vacas aos 54 dias

(tabela 5).

Houve aumento significativo (P = 0,0267) nos níveis de neutrófilos no

sangue das vacas suplementadas com os antioxidantes e uma tendência de

interação (AxO, P = 0,0903) entre os tratamentos (tabela 5). Esses dados

51

mostram que a utilização do óleo de girassol, sem o antioxidante, diminuiu os

níveis de neutrófilos no sangue das vacas aos 28 dias de experimento.

Aos 28 dias de suplementação houve interação significativa entre os

tratamentos (AxO, P = 0,0295) nos níveis de basófilos no sangue das vacas,

onde a inclusão do óleo em conjunto com os antioxidantes aumentaram a

concentração de basófilos no sangue dos animais (tabela 5). Aos 54 dias à

adição de óleo de girassol na dieta das vacas aumentou significativamente (P =

0,0154) as concentrações de basófilos no sangue das vacas.

Os níveis de monócitos no sangue das vacas aumentaram (P = 0,0235)

com a suplementação de antioxidantes na dieta aos 28 dias e tiveram uma

tendência a aumentar (P = 0,0611) com a adição de óleo de girassol aos 54

dias (tabela 5).

Os níveis de eosinófilos no sangue das vacas se diferenciaram devido a

uma interação entre os tratamentos aos 28 dias (AxO, P = 0,0269), onde a

adição de antioxidantes em conjunto com o óleo de girassol aumentou os

níveis de eosinófilos, e quando foi utilizado somente o óleo a concentração

destas células diminuíram (tabela 5).

Os valores leucocitários encontrados no sangue dos animais do

presente estudo estão dentro dos valores de referência para bovinos (KRAMER

et al., 2000; DIVERS; PEEK, 2008). Valores leucocitários acima ou abaixo

desses valores são indicativo de distúrbios fisiológicos, aparecimento de

doenças ou estresse.

A formação de compostos bactericidas como o peróxido de hidrogênio,

durante a eliminação de patógenos, pode ser prejudicial às próprias células de

defesa do sangue. O maior nível de células leucocitárias no sangue dos

animais suplementados, do presente estudo, indicam que o uso de

antioxidantes protegeu as células leucocitárias contra a formação de espécies

reativas de oxigênio durante a fagocitose e consequentemente contra a morte

celular. A maior quantidade de leucócitos ativos no sangue desses animais

pode ser indicativo de maior eficiência imunológica.

52

Tabela 5: Mediana e valores de mínimo – máximo do leucograma das vacas durante o período experimental.

Tratamentos Probabilidade

2

Variáveis Dias C CA O OA A O AxO

LEUC

(103)

28 9,30 (6,70 - 13,60) 9,30 (7,80 - 15,60) 7,40 (5,50 - 11,50) 10,10 (7,60 - 36,70) 0,0131 ns 0,0445

54 12,70 (6,80 - 13,90) 8,30 (6,00 - 10,80) 8,30 (5,30 - 34,30) 10,80 (7,50 - 21,90) ns ns ns

80 8,80 (6,10 - 11,30) 8,30 (4,00 - 9,40) 8,10 (5,10 - 30,20) 10,10 (7,40 - 15,90) ns ns ns

LINFOC

(103/μL)

28 6,44 (4,05 - 11,83) 6,16 (5,00 - 7,80) 5,92 (3,65 - 9,78) 7,58 (5,02 - 33,40) ns ns ns

54 8,64 (4,84 - 10,43) 6,24 (4,47 - 8,21) 4,53 (3,42 - 31,21) 7,99 (4,65 - 16,64) ns ns 0,0845

80 6,09 (4,27 - 8,94) 5,19 (2,92 - 6,72) 4,52 (3,26 - 25,67) 7,21 (3,03 - 10,49) ns ns ns

NEUTROF

(103/μL)

28 1,65 (0,74 - 3,35) 2,22 (1,05 - 3,67) 1,14 (0,55 - 1,78) 2,59 (1,14 - 4,53) 0,0267 ns 0,0903

