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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

ANA FLÁVIA MENDONÇA

Atividade biológica dos óleos essenciais de plantas sobre isolados do complexo Cryptococcus neoformans.

Goiânia 2015

ANA FLÁVIA MENDONÇA

Atividade biológica dos óleos essenciais de plantas sobre isolados do complexo Cryptococcus neoformans.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre em Medicina Tropical e Saúde Pública. Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Kioko Hasimoto e Souza

Goiânia 2015

i

Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública

da Universidade Federal de Goiás

BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Aluna: ANA FLÁVIA MENDONÇA

Orientadora: Profa. Dra. LÚCIA KIOKO HASIMOTO E SOUZA

MEMBROS:

1. Prof. Dra. Lúcia Kioko Hasimoto e Souza

2. Prof. Dr. Fábio Silvestre Ataídes

3. Prof. Dra. Orionalda de Fátima Lisboa Fernandes

Data: 30/04/2015

ii

“Pais, palavra curta de profundo significado

almas unidas, corações atados

fonte de inspiração e ensinamentos

mesmo quando longe, juntos em pensamentos

exemplo de vida a ser seguido

ontem,hoje, amanhã e até o infinito

meu amor por vocês jamais poderá ser medida”

Ana Flávia Mendonça

iii

Rir é correr risco de parecer tolo. Chorar é correr o risco de parecer sentimental. Estender a mão é correr o risco de se envolver. Expor seus sentimentos é correr o risco de mostrar seu verdadeiro eu. Defender seus sonhos e ideias diante da multidão é correr o risco de perder as pessoas. Amar é correr o risco de não ser correspondido. Viver é correr o risco de morrer. Confiar é correr o risco de se decepcionar. Tentar é correr o risco de fracassar. Mas os riscos devem ser corridos, porque o maior perigo é não arriscar nada. Há pessoas que não correm nenhum risco, não fazem nada, não têm nada e não são nada. Elas podem até evitar sofrimentos e desilusões, mas elas não conseguem nada, não sentem nada, não mudam, não crescem, não amam, não vivem. Acorrentadas por suas atitudes, elas viram escravas, privam-se de sua liberdade. Somente a pessoa que corre riscos é livre!

Sêneca

iv

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Jadir e Cida e ao meu irmão, Marco Aurélio pelo amor, carinho e apoio

em todos os momentos da minha vida.

Ao meu marido, Patrick por ter escolhido o Brasil como sua segunda casa para que eu

pudesse terminar os estudos. Obrigada pela paciência, apoio, carinho e dedicação.

À minha orientadora Profa Dra Lúcia Kioko Hasimoto e Souza pela dedicação, carinho,

paciência e pelos grandes ensinamentos. A realização deste projeto não teria sido possível sem a

sua enorme contribuição. Inúmeras palavras não seriam suficientes para expressar minha

gratidão.

As professoras Dra Maria do Rosário Rodrigues Silva, Dra Orionalda de Fátima Lisboa

Fernandes e Dra Carolina Rodrigues Costa pelas importantes sugestões e contribuições neste

trabalho, além da agradável convivência.

Ao Fernando Yano Abrão e Mariana Oliveira pela amizade e fundamental ajuda na

realização dos experimentos, compartilhamento das técnicas e pela paciência em ensinar.

À Thaísa Cristina Silva pela amizade, carinho, apoio durante o trabalho e pelas

importantes dicas nesta etapa final.

À Carolina Martins Treméa pela amizade e fundamental apoio durante toda a realização

do trabalho.

Aos amigos do Laboratório de Micologia do IPTSP: Andressa, Cícero Júnior, Fernanda, Hildene, Maysa, Viviani e Rodolfo pelas contribuições durante estes anos de pesquisa.

Aos amigos do Laboratório de Virologia do IPTSP: Marize, Kareem e Nahla, obrigada pelo carinho e incentivo.

Ao prof. Dr. Fábio Silvestre Ataídes que gentilmente aceitou participar da banca de defesa.

À Maria José da Cunha, coordenadora do Laboratório de Biologia Molecular do LACEN-GO, pela amizade e por tornar possível minha dispensa para dedicação exclusiva ao mestrado nesta etapa final. A você minha eterna gratidão.

Aos amigos do LACEN-GO pelo apoio e incentivo: Angélica, Aryanne, Beth, Camila, Cida, Daniela, Fernanda, Hilda, Larissa, Lilia, Luiz Augusto, Sarah e Vanessa.

v

À equipe do RH do LACEN e da secretaria de pós-graduação do IPTSP por todo o suporte durante este período de mestrado.

Aos amigos da escola de filosofia Nova Acrópole por entenderem minha ausência durante a pós-graduação e pelos grandes ensinamentos que foram sempre uma fonte de inspiração para os momentos difíceis.

À Lidia Akemi Ivamoto, minha irmã japonesa, obrigada por tudo. Não tenho nem palavras para descrever nossa amizade.

As amigas do HDT, que estiveram comigo lá nos primórdios, quando eu ainda estava estudando para a prova de mestrado: Candyce, Danielle, Delsuite e Rhalcia.

Ao meu afilhadinho Herbertt Henrique. Espero que ele me perdoe por este tempo em que não dei toda a atenção que merecia.

E a todos os meus demais amigos e familiares que não foram citados por nomes, mas que não deixam de ter seu destaque no lugar mais importante que é dentro do meu coração.

À Deus por me conduzir na fé em todos os momentos da minha vida.

vi

SUMÁRIO

SUMÁRIO ............................................................................................................................................... vi

LISTA DE FIGURAS, QUADROS. ................................................................................................................ ix

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIAÇÕES. ...................................................................................................... xii

RESUMO ................................................................................................................................................ xiv

ABSTRACT ............................................................................................................................................. xv

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 1

2. REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................................................. 1

2.1. Fungos do complexo Cryptococcus neoformans ................................................................... 1

2.1.1. Morfologia, Ciclo reprodutivo e Habitat ............................................................................ 7

2.1.2. Fatores de Virulência ....................................................................................................... 4

2.2. Criptococose ........................................................................................................................... 7

2.2.1. Epidemiologia das espécies do complexo C. neoformans .................................................. 7

2.2.2. Patogenia do fungo ........................................................................................................... 9

2.2.3. Manifestações clínicas .................................................................................................... 11

2.2.4. Diagnóstico laboratorial .................................................................................................. 14

2.2.5. Tratamento da criptococose ........................................................................................... 14

2.2.6. Resistência medicamentosa...............................................................................................16

2.3. Plantas Medicinais e Óleos Essenciais ................................................................................. 17

2.3.1. Cinnamomum zeylanicum (Canela folha) ........................................................................ 20

2.3.2. Illicium verum (Anis estrelado) ....................................................................................... 21

2.3.3. Juniperus virginiana (Cedro Virginia) ............................................................................ 22

2.3.4. Rosa centifolia (Rosa Marrocos) ..................................................................................... 23

2.3.5. Syzygium aromaticum (Cravo Talo/Cravo-da-Índia) ........................................................ 24

2.4. Ensaios in vitro para a detecção da atividade antifúngica de compostos ............................ 25

2.4.1. Testes de suscetibilidade ................................................................................................. 25

2.4.2. Interação entre agentes antifúngicos ................................................................................ 26

2.4.3. Curva do tempo de morte ................................................................................................ 27

2.5. Determinação do mecanismo de ação dos OEs sobre células fúngicas ............................... 27

2.5.1. Quantificação do ergosterol da membrana fúngica .......................................................... 27

vii

2.5.2. Avaliação de lesão da membrana fúngica por citometria de fluxo .................................... 28

2.6. Avaliação in vitro da citotoxicidade de agentes antimicrobianos ........................................ 30

3. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................................... 31

4. OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 32

4.1. Objetivo Geral ....................................................................................................................... 32

4.2. Objetivos Específicos ............................................................................................................. 32

5. METODOLOGIA .............................................................................................................................. 33

5.1. Microrganismos ................................................................................................................... 33

5.2. Antifúngicos ......................................................................................................................... 33

5.3. Óleos essenciais e eugenol .................................................................................................... 33

5.4. Avaliação da suscetibilidade in vitro pelo método de microdiluição em caldo ................... 34

5.4.1. Diluição dos OEs, eugenol e antifúngicos ....................................................................... 34

5.4.2. Preparo do inóculo.......................................................................................................... 34

5.4.3. Procedimento do teste ..................................................................................................... 35

5.5. Determinação da concentração fungicida mínima (CFM) .................................................. 36

5.6. Avaliação da interação entre os OEs e eugenol com os fármacos anfotericina B e fluconazol pela técnica de chequerboard ........................................................................................ 36

5.7. Curva do tempo de morte (Time kill assay) ........................................................................ 38

5.8. Estudo do mecanismo de ação ............................................................................................. 39

5.8.1. Quantificação de esteróis ................................................................................................ 39

5.8.2. Avaliação da lesão de membrana fúngica sob ação dos OEs e eugenol ............................ 41

5.9. Avaliação da citotoxicidade dos OEs ................................................................................... 41

6. RESULTADOS ................................................................................................................................. 43

6.1. Testes de suscetibilidade in vitro ......................................................................................... 43

6.2. Avaliação da associação de C. zeylanicum, S. aromaticum e eugenol com anfotericina B e fluconazol sobre isolados do complexo C. neoformans. .................................................................. 46

6.3. Curva do tempo de morte (Time kill assay) ........................................................................ 48

6.4. Avaliação da quantificação do ergosterol ............................................................................ 49

6.5. Avaliação da lesão de membrana......................................................................................... 51

6.6. Citotoxicidade ...................................................................................................................... 53

7. DISCUSSÃO .................................................................................................................................... 55

8. CONCLUSÕES ................................................................................................................................. 63

viii

9. REFERÊNCIAS ................................................................................................................................. 64

10. ANEXOS ..................................................................................................................................... 90

Anexo 1: Laudo técnico de Syzygium aromaticum (Eugenia caryophyllus) .................................. 90

Anexo 2: Laudo Técnico de Illicium verum .................................................................................... 91

Anexo 3: Laudo Técnico de Juniperus virginiana .......................................................................... 92

Anexo 4: Laudo Técnico de Cinnamomum zeylanicum ................................................................. 93

Anexo 5: Laudo Técnico de Rosa centifolia .................................................................................... 94

Anexo 6: Comprovação emitida pela FERQUIMA do composto majoritário presente no OE de C. zeylanicum (Canela folha). .............................................................................................................. 95

Anexo 7: Certificado de análise do eugenol emitido pela SIGMA-ALDRICH. ............................. 96

Anexo 8: Artigo científico a ser submetido ..................................................................................... 97

LISTA DE FIGURAS, QUADROS

ix

LISTA DE FIGURAS, QUADROS.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Sorotipos e genótipos das espécies do complexo C. neoformans ............................................... 2

Figura 2: Número de internações por micoses sistêmicas durante os anos de 2000 a 2007, onde PCM=

Paracoccidioidomicose, Histo= Histoplasmose, Cripto= Criptococose e Cocci= Coccidioidomicose (MS-

Vigilância da criptococose- Brasília-DF Abril de 2012) ........................................................................... 8

Figura 3: Número de internações por micoses sistêmicas durante os anos de 2000 a 2007, onde PCM=

Paracoccidioidomicose, Histo= Histoplasmose, Cripto= Criptococose e Cocci= Coccidioidomicose (MS-

Vigilância da criptococose- Brasília-DF Abril de 2012) ........................................................................... 9

Figura 4: Via de penetração e ciclo de infecção de C. neoformans......................................................... 10

Figura 5: Exame direto utilizando o corante tinta da China evidenciando a cápsula fúngica ................... 13

Figura 6: Representação das flores, folhas e cascas de C. zeylanicum. ................................................... 20

Figura 7: Flores, folhas e frutos de I. verum. ......................................................................................... 21

Figura 8: J. virginiana. ......................................................................................................................... 22

Figura 9: Flores de R. centifólia ............................................................................................................ 23

Figura 10: Árvore, folhas e frutos de S. aromaticum ............................................................................. 24

Figura 11: Principais elementos que fazem parte da composição do citômetro de fluxo-BD Biosciences 29

Figura 12: Representação esquemática do teste de suscetibilidade in vitro pelo método de microdiluição

em caldo ................................................................................................................................................ 35

Figura 13: Esquema para a determinação da CFM, onde 10 µL do orifício correspondente a CIM, 2 x

CIM e 4 x CIM da placa de microtitulação de cada fármaco, OEs e composto foram semeados em placa

de ágar Sabouraud. ................................................................................................................................ 36

Figura 14: Representação esquemática da técnica de chequerboard na avaliação da associação entre os

OEs/composto com os fármacos anfotericina B e fluconazol. Na placa (A) foi realizada a diluição do OE,

na (B) a diluição do fármaco e na (C) a mistura de OE + fármaco + inóculo. .......................................... 37

Figura 15: Determinação da CFM do OE de C. zeylanicum sobre C. neoformans ATCC 28957 em ágar

Sabouraud dextrose. .............................................................................................................................. 45

Figura 16: Gráfico representativo do tempo de curva de morte de C. gattii ATCC 24065 sobre ação dos

OEs de C. zeylanicum e S. aromaticum, eugenol e anfotericina B........................................................... 48


x

Figura 17: Perfil dos esteróis de C. gattii ATCC 24065 analisados por espectrometria UV (230-300 nm)

após tratamento com OE de C. zeylanicum (A) e S. aromaticum (B) em concentrações iguais a CIM (256

µg/mL) e ½ CIM (128 µg/mL). .............................................................................................................. 50

Figura 18: Perfil dos esteróis de C. gattii ATCC 24065 analisados por espectrometria UV (230-300 nm)

após tratamento com eugenol (C) em concentrações iguais a CIM (256 µg/mL) e ½ CIM (128 µg/mL) e

fluconazol (D) em CIMs de 4, 8, 16 e 32 µg/mL. ................................................................................... 50

Figura 19: Porcentagem de células de C. gattii ATCC 24065 coradas pelo PI, analisadas por citometria

de fluxo, após o tratamento com concentrações seriadas do OE de C. zeylanicum (A) e S. aromaticum (B)

e eugenol (C). ........................................................................................................................................ 51

Figura 20: Comparação entre as porcentagens obtidas de células de C. gattii ATCC 24065 coradas pelo

PI após o tratamento com concentrações seriadas do OE de C. zeylanicum e S. aromaticum e eugenol

além do controle positivo (Cp) com álcool 70% e controle negativo (Cn = 0,5%) não tratado. ................ 52

Figura 21: Histogramas de C. gatti ATCC 24065 tratados com OE de C. zeylanicum (A), S. aromaticum

(B) e eugenol (C) na concentração de 1024µg/mL (CFM) demonstrando porcentagem de morte celular

através da fluorescência produzida pela marcação com PI, captadas pelo detector FL3 do citômetro de

fluxo. A figura (D) representa o controle de autofluorescência celular, (E) controle de viabilidade

marcado com PI e (F) o controle de lesão de membrana (álcool 70%). ................................................... 52

Figura 22: Citotoxicidade em diferentes concentrações de S. aromaticum, C. zeylanicum, eugenol e

anfotericina B em hemácias, CN = controle negativo e CP = controle positivo. ...................................... 53

LISTA DE QUADROS

Tabela 1: Plantas e/ou extratos com atividade antifúngica avaliadas no Laboratório de Micologia do

IPTSP-UFG. .......................................................................................................................................... 19

Tabela 2: Valores de CIM obtidos pelo teste de microdiluição em caldo de 17 isolados do complexo C.

neoformans na presença do OE de C. zeylanicum, S. aromaticum, R. centifolia e eugenol. ..................... 43

Tabela 3: Valores de CFM de 17 isolados do complexo C. neoformans na presença do OE de C.

zeylanicum, S. aromaticum, R. centifolia e eugenol. ............................................................................... 44

Tabela 4: Análise comparativa em porcentagem dos valores de CFM com a CIM apresentada pelos 17

isolados do complexo C. neoformans ..................................................................................................... 45

Tabela 5: Efeito da associação da anfotericina B e os OEs de C. zeylanicum, S. aromaticum e eugenol em

17 isolados da espécie do complexo C. neoformans ............................................................................... 46


xi

Tabela 6: Efeito da associação fluconazol e os OEs de C. zeylanicum, S. aromaticum e eugenol em 17

isolados da espécie do complexo C. neoformans .................................................................................... 47

Tabela 7: Classificação dos resultados (%) obtidos na associação entre os OEs e o eugenol com os

antifúngicos anfotericina B (AnfoB) e fluconazol sobre 17 isolados do complexo C. neoformans. ......... 47

Tabela 8: Percentual de ergosterol extraído e inibido de C. gattii ATCC 24065 quando tratados com os

OEs de C. zeylanicum, S. aromaticum e eugenol, nas CIMs e ½ CIMs. .................................................. 49

Tabela 9: Porcentagem de lise das hemácias promovidas pelos OEs e eugenol em diferentes

concentrações. ....................................................................................................................................... 54

ABREVIATURAS

xii

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIAÇÕES.

