Materia – Microbiologia e Parasitologia

Professor – Iury Felipe Barboza Americano

Enfermeiro – COREN/RJ 313.623

E-mail – iuryfelipe@hotmail.com

Contato: 21 96444-1743

Aula 05 – Microscópios / Controle do crescimento

microbiano

Microscópios existentes

Uma das mais importantes ferramentas da biologia moderna, os microscópios foram

responsáveis por grandes descobertas relacionadas à vida. Estes aparelhos, que

permitem a observação de materiais invisíveis a olho nu, possibilitaram ao homem

explorar um mundo tão amplo e desconhecido quanto o próprio universo,

proporcionando avanços nos conhecimentos sobre os seres vivos, nas pesquisas

biomédicas e diagnósticos médicos.

Desde sua invenção no século XVII, os microscópios passaram por evoluções que os

tornaram mais potentes e precisos. Tecnologias ópticas especiais foram desenvolvidas

para proporcionar uma observação mais clara e reveladora. Os aprimoramentos foram

aplicados, principalmente, aos sistemas de iluminação e nos tipos de luz que atravessam

os espécimes. Hoje, existe uma grande variedade de tipos de microscópio para

diferentes tipos de aplicações, divididos entre três categorias principais: a microscopia

de luz, microscopia eletrônica e a microscopia de ponta de prova.

Freeimages.com/mterraza Hoje, existe uma grande variedade de tipos de microscópios

para diferentes aplicações.

Conheça um pouco sobre os tipos de microscópios

existentes.

Microscopia de luz

Também chamada de microscopia óptica, a microscopia de luz combina métodos

tradicionais de formação de imagem com princípios de aumento de resolução,

permitindo a observação de detalhes de até 200 nanômetros. Os microscópios ópticos

são, geralmente, utilizados em laboratórios de análises e se dividem em:

1. Microscópio ultravioleta

Neste tipo, utiliza-se a radiação ultravioleta, que tem um comprimento de onda para a

luz visível, melhorando o limite de resolução.

2. Microscópio de fluorescência

A observação dos espécimes é feita através da fixação de substâncias fluorescentes

(fluoro e cromos), que, ao receberem luz, podem ser observados através do brilho

gerado.

3. Microscópio de contraste de fase

Transforma diferentes fases dos raios de luz em diferenças luminosas, permitindo a

observação dos espécimes através do contraste gerado.

4. Microscópio de polarização

Constituído por dois prismas – um polarizador e outro analisador – este tipo de

microscópio é utilizado na observação de materiais birrefringentes (estruturas

anisotrópicas, com índices diferentes de refração como os ossos, músculos, fibras,

cabelos, etc.).

Microscopia eletrônica

Os microscópios eletrônicos utilizam, em vez da luz, um feixe de elétrons, para iluminar

a amostra, combinado a lentes eletrostáticas e eletromagnéticas. Sua capacidade de

ampliação é superior a dos microscópios de luz, atingindo um nível de resolução de 0,2

nanômetros. Os tipos principais são:

1. Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)

Capazes de produzir imagens em alta resolução, estes microscópios ampliam em até 100

mil vezes objeto e permitem obter imagens tridimensionais, sendo bastante utilizados

para a observação da estrutura superficial da amostra.

2. Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET)

Este tipo permite examinar detalhes ínfimos, ampliando o objeto em até um milhão de

vezes. Seu funcionamento consiste na emissão de um feixe de elétrons que interage com

a amostra enquanto a atravessa, formando uma imagem aumentada. Para a observação

neste tipo de microscópio é necessário que o material seja cortado em camadas bem

finas.

Ao contrário da microscopia óptica, este tipo não utiliza lentes de vidro, mas sim

ponteiras de vidro com alta sensibilidade à superfície da amostra, permitindo a

formação de uma imagem com informações tridimensionais. Além da grande

resolução, os microscópios que utilizam essa tecnologia podem medir características

como dureza e elasticidade do material.

Conheça as opções de microscopia que a Prolab, especialista em soluções para

laboratórios, coloca à sua disposição. Em nosso site você encontra microscópios

ópticos – ideais para aplicações laboratoriais – e diversas opções de lâminas e

lamínulas para microscopia.

CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO

- O bem estar da humanidade depende em grande parte da capacidade do homem em

controlar a população dos microrganismos, visando: - Prevenir a transmissão de

doenças. - Evitar a decomposição de alimentos. - Evitar a contaminação da água e do

ambiente. Esse controle de microrganismos é possível pela ação de agentes físicos e

químicos, que possuem propriedades de matar a célula microbiana, ou de impedir a sua

reprodução.

POR QUE CONTROLAR O CRESCIMENTO MICROBIANO?

- PRINCÍPIOS DO CONTROLE MICROBIANO

DEFINIÇÕES

ESTERILIZAÇÃO

DESINFECÇÃO

ANTI-SEPSIA

DEGERMAÇÃO

SANITIZAÇÃO

- PRINCÍPIOS DO CONTROLE MICROBIANO • DEFINIÇÕES 1.

ESTERILIZAÇÃO:

- Destruição de todas as formas de vida microbiana, incluindo os endosporos (formas

mais resistentes) - Método mais comum: Aquecimento - Esterilização comercial:

tratamento de calor suficiente para matar os endosporos do Clostridium botulinum nos

alimentos enlatados.

- PRINCÍPIOS DO CONTROLE MICROBIANO 2. DESINFECÇÃO:

- Processo que promove a inibição, morte ou remoção de vários microrganismos

patogênicos e saprófitas, sem eliminar todas as formas de vida. (somente a destruição

dos patógenos vegetativos e não dos endosporos) - Métodos: - substâncias químicas -

radiação ultravioleta - água fervente - vapor

- PRINCÍPIOS DO CONTROLE MICROBIANO • DESINFECÇÃO: utilização de

desinfetantes (produtos químicos) para tratar uma superfície ou substância inerte. •

ANTI-SEPSIA: quando este tratamento é para um tecido vivo. Produto químico = anti-

séptico ***Anti-Sépticos: menos tóxicos que os desinfetantes

- PRINCÍPIOS DO CONTROLE MICROBIANO MODIFICAÇÕES DA

DESINFECÇÃO: (A) DEGERMAÇÃO: remoção mecânica dos microrganismos, em

vez da morte, em uma área limitada. ****mata somente os microrganismos e não os

endosporos Ex. quando a pele é esfregada com álcool antes de receber a injeção.

- PRINCÍPIOS DO CONTROLE MICROBIANO MODIFICAÇÕES DA

DESINFECÇÃO: (B) SANITIZAÇÃO: Processo que leva à redução dos

microrganismos, a níveis seguros, de acordo com os padrões de saúde pública (elimina

99,9% das formas vegetativas). Ex. lavagem de copos, talheres e louças com alta

temperatura ou aplicando desinfetante químico.

- Curiosidades -SUFIXO CIDA: Nome dos tratamentos que causam a morte direta dos

micróbios (MORTE). germicida, fungicida -SUFIXO STÁTICO/STASE: Inibem o

crescimento e multiplicação bacteriostase -SEPSE: Termo grego= estragado/podre

(indica contaminação) Asséptico = sem contaminação

- FUNGICIDA/BACTERICIDA: Quando um determinado produto exerce uma ação

específica sobre determinado grupo de microrganismos.

FUNGISTÁTICO/BACTERIOSTÁTICO: devem ser usados apenas quando eles inibem

as atividades vitais daquele determinado microrganismo sem matá-lo.

- A TAXA DE MORTE MICROBIANA • DEFINIÇÕES: A morte microbiana ocorre

na forma exponencial. Após uma rápida redução da população, a taxa de morte torna-se

mais lenta devido à sobrevivência de células mais resistentes.

- TAXA DE MORTE MICROBIANA Tempo (min.) Mortes/min. nº de cél. vivas 0 0

1.000.000 1 900.000 100.000 2 90.000 10.000 3 9.000 1.000 4 900 100 5 90 10 6 9 1

Taxa de Morte é normalmente constante (Para cada 1 min. – 90 % da pop. morre)

- FATORES QUE INFLUENCIAM O TRATAMENTO MICROBIANO 1.

