aula 2 e 3 - microscópios e técnicas em biologia celular

Microscpios e Tcnicas em Biologia Celular

Prof. Luiz Henrique Garcia Pereira

Revisando

Partes mecnicas:

Base ou p: o suporte do microscpio, pea que sustenta todas asoutras partes do aparelho.

Brao ou coluna: pea que liga o p parte superior do microscpio.

Revisando

Brao ou coluna: pea que liga o p parte superior do microscpio.

Mesa ou platina: pea de apoio da lmina contendo o material paraestudo, no centro da mesa existe um orifcio para a passagem da luz.

Charriot: pea ligada platina que permite movimentar a lmina noplano horizontal da esquerda para a direita e vice-versa, e de trs parafrente e vice-versa.

Parafuso macromtrico: localiza-se em ambos os lados do brao,serve para ajustar o foco grosseiramente atravs de avano ou recuoda mesa em relao objetiva.

Parafuso micromtrico: ajusta o foco finamente atravs de pequenos

Partes mecnicas:

Revisando

Parafuso micromtrico: ajusta o foco finamente atravs de pequenosavanos ou recuos da mesa.

Tubo ou canho: parte superior do microscpio constituda porum tubo contendo um prisma. Sustenta lentes objetivas eoculares, e serve para focalizao do material.

Revolver: pea onde se encaixam as lentes objetivas. composto por um disco de ranhuras que permite a mudanadas objetivas.

Brao ou coluna

Tubo ou canho

Revolver

Revisando

Partes mecnicas:

Base ou p

Mesa ou platina

CharriotParafuso macromtrico

Parafuso micromtrico

Presilha

Condensador: conjunto de lentes situado abaixo da platina que concentra a luz e fornece iluminao uniforme preparao biolgica.

Revisando

Partes pticas:

Objetivas: conjunto de 4 ou mais lentes superpostas que proporcionam aumentos diferentes para observao do material. O valor do aumento est gravado na

objetiva

Oculares: possui 2 lentes convergentes que ampliam e corrigem os defeitos da imagem. O valor do aumento proporcionado est gravado na ocular

Boto do condensador: permite a movimentao do condensador

Diafragma: regula a intensidade de luz que atinge a preparao atravs de uma

Revisando

Partes pticas:

Diafragma: regula a intensidade de luz que atinge a preparao atravs de uma alavanca para sua abertura ou fechamento

Fonte luminosa atualmente utiliza-se luz artificial emitida por uma lmpada includa no prprio microscpio com um interruptor e algumas vezes com um

restato que permite regular a intensidade da luz. Os modelos antigos tinham um

espelho de duas faces: a face plana para refletir luz natural e a face cncava para

refletir luz artificial

Oculares

Revisando

Partes pticas:

CondensadorBoto do condensador

Diafragma

Objetivas

Fonte luminosa

Revisando

e

Que diferenas voc observou entre a posio da letra a olho nu e no MO?

eRevisando

Nas objetivas de diferentes aumentos, o que voc notou quanto ao tamanho da imagem e quanto rea do campo de observao?

Que diferenas voc observou entre a posio da letra a olho nu e no MO?

Qual o aumento final do microscpio?

Lentes Oculares Lentes Obejtivas Aumento Final

Revisando




Revisando


10X



Revisando


10X4X

10X40X100X



Revisando


10X4X 40X

10X40X100X



Revisando


10X4X 40X

10X 100X40X100X



Revisando


10X4X 40X

10X 100X40X 400X100X



Revisando


10X4X 40X

10X 100X40X 400X100X 1000X

Como funciona o Microscpio?Como funciona o Microscpio?

Funcionamento do microscpio ptico

Lentes


Imagem Real

Lentes

Imagem Real

Imagem Virtual


Comportamento da Luz


Formao da Imagem no MO

Animao

Capacidade de fornecer imagens diferentes entre 2 pontos prximos


Poder de Resoluo do Microscpio

Limite de resoluo

Distncia mnima entre dois pontos para que possam ser discriminados

0,2 m


Limite de Resoluo do Microscpio

Limite de Resoluo do Olho Humano 100 m

Nenhum objeto pode ser distinguido com o uso de umcomprimento de onda maior que ele prprio



Comprimento de onda da luz Visvel

Comprimento de onda =

Abertura numrica = AN



Abertura numrica = AN

Propriedade especfica das lentes relacionadas comndice de refrao do meio e o ngulo de incidnciados raios luminosos (coletar Luz)

Luz Branca = 0,4 0,7 m

Luz branca refrao vidro ~ 0,59 m



LR = 0,61 . AN

LR = 0,61 . 0,59 m = 0,36 m1,0

LR = 0,61 . 0,59 m = 0,25 m1,4



e

Por que s nos aumentos maiores conseguimos enxergar as falhas na letra ( = mais detalhes)?