Abs Absorvância

Anf B Anfotericina B

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ATCC American Type Culture Collection

CFM Concentração fungicida mínima

CDC Centers for Disease Control and Prevention

CF Canela folha

CIM Concentração inibitória mínima

CIF Concentração inibitória fracionária

CLSI Clinical Laboratory Standards Institute

CsA Ciclosporina A

CT Cravo talo

DMSO Dimetilsulfóxido

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

GalXM Galactoxilomanana

GMS Gomori Grocott

GXM Glucuronoxilomanana

HDT Hospital de Doenças Tropicais

HE Hematoxilina eosina

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana

ICIF Índice de concentração inibitória fracionária

Lac Lacase

ABREVIATURAS

xiii

LCR Líquido cefalorraquidiano

MM Mucicarmim de Meyer

MOPS Ácido 3-(N-morfolino)-propanosulfônico

Mpr Metaloprotease

MS Ministério da Saúde

OE Óleo essencial

PBS Phosphate-Buffered Saline

pH Potencial Hidrogeniônico

ROS Espécies oxigênio reativas

RPM Rotações por minuto

RPMI Rosewell Park Memorial Institute

SNC Sistema nervoso central

TARV Terapia antirretroviral

WHO World Health Organization

RESUMO

xiv

RESUMO

Criptococose é uma infecção fúngica oportunística, causada por leveduras do complexo

Cryptococcus neoformans, frequentemente relacionada com altas taxas de morbidade e

mortalidade. Pacientes portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV), transplantados

ou em uso de terapias imunossupressoras são os principais acometidos. Fluconazol e anfotericina

B, principais antifúngicos aplicados no tratamento da doença, são tóxicos para o paciente e, a sua

utilização por tempo prolongado, tem selecionado isolados resistentes fazendo-se necessária a

busca de novos compostos que apresentem boa atividade antifúngica e baixos níveis de

toxicidade. Desta forma, os óleos essenciais (OEs) de plantas são promissores a este fim por

apresentarem propriedade antimicrobiana já relatada. Este estudo teve como objetivo avaliar a

atividade biológica dos OEs de Cinnamomum zeylanicum, Syzygium aromaticum, Juniperus

virginiana, Rosa centifolia, Illicium verum e do eugenol sobre fungos do complexo C.

neoformans. Foram realizados testes para avaliar a atividade antifúngica, a interação com os

fármacos anfotericina B e fluconazol, a curva de morte, o mecanismo de ação e a citotoxicidade.

Os OEs de C. zeylanicum e S. aromaticum e seu composto majoritário, o eugenol, foram os que

apresentaram menores concentrações inibitórias mínimas (CIMs) variando de 128 a 512 µg/mL e

concentrações fungicidas mínimas (CFMs) de 256 a 1024 µg/mL. O OE de S. aromaticum

apresentou um aumento em sua atividade antifúngica quando associado à anfotericina B em

todos os isolados avaliados, enquanto o OE de C. zeylanicum e o eugenol não apresentaram

alterações de sua atividade quando associado aos fármacos. O estudo do mecanismo de ação

revelou que C. zeylanicum, S. aromaticum e o eugenol, na CIM, inibiram a síntese do ergosterol

e na CFM promoveram lesão de membrana. Os ensaios de atividade hemolítica demonstraram

baixa toxicidade destes compostos. Estes resultados demonstram ação dos OEs de C. zeylanicum

e S. aromaticum e do eugenol, sobre isolados do complexo C. neoformans. Desta forma, esses

OEs se tornam promissores na busca de novos medicamentos, a ser utilizados no tratamento da

criptococose.

ABSTRACT

xv

ABSTRACT

Cryptococcosis is an opportunistic fungal disease, caused by the yeasts from

the Cryptococcus neoformans complex, frequently associated with high rates of morbidity and

mortality. Patients infected with the human immunodeficiency virus (HIV), transplanted or in

use of immunosuppressive therapies are the main affected. Fluconazole and amphotericin B, the

main antifungals applied in the treatment of the disease, are toxic to the patient and, their use for

prolonged time, has selected resistant strains making necessary to search for new compounds that

shows good antifungal activity and low levels of toxicity. Thus, the essentials oils (EOs) from

plants are promising for this purpose because their antimicrobial property has been already

reported. This study aimed to evaluate the biological activity of EOs

from Cinnamomum zeylanicum, Syzygium aromaticum, Juniperus virginiana, Rosa centifolia,

Illicium verum and eugenol on fungal isolates from C. neoformans complex. Tests were carried

out to evaluate the fungal activity, interaction with amphotericin B and fluconazole, time kill

assay, mechanism of action and cytotoxicity. The EOs of C. zeylanicum and S. aromaticum and

its majority compound, eugenol, presented the best antifungal activity with minimum inhibitory

concentrations (MICs) ranging from 128-512 µg/mL and minimum fungicidal concentrations

(MFCs) from 256-1024 µg/mL. The EO of S. aromaticum has an increase in its antifungal

activity when combined with amphotericin B in all the isolates evaluated while the EO

of C. zeylanicum and eugenol showed no changes of its activity when associated with drugs. The

study of the mechanism of action revealed that C.zeylanicum, S. aromaticum and eugenol, in

MIC, inhibited the synthesis of ergosterol and in MFC promoted membrane damage. The

hemolytic activity assays showed low toxicity of these compounds. These results demonstrate

action of the EOs from C. zeylanicum and S. aromaticum and eugenol against isolates of C.

neoformans complex. Thus, these EOs become promising in the search for new drugs to be used

in the treatment of cryptococcosis.

INTRODUÇÃO

1

1. INTRODUÇÃO

Durante muitos anos os fungos foram associados a infecções superficiais com tratamentos

bem sucedidos, sendo rara a ocorrência de doença sistêmica com evolução para óbito (LIN,

2009). Atualmente, verifica-se um aumento no número de casos de infecções fúngicas graves,

que podem estar relacionados com o emprego de procedimentos hospitalares invasivos como a

utilização de sondas, cateter, hemodiálise, e especialmente devido ao aumento da população

imunodeprimida (BOO et al., 2005; DI SANTO, 2010). Neste grupo estão os pacientes

portadores de doenças como o HIV, neoplasia, diabetes mellitus, Hodgkin, sarcoidose, lúpus

eritematoso sistêmico e pacientes submetidos a transplantes e/ou em uso de fármacos

imunossupressores (CHAYAKULKEEREE; PERFECT, 2006; DADACHOVA;

CASADEVALL, 2011).

Este cenário favoreceu o aumento do número de pacientes com infecções provocadas por

fungos do complexo C. neoformans e consequentemente o aumento da utilização de antifúngicos

no tratamento da doença, principalmente anfotericina B e fluconazol que são responsáveis por

efeitos colaterais, citotoxicidade e seleção de cepas resistentes (AMICHAI; GRUNWALD, 1998;

SRINIVASAN; LOPEZ-RIBOT; RAMASUBRAMANIAN, 2014). Os óleos essenciais obtidos

de plantas aromáticas, constituídos por substâncias como, por exemplo, terpenos, monoterpenos

e fenilpropanos tem se destacado na pesquisa por novos compostos ativos com atividade

antimicrobiana (BAKKALI et al., 2008).

Este estudo foi fundamentado na necessidade de desenvolver novos fármacos com

atividade antifúngica sobre o agente causador da criptococose visando principalmente diminuir

os efeitos tóxicos nos pacientes e minimizar a seleção de agentes resistentes. Desta maneira,

optamos por avaliar a atividade biológica dos óleos essenciais obtidos das plantas aromáticas

Cinnamomum zeylanicum, Syzygium aromaticum, Juniperus virginiana, Rosa centifolia, Illicium

verum e do eugenol sobre fungos do complexo C. neoformans.

REVISÃO DA LITERATURA

1

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Fungos do complexo Cryptococcus neoformans

C. neoformans foi primeiramente isolado em 1894 pelo biólogo italiano Francesco

Sanfelice em suco de fruta. No mesmo ano os médicos Otto Busse e Abraham Buschke isolaram

esta levedura em lesão tibiana de paciente. O nome Cryptococcus originou-se das palavras

gregas kryptos (escondido) e kokkos (fruto), sendo que a nomenclatura sofreu várias

modificações ao longo dos anos (BARNETT, 2010).

De acordo com a taxonomia atual o complexo Cryptococcus neoformans consiste de duas

espécies: C. neoformans (VUILLEMIN, 1901) e C. gattii (KWON-CHUNG et al., 2002).

Reações de aglutinação dos antígenos da cápsula polissacarídica deste fungo permitiram a

classificação em cinco sorotipos (A a D e AD), sendo C. neoformans var. grubii (sorotipo A)

(FRANZOT; SALKIN; CASADEVALL, 1999), C. neoformans var. neoformans (sorotipo D)

(KWON-CHUNG; BENNETT; RHODES, 1982), os híbridos AD (IKEDA et al., 1982) e C.

gattii (sorotipo B e C) (KWON-CHUNG et al., 2002). As duas espécies foram divididas em

genótipos através de sequenciamento multilócus de fragmentos gênicos múltiplos denominados

C. neoformans VNI, VNB, VNII, VNIII e VNIV e C. gattii VGI, VGII, VGIII e VGIV (MEYER

et al., 2009), (Figura 1).


2

Figura 1: Sorotipos e genótipos das espécies do complexo C. neoformans (CHATURVEDI V; CHATURVEDI S, 2011 adaptado)

2.1.1 Morfologia, Ciclo reprodutivo e Habitat

Fungos do complexo C. neoformans apresentam-se, na análise microscópica, como

leveduras arredondadas com ou sem brotamento, envolvidas por uma cápsula mucopolissacáride,

com diâmetro variando entre 4µm a 10µm (CASADEVALL; PERFECT, 1998). Estas leveduras

apresentam-se como colônias de cor branca a creme, brilhante, de textura mucóide, margem lisa

quando cultivadas à temperatura de 25 a 37°C, após 36 a 72 horas de incubação (MITCHELL;

PERFECT, 1995; PEDROSO; CANDIDO, 2006).


3

A multiplicação fúngica pode ocorrer através de ciclo sexuado ou assexuado. A

reprodução assexuada das espécies de C. neoformans é a mais frequente no meio ambiente e no

hospedeiro. Esta divisão mitótica (brotamento) dá origem a duas células independentes

promovendo um rápido aumento no número de leveduras (LIN; HEITMAN, 2006; LIN, 2009).

As espécies sexuadas, caracterizadas pela presença de filamentos, correspondem a

Filobasidiella neoformans e Filobasidiella bacillispora, nas quais evidenciam tipos sexuais ou

mating types a e α (KWON-CHUNG, 1975; KWON-CHUNG, 1976a). O desenvolvimento

sexuado destes fungos ocorre através de processos denominados de mating, frutificação

monocariótica (LIN; HEITMAN, 2006).

O processo de mating ocorre através da fusão de duas células haploides de tipos sexuais

diferentes, mating type a (MATa) e mating type α (MATα), que se mantidas a 25°C, dão origem

a um único filamento com núcleos distintos. Em resposta a sinais de ferormônios, este filamento

dicariótico dá origem a uma estrutura denominada basídio. Fusão nuclear, meiose e mitose

ocorrem no basídio, produzindo esporos haploides a e α (basidiósporos), que são responsáveis

pela formação de longas cadeias no topo dos mesmos (HULL; HEITMAN, 2002; KWON-

CHUNG, 1976a; KWON-CHUNG, 1976b).

A frutificação monocariótica ocorre quando células de um mesmo mating type se

desenvolvem em condições nutricionais escassas e em ambientes secos. A célula haploide,

normalmente a MATα, dá origem a filamentos monocarióticos com células de conexão separadas

e basídio com esporos haploides em seu topo (HULL; HEITMAN, 2002; WICKES et al., 1996).

C. neoformans é um fungo de distribuição mundial sendo isolado de fontes ambientais

como, ar, solo, madeira e principalmente excretas de aves, as quais se destacam os pombos

(KOZUBOWSKI; HEITMAN, 2012). O nicho ecológico de C. gattii tem sido relacionado à

madeira em decomposição, frutos, vegetais e ocos de árvores (BARNETT, 2010; LIN;

HEITMAN, 2006). C. gattii foi isolado no meio ambiente pela primeira vez em amostras de

árvores Eucalyptus camaldulensis (ELLIS; PFEIFFER, 1990) e, até o momento, mais de 50

espécies de plantas foram descritas como reservatórios deste fungo que também pode ser

encontrado no ar, solo e água (KIDD et al., 2007; SPRINGER; CHATURVEDI, 2010).

Dificilmente C. gattii é encontrado em excretas de pombos, pois já se comprovou sua

incapacidade de completar o seu ciclo de vida sexuado (reprodução mating type) neste tipo de

matéria orgânica, não sendo este o ambiente de escolha para o seu desenvolvimento. Esta


4

incapacidade reprodutiva ocorreria devido à falta de nutrientes necessários, principalmente

fontes de carbono. Isto explicaria o porquê de C. neoformans ser cosmopolita (pois pode ser

transportado através dos pombos) e de C. gattii ter predileção por regiões tropicais e subtropicais

(NIELSEN; OBALDIA; HEITMAN, 2007).

2.1.2 Fatores de Virulência

A viabilidade de C. neoformans no meio ambiente e dentro do hospedeiro é favorecida

por condições intrínsecas ao fungo, denominadas fatores de virulência. Entre os principais,

observa-se a capacidade de crescimento a 37°C, a formação da cápsula mucopolissacáride,

melanina e a capacidade de produzir enzimas como urease, fosfolipase e proteinase. Após a

inalação das partículas infectantes, estes fatores contribuem para a proliferação fúngica e defesa

sobre a resposta imunológica do hospedeiro (COELHO; BOCCA; CASADEVALL, 2014;

STEENBERGEN; CASADEVALL, 2003).

Estima-se que mais de um milhão de espécies pertencem ao reino Fungi (LIN, 2009),

porém, poucas são capazes de sobreviver à temperatura do hospedeiro (37°C) (PERFECT, 2005).

Pesquisas moleculares demonstram que a presença de determinados genes são decisivos para o

desenvolvimento da termotolerância. O primeiro estudo molecular demonstrou que fungos com

ausência do gene CNA1 não conseguiam crescer em altas temperaturas. O CNA1 codifica a

subunidade catalítica A da calcineurina, enzima ativada por cálcio e calmodulina, e participa da

adaptação fúngica a diferentes tipos de estresses, incluindo a adaptação ao aumento da

temperatura (ODOM et al., 1997). Chen et al. (2013) demonstraram que C. gattii necessita da

calcineurina para crescimento na temperatura do hospedeiro. Outros genes, como por exemplo,

VPH1, CCN1, RAS1, CNB1 e MPK1 também estão associados com a termotolerância de fungos

do complexo C. neoformans (PERFECT, 2005).

A cápsula dos fungos do complexo C. neoformans é composta principalmente de dois

polissacárides: glucuronoxilomanana (GXM) e galactoxilomanana (GalXM) e em menor

proporção por manoproteínas (TURNER; CHERNIAK; REISS, 1984; O’MEARA;

ALSPAUGH, 2012). A GXM, constitui 90 a 95% da massa capsular, a GalXM

aproximadamente 5% e as manoproteínas menos de 1% (ZARAGOZA et al., 2009). A cápsula,

além de desempenhar papel estrutural, possui propriedade imunomodulatória (MONARI;


5

BISTONI; VECCHIARELLI, 2006), uma vez que a GXM interage com os neutrófilos

promovendo a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL8) e fator de necrose tumoral α

(RETINI et al., 1996), servindo também como iniciador da ativação da via alternativa do

complemento (KOZEL; WILSON; MURPHY, 1991). A GXM favorece a sobrevivência fúngica

dentro do hospedeiro, através da capacidade de evasão ao ataque do sistema imune, por exemplo,

inibindo a migração dos neutrófilos para focos infecciosos ou inflamatórios (MONARI;

BISTONI; VECCHIARELLI, 2006).

A virulência capsular também está relacionada com a capacidade de interferir na

fagocitose in vitro pela inibição de ligantes na parede celular fúngica (SHOHAM; LEVITZ,

2005). Após o englobamento do fungo pelos fagócitos, ocorre a expansão da cápsula de C.

neoformans, promovendo a diluição do conteúdo lisossomal e o aumento do tamanho dos

fagossomas favorecendo a separação física da superfície fúngica com a membrana fagossomal

que libera substâncias microbicidas (TUCKER; CASADEVALL, 2002). C. neoformans é capaz

de reproduzir-se no interior do macrófago e liberar polissacárides capsulares dentro de vesículas

que serão acumuladas no citoplasma celular até promover a lise do macrófago e a liberação das

mesmas (FELDMESSER et al., 2000; TUCKER; CASADEVALL, 2002) .

A melanina, presente em vários microrganismos incluindo C. neoformans, é um pigmento

de alto peso molecular formada através da polimerização oxidativa de compostos fenólicos,

sendo a reação catalisada pela enzima lacase (JACOBSON, 2000). A sobrevivencia fúngica no

meio ambiente é favorecida pela presença da melanina devido a sua capacidade de resistência a

luz ultravioleta e a temperaturas extremas (CASADEVALL; ROSAS; NOSANCHUK, 2000). A

sua contribuição para a virulência fúngica está relacionada com o aumento da resistência aos

mecanismos de defesa do hospedeiro (NOSANCHUK; CASADEVALL, 2003). Experimentos

in vitro com C. neoformans demonstraram, ao avaliar os fármacos anfotericina B, caspofungina,

fluconazol, itraconazol e 5-fluorocitosina, que as células melanizadas foram menos suscetíveis a

anfotericina B e caspofungina devido à ligação do fármaco com a melanina evitando com que

este alcançasse seu sítio ativo (DUIN; CASADEVALL; NOSANCHUK, 2002; IKEDA et al.,

2003). Em 2012, esta resistência das células melanizadas de C. neoformans à anfotericina B

também foi relatada por Fernandes et al.

Os fungos do complexo C. neoformans secretam enzimas como a urease, fosfolipase e

proteinase que são frequentemente associadas com sua capacidade de virulência (GHANNOUM,


6

2000; STEENBERGEN; CASADEVALL, 2003). A urease é capaz de degradar a uréia em

amônia e carbamato, fornecendo fontes de nitrogênio, além de contribuir para a invasão cerebral

por favorecer a passagem fúngica por barreiras epiteliais (OLSZEWSKI et al., 2004; SINGH et

al., 2013). C. neoformans não produtores de urease têm sido isolados de espécimes clínicos,

sugerindo que a presença desta enzima não é essencial para o desenvolvimento da doença, se

outros fatores de virulência estiverem envolvidos (VARMA et al., 2006). As fosfolipases são

enzimas que hidrolisam as ligações ésteres de fosfolipídeos, presentes na membrana celular do

hospedeiro, promovendo a desestabilização e consequentemente a lise (GHANNOUM, 2000).