TAMANHO DA POPULAÇÃO 2. NATUREZA DA POPULAÇÃO 3.

CONCENTRAÇÃO DOS AGENTES 4. TEMPO DE EXPOSIÇÃO 5.

TEMPERATURA 6. CONDIÇÕES AMBIENTAIS

- FATORES QUE INFLUENCIAM O TRATAMENTO MICROBIANO 1.

TAMANHO DA POPULAÇÃO Quanto > a população microbiana > o tempo de

tratamento 2. NATUREZA DA POPULAÇÃO - Presença de Endosporos: mais

resistentes - Diferentes estágios de crescimento: células jovens mais suscetíveis (do que

as na fase estacionária) - Presença de Mycobacterium (mais resistentes)

- FATORES QUE INFLUENCIAM O TRATAMENTO MICROBIANO 3.

CONCENTRAÇÃO DO AGENTES Quanto + concentrado o agente > a eficiência

Exceção: álcool **** relação não linear 4. TEMPO DE EXPOSIÇÃO De acordo com a

OMS (Organização Mundial da Saúde) o tempo mínimo de exposição = 30 min.

(chance de haver sobreviventes de 1 em 106 indivíduos)

- FATORES QUE INFLUENCIAM O TRATAMENTO MICROBIANO 5.

TEMPERATURA - Temperaturas mais altas: mais eficiência no tratamento - 1º C

aumenta 10 x a eficiência (potencializa o controle e em conjunto com o agente pode-se

diminuir sua concentração) 6. CONDIÇÕES AMBIENTAIS - Presença de material

orgânico: inibe a ação dos antimicrobianos químicos - pH do meio e calor: ácido

(potencializa o resultado)

- AÇÕES DOS AGENTES DE CONTROLE MICROBIANO 1. ALTERAÇÃO DA

PERMEABILIDADE DA MEMBRANA Membrana Plasmática: - localizada

imediatamente no interior da parede celular - regula ativamente a passagem de

nutrientes para dentro da célula e a eliminação de dejetos da mesma Lesão na

membrana: causa o vazamento do conteúdo celular no meio (agentes químicos e

antibióticos).

- AÇÕES DOS AGENTES DE CONTROLE MICROBIANO 2. DANOS ÀS

PROTEÍNAS E AOS ÁCIDOS NUCLÉICOS Proteínas: - Enzimas = vitais para o

desenvolvimento celular (ligações covalentes e pontes de hidrogênio são rompidas por

certos produtos químicos e calor). DNA, RNA: - Fonte de informação genética (lesão

por calor, radiação ou substâncias químicas são letais para a célula).

- MÉTODOS DE CONTROLE MICROBIANO 1. MÉTODO FÍSICO: 2. MÉTODO

QUÍMICO:

- MÉTODOS DE CONTROLE MICROBIANO 1. MÉTODO FÍSICO: - CALOR

(SECO OU ÚMIDO) - PASTEURIZAÇÃO - FILTRAÇÃO - BAIXAS

TEMPERATURAS - RESSECAMENTO - PRESSÃO OSMÓTICA - RADIAÇÃO

- MÉTODO FÍSICO 1. CALOR: - MATA OS MICRORGANISMO

DESNATURANDO SUAS ENZIMAS - A RESISTÊNCIA AO CALOR VARIA DE

ACORDO COM O MICRÓBIO: - Ponto de Morte Térmica (PMT): < temperatura em

que todos os microrganismos em uma suspensão líquida serão mortos por calor em 10

min. - Tempo de Morte Térmica (TMT): período mínimo de tempo em que todos os

microrganismos serão mortos. - Tempo de Redução Decimal (TRD ou D): o tempo, em

min, em que 90 % de uma população microbiana em uma determinada temperatura

serão mortas.

- MÉTODO FÍSICO 1. CALOR: A) CALOR SECO: - Incineração: processo drástico de

eliminação dos microrganismos e que destroem o produto. - Flambagem: processo onde

o material é levado diretamente ao fogo, seja seco ou embebido em álcool (utilizado na

desinfecção de alças de vidro). - Estufa esterilizante: amplamente utilizada para as

vidrarias e outros materiais (160 ºC/2 h ou 180 ºC/1 h).