54 2,34 (0,64 - 3,48) 1,34 (1,16 - 3,08) 2,19 (0,74 - 6,11) 1,74 (0,83 - 4,72) ns ns ns

80 1,71 (0,44 – 3,05) 1,14 (0,28 - 2,20) 0,92 (0,36 - 3,40) 2,12 (1,39 - 3,85) ns ns ns

BASOF

(103/μL)

28 0,00 (0,00 - 0,19) 0,00 (0,00 - 0,10) 0,00 (0,00 - 0,00) 0,08 (0,00 - 0,30) ns ns 0,0295

54 0,00 (0,00 - 0,13) 0,00 (0,00 - 0,00) 0,11 (0,00 - 0,34) 0,00 (0,00 - 0,32) ns 0,0154 ns

80 0,00 (0,00 - 0,08) 0,00 (0,00 - 0,09) 0,00 (0,00 - 0,24) 0,00 (0,00 - 0,00) ns ns ns

MONOC

(103/μL)

28 0,21 (0,14 - 0,54) 0,47 (0,00 - 0,57) 0,12 (0,00 - 0,26) 0,37 (0,10 - 0,75) 0,0235 ns ns

54 0,13 (0,00 - 0,64) 0,15 (0,00 - 0,39) 0,27 (0,13 - 0,75) 0,37 (0,00 - 0,49) ns 0,0611 ns

80 0,26 (0,12 - 0,68) 0,43 (0,08 - 0,59) 0,18 (0,00 - 0,79) 0,35 (0,07 - 0,52) ns ns ns

EOSIN

(103/μL)

28 0,41 (0,00 - 1,21) 0,00 (0,00 - 1,33) 0,20 (0,12 - 0,80) 0,71 (0,30 - 2,26) ns ns 0,0269

54 0,47 (0,09 - 1,28) 0,27 (0,00 - 1,41) 0,29 (0,13 - 1,03) 0,53 (0,09 - 1,53) ns ns ns




53

4.4 Avaliação funcional dos leucócitos polimorfonucleares do sangue

Após a quantificação das populações de leucócitos nas amostras de

sangue, a avaliação funcional procedeu-se por meio das análises da fagocitose

e da liberação de peróxido de hidrogênio intracelular.

4.4.1 Avaliação da população de células PMN CH138+ do sangue

Não houve efeito significativo (P > 0,05) entre os tratamentos para a

quantidade de células PMN CH138+ no sangue dos animais durante todo o

período experimental. As medianas e os valores de mínima e máxima (%)

foram de 75,95 (37,10 – 96,30); 77,80 (52,10 – 95,20); 77,70 (49,60 – 96,90) e

74,60 (34,50 – 93,60) para os tratamentos C, CA, O e OA respectivamente.

Também não houve efeito significativo (P > 0,05) entre os tratamentos

para a quantidade de células PMN CH138+ que produziram peróxido de

hidrogênio intracelular no sangue dos animais durante todo o período

experimental. As medianas e os valores de mínima e máxima (%) foram de

94,45 (78,30 – 98,70); 95,90 (64,60 – 98,80); 95,75 (78 – 98,50) e 96,45 (81,00

– 98,80) para os tratamentos C, CA, O e OA respectivamente.

Foi possível observar tendência de interação (AxO, P = 0,0564) entre os

tratamentos sobre a intensidade de produção de peróxido de hidrogênio pelas

células PMN CH138+ no sangue das vacas aos 54 dias (tabela 6). A inclusão

dos antioxidantes, sem a adição do óleo aumentaram a intensidade de

produção de peróxido no sangue dos animais fato este, que não ocorreu com

os animais que receberam antioxidantes em conjunto com o óleo. Aos 80 dias

houve efeito significativo (P = 0,0206) na intensidade de produção de peróxidos

com a adição dos antioxidantes na dieta das vacas.

Esses resultados indicam que, apesar da suplementação com óleo e

antioxidantes não alterarem a quantidade de células PMN CH138+, houve uma

melhoria bactericida dessas células no sangue dos animais que receberam

apenas antioxidantes.