As proteinases são responsáveis pela hidrólise das proteínas do hospedeiro, tais como o

colágeno, fibrinogênio, elastina, imunoglobulinas e componentes do complemento o que

promove danos teciduais e o comprometimento do sistema de defesa (CHEN; BLANK;

CASADEVALL, 1996; STEENBERG; CASADEVALL, 2003).


7

2.2. Criptococose

A criptococose que tem como agente etiológico leveduras encapsuladas classificadas no

complexo Cryptococcus neoformans, tornou-se uma das mais importantes infecções

oportunísticas, representando uma das principais causas de morte em pacientes com baixa

contagem de células CD4, decorrente da imunodepressão provocada pelo HIV

(CHAYAKULKEEREE; PERFECT, 2006; CROWE et al., 1991). Países desenvolvidos

apresentam uma diminuição dos casos desta enfermidade fúngica pela facilidade de acesso ao

atendimento médico e início da terapia antirretrovial (TARV). Ao contrário, em regiões que

apresentam escassa assistência à saúde, a incidência da doença e mortalidade ainda são altas

(MIRZA et al., 2003). No Brasil a criptococose apresenta alta prevalência, principalmente nos

pacientes HIV positivos (PAPPALARDO; MELHEM, 2003), sendo considerada como um

problema de saúde pública (DEL POETA; CASADEVALL, 2012).

2.2.1. Epidemiologia das espécies do complexo C. neoformans

Fungos do complexo C. neoformans são responsáveis por aproximadamente um milhão

de novos casos de meningite fúngica por ano em pacientes HIV positivos, resultando em cerca de

625.000 mortes anuais. A média estimada de novos casos anuais é de 70.000 nas Américas

(Norte e Sul) e Caribe; 720.000 na África subsaariana; 6.500 no norte da África e Oriente Médio;

27.700 na Europa e Ásia Central e 133.600 nas regiões Leste, Sul e Sudeste da Ásia (PARK et

al., 2009).

C. neoformans var. grubii encontra-se distribuído mundialmente sendo a principal causa

de infecções fúngicas em pacientes HIV positivos. C. neoformans var. neoformans é encontrado

com maior frequência em países europeus (MITCHELL; PERFECT, 1995; KWON-CHUNG;

BENNETT, 1984). C. gattii é prevalente em regiões tropicais e subtropicais onde acomete

principalmente indivíduos imunocompetentes. Nos últimos anos, o isolamento de C. gattii foi

descrito na Ásia, África, Austrália, nas Américas (Sul, Central e Norte) e alguns países europeus

como França, Alemanha e Àustria (SORREL, 2001; VIVIANI et al., 2006).

C. gattii recebeu atenção mundial devido a um surto, iniciado em 1999 na Ilha de

Vancouver (Província Colúmbia Britânica-Canadá), provavelmente desencadeado por uma

propagação fúngica, associada a um ambiente climático favorável ao desenvolvimento deste


8

microrganismo (CHATURVEDI V; CHATURVEDI S, 2011; MAK et al., 2010). Até o ano de

2007, 218 casos de criptococose por C. gattii foram identificados na Colúmbia Britânica,

apresentando taxa de mortalidade de 8,7% e incidência anual de 5,8 casos por milhão de

residentes, o que motivou novas condutas de saúde pública, como planejamento de estratégias

para prevenir e controlar a doença nesta região (GALANIS; MACDOUGALL, 2010). C. gattii

continua se propagando pelo noroeste do Pacífico e pela costa ocidental, zona próxima ao

Canadá, emergindo como principal patógeno na região noroeste dos Estados Unidos (BYRNES

et al., 2010; DATTA et al., 2009).

A análise de 467 isolados, clínicos e ambientais, de fungos do complexo C. neoformans

obtidos de diversas regiões brasileiras mostrou o predomínio do sorotipo A nas regiões Norte,

Centro-Oeste, Sul e Sudeste, e predomínio do sorotipo B na região Nordeste (NISHIKAWA et

al., 2003). Em um hospital de referência, para pacientes portadores de HIV da cidade de Goiânia-

GO, Souza et al. (2013) verificaram, entre 2009 e 2010, que 93,5% dos isolados pertenciam ao

sorotipo A (C. neoformans var. grubii).

As Figuras 2 e 3 publicadas pelo Ministério da Saúde (MS) em 2012 mostram alguns

dados importantes no Brasil.

Figura 2: Número de internações por micoses sistêmicas durante os anos de 2000 a 2007, onde PCM= Paracoccidioidomicose, Histo= Histoplasmose, Cripto= Criptococose e Cocci= Coccidioidomicose (MS-Vigilância da criptococose- Brasília-DF Abril de 2012).

De acordo com a Figura 2, no ano de 2000 o agente responsável pelo maior número de

internações hospitalares foi Paracoccidioides seguido por Cryptococcus. De 2001 a 2007,

Cryptoccocus foi o principal responsável pelas internações, sendo que nos dois primeiros anos

houve um significativo aumento de 189 para 669.


9

Figura 3: Número de internações por criptococose de acordo com as regiões brasileiras, durante os anos de 2000 a 2007 (MS-Vigilância da criptococose- Brasília-DF Abril de 2012)

A região Sudeste foi a região com maior número de internações causadas por

Cryptococcus, durante os anos de 2000 a 2007 (Figura 3).

2.2.2. Patogenia do fungo

Como nas demais doenças fúngicas sistêmicas, a via inalatória é a principal porta de

entrada de Cryptococcus, a partir de fonte de contágio ambiental das partículas infectantes, que

são pequenas leveduras desidratadas ou basidiósporos (DEL POETA; CASADEVALL, 2012;

GILES et al. 2009; VELAGAPUDI et al. 2009). A criptococose pode acometer humanos (LIN;

HEITMAN, 2006) e animais como gatos, cães (FAGGI et al., 1993) koalas

(KROCKENBERGER; CANFIELD; MALIK, 2003) e cabras (BARÓ et al., 1998) sendo que a

transmissão de animais para humanos ou inter-humanos não foi descrita (LIN; HEITMAN,

2006) . Após a inalação, o fungo pode permanecer localizado nos pulmões ou disseminar via

hematogênica para outros órgãos como fígado (NARA et al., 2008), trato urinário (SOBEL;

VAZQUEZ, 1999), ossos (NOCERA et al., 2010), olhos (SEATON et al., 1997), articulações

(KOHLI, HADLEY, 2005) além de apresentar um acentuado tropismo para o sistema nervoso

central (SNC) como demonstrado na Figura 4 (CHAYAKULKEEREE; PERFECT, 2006;

PERFECT; CASADEVALL, 2002).


10

Figura 4: Via de penetração e ciclo de infecção de C. neoformans (Adaptado de HULL; HEITMAN, 2002).

A presença de C. neoformans no SNC é favorecida pela concentração de nutrientes

assimiláveis como tiamina, ácido glutâmico, glutamina, dopamina, carboidratos e minerais, pela

falta de atividade do sistema complemento e pela presença de receptores específicos nas células

neurais, favorecendo a sobrevivência e proliferação fúngica (LIN; HEITMAN, 2006). A

passagem destes fungos pela barreira hematocefálica provavelmente ocorre por penetração

transcelular microvascular por células endoteliais (CHANG et al., 2004). Esta passagem poderia

ser feita de maneira independente pelo fungo ou dentro de um macrófago, mecanismo conhecido

como “Cavalo de Tróia”, entrando nos espaços de Virchow-Robin e/ou espaços subaracnóides

presentes nas meninges localizados entre aracnóide e pia-máter, provocando assim a meningite

criptocócica (DEL POETA; CASADEVALL, 2012). Recentemente, foi identificada uma

proteína extracelular (Mpr1) localizada na superfície de C. neoformans, que mostrou-se

necessária para o estabelecimento da doença no SNC, onde favoreceria a migração transcelular

do fungo, promovendo os processos de adesão, invasão, transmigração ou extrusão do endotélio

cerebral (CHEN et al., 2003; VU et al., 2014).

Inalação de partículas

infectantes

Eucalípto Fezes de

pombo

Disseminação para

Sistema nervoso

Trato

respiratório

Alojamento nos

alvéolos

Cultura

positiva


11

2.2.3. Manifestações clínicas

As manifestações clínicas relacionam-se diretamente com a quantidade de partículas

fúngicas inaladas, virulência do fungo e estado imunológico do hospedeiro (MITCHELL;

PERFECT, 1995). Na criptococose pulmonar os pacientes podem apresentar febre, dor de

cabeça, suores noturnos, fatiga, perda do apetite e consequentemente perda de peso, dispneia,

tosse produtiva com ou sem hemoptise e dores no peito (NADROUS et al., 2003). Na lesão

pulmonar primária detecta-se a presença de nódulos isolados ou agrupados e, em alguns casos,

infiltrado pulmonar afetando os alvéolos (SUBRAMANIAN; MATHAI, 2005).

Na meningite criptocócica, sintomas como dor de cabeça, febre, dor na nuca e confusão

mental são relatados com frequência (SUBRAMANIAN; MATAI, 2005). Complicações como

perda visual e auditiva podem ocorrer devido ao aumento da pressão intracraniana (SATISH et.

al., 2006). Pseudocistos mucinosos, dilatação do espaço perivascular, criptococoma, expansão do

plexo coróide e hidrocefalia são características das lesões no interior da cavidade craniana

(HOSPENTHAL; BENNETT, 2000). A evolução da doença pode levar o indivíduo ao coma e

óbito (PARK et al., 2009).

O aparecimento de lesões na pele e tecidos moles causadas por este fungo ocorre

principalmente em pacientes imunodreprimidos, apresentando-se como lesões ulceradas,

abscessos, celulites, granulomas (CHAYAKULKEEREE; PERFECT, 2006) ou nódulos

edematosos associados a quadro febril (BOSWELL et al., 2008).

Apesar de todos estes sintomas e manifestações clínicas presentes em pacientes com

criptococose, faz-se necessário a confirmação da presença de C. neoformans, para o diagnóstico

diferencial de doenças causadas por outros microrganismos e/ou neoplasias, evitando-se assim

tratamentos errôneos, intervenções inadequadas, despesas desnecessárias e o risco do

desenvolvimento de uma doença fatal para o paciente (SANTOS et al., 2004).


12

2.2.4. Diagnóstico laboratorial

O diagnóstico microbiológico de C. neoformans inclui a pesquisa no líquor, urina,

sangue, fragmentos de tecido, aspirado de lesões cutâneas, escarro e outras amostras do trato

respiratório, através de técnicas de cultura, exame histopatológico, exame microscópico direto,

sorologia e técnicas moleculares (ANTINORI, 2013; CHAYAKULKEEREE; PERFECT, 2006).

O cultivo da amostra é realizado em ágar Sabouraud-dextrose que permite o crescimento

de colônias com aspecto mucóide e de coloração creme, após 48 a 72 horas de incubação em

temperaturas que podem variar de 25 a 37°C em aerobiose (CHAYAKULKEEREE; PERFECT,

2006; PEDROSO; CANDIDO, 2006). O meio diferencial contento composto fenólico, ágar L-

diidroxifenilalanina (L-Dopa), também pode ser utilizado. Este meio favorece a ação da enzima

fúngica fenol-oxidase (lacase), com síntese de melanina através de processo oxidativo,

resultando no crescimento de colônias com coloração escura (KWON-CHUNG; TOM; COSTA,

1983; PEDROSO; CANDIDO, 2006). O ágar canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) é

utilizado para a diferenciação de espécie, sendo que somente C. gattii consegue crescer na

presença da canavanina e utilizar a glicina como fonte de carbono e nitrogênio, promovendo a

mudança de cor do meio de cultura verde/amarelo para azul devido a alcalinização do pH do

mesmo (KLEIN et al., 2009; KWON-CHUNG; POLACHECK; BENNETT, 1982).

A identificação de C. neoformans em biópsias é realizada por técnicas histoquímicas,

onde se pesquisa os elementos fúngicos corando a parede celular, como Gomori Grocott (GMS)

e Fontana-Masson e técnicas como Mucicarmim de Meyer (MM) que diferenciam Cryptococcus

de outros fungos através da coloração da cápsula. A Hematoxilina-eosina (HE), embora não seja

capaz de evidenciar estruturas fúngicas, possibilita a visualização da reação tecidual (GAZZONI;

PEGAS; SEVERO, 2008; KWON-CHUNG; HILL; BENNETT, 1981).

O exame microscópico direto é feito utilizando-se a tinta da China, também conhecida

como tinta nanquim (MITCHELL; PERFECT, 1995) que permite a visualização da cápsula

polissacarídica, inclusões citoplasmáticas e leveduras em brotamento (Figura 5).


13

Figura 5: Exame direto utilizando o corante tinta da China evidenciando a cápsula fúngica (ANVISA 2013). Entre os testes sorológicos, o mais comumente empregado é a aglutinação em látex que

consiste na utilização de partículas sensibilizadas com anticorpos que se ligam aos antígenos

capsulares de C. neoformans, quando presentes no soro (YEO; WONG, 2002). Estes testes

normalmente requerem um tratamento ou diluição prévia da amostra para evitar resultados falso-

positivos causados por componentes presentes na amostra, como por exemplo, o fator

reumatóide, e resultados falso negativos como os causados pelo excesso de anticorpos (efeito

prozona) (HAMILTON et al., 1991). Os ensaios imunoenzimáticos (EIE) são utilizados para a

detecção de antígenos ou anticorpos na amostra, com a vantagem de não necessitarem

tratamentos prévios sobre possíveis interferentes (PEDROSO; CANDIDO, 2006; YEO; WONG,

2002).

Técnicas moleculares como a hibridização e reação em cadeia da polimerase (PCR)

apresentam alta sensibilidade e especificidade na detecção fúngica, constituindo ferramentas

úteis com finalidades epidemiológicas, como por exemplo, na definição e monitoramento de

genótipos de uma determinada região geográfica (SIDRIM et al., 2010).

O correto diagnóstico, auxiliado pelas metodologias descritas, é essencial para a escolha

da terapia, visto que, quanto mais precoce for o início do tratamento diminui-se a probabilidade

de disseminação do fungo, incluindo invasão do SNC, aumentando as chances de cura sem

sequelas para o paciente.


14

2.2.5. Tratamento da criptococose

No tratamento da criptococose, de acordo com o Guidelines da Sociedade Americana de

Doenças Infecciosas (IDSA), os principais antifúngicos utilizados são a anfotericina B,

fluconazol, fluocitosina e itraconazol, sendo que a escolha do antifúngico vai depender do local

da infecção, gravidade da doença e do estado imunológico do paciente (PERFECT et al., 2010;

SAAG et al., 2000).

O tratamento atual da meningite criptocócica é baseado em três fases distintas: terapia de

indução, consolidação e manutenção. A fase de indução tem por objetivo alcançar uma rápida

atividade fungicida, para obter a esterilidade do líquido cefalorraquidiano (LCR), sendo a

anfotericina B isolada ou em associação com a fluocitosina ou fluconazol, o fármaco mais

utilizado por um período de duas semanas. Na fase de consolidação, com duração de oito

semanas, recomenda-se o uso oral de fluconazol que também é utilizado na fase de manutenção,

que pode durar de 12 a 24 meses, cujo principal objetivo é evitar recidivas (WHO 2011). Em

pacientes imunocompetentes o esquema terapêutico desta meningite segue o mesmo padrão dos

pacientes imunodeprimidos, porém alterações na duração do tratamento podem ocorrer

(PERFECT et al., 2010).

A anfotericina B, sintetizada por Streptomyces nodosus, é um fármaco poliênico que tem

sido amplamente utilizado no tratamento de doenças fúngicas sistêmicas (ELLIS, 2002). Este

medicamento apresenta baixa solubilidade na maioria dos solventes e possui diferentes veículos

como encapsulamento de base lipossômica, formação de complexos lipídicos e dispersões

coloidais para sua administração (FILIPPIN; SOUZA, 2006). Seu mecanismo de ação é baseado

na ligação ao ergosterol presente na membrana celular fúngica, formando poros que permitem a

saída de conteúdo citoplasmático, como pequenos íons e metabólitos, principalmente íons

potássio, provocando a morte do fungo (BOLARD; JOLY; YENI, 1993; ODDS; BROWN;

GOW, 2003).

Apesar de sua comprovada eficácia, pacientes em uso de anfotericina B podem ter o

tratamento interrompido, mesmo na presença de infecção fúngica grave, devido à toxicidade

(LANIADO-LABORÍN; CABRALES-VARGAS, 2009). É comum o relato de efeitos colaterais

como: nefrotoxicidade, incluindo a insuficiência renal aguda (DERAY, 2002) e sintomas


15

relacionados com a infusão do fármaco como calafrios, febre, rubor, urticaria e falta de ar

(NUCCI et al., 1999; WALSH et al., 1998). Sintomas cardíacos como arritmia e falência súbita

(GROOT et al., 2008; NIX, 2014), além de efeitos tóxicos na medula óssea, como anemia,

também são relatados (YEO et al., 2006). Algumas dosagens laboratoriais podem revelar

alterações, como por exemplo, diminuição dos níveis séricos de potássio e cálcio, aumento de

creatinina, fosfatase alcalina, transaminase glutâmico-oxalacética (TGO), transaminase

glutâmico-pirúvica (TGP) e bilirrubina no soro (MORA-DUARTE et al., 2002). Em pacientes

recebendo terapia com anfotericina B, deve ser realizada a prevenção, monitoramento e manejo

da toxicidade causada por este fármaco. Recomenda-se hidratação preventiva e suplementação

eletrolítica, monitoração dos níveis séricos de potássio, creatinina e hemoglobina (WORLD

HEALTH ORGANIZATION-WHO 2011).