- MÉTODO FÍSICO 1. CALOR: B) CALOR ÚMIDO: - mata os microrganismos pela

coagulação das proteínas (ruptura das pontes de h – estrutura tridimensional) -

ESTERILIZAÇÃO POR CALOR ÚMIDO: - Fervura (100 ºC) - Vapor de fluxo livre -

Autoclave

- MÉTODO FÍSICO FERVURA: Mata as formas vegetativas dos patógenos

bacterianos, quase todos os vírus e os fungos e seus esporos (~ 10 min.) VAPOR DE

FLUXO LIVRE (NÃO PRESSURIZADO) Equivalente a água fervente Não mata os

endosporos bacterianos e alguns vírus Um tipo do vírus da hepatite pode sobreviver a

até 30 min de fervura e alguns endosporos bacterianos resistem à fervura por mais de 20

h.

- MÉTODO FÍSICO AUTOCLAVE: Esterilização mais confiável: temperatura acima

da água fervente (através do vapor sob pressão) Quanto maior a pressão na autoclave >

a temperatura 100 ºC sob pressão de 1 atm (15 libras de pressão por polegada quadrada

– psi) aumentará para 121 ºC 121 ºC – suficiente para matar todos os organismos e seus

endosporos por 15 min.

- MÉTODO FÍSICO PASTEURIZAÇÃO: Louis Pasteur: descobriu um método prático

de prevenir a deterioração da cerveja e vinho através de um aquecimento leve

(suficiente para matar microrganismos que causavam a deterioração sem alterar o sabor

do produto). - Principalmente utilizado na Indústria de Laticínios - Teste de eficiência:

atividade da fosfatase (enzima presente no leite que após a pasteurização deve estar

inativada).

- MÉTODO FÍSICO PASTEURIZAÇÃO: Tratamento Clássico: 63 ºC por 30 min

Pasteurização de Alta Temperatura e Curto Tempo (HTST – high – temperature short-

time): 72 ºC por 15 s Leite Pasteurização - submetido a temperatura (72 ºC) enquanto

flui continuamente por uma serpentina. Conserva-se bem sob refrigeração Esterilização

– submetido a altas temperaturas (UHT – ultra-high temperature) para que possa ser

armazenado sem refrigeração (a temperatura vai de 74 ºC para 140 ºC e depois retorna

para a temperatura inicial)

- MÉTODO FÍSICO Tratamentos Equivalentes: À medida que a temperatura é

aumentada, muito menos tempo é necessário para matar o mesmo nº. de micróbios. Ex.

Endosporos - 115º C – 70 min. -125 ºC – 7 min. 63 ºC – 30 min. (pasteurização) 72 ºC –

15 s (HTST) 140 ºC - < 1 s (UHT) Resultados similares

- MÉTODO FÍSICO 2. FILTRAÇÃO: Passagem de um líquido ou gás através de um

material semelhante a uma tela, com poros pequenos o suficiente para reter os

microrganismos. - Filtro de Partículas de Ar de Alta Eficiência (HEPA – high efficiency

particulate air). Ex: salas de hospitais com pacientes queimados (0,3 µm). - Filtro de

Membrana – compostos por ésteres de celulose ou polímeros plásticos (normalmente

usa-se filtro de 0,2 µm).

- Bactérias retidas na superfície de um filtro do tipo Isopore® (Adaptado de Prescott et

al., Microbiology, 1997) OBS: Filtro tipo Isoporo: filmes de policarbonato tratados com

radiação nuclear seguido de cauterização química.

- MÉTODO FÍSICO 3. BAIXAS TEMPERATURAS: - Depende do tipo de

microrganismo e da intensidade de aplicação. - Diminuição/interrupção do metabolismo

celular. Refrigeradores comuns (0 – 7 ºC): efeito bacteriostático (a temperatura afeta a

reprodução e o metabolismo celular). Psicótrofos: crescem em baixas temperaturas.

Mesófilos: patógenos humanos (temperatura ambiente).