Preparao do material para anlise no microscpio

1 - Clulas so muito frgeis e muitos dos seus componentes perdem a estrutura aps a morte da clula



2 - Material deve permitir a passagem da luz

Maioria dos tecidos so compostos de diversascamadas de clulas



2 - Material deve permitir a passagem da luz

Maioria dos tecidos so compostos de diversascamadas de clulas

3 - Clulas e seus componentes so transparentes

(excees = presena de pigmentos coloridos)

FIXAO DO MATERIAL

Consiste no uso de substncias (fixadores) que provocam a


1 Fragilidade das Clulas

Consiste no uso de substncias (fixadores) que provocam a morte das clulas propiciando a preservao da estrutura que tinham em vida)

Diversos fixadores cidos, formaldedo, acetonas, etc)

Formam ligaes qumicas fortes entre as molculas proteicas sustenta sua estrutura

Mtodos fsicos


FIXAO DO MATERIAL

1 Fragilidade das Clulas

Congelamento - dessecamento

Congelamento rpido -160 a -190 C (Nitrognio lquido)

Dessecamento vcuo -30 a -60 C

Maioria dos tecidos so compostos diversas camadas de clulas

CORTE DO MATERIAL


2 Passagem da Luz

CORTE DO MATERIAL

Camadas Finas

Problemas = tecidos moles

Incluso do tecido em material rgido

Blocos de parafina ou resina


2 Passagem da Luz


2 Passagem da Luz

Lminas de ao ou vidro

Cortes de 1 a 10 m

3 Transparncia das Clulas

(excees = presena de pigmentos coloridos)

COLORAO


Substncias qumicas orgnicas

Tem afinidade por molculas ou parte de molculas das estruturas celulares

2 grupos principais de corantes:

Bsicos grupo cromforo uma base Corantes basfilos



cidos grupo cromforo um cido Corantes acidfilos



2 grupos principais de corantes:

Bsicos grupo cromforo uma base Corantes basfilos

Estruturas celulares Com caractersticas cidas

(basofilia)

ProtenasNcleo

Retculo Endoplasmticocidos Nuclicos (DNA e RNA)

Estruturas celulares Com caractersticas bsicas

(acidofilia)

CitoplasmaFibras de Colgeno

cidos grupo cromforo um cido Corantes acidfilos

Exemplos de corantes

Hematoxilina corante basfilo Eosina corante acidfilo

ProtenasNcleo Citoplasma



NcleoRetculo

Endoplasmticocidos Nuclicos

(DNA e RNA)

CitoplasmaFibras de Colgeno

AZUL / ROXO ROSA / VERMELHO

Colorao HE

GPreparao do material para anlise no microscpio

Corantes Basfilos Corantes Acidfilos


- Azul de Toluidina- Azul de metileno- Azul de alcian- Hematoxilina

- Xylidine ponceau- Sirius red- Fast Green- Eosina- Orcena


FIXAO

CORTECORTE

COLORAO

Tipos de Lminas

Lminas Frescas

Lminas Permanentes


Simples montagem

Esmagamento

Esfregao

Transparentes

Trabalhando com Clulas Vivas

Mtodos de fixao, corte e colorao matam as clulas


Novos microscpios

Microscpio de campo escuro

Luz incide obliquamente

Diferente densidades = refraes distintas


Somente luz que passa pelo objeto chega a objetiva

Imagem clara com fundo escuro

Caminho da luz varia com a densidade


Microscpio de Fase



Sistema capta diferenas

Gerao de imagem com contraste

Microscpio de Fase




Microscpio de Interferncia


Sistema capta diferenas

Gerao de imagem com grande contraste

Evoluo da Microscopia e Anlise das Clulas

Microscopia de Fluorescncia

Uso de substncias fluorescentes para marcao de alvos-especficos

Deteco da luminosidade por cmera CCD

Tratamento imagem por computador

Visualizao de estruturas menores que 0,2 m



Citoqumica

Imunocitoqumica


Microscopia Confocal

Foco de um nico ponto de luz sobre um pontoespecfico da amostra, com profundidade especfica

Deteco de diferentes pontos/camadas por vez (escaneamento)

Montagem imagem por computador

Visualizao de estruturas em 3D


Microscopia Confocal

Aumentando o Poder de Resoluo dos Microscpios

Microscpio Eletrnico



Nenhum objeto pode ser distinguido com o uso de umcomprimento de onda maior que ele prprio

Animao


Microscpio ptico

Refrao da Luz

Fonte Luminosa


Disperso dos eltrons

Fonte de Eltrons

Imagem formada pelos raios luminosos

Refrao da Luz

Limite de resoluo = 0,2 m (200 nm)

1.000 1.500.X

Disperso dos eltrons

Imagem formada pela ausncia de eltrons

Limite de resoluo = 0,000005 m (0,005nm)

1.000.000 X


Cortes de 20 nm de espessura

Preparo das amostras

Imagem baseada na disperso do eltrons

Muitos tomos com baixo peso molecular


Soluo aumentar peso molecular maior disperso dos eltrons

Cobertura do material com metais pesados

smio, urnio, chumbo, platina e ouro


Cinza vulcnica

Velcro

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