Aula 03

Imunologia

ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS – ELISA

O método imunoenzimático para detecção e quantificação de antígenos ou anticorpos específicos. Estes grupos observaram que proteínas poderiam ser imobilizadas em uma superfície sólida depoliestireno e a reação imune, ser revelada pela formação de produtos coloridos da reação enzima-substrato, na presença de um componente doador de elétrons, denominado cromógeno.

O ELISA direto é mais usado em imuno-histoquímica. Seu fundamento consiste na utilização de anticorpos primários marcados com enzima, que se combinam especificamente aos antígenos presentes em cortes histológicos. A aplicação da solução reveladora destaca o material pesquisado.

O ELISA indireto é empregado para a pesquisa de anticorpos, onde amostras de soro ou plasma são colocadas para reagir com antígenos imobilizados em uma fase sólida (placas de ELISA). Posteriormente, são revelados com auxílio de conjugado enzimático específico levando a formação de um produto corado ao agir sobre substratos cromogênicos. Para pesquisa de antígenos presentes em material biológico, a amostra é posta para reagir com anticorpos específicos imobilizados na fase sólida.

O ELISA competitivo consiste na pesquisa de antígeno, onde o anticorpo é mobilizado na fase sólida e o antígeno correspondente compete com uma quantidade padronizada e marcado para sítios de combinação disponível.

WESTERN BLOT – WB

A técnica de Western Blotting, é uma ferramenta de grande utilidade para a caracterização de antígenos, ou para pesquisa de anticorpos específicos para um determinado componente antigênico.

A técnica de WB baseia-se numa combinação de três métodos:

A separação de macromoléculas através de eletroforese em gel de poliacrilamida;

Sua transferência eletrolítica para membranas (geralmente de nitrocelulose);

Ensaio de revelação.

Eletroforese em gelAs proteínas da amostra são separadas de acordo com o

peso molecular.

TransferênciaA fim de fazer as proteínas acessíveis à detecção do

anticorpo, elas são movidas do gel para uma membrana de nitrocelulose. A membrana é colocada face-a-face com o gel, e uma corrente elétrica é aplicada entre grandes placas de cada lado, então as proteínas carregadas se movem do gel para a membrana enquanto mantém a mesma disposição que continham no gel. Como resultado desse processo de "borramento" as proteínas são expostas a uma fina camada para detecção.

Revelação / Bloqueio Desde que a membrana foi escolhida por sua habilidade

de ligar proteínas, passos precisam ser feitos para impedir as interações não específicas entre a membrana e o anticorpo usado para a detecção da proteína alvo.

Métodos de dois passosAnticorpo primário: Anticorpos são gerados quando uma

espécie hospedeira ou uma cultura de células imunes são expostos à proteína de interesse (ou a uma parte dela). Normalmente uma parte da resposta imune é colhida e usada como ferramenta de detecção específica e sensível que se liga à proteína diretamente - por isso anticorpo primário.

Anticorpo secundário: Depois de se enxaguar a membrana para remover o anticorpo primário não ligado, ela é exposta a outro anticorpo, direcionado a porções espécies-específicas do anticorpo primário. Este é conhecido como anticorpo secundário. Ele geralmente é ligado a biotina ou a uma enzima reveladora como por exemplo fosfatase alcalina. Esse passo confere a vantagem de que vários anticorpos secundários se ligarão a um anticorpo primário, providenciando um sinal intensificado.

O teste confirmatório de HIV emprega um Western blot para detectar o anticorpo anti-HIV na amostra de soro humano. Proteínas de células conhecidas infectadas com o HIV são separadas e "blotadas" em uma membrana como acima. Então, no soro a ser testado é aplicado o anticorpo primário no passo de incubação; o anticorpo livre é lavado, e um anticorpo anti-humano secundário é ligado, e uma enzima reveladora é adicionada. As bandas impregnadas então indicam os anticorpos do soro dos pacientes marcados com o anticorpo anti-humano.

Um Western blot também é um teste definitivo para a doença da vaca louca.

Algumas formas do teste da Doença de Lyme empregam o Western blot.

NUNCA É DEMAIS APRENDER. NUNCA É DEMAIS ENSINAR.