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PURIFICAO DE PRODUTOS PURIFICAO DE PRODUTOS BIOTECNOLGICOSBIOTECNOLGICOS

Disciplina: Biotecnologia Farmacutica

Profa.Greiciane G. Paneto

Etapas de um Etapas de um Processo Processo

de de PurificaoPurificao

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Etapa do processoEtapa do processo Operaes unitrias Operaes unitrias Princpio Princpio

Clarificao

Filtrao convencional Tamanho de partculas Centrifugao Tamanho e densidade de partculas Filtrao tangencial (membranas) Tamanho de partculas

Floculao Hidrofobicidade de partculas

Rompimento de clulas

Homegeneizao Cisalhamento Ultra-som Cisalhamento Moagem em moinho de bolas Cisalhamento

Rompimento qumico ou enzimtico Hidrlise, solubilizao ou desidratao de molculas que compem a parede ou a membrana celular

Purificao de baixa resoluo

Precipitao Solubilidade

U Itrafiltrao (membranas) Massa molar e raio hidrodinmico de molculas

Extrao em sistemas de duas fases lquidas Solubilidade, massa molar

Purificao de alta resoluo

Cromatografia de troca-inica Tipo e densidade de carga na superfcie da biomolcula

Cromatografia de afinidade (biolgica ou qumica)

Stios especficos da superfcie de uma protena (adsoro)

Cromatografia de imunoafinidadeStios especficos da superfcie de uma protena (adsoro antgeno/anticorpo)

Cromatografia de interao hidrofbica Hidrofobicidade

Cromatografia de excluso molecular Massa molar

Membranas adsortivasMassa molar e caractersticas para adsoro ou stios especficos da superfcie de uma protena

Tratamentos finais

Cristalizao Solubilidade e caractersticas de equilbrio lquido-slido

LiofiIizao Caractersticas de equilbrio lquido-slido

Secagem Caractersticas de equilbrio lquido-slido

CLARIFICAO

Filtrao: usada quando assepsia no necessria;

Cetrifugao: sedimentao pela fora da gravidade.

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Rompimento Celular Microbiano

Produtos intracelulares tornam o processo de purificao de biomolculas mais difcil em comparao com produtos extracelulares devido necessidade do

rompimento

Rompimento Celular

Mtodos para Rompimento: Aplicados aps a separao e lavagem das clulas.

Clulas animais (possuem apenas membrana),fcil rompimento com baixa fora decisalhamento;

Bactrias, leveduras e outros fungos possuemparedes rgidas, exigem grande tenses decisalhamento para rompimento.

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Forma mais adequada de Rompimento?

Tipo de microrganismo;

Tamanho da clula;

Tolerncia a tenses de cisalhamento;

Necessidade de controle de temperatura;

Gasto de energia.

Parede Celular

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Mtodos de Rompimento Celular

Homogeneizador de alta presso

Moinho de bolas

Ultrassom

Homogeneizador de alta presso

Moinho de bolas

Ultrassom Mecnicos

Choque osmtico

Congelamento-descongelamento

Aquecimento

Secagem

Choque osmtico

Congelamento-descongelamento

Aquecimento

Secagem

No-mecnicos

lcalis

Solventes

Detergentes

cidos

lcalis

Solventes

Detergentes

cidos

Qumicos

Lize enzimticaEnzimticos

Mecnico Mecnico -- Homogeneizador a alta presso

CavitaoTurbulnciaCisalhamento

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Mecnico Mecnico -- Homogeneizador a alta presso

Este tipo de rompimento provoca aumento da temperatura do meio, por isso necessita de sistema de refrigerao.

Presses utilizadas podem variar de 5000 a 20000 psi, velocidades de alimentao da ordem de 180 a 280 m/s e concentraes celulares de 450 a 750 g/L (massa mida).

Mecnico Mecnico -- Homogeneizador a alta presso

O desempenho pode ser afetado por:

Presso de operao; Velocidade de alimentao; Temperatura; Estado fisiolgico do microrganismo; Condies de cultivo; Tipo de clula e sua concentrao.

tamanho das clulas (maior => rompimento mais fcil)

presso (maior => maior eficincia)

nmero de passagens (mltiplas etapas aumenta o ren-dimento)

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Mecnico Mecnico Moinho de Bolas

Consiste na passagem da suspenso celular por uma cmara de triturao (vertical ou horizontal) provida de um eixo com discos de agitao e preenchida com esferas de vidro.

O rompimento ocorre devido fora de cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das clulas.

Mecnico Mecnico Moinho de Bolas

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MecnicoMecnico Ultra-som

O rompimento ocorre quando ondas sonoras(~20kHz), so convertidas em vibraes em ummeio lquido e causam o fenmeno decavitao.

Escala de laboratrio.

Mecnico Mecnico -- Ultrassom

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Rompimentos Mecnicos

Desvantagens:

As elevadas foras de cisalhamento provocadas pelosrompimentos mecnicos podem destruir organelascelulares e desnaturar enzimas;

Com o rompimento integral das clulas todo ocontedo intracelular, incluindo cidos nuclicos,organelas e fragmentos celulares liberado junto coma molcula-alvo, sendo que o homogeneizado celularpode conter grande quantidade de contaminantes eelevada viscosidade.

Produto intracelular mtodos mtodos qumicosqumicos de rompimento

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Produto extracelular

Processos cromatogrficos

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(Cromatografia) Filtrao em gel

Cromatografia de afinidade

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Cromatografia de Troca Inica

Eletroforese

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Tratamentos Finais