- MÉTODO FÍSICO 4. RESSECAMENTO: Na ausência de água, os microrganismos

não podem crescer ou se reproduzir mas podem permanecer viáveis por anos através das

formas de resistência (endosporos/esporos). A resistência ao ressecamento varia de

acordo com o microrganismos.

- MÉTODO FÍSICO 5. PRESSÃO OSMÓTICA: Concentrações de sais – Plasmólise

Processo semelhante ao ressecamento Bastante utilizado na conservação de

alimentos. Ex: curar carnes (sal) e conservar frutas (açúcar). Fungos – mais

resistentes em crescer em baixas concentrações de água e altas concentrações de sais.

- MÉTODO FÍSICO 6. RADIAÇÃO: Radiação tem vários efeitos sobre as células,

dependendo do seu comprimento de onda, intensidade e duração. Dois tipos de radiação

que mata microrganismos: - Radiação Ionizante - Radiação não-ionizante

- RADIAÇÃO IONIZANTE: - Radiações de pequeno comprimento de onda e portanto

de alta energia e penetrabilidade. - Raios Gama, raios X ou feixes de elétrons de alta

Energia. (1) Raios Gama: emitidos pelo Cobalto radioativo. (2) Feixes de Elétrons: são

produzidos acelerando elétrons até energias elevadas em máquinas especiais. (3) Raios

X: são produzidos por máquinas similares as dos feixes de elétrons e são de natureza

similar aos raios gama. MÉTODO FÍSICO

- RADIAÇÃO IONIZANTE: Principal efeito da Radiação Ionizante: É através da

ionização da água, que forma radicais hidroxila altamente reativos. Estes radicais

reagem com componentes orgânicos, especialmente o DNA (destroem as pontes de H,

duplas ligações) . Radical Hidroxila (OH) é outra forma intermediária do O2 sendo

provavelmente o mais reativo. É gerado no citoplasma da célula por meio do efeito de

radiações ionizantes. Estes radicais hidroxila são produzidos durante a respiração

aeróbica na maioria dos microrganismos. MÉTODO FÍSICO

- RADIAÇÃO NÃO - IONIZANTE: - Possui um comprimento de onda > que da

Radiação Ionizante (normalmente acima de 1 nm). - Luz Ultra Violeta (UV):

comprimento de onda de 4 a 400 nm, sendo o comprimento de 260 nm o mais eficiente.

Desvantagem - apresenta baixa penetrabilidade (não atravessa vidros, filmes escuros e

outros materiais). MÉTODO FÍSICO

- RADIAÇÃO NÃO - IONIZANTE: A luz UV danifica o DNA das células expostas,

produzindo ligações entre as timinas adjacentes nas cadeias de DNA. Estes dímeros de

T = T inibem a replicação correta do DNA. 260 nm = mais efetivo para o controle

microbiano (comprimento de onda é absorvido especialmente pelo DNA celular).

MÉTODO FÍSICO

- MÉTODOS DE CONTROLE MICROBIANO 2. MÉTODO QUÍMICO: Os agentes

químicos são usados para controlar o crescimento de microrganismos em ambos os

tecidos vivos e os objetos inanimados (DESINFETANTES). AGENTES QUÍMICOS:

dificilmente se obtém a esterilidade PROBLEMA: ação dos agentes é diferente para

cada micróbio.

- Alta toxicidade para os microrganismos - Solúvel em água - Estabilidade elevada -

Inócuo para o homem e animais - Ausência de afinidade por matéria orgânica estranha -

Toxicidade para os microrganismos em temperatura ambiente - Capacidade de

penetração - Não ser corrosivo e nem manchar - Desodorante - Detergente

CARACTERÍSTICAS DOS AGENTES QUÍMICOS

- MÉTODO QUÍMICO TIPOS DE DESINFETANTES: 1. Compostos Orgânicos

(Fenol e Compostos Fenólicos, Álcoois, Compostos de Amônio Quaternário -Quats) 2.