54

4.4.2 Avaliação da fagocitose da E. coli pelas células PMN CH138+ do

sangue

Não houve efeito significativo (P > 0,05) entre os tratamentos para

quantidade de células PMN CH138+ que fagocitam a E. coli no sangue das

vacas. As medianas e os valores de mínima e máxima (%) foram de 32,20

(13,50 - 69,90); 38,60 (15,60 - 71,70); 35,80 (13,10 – 64,30) e 36,70 (3,06 –

54,80) para os tratamentos C, CA, O e OA respectivamente.


intensidade de fagocitose da E. coli pelas células PMN CH138+ no sangue das

vacas. As medianas e os valores de mínima e máxima relativos foram de

477,00 (116,00 – 787,00); 511,00 (146,00 – 1231,00); 520,00 (118,00 – 953,00)

e 490,00 (117,00 – 864,00) para os tratamentos C, CA, O e OA

respectivamente.


quantidade de células PMN CH138+ que produziram peróxido de hidrogênio

intracelular durante a fagocitose da E. coli no sangue das vacas. As medianas

e os valores de mínima e máxima (%) foram de 88,40 (60,60 – 97,30); 86,75

(54,40 – 97,20); 89,70 (47,90 – 98,20) e 90,65 (60,30 – 98,40) para os

tratamentos C, CA, O e OA respectivamente.

Foi possível observar tendência de interação (AxO, P = 0,0508) entre os

tratamentos para intensidade de produção de peróxido de hidrogênio

intracelular pelas células PMN CH138+ durante a fagocitose da E. coli no

sangue das vacas aos 28 dias (tabela 7). A inclusão do óleo, sem adição dos

antioxidantes aumentou a intensidade de produção de peróxidos no sangue

dos animais enquanto que, com a adição do antioxidante ao óleo essa

intensidade diminuiu.

Esses resultados indicam que, apesar da suplementação com óleo e

antioxidantes não alterarem a quantidade de células PMN CH138+ que

fagocitam E. coli, houve uma melhoria bactericida dessas células no sangue

dos animais que receberam apenas óleo (tabela 6).

55

Tabela 6: Mediana e valores de mínimo – máximo a intensidade de produção de peróxido de hidrogênio pelas células PMN CH138+ no sangue das vacas

durante o período experimental.


Variável Dias C C+A O O+A A O AxO

Intensidade de produção de peróxidos

28 320,00 (247,00 - 499,00) 426,00 (240,00 - 501,00) 413,00 (335,00 - 1070,00) 397,00 (347,00 - 1080,00) ns ns ns

54 415,00 (242,00 - 692,00) 813,00 (638,00 - 976,00) 563,00 (357,00 - 879,00) 419,00 (197,00 - 860,00) ns ns 0,0564

80 211,00 (157,00 - 472,00) 388,00 (266,00 - 994,00) 216,00 (163,00 - 528,00) 289,00 (191,00 - 747,00) 0,0206 ns ns 1Tratamentos: C (Controle), CA (Controle + selênio + vitamina E), O (Óleo de Girassol), OA (Óleo de girassol + selênio + vitamina E).



Tabela 7: Mediana e valores de mínimo – máximo a intensidade de produção de peróxido de hidrogênio pelas células PMN CH138+ durante a fagocitose da

E. coli no sangue das vacas durante o período experimental.


Variável Dias C C+A O OA A O AxO

Intensidade da produção de peróxido

28 652,00 (416,00 - 848,00) 1029,00 (347,00 - 1297,00) 1168,00 (477,00 - 1960,00) 809,00 (319,00 - 2013,00) ns ns 0,0508

54 1590,00 (1231,00 - 1858,00) 1601,00 (1161,00 - 2884,00) 1746,00 (840,00 - 2332,00) 1387,00 (751,00 - 2192,00) ns ns ns