Fluconazol e intraconazol, antifúngicos triazólicos de amplo espectro, promovem a

inibição da enzima fúngica lanosterol 14α-demetilase (MAERTENS, 2004). Esta é uma enzima

do citocromo P450, que é codificado pelo gene ERG11, envolvida na síntese do ergosterol, o

principal componente da membrana plasmática fúngica (ODDS; BROWN; GOW, 2003). A

diminuição da síntese do ergosterol, causada por estes medicamentos, promove alterações na

fluidez da membrana e consequentemente inibição do crescimento e reprodução do fungo. O

fluconazol, derivado de compostos sintéticos, começou a ser utilizado em 1990 e apresenta uma

boa atividade no combate à candidíase, meningite por Cryptococcus, coccidioidomicose, porém

apresenta poucos resultados sobre fungos filamentosos (MAERTENS, 2004). O itraconazol,

utilizado desde 1992, ao contrário do fluconazol, é eficaz no tratamento da aspergilose e

esporotricose, porém é mais tóxico para o paciente (ESPINEL-INGROFF; SHADOMY;

GEBHART, 1984; VANDEPUTTE; FERRARI; COSTE, 2012).

Os efeitos colaterais atribuídos ao uso destes azólicos englobam problemas

gastrointestinais como náuseas, vômitos, dores abdominais e diarreia (ZERVOS; MEUNIER,

1993), problemas hepáticos como icterícia severa e necrose hepática aguda (GUILLAUME; DE

PREZ; COGAN, 1996) e alterações hematológicas como trombocitopenia e granulocitopenia

(PASIKHOVA; LUDLOW, 2014). Outros sintomas como dor de cabeça, tontura (ZERVOS;

MEUNIER, 1993), pruridos, exantemas (AMICHAI; GRUNWALD, 1998), reações alérgicas

(KESHRI et al., 2014), hipocalcemia e alterações endócrinas são relatados (LIONAKIS;

SAMONIS; KONTOYIANNIS, 2008).


16

Fluocitosina, classificada no grupo das fluoropirimidinas, é um antifúngico utilizado

principalmente em associação com outros fármacos devido à probabilidade do desenvolvimento

de resistência. Quando no interior da célula fúngica, a fluocitosina é convertida em 5-fluorouracil

que, por sua vez, inibe a ação da enzima timidilato sintetase e consequentemente a síntese de

DNA. Este antifúngico mostra-se mais eficaz em leveduras por estas possuírem uma enzima,

citosina permease, que facilita a entrada do fármaco no interior do fungo (ODDS; BROWN;

GOW, 2003).

A utilização dos antifúngicos por tempos prolongados tem crescido nos últimos anos

devido ao aumento do número de infecções fúngicas graves relatadas, principalmente nos

pacientes imunodeprimidos, favorecendo o aparecimento de isolados resistentes (REX et al.,

2001; STOPPA et al., 2009).

2.2.6. Resistência medicamentosa

A resistência medicamentosa é um processo no qual a concentração terapêutica do

fármaco utilizado no tratamento não é mais capaz de inibir o crescimento fúngico. Os

mecanismos de resistência mais comumente relatados estão relacionados com a saída do fármaco

do interior celular (efluxo), alterações fenotípicas nos sítios alvos dos fármacos, recombinações

genômicas fúngicas e a presença de biofilme (SRINIVASAN; LOPEZ-RIBOT;

RAMASUBRAMANIAN, 2014).

A resistência fúngica aos poliênicos, embora menos frequente do que a relatada nos

azólicos, pode estar relacionada com a variação da quantidade de ergosterol e seus precursores

presente na membrana de C. neoformans. Outra possibilidade seria a ocorrência de alterações na

síntese de proteínas e enzimas que teriam a capacidade de degradar o antifúngico (FILIPPIN;

SOUZA, 2006).

O uso constante de azólicos como fluconazol e itraconazol, tem levado ao aparecimento

de cepas resistentes e como consequência, falência terapêutica (SANGLARD, 2002). Dentre os

prováveis fatores responsáveis pela resistência, podemos citar a presença de transportadores que

promovem a saída do mesmo (efluxo) levando a um baixo nível de acúmulo do fármaco no

interior da célula fúngica (SANGLARD; BILLE, 2002); mutações no gene ERG11 que

provocam mudanças na estrutura fúngica levando a diminuição da afinidade de ligação com os

compostos azólicos; alterações de enzimas específicas envolvidas nas vias de biossíntese do


17

ergosterol (SANGLARD, 2002). A formação de matriz extracelular constitui uma barreira física,

impedindo a eficaz entrada do fármaco na célula fúngica (RAMAGE et al., 2012). Terapias

prolongadas provavelmente levariam ao desenvolvimento de isolados fúngicos resistentes, uma

vez que quando comparados os resultados de CIM obtidos de C. neoformans de isolados clínicos

de pacientes HIV positivos e de isolados do meio ambiente, comprovou-se uma diminuição na

suscetibilidade nos pacientes submetidos ao tratamento com fluconazol (ALVES et al., 2001).

A alta prevalência de infecções fúngicas graves (VANDEPUTTE; FERRARI; COSTE,

2012), os efeitos colaterais, a citotoxicidade (AMICHAI; GRUNWALD, 1998) e o aumento do

número de isolados resistentes (SRINIVASAN; LOPEZ-RIBOT; RAMASUBRAMANIAN,

2014), provocados pela utilização dos medicamentos atualmente disponíveis, ressaltam a

necessidade de se buscar agentes antimicrobianos mais eficazes e menos tóxicos para o

desenvolvimento de estratégias terapêuticas alternativas (LIN, 2009). Diante disso, torna-se de

grande importância estudos e investigações multidisciplinares, focados na avaliação da atividade

antifúngica de extratos e óleos essenciais de plantas, que podem servir para a seleção de

compostos naturais com potencial para a elaboração de novos fármacos (VIOLANTE et al.,

2012).

2.3. Plantas Medicinais e Óleos Essenciais

Desde tempos remotos, a utilização de vegetais tem proporcionado grandes contribuições

na prevenção, tratamento e até mesmo na cura de algumas enfermidades (VILA; FREIXA;

CAÑIGUERAL, 2013). O estudo das plantas e de seus metabólitos, principalmente os

secundários, conhecidos por participarem do processo de adaptação do vegetal ao meio

ambiente, tem favorecido a produção de fármacos cujos princípios ativos foram isolados de

produtos naturais ou semissintéticos (BRANDÃO et al., 2010; GURIB-FAKIM, 2006;

PEREIRA; CARDOSO, 2012). No Brasil, estes estudos são beneficiados por se tratar de um país

rico em biodiversidade, fazendo parte desta, cerca de 60 mil espécies vegetais (COSTA-

LOTUFO et al., 2010; ELISABETSKY; COSTA-CAMPOS, 1996).

Os óleos essenciais (OEs), classificados como metabólitos secundários, são compostos

líquidos voláteis, de baixa solubilidade em água, fotossensíveis, odor característico e, na maioria

das vezes, são incolores ou amarelo claro (KALEMBA; KUNICKA, 2003; BAKKALI et al.,


18

2008). A produção de óleos pode ocorrer em diferentes partes da planta como folhas, flores e

caule e o armazenamento ocorre em estruturas como canais, cavidades e células excretoras do

vegetal (BURT, 2004; BAKKALI et al., 2008).

Os OEs podem ser utilizados na fabricação de perfumes, produtos sanitários, na culinária

e, por apresentararem propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes e anticancerígenas são

utilizados também na área farmacêutica; apresentam atividade biocida sobre organismos como

bactérias, fungos, vírus, protozoários, insetos e plantas (IBRAHIM et al., 2001; KALEMBA;

KUNICKA, 2003; BAKKALI et al., 2008; RAUT; KARUPPAYIL, 2014).

Os principais constituintes dos OEs são os terpenos cuja composição química é composta

de hidrocarbonetos formados por isoprenos (C5H8), principalmente os monoterpenos (C10H16)

e sesquiterpenos (C15H24); terpenóides, que são terpenos associados ao oxigênio; e em menores

concentrações os compostos aromáticos, caracterizados pela presença de anel benzênico e os

compostos alifáticos onde este anel não é observado (BAKKALI et al., 2008). Esta composição

química varia de acordo com a espécie da planta, parte do vegetal utilizada (folha, caule, etc),

estágio de desenvolvimento, condições climáticas, localização geográfica da planta,

disponibilidade de nutrientes, técnicas de extração e armazenamento da mesma (COWAN 1999;

KALEMBA; KUNICKA, 2003).

Técnicas como destilação por arraste com vapor de água, extração com solventes

voláteis, extração com fluídos supercríticos, extração assistida por micro-ondas e por

“headspace” são utilizadas na extração dos OEs (RUBIOLO et al., 2010). Devido à volatilidade

e polaridade dos componentes analisados, a técnica de escolha para a análise da composição do

OE tem sido a cromatografia gasosa capilar (CG) (RUBIOLO et al., 2010) que consiste na

separação da mistura por interação diferencial dos seus componentes dentro de colunas presentes

no cromatógrafo (MARRIOTT; SHELLIE; CORNWELL 2001). Esta metodologia é composta

por uma fase estacionária e uma fase móvel, sendo esta última também conhecida como gás de

arraste. A espectrometria de massas (MS) pode ser utilizada como complemento da

cromatografia, aumentando a capacidade analítica, por fornecer a confirmação da fórmula

molecular do componente detectado principalmente nos casos onde ocorre uma sobreposição de

picos (MARRIOTT; SHELLIE; CORNWELL 2001).

A atividade antifúngica do OE pode ser avaliada por métodos in vitro como difusão em

ágar: consiste na medição do diâmetro do halo de inibição formado na placa de Petri contendo


19

meio de cultura sólido, microrganismo inoculado mais o OE distribuído em discos de papel ou

dentro de poços feitos no meio (SCORZONI et al., 2007); ensaios de diluição como macro e

microdiluição: os OEs são adicionados em meio de cultura líquido previamente inoculado com o

fungo e após o período de incubação a CIM é determinada por leitura visual ou por turbidimetria

(KALEMBA; KUNICKA, 2003). Alguns fatores podem influenciar nesta avaliação, como por

exemplo, tempo de incubação, volatilidade, condições de extração e armazenamento do óleo

(NASCIMENTO et al., 2007).

O Laboratório de Micologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP)

da Universidade Federal do estado de Goiás (UFG) tem conduzido estudos com componentes

naturais de plantas, com o objetivo de encontrar compostos que possam ser utilizados na

produção de novos fármacos. Alguns dos trabalhos realizados neste laboratório são apresentados

na Tabela 1.

Tabela 1: Plantas e/ou extratos com atividade antifúngica avaliadas no Laboratório de Micologia do IPTSP-UFG.

Planta/Extrato Fungo Resultado Autor/Ano Caryocar brasiliensis C. neoformans Cera epicuticular de

C. brasiliensis: CIM ≤ 250 µg/mL PASSOS et al., 2002

Hyptis ovalifolia, H. suaveolens, H. saxatilis, Hyptidendrum canum, Eugenia uniflora, E. dysenterica, Caryocar brasiliensis Lafoensia pacari

T. rubrum, T. mentagrophytes,

M. canis e M. gypseum

H. ovalifolia: CIM de 15.6 a 1000 µg/mL E. uniflora: CIM de 500 e 1000 µg/mL.

SOUZA et al., 2002

Ocimum gratissimum C. neoformans Fração clorofórmica: CIM de 62,5 a 125 µg/mL Eugenol: CIM de 0.9 a 250 µg/mL

LEMOS et al., 2005

Pimenta pseudocaryohyllus

C. neoformans Isolados de C. neoformans não- melanizados e melanizados com CIM de 64 a 256 µg/mL.

FERNANDES et al., 2012

Hymenaea courbaril C. neoformans, T. rubrum,

T. mentagrophytes, T. tonsurans e M. gypseum

Seiva fresca de H. courbaril: CIM < 256 µg/mL Fisetina: CIM < 128 µg/mL

COSTA et al., 2014

Os OEs de algumas plantas tem se destacado como inibidores do crescimento in vitro de

fungos, de acordo com trabalhos, como o de Daucus carota apresentado por Tavares et al.


20

(2008), que demonstraram atividade antifúngica sobre espécies de dermatófitos e C. neoformans

com CIM de 0,16 a 0,64 µL/mL (aproximadamente 160 e 640 µg/mL) e CIM de 0,32 e 0,64

µL/mL (aproximadamente 320 e 640 µg/mL) respectivamente. Em 2006, Pawar e Taker

comprovaram que os OEs de Cinnamomum zeylanicum, Cinnamomum cassia, Syzygium

aromaticum e Cymbopogon citratus promoveram a formação de zonas de inibição com

diâmetros variando entre 21 a 50 mm sobre o crescimento de hifas e formação de esporos de

Aspergillus niger pela técnica de disco difusão. A avaliação da atividade inibitória do OE de

Amiris balsamifera sobre o crescimento de C. neoformans, realizada por Abrão et al. (2014),

demonstrou que este OE pode ser considerado na investigação de substâncias com finalidades

terapêuticas, uma vez que a CIM foi de 128 e 256 µg/mL.

Este trabalho visa avaliar a atividade dos OEs de Cinnamomum zeylanicum, Illicium

verum, Juniperus virginiana, Rosa Centifolia e Syzygium aromaticum, em isolados do complexo

C. neoformans com perspectivas de resultados promissores de futuros candidatos a compostos

alternativos sobre estes fungos.

2.3.1. Cinnamomum zeylanicum (Canela folha)

Figura 1: Representação das flores, folhas e cascas de C. zeylanicum. (www.toptropicals.com/. www.botanical.com).

Cinnamomum zeylanicum (Figura 6), pertencente à família Lauraceae, é uma planta

natural do Sri Lanka e sul da Índia popularmente conhecida como canela folha

(PARANAGAMA et al., 2001). A casca, folha, flor, fruto e raiz de C. zeylanicum são utilizados

na culinária ou como produtos terapêuticos na medicina ayurvédica além de servirem como

fontes para a extração do OE (RANASINGHE et al., 2013).

A composição química, bem como os efeitos farmacológicos do OE obtido, variam de

acordo com a parte da planta utilizada neste processo (RANASINGHE et al., 2013). Cerca de


21

82,5% da composição do OE proveniente da casca de C. zeylanicum incluem o eugenol, trans-

cinamaldeído e linalol (CHERICONI et al., 2005).

Efeitos benéficos à saúde como propriedade anti-inflamatória (GANAPATY; BEKNAL,

2005), atividade antibacteriana (GUERRA et al., 2012; MAIDMENT; DYSON; HAYSOM,

2006), antifúngica (BHATIA; SHARMA, 2012; CARMO et al., 2008), inibição da propagação

do rota-virus humano (GONÇALVES et al., 2005), atividade antioxidante (JAYAPRAKASHA

et al., 2007) e controle da glicemia em diabéticos (BANDARA; ULUWADUGE; JANSZ, 2012)

têm sido atribuídas à C. zeylanicum por meio de pesquisas in-vitro e in-vivo.

A atividade antifúngica deste OE foi descrita sobre leveduras do gênero Candida,

espécies de Aspergillus, dermatófitos e C. neoformans. Unlu et al. (2010) demonstraram que o

OE de C. zeylanicum foi capaz de inibir o crescimento de leverudas do gênero Candida. Esta

ação antifúngica também foi observada por Jantan et al. (2008) com CIMs variando entre 0,04 a

0,63 µg/µL (aproximadamente 40 a 630 µg/mL) para espécies de Candida, Aspergillus,

dermatófitos e C. neoformans.

2.3.2. Illicium verum (Anis estrelado)

Figura 2: Flores, folhas e frutos de I. verum. (www.taliaessenze.com/www.comercialemar.com.br).

Illicium verum é uma planta aromática, pertencente à família Illiciaceae, com o fruto em

formato de estrela (Figura 7), motivo pelo qual é popularmente conhecida por anis estrelado

(WANG et al., 2011). Proveniente de regiões tropicais e subtropicais asiáticas, I. verum é

tradicionalmente utilizado como especiaria culinária (HUANG et al., 2010) e devido a suas

propriedades terapêuticas, tem sido utilizado na medicina tradicional chinesa (ITOIGAWA et al.,


22

2004). A atividade antioxidante (BENMALEK et al., 2013), inseticida (CHAUBEY, 2008),

analgésica (RITTER et al., 2013), antibacteriana (YANG et al., 2010) e antifúngica (HUANG et

al., 2010) desta planta é descrita na literatura.

O anis estrelado é uma das fontes de obtenção do ácido chiquímico, ingrediente primário

utilizado na fabricação do Tamiflu® (Oseltamivir) que é o medicamento com ação antiviral

utilizado no tratamento da gripe por influenza (OHIRA et al., 2009).

O principal componente do OE de I. verum é o trans-anetol (anetol) (HUANG et al.,

2010) com propriedades antifúngicas já descritas na literatura (DZAMIC et al., 2009; DE et al.,

2002). De et al. (2002), através da técnica de ágar difusão, demonstraram que o anetol inibiu o

crescimento de fungos filamentosos saprofíticos, fungos patogênicos de plantas, dermatófitos e

leveduras, com valores de concentração inibitória mínima (CIM) variando de 5 a 50 µg/mL. A

inibição de fungos fitopatogênicos foi demonstrada por Huang et al. (2010) utilizando o OE e o

seu composto ativo, o anetol, obtidos de I. verum através da técnica de inibição do crescimento

micelial radial.

2.3.3. Juniperus virginiana (Cedro Virginia)

Figura 3: J. virginiana. (www.abnativeplants.com/www.henriettes-herb.com)

Juniperus virginiana, ilustrado na Figura 8, também conhecido como cedro vermelho

oriental ou cedro virginia, pertence à família Cupressaceae e encontra-se distribuído

principalmente nos Estados Unidos e Canadá (GAWDE; CANTRELL; ZHELJAZKOV, 2009).

A madeira desta planta conífera é conhecida pela durabilidade e resistência a cupins (ZHU et al.,


23

2001) e outros insetos (MEISSNER; SILVERMAN, 2001). Devido às propriedades medicinais,

J. virginiana era utilizada pelas tribos indígenas norte americanas, na cura de resfriados,

sarampo, coceira, verminoses, dores reumáticas e bronquite (HAMEL; CHILTOSKEY, 2002;

HUTTON, 2010; NOLAN, 1998).