Halogênios 3. Metais Pesados e seus compostos 4. Outros (Peroxigênios,

Quimioesterilizantes Gasosos, Agentes de superfície, Biguanidas, Antibióticos)

- MÉTODOS QUÍMICOS MAIS USADOS FENOL (ácido carbólico) E COMPOSTOS

FENÓLICOS - Pastilhas de Garganta: apresenta fenol que tem um efeito analgésico

mas baixo efeito antimicrobiano. Em conc. > 1% (sprays para garganta), > efeito

antibacteriano. - Compostos fenólicos contém uma molécula de fenol quimicamente

alterada para reduzir suas qualidades irritantes e aumentar sua atividade antibacteriana

em combinação com o sabão ou detergente (bifenol, hexaclorofeno).Ação: lesam a

membrana plasmática, inativam as enzimas e desnaturam as proteínas.

- MÉTODOS QUÍMICOS MAIS USADOS BIGUANIDAS - Clorexidina

(frequentemente utilizada no controle microbiano da pele e mucosas). - Efetiva para a

maioria das bactérias vegetativas e fungos, mas não é esporicida - Únicos vírus

afetados: certos tipos envelopados. Efeito bactericida: está relacionado à lesão que este

reagente causa a membrana plasmática.

- MÉTODOS QUÍMICOS MAIS USADOS HALOGÊNIOS - Particularmente Iodo e

Cloro (agentes antimicrobianos efetivos) - I2 – efetivo contra todos os tipos de

bactérias, muitos endosporos, vários fungos e alguns vírus. Mecanismo do I2: o iodo se

combina ao aminoácido tirosina, um componente de muitas enzimas e outras proteínas

celulares, inibindo a função proteíca. Também oxida os grupos sulfidrila (- SH) de

certos aminoácidos que são importantes para manter a estrutura das proteínas.

- MÉTODOS QUÍMICOS MAIS USADOS HALOGÊNIOS - Cl2 – como gás ou em

combinação com outras substâncias químicas. - Ação germicida é causada pelo ácido

hipocloroso (HOCl) Ácido Hipocloroso: ação ainda desconhecida. É um forte oxidante

que impede o funcionamento de boa parte do sistema enzimático celular.

- MÉTODOS QUÍMICOS MAIS USADOS ÁLCOOIS - Matam efetivamente as

bactérias e fungos, mas não os endosporos e os vírus não-envelopados. - Os mais

utilizados: Etanol (70 %) e Isopropanol VANTAGENS: agem e depois evaporam sem

deixar resíduo. Mecanismos de ação: desnaturação das proteínas, rompimento da

membrana e dissolução de muitos lipídios.

- MÉTODOS QUÍMICOS MAIS USADOS METAIS PESADOS E SEUS

COMPOSTOS - Bastante utilizados como germicidas ou anti-sépticos. - Prata,

Mercúrio, Cobre e Zinco. - Ação Oligodinâmica (oligo = pouco) = < [metais] - >

atividade antimicrobiana - Nitrato de Prata 1 %, Cloreto de Mercúrio, Sulfato de Cobre,

Cloreto de Zinco. Mecanismos de ação: quando os íons de metal se combinam com os

grupos sulfidrilas nas proteínas celulares ocorre a desnaturação.

- MÉTODOS QUÍMICOS MAIS USADOS AGENTES DE SUPERFÍCIE Agentes de

superfície (tensoativos ou surfactantes) podem reduzir a tensão superficial entre as

moléculas de um líquido. - sabão: pouco valor anti-séptico (mais importante na remoção

mecânica através da esfregação). - detergentes: ânion da molécula reage com a

membrana plasmática (atuam sobre um amplo espectro de micróbios e não são tóxicos)

- MÉTODOS QUÍMICOS MAIS USADOS ANTIBIÓTICOS - Controle microbiano

através da ingestão ou aplicação superficial. - Alguns antibióticos são utilizados para

controle de produtos (bacteriocina). Nisina: adicionada ao queijo para inibir o

crescimento de certas bactérias da deterioração formadoras de endosporos Natamicina:

antibiótico antifúngico aprovado para uso em alimentos, principalmente para queijo.

Referencias:

https://www.prolab.com.br/blog/equipamentos-aplicacoes/saiba-quais-sao-os-tipos-de-

microscopios-existentes/

https://pt.slideshare.net/gildocrispim/controle-crescimentomicrobiano-esterilizao