56

Tabela 8: Mediana e valores de mínimo – máximo a intensidade de produção de peróxido de hidrogênio pelas células PMN CH138+ durante a fagocitose do

S. aureus no sangue das vacas durante o período experimental.


Variáveis Dias C C+A O O+A A O AxO

% de PMN que fagocitam S. aureus

28 45,40 (24,40 - 93,30) 51,30 (30,10 - 78,20) 57,00 (43,60 - 80,50) 44,90 (31,90 - 87,80) ns ns ns

54 41,10 (30,50 - 55,40) 51,70 (18,20 - 73,20) 58,80 (33,70 - 80,00) 49,20 (30,10 - 70,90) ns ns 0,041

80 37,00 (23,30 - 68,70) 40,70 (20,60 - 69,40) 47,60 (25,40 - 82,00) 39,40 (20,20 - 61,00) ns ns ns

Intensidade de fagocitose

28 435,00 (195,00 - 532,00) 449,00 (242,00 - 563,00) 443,00 (314,00 - 587,00) 425,00 (103,00 - 552,00) ns ns ns

54 72,80 (58,80 - 101,00) 106,00 (83,10 - 165,00) 117,00 (73,30 - 177,00) 95,30 (78,90 - 141,00) ns 0,0884 0,0026

80 123,00 (88,90 - 155,00) 126,00 (107,00 - 145,00) 136,00 (101,00 - 163,00) 100,00 (73,10 - 158,00) ns ns 0,0934

Intensidade da produção de peróxido

28 621,00 (213,00 - 754,00) 436,00 (237,00 - 671,00) 586,00 (313,00 - 871,00) 481,00 (298,00 - 2179,00) ns ns ns

54 1059,00 (917,00 - 1225,00) 1521,00 (968,00 - 2824,00) 1357,00 (731,00 - 1610,00) 1055,00 (704,00 - 1274,00) ns ns 0,039




57

4.4.3 Avaliação da fagocitose do S. aureus pelas células PMN CH138+ do

sangue

Foi possível observar interação significativa (AxO, P = 0,041) entre os

tratamentos para a quantidade de células PMN CH138+ que fagocitam S.

aureus no sangue das vacas aos 54 dias (tabela 8). A inclusão do óleo, sem

adição dos antioxidantes aumentou a quantidade dessas células no sangue

dos animais enquanto que, com a adição do antioxidante a quantidade de

células diminuiu.

Houve tendência ao aumento (P = 0,0884) na intensidade de fagocitose

do S. aureus pelas células PMN CH138+ no sangue das vacas suplementadas

com o óleo de girassol e uma interação significativa (AxO, P = 0,0026) entre os

tratamentos aos 54 dias (tabela 8). Esses resultados mostram que a utilização

do óleo, dos antioxidantes ou os dois em conjunto aumentaram a intensidade

de fagocitose do S. aureus. Aos 80 dias, foi possível observar uma tendência

de interação (AxO, P = 0,0934) entre os tratamentos onde, os animais

suplementados com óleo e antioxidantes apresentaram menor intensidade de

fagocitose quando comparado aos animais que receberam apenas o óleo.


quantidade de células PMN CH138+ que produziram peróxido de hidrogênio

intracelular durante a fagocitose do S. aureus no sangue das vacas. As

medianas e os valores de mínima e máxima (%) foram de 96,30 (73,50 –

99,50); 95,00 (64,30 – 99,40); 93,90 (80,40 – 99,50) e 95,85 (80,10 – 99,60)

para os tratamentos C, CA, O e OA respectivamente.

Houve interação significativa (AxO, P = 0,039) entre os tratamentos na

intensidade de produção de peróxido de hidrogênio pelas células PMN CH138+

durante a fagocitose do S. aureus aos 54 dias (tabela 8). Esses resultados

mostram que a utilização do óleo em conjunto com os antioxidantes diminuiu a

intensidade de produção de peróxido no sangue dos animais. A utilização do

óleo de girassol ou dos antioxidantes foram capazes de aumentar a intensidade

quando usados separadamente.