Esta planta é utilizada comercialmente para a obtenção do OE (SEMEN; HIZIROGLU,

2005), cujos principais componentes são o cedrol e α-cedrene, com porcentagens que variam de

acordo com a parte da planta utilizada ou técnica de extração (ELLER et al., 2010). Extratos e

OEs obtidos da madeira de J. virginiana possuem atividades antibacterianas e antifúngicas

descritas (PIRES et al., 2011; STEWART; JONES; SETZER, 2014). Atividade antifúngica sobre

C. albicans foi descrita por Stewart et al. (2014) através da técnica de microdiluição em caldo,

utilizando o OE de J. virginiana obtido da madeira, folhas e frutos com valores de CIM de 625 e

1250 µg/mL. Concentração inibitória mínima de 1000 µg/mL foi determinada, através da

microdiluição em caldo, utilizando-se o OE de J. virginiana sobre Candida parapsilosis e

Candida orthopsilosis por Pires et al., 2011.

2.3.4. Rosa centifolia (Rosa Marrocos)

Figura 4: Flores de R. centifólia (www.99roots.com/ en.wikipedia.org).

Rosa centifolia (Figura 9) pertence à família Rosaceae e é nativa da Ásia e Oriente

Médio. São plantas amplamente utilizadas como decorativas e o seu OE é empregado na


24

fabricação de sabão, cosméticos e como aromatizantes de chás e licores (SHABBIR et al., 2009).

Os principais componentes do OE desta planta são: álcool fenetílico, geraniol e acetato de

geraniol (JITENDRA et al., 2012).

Já foi demonstrado que o óleo extraído de R. centifolia é utilizado como antisséptico,

antidepressivo, digestivo, anti-inflamatório, afrodisíaco (ALLARDICE, 1994) e antiasmático

(BERKOWSKY; BRUCE, 2000).

A atividade antimicrobiana de extratos de R. centifolia, foi demonstrada por Ali et al.

(2011) em cepas de Staphylococcus aureus, Streptococcus epidermidis, Salmonella enterica

serovar Tiphy, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes, Acinetobacter calcoaceticus e

C. albicans quando observaram que estes compostos inibiram o crescimento em concentrações

que variaram de 250 a 2000 µg/mL.

2.3.5. Syzygium aromaticum (Cravo Talo/Cravo-da-Índia)

Figura 5: Árvore, folhas e frutos de S. aromaticum (www.ecoplanet.in/www.plant.pictures.de).

Syzygium aromaticum (Eugenia caryophyllata), comumente conhecido como cravo-da-

índia (Figura 10), é classificado na família Myrtaceae e tem amplo cultivo em regiões como Sri-

Lanka, Madagascar, Tanzânia e Brasil (ALITONOU et al., 2012; PINTO et al., 2009). É uma

especiaria utilizada na culinária e no tratamento de problemas gastrointestinais, odontológicos,

respiratórios, cefaleia e dor de garganta principalmente em países asiáticos e na Austrália

(BANERJEE; PANDA; DAS, 2006; CHAIEB et al., 2007; GURIB-FAKIM, 2006). Outras


25

propriedades são atribuídas a S. aromaticum como antioxidante (LEE; SHIBAMOTO, 2001),

anticarcinogênica (DWIVEDI et al., 2011), antialérgica (KIM et al., 1998) e antimicrobiana

(ALITONOU et al., 2012).

O eugenol é considerado o principal componente do OE de S. aromaticum, seguido pelo

β-cariofileno e o álcool benzílico, cujas concentrações podem variar de acordo com as

metodologias de análises (CHAIEB et al., 2007). Gayoso et al. (2005) avaliaram in vitro, através

da técnica de difusão em ágar, a atividade do OE de S. aromaticum e do eugenol sobre C.

albicans, C. tropicalis, C. krusei, Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes e Geotrichum

candidum provenientes de onicomicoses. Pelos resultados obtidos, através da leitura do diâmetro

dos halos de inibição que variaram de 10 a 28 mm, ambos os compostos utilizados no estudo

foram considerados como uma opção na manipulação de fármacos que atuam nesta micose por

apresentarem significativa atividade sobre fungos filamentosos e leveduras.

Em 2005, Chami et al. observaram modificações morfológicas em leveduras da espécie

Saccharomyces cerevisiae tratadas com OE de cravo. Após o tratamento, imagens de

microscopia eletrônica revelaram que este óleo promoveu alterações na forma celular do fungo

além de rupturas na superfície do mesmo. Fungos filamentosos como Aspergillus niger tiveram o

crescimento inibido na presença deste OE através do teste de disco difusão em ágar (PAWAR;

THAKER, 2006).

2.4. Ensaios in vitro para a detecção da atividade antifúngica de compostos

2.4.1. Testes de suscetibilidade

A atividade antifúngica de fármacos, OEs ou compostos naturais pode ser avaliada por

testes de suscetibilidade com o emprego de metodologias como a difusão em ágar ou diluição em

meio líquido. O Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) é uma organização

internacional interdisciplinar que desenvolve e padronizada ensaios clínicos, buscando uma

melhoria em questões relacionadas à atenção a saúde. Este instituto padronizou algumas

metodologias para avaliação da suscetibilidade de fungos filamentosos e leveduras aos

antifúngicos para a determinação da CIM. Como método de referência para leveduras das

espécies de Candida e C. neoformans foi estabelecido o protocolo M27-A3 (CLSI, 2008) com


26

atualizações no último suplemento M27-S4 (CLSI, 2012). Os resultados obtidos permitem

classificar o isolado em suscetível, sensibilidade dose dependente, sensibilidade intermediária e

resistente (CLSI M27-A3 2008).

Outros testes podem ser comercialmente adquiridos como o Etest® (AB Biodisk, Solna,

Suécia) e Neo-Sensitabs® (Rosco-Diagnóstica, Dinamarca), que são metodologias que permitem

a determinação da CIM através da difusão em ágar. Métodos automatizados como VITEK®2

(Biomérieux) e WalkAway® (Siemens, Alemanhã), as placas de microdiluição da Sensititre®

YeastOne® (TREK Diagnostic Systems, Clevelend, OH) e Fungitest® Kit (Bio-Rad, Califórnia)

também podem ser utilizados (PFALLER et al., 2007).

2.4.2. Interação entre agentes antifúngicos

Uma alternativa bastante promissora na tentativa de melhorar a eficácia do fármaco,

proporcionar uma terapia de amplo espectro minimizando o surgimento de isolados resistentes

aos antifúngicos disponíveis é a avaliação da interação entre compostos (DRAGO et al., 2007;

MUSIOL; MROZEK-WILCZKIEWICZ; POLANSKI, 2014).

A avaliação da interação entre dois ou mais agentes antifúngicos, sejam eles fármacos,

OEs ou extratos, pode ser realizada por uma metodologia in vitro denominada “chequerboard”.

Esta metodologia baseia-se no protocolo do CLSI para microdiluição em caldo, na qual são

determinadas as CIMs dos compostos, isoladamente e em associação, permitindo o cálculo do

índice de concentração inibitória fracionária (ICIF), classificando-a como sinérgica, antagonista

ou indiferente (ODDS, 2003).

Este ensaio é bastante utilizado em trabalhos desenvolvidos por microbiologistas, como

demonstrado em uma pesquisa, durante os anos de 1998 a 2002. Neste período, avaliou-se 96

artigos publicados que realizaram a técnica de interação entre agentes antimicrobianos in vitro,

sendo que em 58 artigos (60,4%) chequerboard foi a técnica de escolha para estes fins (ODDS,

2003).

Castro et al. (2013) avaliaram a interação entre o OE de C. zeylanicum e o antifúngico

nistatina sobre o crescimento de C. albicans utilizando a metodologia de chequerboard. Quando

avaliados isoladamente, o valor da CIM foi de 312,5 µg/mL para o OE e 64 µg/mL para o


27

fármaco, quando em combinação os valores de CIM foram 39 µg/mL e 32 µg/mL,

respectivamente. Comprovou-se pelo cálculo do ICIF que a combinação entre estes dois

componentes potencializou o efeito inibitório sobre a espécie fúngica avaliada. O mesmo efeito

sinérgico (ICIF ≤ 0,5) foi observado com a associação do OE de Mentha suaveolens com o

fármaco fluconazol sobre o crescimento de C. albicans demonstrado pelo valor de ICIF de 0,375

(STRINGARO et al., 2014).

2.4.3. Curva do tempo de morte São estudos capazes de fornecer informações importantes sobre a interação do agente

antimicrobiano e patógeno principalmente sobre a capacidade farmacodinâmica, isto é, ação do

fármaco no microrganismo. A ação fungicida do agente microbiano pode ser expressa pela taxa

de morte determinada por uma concentração fixa do antimicrobiano em condições pré-

estabelecidas, contando-se o número de células viáveis em intervalos periódicos de incubação.

Os resultados são plotados em curva logaritmica onde o eixo das abcissas corresponde ao

intervalo de tempo avaliado e o eixo das ordenadas ao número de unidades formadoras de

colônias daquele período analisado (TAM; SCHILLING; NIKOLAOU, 2005).

Ahmad et al. (2011), através da curva do tempo de morte, demonstraram que os

compostos carvacrol e timol desempenharam uma rápida ação fungicida, 12 horas após a

incubação em concentrações quatro vezes superiores a CIM, sobre isolados do gênero Candida.

2.5. Determinação do mecanismo de ação dos OEs sobre células fúngicas

A diversidade de componentes presentes nos OEs faz com que estes possam atuar em

diferentes sítios alterando o metabolismo e até mesmo provocando a morte celular (BAKKALI et

al., 2008). Sendo assim, é importante determinar, para cada OE avaliado, seu mecanismo de

ação. Este estudo pode ser realizado por técnicas que quantificam o ergosterol e por técnicas

capazes de detectar lesão de membrana em células fúngicas.

2.5.1. Quantificação do ergosterol da membrana fúngica O ergosterol é o principal esterol presente nas espécies fúngicas contribuindo para um

normal crescimento e desenvolvimento do microrganismo, uma vez que exerce importantes


28

funções na membrana celular como por exemplo, regula sua fluidez, promove a integridade e

favorece a ligação de enzimas na mesma (LUPETTI et al., 2002). Dada a relevância do

ergosterol para a sobrevivência fúngica, muitas terapias antifúngicas, como os fármacos azólicos,

atuam na biossíntese desse esterol (KHAN et al., 2010).

Devido ao fenômeno “trailing”, caracterizado pelo crescimento residual de leveduras

mesmo em concentrações inibitórias de fármacos fungistáticos, Arthington-Skaggs et al. (1999)

propuseram uma metodologia associada à espectrometria capaz de quantificar os esteróis

presentes na membrana fúngica, cuja finalidade era evitar interpretações equivocadas de

resistência (ARTHINGTON-SKAGGS et al., 1999). A espectroscopia eletrônica (UV-Vis) é

uma das técnicas disponíveis para que, após feita a extração do ergosterol fúngico, o mesmo

possa ser quantificado. Esta técnica baseia-se na absorção de radiação luminosa na região do

ultravioleta (200-400 nm) e no visível (400-800 nm) em decorrência das transições eletrônicas

moleculares (TREVISAN; POPPI, 2006).

A quantificação do ergosterol, utilizando o OE de Ocimum sanctum e seus dois principais

constituintes (linalol e metil chavicol), foi realizada em espécies de Candida. Observou-se que o

linalol e o metil chavicol inibiu a síntese do ergosterol em valores de CIM sub-inibitórios,

sugerindo que um dos seus mecanismos de ação pode ser atribuído a esta potente capacidade de

inibição de esteróis destes compostos (KHAN et al., 2010).

2.5.2. Avaliação de lesão da membrana fúngica por citometria de fluxo A citometria de fluxo é capaz de realizar análises em células ou outras partículas como

núcleos, cromossomas ou microrganismos fornecendo informações qualitativas, como

características morfológicas, bioquímicas e fisiológicas, e quantitativas como o número total de

estruturas avaliadas (BROWN; WITTWER, 2000). Esta metodologia é utilizada na

quantificação de células CD4, CD8, detecção de antígeno leucocitário humano (HLA-B27) e

imunofenotipagens (BROWN; WITTWER, 2000).

Fazem parte da constituição de um citômetro uma fonte de radiação (laser), câmara de

fluxo, unidades de filtros ópticos, fotodiodos ou fotomultiplicadores como demonstrados na

Figura 11. O princípio de funcionamento do citômetro está relacionado com a análise das

partículas, previamente marcadas com fluorocromos ou anticorpos monoclonais, que quando

diluídas em solução isotônica, são aspiradas pelo aparelho e atravessam a câmara onde ocorre a

passagem célula a célula através do feixe de radiação perpendicular ao fluxo. O feixe de radiação


29

de excitação ao interceptar a célula na câmara sofre dispersão na direção frontal ou lateral sendo

detectada por fotodiodos ou um desvio de 90º pode ser promovido por lentes, espelhos dicroicos

e filtros ópticos (SILVA et al., 2004). Estes sinais ópticos são captados pelos fotomultiplicadores

e convertidos em sinais eletrônicos que serão analisados pelo software do equipamento

(MACEY, 2007).

Figura 6: Principais elementos que fazem parte da composição do citômetro de fluxo-BD Biosciences (SILVA et al., 2004).

A citometria de fluxo foi utilizada na investigação dos efeitos dos compostos carvacrol e

timol na integridade celular de isolados de Candida. A ligação do marcador de fluorescência

iodeto de propídio (PI) ao ácido nucleico da célula fúngica indicou que o mecanismo de ação dos


30

compostos avaliados foi por lesão de membrana acarretando em morte celular (AHMAD et al.,

2011).

2.6. Avaliação in vitro da citotoxicidade de agentes antimicrobianos

A realização de técnicas in vitro que sejam capazes de avaliar os efeitos tóxicos de

substâncias com potencial antimicrobiano devem ser incluídas na pesquisa para descartar

possíveis efeitos nocivos à saude. Ensaios de citotoxicidade têm como objetivo avaliar

parâmetros relacionados à viabilidade e proliferação celular. Esta metodologia pode ser realizada

em culturas celulares ou por técnicas que foram adaptadas para placas de microtitulação,

possibilitando análises simultâneas, resultados rápidos e menos laboriosos (WEYERMANN;

LOCHMANN; ZIMMER, 2005).

A viabilidade da célula pode ser avaliada através da atividade metabólica celular por

ensaio colorimétrico como a redução do sal de tetrazólio (3-(4,5dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil

brometo de tetrazolina) (MTT). As células metabolicamente ativas reduzem o MTT produzindo

cristais de formazan de coloração roxa que são solubilizados pelo dimetilsulfóxido (DMSO) e a

absorbância é determinada em espectrofotômetro, isto é, a quantidade de formazan é diretamente

proporcional ao número de células viáveis (MOSMANN, 1983). Essa avaliação também pode ser

realizada com o uso de corantes vitais, como por exemplo, o vermelho neutro, devido a sua

capacidade de se ligar na matriz lisossomal de células íntegras, possibilitando a quantificação

pela intensidade de cor da cultura celular (ROGERO et al., 2003).

A morte celular pode ser avaliada através de metodologia que detecta a liberação de enzimas

citoplasmáticas, como a lactato desidrogenase (LDH), quando a integridade da membrana é

danificada (WEYERMANN; LOCHMANN; ZIMMER, 2005). Ensaios hemolíticos também

avaliam a morte celular através da quantificação da hemoglobina liberada na presença de

diferentes concentrações do composto estudado (MARYA et al., 2012). Em 2015, Cavaleiro et

al. demonstraram que o OE de Angelica major, na concentração de 2.5 uL/mL, provocou lise em

10% das hemácias, sendo considerado pelos autores como baixa atividade hemolítica

JUSTIFICATIVA

31

3. JUSTIFICATIVA

Leveduras do complexo C. neoformans são responsáveis por infecções graves, sendo

frequentemente associadas à meningite fúngica, principalmente em pacientes

imunocomprometidos, com altas taxas de morbidade e mortalidade. Os principais antifúngicos

empregados no tratamento da criptococose, a anfotericina B e o fluconazol são responsáveis por

efeitos colaterais e elevado grau de toxicidade. Associados a estes fatores, a presença de isolados

resistentes não é um evento raro, dificultando o tratamento, além de elevar o custo com gastos

hospitalares. A busca por compostos naturais se torna necessária para a obtenção de agentes

antifúngicos com novos mecanismos de ação, amplo espectro de atividade e menos efeitos

colaterais que possam limitar a dose terapêutica. As plantas, desde tempos remotos, são

utilizadas na medicina popular por oferecem uma grande diversidade de componentes que são

importantes fontes no desenvolvimento de fármacos e atualmente tem atraído a atenção dos

microbiologistas. Os óleos essenciais são metabólitos secundários das plantas com propriedades

antifúngicas já relatadas sobre leveduras e fungos filamentosos. Neste contexto, a atividade

biológica dos óleos essenciais de Cinnamomum zeylanicum, Illicium verum, Juniperus

virginiana, Rosa centifolia e Syzygium aromaticum e do eugenol foi avaliada com o objetivo de

verificar atividade antifúngica, associação com os fármacos anfotericina B e fluconazol,

mecanismo de ação sobre a célula e toxicidade. Resultados promissores contribuem para que

estes óleos se tornem alvos de estudos na formulação de novos antifúngicos.

OBJETIVOS

32

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo Geral

Avaliar a atividade biológica in vitro dos OEs de C. zeylanicum, I. verum, J. virginiana,

R. centifolia, S. aromaticum e do eugenol sobre fungos do complexo Cryptococcus neoformans.

4.2. Objetivos Específicos

1- Avaliar a atividade antifúngica através da determinação dos valores de CIMs dos OEs de

C. zeylanicum, S. aromaticum, R. centifolia, I. verum e J. virginiana sobre isolados do

complexo Cryptococcus neoformans.

2- Determinar os valores de CIMs do componente majoritário dos OEs de C. zeylanicum e

S. aromaticum, o eugenol, sobre isolados do complexo Cryptococcus neoformans.

3- Para os OEs/composto majoritário com valores de CIM ≤ 256 µg/mL sobre isolados do

complexo Cryptococcus neoformans, serão realizadas as seguintes avaliações:

• Determinação dos valores de CFMs

• Interação com os fármacos anfotericina B e fluconazol sobre isolados do complexo C.

neoformans.