Esses resultados indicam que a suplementação com óleo foi capaz de

aumentar a quantidade de células PMN CH138+ que fagocitam S. aureus, e

58

que a utilização do óleo em conjunto com os antioxidantes melhorou a

capacidade bactericida dessas células contra o S. aureus no sangue dos

animais.

4.5 CCS e exame bacteriológico


CCS no leite dos animais durante o período experimental. Os valores (log) de

CCS obtidos durante o período experimental foram de 5,21; 5,48; 5,80; 5,74

para os animais dos tratamentos C, CA, O e OA respectivamente.

Resultados diferentes foram encontrados por Smith et. Al (1984) que ao

suplementar com 0,74 g/vaca/dia de vitamina E e 0,1 mg/kg/PV de selênio

injetável obteve diminuição da incidência (37%) e dos sintomas da mastite

clínica. Aseltine (1991) também encontrou resultados satisfatórios de redução

de mastite e recomenda níveis de 6 mg/dia de selênio para vacas em lactação

e 1000 UI/dia de vitamina E. Weiss et al. (1990 e 1997) constatou que o

consumo de níveis crescentes de selênio (até 5mg/dia) e vitamina E (2000

UI/dia) diminuiu a incidência de mastite clínica e CCS dos animais. Zanetti et al.

(1998 e 2003) recomenda a suplementação com 5 mg/dia de selênio no pré-

parto para redução de casos clínicos e sub-clínicos de mastite.

No presente estudo, também foram observados casos de infecções por

teto das vacas durante o período experimental. A porcentagem de ocorrência

de cada patógeno nos tetos dos animais de cada tratamento pode ser vista na

tabela 9.

Os resultados indicam que os patógenos de maior ocorrência nos tetos

dos animais foram o Staphylococcus sp e Corynebacterium sp. Brito et al.

(1999) encontrou padrão de infecção semelhantes ao examinar amostras de

leite de todos os quartos mamários de 1609 vacas em lactação de 48 rebanhos

do Estado de Minas Gerais.

Harmon et al. (1986) atribui a maior presença de infecção por

Corynebacterium sp. nos rebanhos com a ineficiência do processo de

desinfecção dos tetos após a ordenha. Outro fator que pode indicar a

prevalência de infecção por Staphylococcus sp e Corynebacterium sp é o tipo

59

de desinfetante utilizado no pós-dipping (White et. Al., 1989; Hogan et. Al.,

1987).

Tabela 9: Porcentagem de ocorrência dos patógenos nos tetos das vacas durante o período

experimental.

Staphylococcus sp Dias

Trat1 0 28 54 802

C 0,06 0,10 0,06 0,00

CA 0,12 0,11 0,17 0,15

O 0,33 0,46 0,23 0,17

OA 0,15 0,00 0,07 .

Streptococcus sp Dias

Trat1 0 28 54 80

C 0,00 0,00 0,00 0,00

CA 0,00 0,00 0,00 0,00

O 0,04 0,00 0,08 0,09

OA 0,04 0,05 0,04 .

Corynebacterium sp Dias

Trat1 0 28 54 80

C 0,06 0,00 0,00 0,00

CA 0,20 0,00 0,00 0,00

O 0,07 0,08 0,12 0,09

OA 0,22 0,14 0,22 .

1Tratamentos: C (Controle), C + A (Controle + selênio + vitamina E), O (Óleo de Girassol), O +

A (Óleo de girassol + selênio + vitamina E). 2 Perda de amostras de leite dos animais do tratamento OA na última coleta.

61

5 CONCLUSÕES

A suplementação com os antioxidantes selênio e vitamina E na dieta

mostrou melhorar o sistema imunológico das vacas devido ao aumento dos

níveis enzimáticos da glutationa peroxidase e da quantidade de células

leucocitárias ativas no sangue dos animais.

A adição de óleo de girassol na dieta mostrou melhorar a atividade

fagocitária dos leucócitos polimorfonucleares no sangue dos animais.

62

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