• Ação fungicida, através da curva do tempo de morte, sobre C. gattii ATCC 24065.

• Mecanismo de ação através da quantificação do ergosterol pela metodologia de

chequerboard e verificação de lesão de membrana pela citometria de fluxo.

• Atividade citotóxica através da quantificação da hemoglobina liberada pela lise de

hemácias.

METODOLOGIA

33

5. METODOLOGIA

5.1. Microrganismos

Foram utilizadas 11 cepas de Cryptococcus neoformans, 4 de Cryptococcus gattii e cepas

padrão C. neoformans ATCC 28957 e C. gattii ATCC 24065 pertencentes à Micoteca do

Laboratório de Micologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade

Federal de Goiás. Os isolados foram obtidos de amostras de líquido cefalorraquidiano de

pacientes HIV positivos do Hospital de Doenças Tropicais Dr. Anuar Auad, situado em Goiânia-

Goiás (protocolo 004/03 do Comitê de Ética).

Estes microrganismos estavam conservados em Caldo Sabouraud Dextrose (CSD) com

glicerol e acondicionados à – 20ºC. Antes dos ensaios os mesmos foram cultivados em Àgar

Sabouraud Dextrose à 35ºC por 72 horas.

5.2. Antifúngicos

Anfotericina B (Cristália) e fluconazol (Medley) foram utilizados nos testes de

suscetibilidade e mantidos em solução estoque em concentrações de 5000 e 4000 µg/mL

respectivamente. A solução de trabalho foi preparada diluindo o fármaco em Roswell Park

Memorial Institute (RPMI) 1640.

5.3. Óleos essenciais e eugenol

Os OEs de C. zeylanicum, I. verum, J. virginiana, R. centifolia, S. aromaticum foram

adquiridos da Ferquima Indústria e Comércio LTDA, localizada em Vargem Grande Paulista–

SP. O eugenol foi adquirido da empresa Sigma-Aldrich (St. Louis-Mo-EUA). Os laudos técnicos

emitidos pelas empresas encontram-se em anexo no final deste trabalho.

METODOLOGIA

34

5.4. Avaliação da suscetibilidade in vitro pelo método de microdiluição em caldo

A atividade antifúngica da anfotericina B, fluconazol, eugenol e dos OEs de C.

zeylanicum, I. verum, J. virginiana, R. centifolia e S. aromaticum foi determinada através da

técnica de microdiluição em caldo, conforme a norma de padronização que permite a

determinação da CIM, publicada no documento M27-A3 (CLSI 2008) e M27-S4 (CLSI 2012).

C. parapsilosis ATCC 22019 foi utilizada como controle neste ensaio.

5.4.1. Diluição dos OEs, eugenol e antifúngicos

Os OEs e o eugenol foram solubilizados em 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) e

posteriormente completou-se com RPMI 1640 para obtenção de volume final de 10 mL sendo

esta solução estoque armazenada à – 20ºC. A solução de trabalho foi preparada de forma a obter

uma concentração de 2048 µg/mL. Os antifúngicos anfotericina B e fluconazol foram diluídos de

acordo com o protocolo do CLSI (2008) e mantidos em solução estoque à -20 ºC.

5.4.2. Preparo do inóculo

Os isolados de Cryptococcus foram repicados em ágar Sabouraud dextrose e incubados à

temperatura ambiente por 72 horas antes da realização dos testes de suscetibilidade aos

antifúngicos e OEs. Colônias foram colocadas em 5 mL de solução salina estéril (0,85% ) e

agitadas por 15 segundos em agitador tipo vortex. A densidade do inóculo foi ajustada em

espectrofotômetro em comprimento de onda de 530 nm, para uma transmitância de 85%,

correspondente à escala 0,5 de McFarland, contendo aproximadamente 1 a 5 x 106 unidades

formadoras de colônia por mL (UFC/mL).

Esta suspensão foi diluída 1:50 e posteriomente 1:20, em meio RPMI 1640 tamponado

com ácido morfolino propanosulfônico (MOPS) pH 7,0 para a obtenção de uma solução final de

0,5 a 2,5 x 103 UFC/mL.

METODOLOGIA

35

5.4.3. Procedimento do teste

Um volume de 200 µL de OE, eugenol ou fármaco foi colocado nos orifícios da primeira

coluna da placa de microtitulação e nas demais colunas 100 µL de RPMI. Realizou-se diluição

seriada obtendo-se concentrações que variaram de 16 a 0,03 µg/mL para anfotericina B, de 64 a

0,125 µg/mL para fluconazol e de 1024 a 2 µg/mL para os OEs e eugenol (Figura 12). Foi

adicionado 100 µL do inóculo em cada orifício com exceção do controle de esterilidade do meio

contendo apenas RPMI na última coluna da placa. Foram realizados controles do inóculo na

penúltima coluna e controle de qualidade do teste, com a ATCC 22019, na última linha da placa.

A placa foi incubada por 72 horas à 35°C.

Figura 7: Representação esquemática do teste de suscetibilidade in vitro pelo método de microdiluição em caldo

Após o período de incubação, a leitura foi realizada visualmente e a CIM para

anfotericina B, OEs e composto determinada como a menor concentração capaz de inibir o

crescimento total dos isolados de Cryptococcus e para o fluconazol considerou-se a concentração

que apresentou uma inibição de 50%, comparando-se com o controle do inóculo. Os ensaios

foram realizados em triplicata.

METODOLOGIA

36

5.5. Determinação da concentração fungicida mínima (CFM)

Baseado nos resultados de CIM foi determinado a CFM dos fármacos, OEs e composto.

Nas concentrações correspondentes a CIM, 2 vezes e 4 vezes a CIM foi retirado 10 µL de cada

orifício da placa de microtitulação e inoculados em placa de Petri contendo ágar Sabouraud

dextrose (Figura 13). Após 72 horas de incubação à 35°C foi realizado a contagem de colônias e

a CFM foi definida como a concentração onde não ocorreu crescimento ou houve o crescimento

de apenas uma colônia do fungo (DE LOGU et al., 2005).

Figura 8: Esquema para a determinação da CFM, onde 10 µL do orifício correspondente a CIM, 2 x CIM e 4 x CIM da placa de microtitulação de cada fármaco, OEs e composto foram semeados em placa de ágar Sabouraud.

5.6. Avaliação da interação entre os OEs e eugenol com os fármacos anfotericina B e fluconazol pela técnica de chequerboard

Os OEs de C. zeylanicum, S. aromaticum e o eugenol foram avaliados, pela técnica de

chequerboard, para verificar a interação com os fármacos anfotericina B e fluconazol sobre os

isolados de Cryptococcus (WHITE et al.; 1996). As concentrações avaliadas foram de 1024 a 8

µg/mL para OEs e eugenol, de 16 a 0,03 µg/mL para a anfotericina B e de 64 a 0,125 µg/mL

para o fluconazol considerando a CIM previamente determinada para cada isolado. Foram

avaliados 15 isolados do complexo C. neoformans e as cepas padrão C. gattii ATCC 24065 e C.

neoformans ATCC 28957.

METODOLOGIA

37

Em uma placa de microtitulação, “A”, realizou-se a diluição do OE, na “B” a diluição do

fármaco e na “C” a mistura de OE+fármaco+inóculo, como demonstrado na Figura 14. Na

primeira linha da placa A adicionou-se 200 µL de OE, em concentração 4 vezes maior do que a

inicial (1024 µg/mL), e realizou-se diluição seriada, em sentido horizontal, para os demais

orifícios contendo 100 µL de RPMI. Na primeira coluna da placa B adicionou-se 200 µL de

fármaco, em concentração 4 vezes maior do que a inicial (16 µg/mL para anfotericina e 64

µg/mL para fluconazol) , e realizou-se diluição seriada, em sentido vertical, para os demais

orifícios contendo 100 µL de RPMI. Na placa C, foram transferidos 50 µL do OE previamente

diluído na placa A e 50 µL do fármaco previamente diluído na placa B, no poço correspondente.

A seguir adicionou-se 100 µL do inóculo em todos os orifícios, com exceção do controle do

meio. Como controle do inóculo pipetou-se 100 µL de RPMI e 100 µL de inóculo e para controle

de esterilidade 200 µL de RPMI em orifício. A placa C foi incubada à 35°C por 72 horas e,

através de leitura visual foi determinada a CIM, que corresponde a menor concentração do OE e

do fármaco associados , que inibiu o crescimento visível do fungo, em toda a placa comparado

ao controle do inóculo

Figura 9: Representação esquemática da técnica de chequerboard na avaliação da associação entre os OEs/composto com os fármacos anfotericina B e fluconazol. Na placa (A) foi realizada a diluição do OE, na (B) a diluição do fármaco e na (C) a mistura de OE + fármaco + inóculo.

Óleo essencial ou composto

Fármaco

RPMI

Placa B

Placa C

50 μL no poço correspondente 50 μL no poço correspondente

Placa A

METODOLOGIA

38

O efeito da associação entre os OEs e os fármacos foi determinado através do Índice de

Concentração Inibitória Fracionária (ICIF), cujo cálculo é realizado através da soma da

Concentração Inibitória Fracionária do composto A (CIFA) com a Concentração Inibitória

Fracionária do composto B (CIFB), sendo A o OE e B o antifúngico.

ICIF = CIFA + CIFB

CIFA = CIM do composto A (OE) na associação (chequerboard) CIM do composto A (OE) isolado (microdiluição em caldo)

CIFB = CIM do composto B (antifúngico) na associação (chequerboard) CIM do composto B (antifúngico) isolado (microdiluição em caldo)

Segundo os critérios propostos por Odds (2003) os resultados do cálculo do ICIF permitiram

classificar a associação em:

Sinérgica – ICIF ≤ 0,5

Indiferente – ICIF > 0,5 e ≤ 4

Antagonista – ICIF > 4

5.7. Curva do tempo de morte (Time kill assay)

A avaliação da curva de morte foi realizada com a cepa C. gattii ATCC 24065, segundo

Perfect et al. (1996) com modificações. A cepa foi semeada em ágar Sabouraud dextrose e

incubada por 72 horas em temperatura ambiente e após, uma alçada de colônias foi colocada em

Erlenmeyer contendo 30 mL de RPMI e incubado overnight à 35°C sob agitação constante em

agitador para frascos com incubadora. O inóculo foi preparado em 4 mL de RPMI com

densidade ajustada no espectrofotômetro para uma transmitância de 85% em comprimento de

onda de 530 nm, correspondente à escala 0,5 de McFarland, contendo aproximadamente 1 a 5 x

106 UFC/mL. Um volume de 10 µL do inóculo foi pipetado em Erlenmeyer contendo 10 mL de

METODOLOGIA

39

RPMI mais OE/eugenol na concentração correspondente a CFM. Após estas diluições a

concentração final do inóculo foi de aproximadamente 0,5 a 2,5 x 103 UFC/mL.

Os frascos foram incubados à 35°C sob agitação constante e nos intervalos de tempo de 0,

6, 12, 24, 48 e 72 horas retirou-se alíquotas que foram semeadas em ágar Sabouraud dextrose e

mantidas à temperatura ambiente. Após 72 horas, a partir de cada intervalo semeado, foi feita a

leitura visual da placa onde se determinou o número de UFC/mL.

Para determinar o momento exato da ação fungicida, o mesmo teste foi realizado com os

intervalos 0, 1, 2, 3, 4, 5 e 6 horas, uma vez que observou-se presença de colônias no tempo 0 e

ausência no tempo 6 horas. Como controle da técnica da curva do tempo de morte, o

procedimento também foi realizado utilizando C. gattii ATCC 24065 tratada com anfotericina B

na concentração fungicida mínima.

Os resultados de contagem de colônias permitiram construir uma curva logarítmica onde o

eixo das ordenadas corresponde a UFC/mL em logaritmo de base 10 e o eixo das abscissas ao

intervalo de tempo.

5.8. Estudo do mecanismo de ação

5.8.1. Quantificação de esteróis

O ergosterol presente nas células fúngicas foi quantificado seguindo a metodologia

desenvolvida por Arthington-Skaggs et al. (1999) com modificações. C. gattii ATCC 24065 foi

semeado em placa de Petri contendo ágar Sabouraud dextrose e incubado em temperatura

ambiente por 72 horas. Após este período, uma colônia fúngica foi retirada do meio de cultura e

colocada em Erlenmeyer contendo 50 mL de caldo Sabouraud dextrose juntamente com o

composto em teste em concentrações correspondentes a CIM e ½ CIM avaliada no teste de

suscetibilidade in vitro. Os Erlenmeyers foram incubados por 48 horas a 35°C sob agitação

constante. Após este período o volume total presente em cada Erlenmeyer foi transferido para

tubos Falcon de 50 mL, previamente identificados e pesados, e centrifugado a 3000 rpm por 5

minutos. O sobrenadante foi desprezado e as células sedimentadas foram lavadas uma vez com

água destilada. O sobrenadante foi novamente desprezado e pesou-se o tubo Falcon contendo o

pellet. Leveduras tratadas com fluconazol foram utilizadas como controle positivo e leveduras

sem adição de fármaco como controle negativo.

METODOLOGIA

40

Solução alcoólica de hidróxido de potássio à 25% foi preparada (25g de KOH, 35mL água

e álcool 100% qsp 100mL) e 3 mL foram adicionados aos tubos Falcon contendo o pellet. O

álcool é o responsável pela solubilização da bicamada lipídica da membrana fúngica e o

hidróxido de potássio promove a saponificação. Os tubos foram agitados em agitador tipo vortex

por 1 minuto e incubados por 4 horas em banho-maria a 85°C. Após a incubação, adicionou-se 1

mL de água destilada e 3 mL de heptano em cada Falcon seguido de agitação no vortex por 3

minutos. O heptano foi adicionado com o objetivo de separar a camada lipofílica que contém os

esteróis 24(28) dehidroergosterol (DHE) e ergosterol. A parte contendo os esteróis foi retirada e

armazenada em tubos de ensaio à -20°C por 24 horas sendo posteriormente diluídas 1:5 em

álcool 100% para a realização da leitura em espectrofotômetro de varredura em comprimento de

onda de 230 a 300 nm (Varian Cary® 50 UV-Vis). A presença do ergosterol e do 24(28)DHE

resultam em uma característica curva com quatro picos. A ausência de ergosterol resulta em uma

linha contínua (ausência de picos).

Os esteróis 24(28) DHE + ergosterol absorvem em comprimento de onda de 281,5 nm,

entretanto o 24(28) DHE mostra uma intensa banda de absorção em comprimento de onda de

230 nm.

A porcentagem destes esteróis foi determinada utilizando-se os cálculos propostos por

Arthington-Skaggs et al. (1999) :

% ergosterol + % 24(28)DHE = (A281,5/290) × F

peso do pellet

% 24(28)DHE = (A230/518) × F

peso do pellet

% ergosterol = [ % ergosterol + % 24(28) DHE] – % 24(28)DHE

Onde:

F = fator de diluição do etanol

METODOLOGIA

41

5.8.2. Avaliação da lesão de membrana fúngica sob ação dos OEs e eugenol

A avaliação da lesão de membrana foi realizada utilizando C. gattii ATCC 24065,

segundo Ahmad et al. (2011) com modificações. A cepa foi cultivada em caldo Sabouraud

dextrose sob agitação constante à 35°C overnight e após foi preparado um inóculo de 106

células/mL em RPMI. Os OEs de C. zeylanicum e S. aromaticum e o eugenol foram avaliados

nas concentrações correspondentes à CFM, ½ CFM e ¼ CFM. Colocou-se 10 mL de RPMI em

tubos do tipo Falcon com o OE/eugenol na concentração a ser avaliada e adicionou-se 10 µL do

inóculo. Os tubos foram incubados a 35°C por 1 hora para C. zeylanicum e S. aromaticum e 4

horas para o eugenol, considerando o tempo determinado pela curva de morte, e posteriormente

centrifugados por 10 minutos a 3700 rpm e o sobrenadante descartado. As células sedimentadas

foram ressuspensas em 1 mL de tampão PBS pH 7,2 com posterior agitação em vórtex sendo

todo o volume transferido para tubos tipo Eppendorf que foram centrifugados 10 minutos a 3700

rpm sendo em seguida o sobrenadante descartado. As células sedimentadas foram ressuspensas

em 200 µL de tampão PBS pH 7,2 e em seguida 5 µL do marcador de fluorescência iodeto de

propídeo (PI) foram adicionados e mantidos incubados por 30 minutos à 35°C ao abrigo da luz.

O marcador PI se liga ao DNA de células, cuja membrana foi lesionada, produzindo

fluorescência (luz vermelha) que é captada pelo detector FL3 do citômetro. A medida da

intensidade de fluorescência foi realizada no citômetro BD AccuriTM C6.

Como controle para detecção de auto-fluorescência, utilizou-se o fungo sem a presença do

marcador PI. Células fúngicas não tratadas com PI foram utilizadas como controle de viabilidade

celular e células tratadas com álcool 70% como controle de lesão de membrana.

5.9. Avaliação da citotoxicidade dos OEs

Os OEs de C. zeylanicum, S. aromaticum e o eugenol foram avaliados quanto a sua

capacidade de provocar a lise de hemácias, com liberação de hemoglobina segundo He et al.

(2007) com modificações. Para este ensaio coletou-se 5 mL de amostra de sangue de indivíduo

com índices hematológicos normais, em tubo contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).

O sangue foi centrifugado por 10 minutos a 2000 rpm e as hemácias foram lavadas 3 vezes com

tampão fosfato-salino (PBS) pH 7,4. Após a lavagem, ressuspendeu-se as hemácias em 20 mL de

METODOLOGIA

42

PBS pH 7.4 (diluição 1:5). Os OEs/ eugenol foram preparados realizando diluição seriada ao

dobro, obtendo concentrações que variaram de 4096 a 128 µg/mL. Posteriormente, colocou-se 50

µL da suspensão de hemácias em cada Eppendorf e incubou-se à 37°C no agitador por 30

minutos. Como controles utilizou-se solução de Triton X-100 diluído a 1% com hemácias

(controle positivo) e PBS com hemácias (controle negativo). Após a incubação as amostras

foram centrifugadas a 3000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante de cada Eppendorf foi

transferido para uma placa de microtitulação de 96 orifícios. A hemoglobina liberada foi

mensurada em leitora de EIE em comprimento de onda de 560 nm.

A porcentagem da hemólise foi verificada por:

Hemólise % = Abs OE – CN

× 100 Abs CP – AbsCN

Onde: CN= Controle negativo

CP= Controle positivo

Abs= Absorbância

RESULTADOS

43

6. RESULTADOS

6.1. Testes de suscetibilidade in vitro A avaliação do OEs sobre os 17 isolados de C. neoformans e C. gattii mostrou CIMs que

variaram de 128 a ≥ 1024 µg/mL. Os OEs de J. virginiana e I. verum apresentaram CIMs ≥ 1024

µg/mL, de 256 a 1024 µg/mL para R. centifolia e 128 a 256 µg/mL para C. zeylanicum e S.

aromaticum. A concentração de 128 µg/mL foi capaz de inibir 58,8% e 23,5% dos isolados

avaliados, para os OEs de C. zeylanicum e S. aromaticum respectivamente, enquanto o OE de R.

centifolia inibiu 70,6% dos isolados na CIM 512 µg/mL. O eugenol apresentou valores de CIM

que variaram de 128 a 512 µg/mL, sendo que para 52,9% dos isolados a CIM foi de 512 µg/mL

(Tabela 2).

Os OEs de I. verum e J. virginiana não conseguiram inibir fungos do complexo Cryptococcus neoformans em concentrações < 1024 µg/mL, por isto os resultados não constam na Tabela 2. Tabela 2: Valores de CIM obtidos pelo teste de microdiluição em caldo de 17 isolados do complexo C. neoformans na presença do OE de C. zeylanicum, S. aromaticum, R. centifolia e eugenol.

Isolados CIM (µg/mL) C. neoformans C. zeylanicum S. aromaticum R. centifolia Eugenol

L03 256 256 1024 256 L04 256 256 512 512 L05 128 128 512 256 L14 128 128 512 512 L15 128 256 512 256 L18 256 256 1024 512 L21 256 128 512 512 L23 128 256 512 512 L24 128 256 512 512 L29 128 256 512 256 L30 128 256 256 256

C. gattii L01 128 128 512 256 L09 256 256 512 512 L20 128 256 1024 512 L48 256 256 512 512

C. neoformans ATCC 28957 128 256 512 128 C. gattii ATCC 24065 256 256 1024 256

RESULTADOS

44

Quando analisamos nossos resultados observamos que as CFMs dos OEs foram ≥ 1024

µg/mL para J. virginiana e I. verum, 512 a 1024 µg/mL para R. centifolia e 256 a 1024 µg/mL

para C. zeylanicum e S. aromaticum. Para o eugenol a CFM variou de 512 a 1024 µg/mL. Para

C. zeylanicum e S. aromaticum 52,9 e 76,5% dos isolados apresentaram CFM de 512 µg/mL

respectivamente. A CFM de 1024 µg/mL foi observada em 52,9% para eugenol e 70,6% para R.

centifolia (Tabela 3).

Tabela 3: Valores de CFM de 17 isolados do complexo C. neoformans na presença do OE de C. zeylanicum, S. aromaticum, R. centifolia e eugenol.

Isolados CFM (µg/mL) C. neoformans C. zeylanicum S. aromaticum R. centifolia Eugenol

L03 512 512 1024 1024 L04 512 512 1024 512 L05 256 512 512 512 L14 512 512 1024 1024 L15 256 1024 1024 512 L18 512 512 1024 1024 L21 512 512 1024 1024 L23 256 512 1024 512 L24 512 512 512 1024 L29 256 512 1024 512 L30 256 512 512 512

C. gattii L01 256 256 1024 512 L09 512 512 512 1024 L20 512 512 1024 1024 L48 512 512 512 1024

C. neoformans ATCC 28957 256 256 1024 512 C. gattii ATCC 24065 1024 1024 1024 1024

RESULTADOS

45

Para a determinação da CFM do OE de C. zeylanicum, observamos que na concentração

de 256 µg/mL não houve o crescimento de colônias do isolado C. neoformans ATCC 28957

considerando esta concentração com a CIM (128 µg/mL), como demonstrado na Figura 15.

Figura 10: Determinação da CFM do OE de C. zeylanicum sobre C. neoformans ATCC 28957 em ágar Sabouraud dextrose.

Quando avaliamos os resultados da CFM dos OEs com maior atividade antifúngica, observamos

que mais de 50% dos 17 isolados apresentaram o valor da CFM correspondentes a 2x o valor da

CIM (Tabela 4).

Tabela 4: Análise comparativa em porcentagem dos valores de CFM com a CIM apresentada pelos 17 isolados do complexo C. neoformans

CFM C. zeylanicum

(n / %) S. aromaticum

(n / %) Eugenol (n / %)

R. centifolia (n / %)

= CIM 0 1 / 5,9 2 / 11,8 8 / 47,1

2 × CIM 13 / 76,5 11 / 64,7 12 / 70,6 9 / 52,9

4 × CIM 4 / 23,5 5 / 29,4 3 / 17,6 0

8 × CIM 0 0 0 0

RESULTADOS

46

6.2. Avaliação da associação de C. zeylanicum, S. aromaticum e eugenol com anfotericina B e fluconazol sobre isolados do complexo C. neoformans.

Os resultados do método de chequerboard que traduzem os efeito in vitro das associações

entre os OEs e o composto majoritário eugenol com anfotericina B e fluconazol encontram-se

apresentados nas Tabelas 5 e 6.

A avaliação da associação da anfotericina B com o OE de C. zeylanicum demonstrou que

os resultados de ICIFs variaram entre 0,375 a 4,125, se mostrando indiferente em 88,23%

(15/17) dos isolados estudados enquanto efeito sinérgico e antagonista foi observado para ambos

em 5,88% (1/17). Resultados importantes foram observados na associação entre do OE de S.

aromaticum com a anfotericina B, com ICIFs variando entre 0,155 a 0,37, atuando de modo

sinérgico em 100% dos isolados avaliados. A interação do eugenol com anfotericina B resultou

em ICIFs variando entre 0,56 a 1,5 enquanto que na associação com o fluconazol variou de 1,03

a 2,25. A associação deste composto com estes fármacos não promoveu alteração da atividade

antifúngica em todos isolados de fungos do complexo C. neoformans avaliados (Tabela 5).

Tabela 5: Efeito da associação da anfotericina B e os OEs de C. zeylanicum, S. aromaticum e eugenol em 17 isolados da espécie do complexo C. neoformans

Isolados Anfotericina (ICIF) C. zeylanicum S. aromaticum Eugenol

L1 1,25 (I) 0,37 (S) 1,125 (I) L3 0,625 (I) 0,155 (S) 1,03 (I) L4 0,625 (I) 0,155 (S) 1 (I) L5 1,25 (I) 0,37 (S) 1 (I) L9 2,125 (I) 0,185 (S) 1 (I) L14 1,25 (I) 0,28 (S) 0,56 (I) L15 0,75 (I) 0,155 (S) 1,25 (I) L18 0,75 (I) 0,155 (S) 0,75 (I) L20 1,00 (I) 0,155 (S) 0,56 (I) L21 0,375 (S) 0,28 (S) 1,06 (I) L23 0,73 (I) 0,245 (S) 0,75 (I) L24 0,75 (I) 0,185 (S) 1 (I) L29 0,98 (I) 0,245 (S) 1 (I) L30 2,25 (I) 0,245 (S) 0,75 (I) L48 4,125 (A) 0,245 (S) 1,25 (I) C. neoformans ATCC 28957 0,98 (I) 0,245 (S) 1,5 (I) C. gattii ATCC 24065 1,0 (I) 0,155 (S) 1 (I)

ICIF = índice de concentração inibitória fracionária.(I)-indiferente; (S)-sinérgico e (A)-antagonista.

RESULTADOS

47

A associação dos OEs com o fluconazol mostrou ICIFs de 1,25 a 4,125 para C.

zeylanicum, sendo que para 70,6% (12/17) dos isolados do complexo C. neoformans não houve

alteração da atividade antifúngica (indiferente) e em 29,4% de fungos avaliados, a associação

entre os composto promoveu uma diminuição da atividade (antagonismo). Para a interação do

OE de S. aromaticum com fluconazol houve uma diminuição de atividade antifúngica em 41,2%

(7/17) dos isolados de fungos do complexo C. neoformans (ICIFs entre 1,25 a 8,125).

Tabela 6: Efeito da associação fluconazol e os OEs de C. zeylanicum, S. aromaticum e eugenol em 17 isolados da espécie do complexo C. neoformans

Isolados Fluconazol (ICIF)

C. zeylanicum S. aromaticum Eugenol L1 2,125 (I) 4,125 (A) 2,0 (I) L3 1,25 (I) 3 (I) 2,06 (I) L4 2,06 (I) 2,06 (I) 1,06 (I) L5 4,06 (A) 8,06 (A) 2 (I) L9 2,06 (I) 4,06 (A) 1,0 (I) L14 4,125 (A) 8,125 (A) 1,06 (I) L15 4,06 (A) 2,125 (I) 2,06 (I) L18 2,03 (I) 2,03 (I) 1,03 (I) L20 3,0 (I) 2,03 (I) 1,03 (I) L21 2,03 (I) 4,03 (A) 1,06 (I) L23 2,03 (I) 2,03 (I) 1,03 (I) L24 4,125 (A) 2,125 (I) 1,1 (I) L29 4,06 (A) 2,06 (I) 2,06 (I) L30 2,06 (I) 2,06 (I) 2,0 (I) L48 2,06 (I) 4,06 (A) 1,0 (I) C. neoformans ATCC 28957 2,25 (I) 1,25 (I) 2,25 (I) C. gattii ATCC 24065 2,06 (I) 4,06 (A) 2,0 (I) ICIF = índice de concentração inibitória fracionária; (I)-indiferente; (S)-sinérgico e (A)-antagonista.

Tabela 7: Classificação dos resultados (%) obtidos na associação entre os OEs e o eugenol com os antifúngicos anfotericina B (AnfoB) e fluconazol sobre 17 isolados do complexo C. neoformans.

Classificação C. zeylanicum S. aromaticum Eugenol

AnfoB Fluconazol AnfoB Fluconazol AnfoB Fluconazol Antagonista 5,9% 29,4% 0 41,2% 0 0

Indiferente 88,2% 70,6% 0 58,8% 100% 100%

Sinérgico 5,9% 0 100% 0 0 0

RESULTADOS

48

6.3. Curva do tempo de morte (Time kill assay)

A realização da curva do tempo de morte permitiu avaliar um quadro dinâmico da ação

fungicida dos OEs de C. zeylanicum e S. aromaticum e seu principal componente, o eugenol

sobre C. gattii ATCC 24065 em relação ao tempo de exposição. Os resultados da contagem de

colônias, 72 horas após a semeadura, mostraram que o tempo de morte foi definido em 1 hora

sobre ação dos OEs de C. zeylanicum e S. aromaticum. A ação fungicida do eugenol foi

verificada em 4 horas após a exposição a este composto e, para anfotericina B, 5 horas após

exposição inicial. Os resultados estão representados na Figura 16.

Figura 11: Gráfico representativo do tempo de curva de morte de C. gattii ATCC 24065 sobre ação dos OEs de C. zeylanicum e S. aromaticum, eugenol e anfotericina B

Tempo (horas)

Log

10 U

FC

/mL

RESULTADOS

49

6.4. Avaliação da quantificação do ergosterol

A avaliação da quantificação do ergosterol de C. gattii ATCC 24065 quando tratado com

o OE de C. zeylanicum e de S. aromaticum, na concentração equivalente a CIM (256 µg/mL),

demonstrou que houve uma inibição total da produção do ergosterol, quando comparados ao

controle sem a presença de OE ou fármaco. A ação do componente majoritário de ambos os OEs,

o eugenol, sobre o fungo, demonstrou que na concentração inibitória (256 µg/mL) e sub-

inibitória (128 µg/mL) não houve a síntese do ergosterol, uma vez que não foi detectado esteróis

na leitura pelo espectrofotômetro de varredura (Tabela 8). O controle utilizando o fluconazol

mostrou que houve uma redução de 21 a 100% na síntese de ergosterol dependendo da

concentração avaliada. As Figuras 17 e 18 representam o perfil dos esteróis obtidos através desta

metodologia de quantificação.

Tabela 8: Percentual de ergosterol extraído e inibido de C. gattii ATCC 24065 quando tratados com os OEs de C. zeylanicum, S. aromaticum e eugenol, nas CIMs e ½ CIMs.

Composto Ergosterol (%)

Extração Inibição

CIM ½ CIM CIM ½ CIM

C. zeylanicum 0 0,00527 100 46

S. aromaticum 0 0,00748 100 24

Eugenol 0 0 100 100

RESULTADOS

50

Figura 12: Perfil dos esteróis de C. gattii ATCC 24065 analisados por espectrometria UV (230-300 nm) após tratamento com OE de C. zeylanicum (A) e S. aromaticum (B) em concentrações iguais a CIM (256 µg/mL) e ½ CIM (128 µg/mL).

Figura 13: Perfil dos esteróis de C. gattii ATCC 24065 analisados por espectrometria UV (230-300 nm) após tratamento com eugenol (C) em concentrações iguais a CIM (256 µg/mL) e ½ CIM (128 µg/mL) e fluconazol (D) em CIMs de 4, 8, 16 e 32 µg/mL.

RESULTADOS

51

6.5. Avaliação da lesão de membrana

Para avaliar alteração de membrana celular de C. gattii ATCC 24065 detectou-se, por

citometria de fluxo, a fluorescência emitida pelo marcador PI, que se liga ao material genético

após penetrar nas células fúngicas lesionadas pela ação dos OEs e eugenol. Para o OE obtido de

C. zeylanicum a porcentagem de lesão de membrana na concentração correspondente à CFM

(1024 µg/mL) foi 99,7%. Nas demais concentrações a porcentagem foi de 19,7% (½ CFM) e

14% (¼ CFM) como demonstrado na Figura 19 (A). OE de S. aromaticum mostrou que em todas

as concentrações avaliadas ocorreram lesão da membrana com morte celular que variou de 81,4 a

25,8% (Figura 19-B), enquanto que para o eugenol foi detectada fluorescência em 95,9% das

células (Figura 19-C). Um comparativo entre as porcentagens obtidas para cada OE, eugenol,

controle negativo e controle positivo foi realizado na Figura 20.

Figura 14: Porcentagem de células de C. gattii ATCC 24065 coradas pelo PI, analisadas por citometria de fluxo, após o tratamento com concentrações seriadas do OE de C. zeylanicum (A) e S. aromaticum (B) e eugenol (C).

Concentrações

(µg/mL)

% C

élu

las

cora

das

co

m P

I

Concentrações

(µg/mL)

% C

élu

las

cora

das

co

m P

I

Concentrações

(µg/mL)

% C

élu

las

cora

das

co

m P

I

A

C

RESULTADOS

52

Figura 15: Comparação entre as porcentagens obtidas de células de C. gattii ATCC 24065 coradas pelo PI após o tratamento com concentrações seriadas do OE de C. zeylanicum e S. aromaticum e eugenol além do controle positivo (Cp) com álcool 70% e controle negativo (Cn = 0,5%) não tratado.

A análise do mecanismo de ação dos OEs sobre as células fúngicas, quando realizada

pelo citômetro de fluxo, fornece os resultados em histogramas. A Figura 21 mostra os

histogramas obtidos para cada OE quando avaliados em concentração correspondente a CFM

(1024 ug/mL) e também para os controles negativo, positivo e de auto-fluorescência.

Figura 16: Histogramas de C. gatti ATCC 24065 tratados com OE de C. zeylanicum (A), S. aromaticum (B) e eugenol (C) na concentração de 1024µg/mL (CFM) demonstrando porcentagem de morte celular através da fluorescência produzida pela marcação com PI, captadas pelo detector FL3 do citômetro de fluxo. A figura (D) representa o controle de autofluorescência celular, (E) controle de viabilidade marcado com PI e (F) o controle de lesão de membrana (álcool 70%).

Concentrações

RESULTADOS

53

6.6. Citotoxicidade

Os ensaios de citotoxicidade em hemácias, realizados em placa de microtitulação,

mostraram que em concentrações ≤ 1024 µg/mL C. zeylanicum e S. aromaticum não

promoveram hemólise (Figura 22), porém, na concentração de 2048 µg/mL a hemólise foi 3,2 e

1,7% respectivamente. Com relação ao eugenol, a porcentagem de hemólise na concentração

1024 µg/mL foi 1,6% enquanto na concentração128 µg/mL foi de 1,3%. Observou-se que na

concentração de 4096µg/mL este composto promoveu a lise de 27% das hemácias (Tabela 9).

A anfotericina B também foi avaliada quanto a sua capacidade hemolítica demonstrando

que nas concentrações de 0,125 até 4 µg/mL não ocorreu lise de hemácia.

Figura 17: Citotoxicidade em diferentes concentrações de S. aromaticum, C. zeylanicum, eugenol e anfotericina B em hemácias, CN = controle negativo e CP = controle positivo.

8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 µg/mL CN CP

Anfo Anfo Anfo

4096 2048 1024 512 256 128 µg/mL CN CP

S. aromaticum

S. aromaticum

C. zeylanicum

C. zeylanicum

4096 2048 1024 512 256 128 µg/mL CN CP

Eugenol Eugenol

Eugenol Anfo Anfo Anfo

400 200 100 50 25 12,5 µg/mL

RESULTADOS

54

Tabela 9: Porcentagem de lise das hemácias promovidas pelos OEs e eugenol em diferentes concentrações.

Concentração S. aromaticum C. zeylanicum Eugenol

(µg/mL) % de hemólise

4096 100 100 27

2048 1,7 3,2 4,1

1024 0 0 1,4

512 0 0 1,6

256 0 0 1,6

128 0 0 1,3

DISCUSSÃO

55

7. DISCUSSÃO

A busca por agentes antimicrobianos derivados de plantas tem se tornado cada vez mais

crescente, uma vez que o tratamento das infecções fúngicas, apesar do enorme progresso da

medicina nas últimas décadas, nem sempre é eficaz. A grande diversidade de componentes

químicos obtidos dos vegetais faz com que estes se tornem amplamente pesquisados, devido ao

potencial para o desenvolvimento de novos fármacos (VILA; FREIXA; CAÑIGUERAL, 2013).

Os OEs e extratos obtidos de plantas têm sido utilizados ao longo dos anos na medicina

popular em diferentes regiões apresentado eficaz atividade sobre grande diversidade de

microrganismos, incluindo os fungos (TABASSUM; VIDYASAGAR, 2013). Vários OEs

possuem atividade antifúngica sem efeitos colaterais em homens e animais (SOKMEN; JONES;

ERTURK, 1999) e estudos in vitro e in vivo sugerem que os OEs podem ser usados como

agentes antifúngicos efetivos (ADAM et al., 1998). Entretanto, a ação dos OEs sobre os agentes

da criptococose é pouco avaliada, tornando de grande importância a realização deste trabalho que

analisa a capacidade antifúngica dos OEs de C. zeylanicum, I. verum, J. virginiana, R. centifolia

e S. aromaticum sobre fungos do complexo C. neoformans.

Em geral os controles utilizados para avaliar a eficácia de compostos de plantas são

padrões antifúngicos indicados para cada microrganismo. No entanto, não há padronização sobre

o nível de aceitação para planta, quando comparados com os padrões. Por isso, alguns autores

consideram apenas atividade comparável aos antifúngicos, enquanto outros consideram valores

ainda mais elevados (NAEINI et al., 2009; DUARTE et al., 2005). Aligiannis et al. (2001)

propuseram a classificação a seguir baseando-se nos valores de CIM: < 500 µg/mL forte

atividade, entre 600 a 1500 µg/mL moderada e >1600 µg/mL fraca atividade. A classificação dos

resultados obtidos em nosso trabalho será baseada nos valores propostos por estes autores.

Os resultados da ação de C. zeylanicum sobre os isolados de fungos do complexo C.

neoformans obtidos neste trabalho, em que 58,8% foram inibidos na CIM de 128 µg/mL,

demonstram que este OE possui forte atividade antifúngica com grande potencial nas pesquisas

de substâncias a serem utilizadas no tratamento da criptococose. Resultados semelhantes foram

observados por Jantan et al. (2008) onde a atividade antifúngica do OE de C. zeylanicum foi

avaliada, pela técnica de microdiluição em caldo, obtendo para C. neoformans CIM de 0,16 a

DISCUSSÃO

56

0,31 µg µL-1 (aproximadamente 160 a 310 µg/mL). Por outro lado, valores menores de CIM

(15,6 µg/mL) foram relatados por Sivamani et al. (2010) ao avaliar isolados de C. neoformans,

provenientes de pacientes HIV positivos.

A atividade do OE de C. zeylanicum foi avaliada em outras espécies de leveduras

mostrando-se eficaz ao inibir o crescimento de cepas ATCC de C. albicans, C. parapsilosis e C.

krusei com halo de inibição > 40 mm e a CIM entre < 0,04 a 1,12 mg mL-1 (aproximadamente 40

a 1120 µg/mL) (UNLU et al., 2010). Khan et al., (2009), avaliaram a atividade de C. zeylanicum

através da microdiluição em caldo, sobre isolados de C. albicans provenientes de infecções

nosocomiais, obtendo CIM de 780 µg/mL. C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis e C.

tropicalis apresentaram CIM de 0,08 a 0,63 ug ul -1(aproximadamente 80 a 630 ug/ml) segundo

Jantan et al. (2008).

A atividade in vitro do OE de C. zeylanicum em fungos filamentosos, foi avaliada através

da técnica de ágar diluição segundo Sivamani et al. (2010). O valor de CIM encontrado para A.

niger, A. flavus e A. fumigatus foi de 31,25 µg/mL. Este OE demonstrou forte atividade

antifúngica quando avaliado sobre espécies de dermatófitos com CIMs variando entre < 0,04 µg

µL-1 a 0,16 µg µL-1 (aproximadamente < 40 a 160 µg/mL) (JANTAN et al., 2008). Estes dados

confirmam a atividade antifúngica demonstrada em nossos resultados.

Assim como o OE de C. zeylanicum, o OE de S. aromaticum também tem sido avaliado

em pesquisas com Candida, Aspergillus, dermatófitos, sendo raros os relatos em Cryptococcus

(KIRUI et al., 2014; PARK et al., 2007; PAWAR; THAKER, 2006).

Avaliações do OE obtido de S. aromaticum em isolados do complexo C. neoformans

foram descritos, utilizando metodologias diferentes, sendo diluição em ágar Sabouraud obtendo

CIM de 200 µL/L (aproximadamente 200 µg/mL) (VIOLLON; CHAUMONT, 1994) e disco

difusão, apresentando halo de inibição de 15 ± 2,0 mm, sendo considerados como muito

sensíveis pelos autores (KIRUI et al., 2014). Os dados obtidos por estes autores demonstram

potencial antifúngico deste OE, confirmando os resultados do nosso trabalho em que a CIM

de128 µg/mL para o OE de S. aromaticum foi verificada em 23,5% de isolados do complexo C.

neoformans.

Leveduras do gênero Candida, dermatófitos e fungos filamentosos também têm sido

avaliados na presença deste OE apresentando atividade antifúngica descrita. Pinto et al. (2009)

avaliando ATCCs de C. albicans, C. krusei, C. tropicalis e C. parapsilosis e cinco isolados

DISCUSSÃO

57

clínicos encontraram valores de CIM variando de 0,32 a 0,64 µL mL- 1 (aproximadamente 320 e

640 µg/mL) e menores valores foram obtidos para isolados clínicos de E. floccosum, T. rubrum,

T. mentagrophytes, M. canis e M. gypseum entre aproximadamente 80 e 160 µg/mL. Este

mesmos autores demonstraram inibição do crescimento de espécies do gênero Aspergillus em

ATCCs e isolados clínicos. Estes resultados confirmam que o OE de S. aromaticum tem

interessante potencial terapêutico para o tratamento das infecções fúngicas.

Neste trabalho foi avaliada a capacidade do eugenol, composto majoritário dos OEs de C.

zeylanicum e S. aromaticum, de inibir o crescimento de isolados do complexo C. neoformans

com a finalidade de correlacionar este constituinte com sua atividade antifúngica. A CIM

encontrada utilizando este componente foi de 256 µg/mL em 41,2% dos isolados avaliados.

Estudos prévios têm reportado a atividade antifúngica para o eugenol em leveduras e fungos

filamentosos contaminantes e patogênicos (CHAIEB et al., 2007; GAYOSO et al., 2005; LÓPEZ

et al., 2005). Boonchird e Flegel (1982) avaliaram a ação deste composto sobre 33 isolados de C.

neoformans onde a média das CIMs obtidas foi de 293 ± 52 µg/mL e Lemos et al. (2005)

demonstraram que mais de 90% dos isolados de C. neoformans foram inibidos a uma

concentração de 250 µg/mL, quando tratados com eugenol. Carrasco et al. (2012) avaliando a

atividade antifúngica do eugenol, encontraram valores de CIM de 250 µg/mL sobre C.

neoformans.

Quando comparamos a capacidade de inibição do crescimento fúngico do eugenol com os

OEs obtidos de C. zeylanicum observamos que 17,6% apresentaram valores iguais de CIM e para

S. aromaticum 29,4%, quando tratados com eugenol. Para os demais isolados, os valores foram

até quatro vezes maiores. Estes resultados demonstram que a capacidade antifúngica dos OEs de

C. zeylanicum e S. aromaticum não se deve exclusivamente a presença do eugenol. Sendo assim,

podemos inferir que outros componentes presentes nestes OEs em menores concentrações

também contribuem nesta capacidade de inibição fúngica.

As rosas além de amplamente cultivadas por sua beleza, são fontes para a obtenção de

extratos e óleos essenciais conhecidos por apresentarem propriedades antimicrobianas (YI et al.,

2007). A avaliação da atividade antifúngica do OE de R. centifolia, neste estudo, mostrou que na

CIM de 512 µg/mL houve inibição do crescimento em 70,6% dos isolados de fungos do

complexo C. neoformans, sendo classificada como atividade moderada. Não há relatos da

avaliação deste OE em outros fungos, apenas sua atividade antibacteriana, como demonstrada

DISCUSSÃO

58

por Hassanali (2003), sobre S. aureus, E. coli, S. typhi e S. pyogenes. Diante disso, estudo de sua

ação deve ser estendido a outros patógenos incluindo leveduras e fungos filamentosos.

O anis estrelado (I. verum) é uma planta muito utilizada na medicina popular asiática

(OKUYAMA; NAKAMURA; YAMAZAKI, 1993) e seu principal componente, o anetol, possui

atividade antifúngica descrita por Huang et al. ( 2010). Nosso trabalho evidenciou fraca atividade

antifúngica deste OE sobre fungos do complexo Cryptococcus, uma vez que as CIMs

encontradas foram ≥1024 µg/mL. Dados semelhantes foram encontrados por Prasath, Kumar e

Saravanamuthu (2013) quando o extrato obtido da flor de I. verum não foi capaz de formar halo

de inibição em contato com C. neoformans. Uma pesquisa conduzida por De et al. ( 2002),

mostrou CIM variando de 30 a 50 µg/mL sobre fungos do gênero Aspergillus quando tratados

com o anetol. Por outro lado, este OE demonstrou alta atividade sobre fungos patogênicos de

plantas, entre eles os gêneros Alternaria e Fusarium, com CIMs variando entre 0,07 a 0,25

mg/mL (aproximadamente 70 a 250 µg/mL) (HUANG et al., 2010).

O OE de J. virginiana tem ampla possibilidade de aplicação, incluindo antibacteriana e

antifúngica (SEMEN; HIZIROGLU, 2005). Neste trabalho, o OE de J. virginiana não foi capaz

de inibir o crescimento de fungos do complexo C. neoformans em CIMs < 1024 µg/mL. Valores

semelhantes aos encontrados neste trabalho foram observados sobre espécies fúngicas. Pires et

al., em 2011, avaliaram a ação antifúngica deste OE sobre isolados de C. parapsilosis e C.

orthopsilosis provenientes de circuito hidráulico de equipamento de hemodiálise. Estes

pesquisadores encontraram CIM de 1000 µg/mL para ambas espécies de Candida. O OE obtido

da madeira de J. virginiana demonstrou atividade com CIM de 1250 µg/mL enquanto que para o

óleo obtido das folhas a CIM foi de 650 µg/mL quando avaliados sobre C. albicans (STEWART

et al.,2014). Através da técnica de ágar difusão, este OE apresentou moderada atividade

antifúngica sobre Trichophyton mentagrophytes com halos de inibição de 13±1 mm (INOUYE;

USHIDA; ABE, 2006).

Os resultados deste presente estudo demonstraram que a CFM dos OEs avaliados e do

eugenol em mais de 50% dos isolados foram duas vezes maiores do que os valores da CIM,

sendo assim, podemos inferir que estes compostos são capazes de inibir o crescimento dos

isolados de fungos do complexo C. neoformans, exercendo ação fungicida em concentrações que

correspondem a duas vezes o valor da CIM encontrada.

DISCUSSÃO

59

Não foram encontrados relatos de valores de CFM dos OEs de C. zeylanicum, S.

aromaticum e R. centifolia sobre fungos do complexo C. neoformans, porém Khan et al. (2009)

demonstraram ação fungicida do OE de C. zeylanicum sobre isolados clínicos de C. albicans

com valores de CFM de 1560 µg/mL. Pinto et al. (2009), também verificaram propriedade

fungicida de S. aromaticum em concentrações correspondentes a duas vezes a CIM sobre

espécies de dermatófitos, com valores de CFM entre 0,16 e 0,32 µL mL-1 (aproximadamente 160

a 320 µg/mL).

Os valores de CFM encontrados em nossa avaliação do eugenol (512 e 1024 µg/mL)

corresponderam a duas vezes o valor da CIM em 70,6 % dos isolados analisados, mostrarando

que este componente apresentou considerável atividade fungicida sobre os agentes da

criptococose. Resultados semelhantes foram obtidos por Boonchird e Flegel (1981), onde a

análise de 33 isolados de C. neoformans tratados com eugenol determinou uma média de CFM

de 521 ± 164 µg/mL, duas vezes a CIM.

A metodologia de escolha para avaliação da associação entre C. zeylanicum, S.

aromaticum e seu composto majoritário, o eugenol com os fármacos anfotericina B e fluconazol,

em nosso trabalho, foi a de chequerboard. O estudo destas interações desempenha importante

papel, uma vez que novas formulações medicamentosas podem ser desenvolvidas a partir de

compostos sinérgicos.

Grande parte dos testes realizados com os antifúngicos anfotericina B e fluconazol

associados com o OE de C. zeylanicum foram classificados como indiferentes. Frente aos

resultados obtidos, foi verificado que a associação destes fármacos com C. zeylanicum não

acrescentaria benefícios ao tratamento da criptococose.

A interação entre S. aromaticum e anfotericina B sobre os 17 isolados do complexo C.

neoformans avaliados mostrou sinergismo, com redução dos valores iniciais de CIM em até oito

vezes. Os prováveis mecanismos responsáveis pela atividade sinérgica observada podem estar

relacionados com inibição das vias bioquímicas celulares essenciais para sobrevivência fúngica,

aumento da penetração do agente antifúngico na membrana celular facilitada pela ação de outro

antifúngico, inibição de proteínas transportadoras responsáveis pela extrusão do fármaco ou

inibição simultânea de diferentes alvos celulares (JHONSON et al., 2004). Os resultados

colaboram e estimulam para que este OE seja submetido a novos estudos, uma vez que

apresentou um importante aumento em sua atividade antifúngica, associado à anfotericina B,

DISCUSSÃO

60

principal fármaco utilizado no tratamento da criptococose. Esta ação sinérgica favoreceria a

terapia antifúngica, uma vez que, a dose efetiva mínima do fármaco poderia ser reduzida, além

de ser útil nos casos de falha terapêutica.

Embora outros estudos de interação dos OEs com anfotericina B e fluconazol sobre C.

neoformans, objetos deste trabalho, não tenham sido realizados, relatos de outras associações são

encontrados na literatura como a interação entre C. zeylanicum e nistatina sobre cepas C.

albicans avaliada pela metodologia de chequerboard por Castro et al. (2013). Valores de CIM

do OE determinados na associação foram reduzidos em 1/4 e os do fármaco em 1/8 quando

comparados com os valores individuais de onde os autores concluiram que a associação entre C.

zeylanicum e nistatina potencializou a ação inibitória do crescimento de C. albicans. Embora os

resultados de nosso trabalho não tenham demonstrado efeitos sinérgicos de C. zeylanicum com

anfotericina B e fluconazol, este OE foi capaz de potencializar a atividade antifúngica de outro

fármaco.

A interação do OE de S. aromaticum com fármacos anfotericina B e fluconazol também

foi avaliada sobre cepas ATCCs e isolados de C. albicans, sendo todas elas classificadas como

indiferentes (KHAN; MALIK; AHMAD, 2011).

A associação entre o eugenol e anfotericina B ou fluconazol não promoveu alteração da

atividade antifúngica nos isolados de fungos do complexo C. neoformans nesta pesquisa. Não

foram encontrados na literatura relatos de estudos da associação destes compostos sobre

Cryptococcus para comparação de resultados.

Uma pesquisa conduzida com isolados clínicos de Candida evidenciou que o tratamento

da infecção com fluconazol poderia ser suplementada com o eugenol, uma vez que foi

comprovado sinergismo na maioria dos isolados por chequerboard (AHMAD et al., 2010). Em

C. albicans a combinação de anfotericina B com o eugenol não alterou a atividade antifúngica do

fármaco (KHAN; AHMAD, 2012).

A quantificação dos esteróis foi realizada com o objetivo de determinar se os OEs e o

eugenol são capazes de interferir na biossíntese do ergosterol. A cepa C. gattii ATCC 24065

avaliada com fluconazol foi utilizada como parâmetro de comparação, uma vez que, o

mecanismo de ação deste fármaco é a inibição da síntese do ergosterol. Nossos resultados para o

OE de C. zeylanicum e S. aromaticum nos valores correspondentes a CIM promoveram inibição

total da síntese do ergosterol.

DISCUSSÃO

61

A análise do composto majoritário desses OEs, o eugenol, revelou que este componente

foi capaz de promover total inibição da síntese do ergosterol em concentrações correspondentes a

valores inibitórios e sub-inibitórios. Estes dados levam a concluir que provavelmente este

componente seja o responsável pela inibição da biossíntese do ergosterol observada nos OEs de

C. zeylanicum e S. aromaticum. Em leveduras do gênero Candida a atividade antifúngica do

eugenol tem como principal alvo a inibição da biossíntese de ergosterol, conforme demonstrado

por Ahmad et al. (2010). Pinto et al. (2009) também verificaram diminuição da síntese do

ergosterol em isolados de C. albicans quando tratados com ½ CIM de S. aromaticum e eugenol.

Neste trabalho, utilizou-se a citometria de fluxo para verificar a integridade das células

fúngicas quando expostas aos OEs e eugenol. O marcador PI foi utilizado nessa avaliação pela

sua capacidade de se ligar ao ácido nucleico das células evidenciando lesão de membrana

(PINA-VAZ et al. 2001). Os nossos resultados mostraram que o PI foi internalizado em mais de

80% das células fúngicas analisadas, sobre ação dos OEs obtidos de C. zeylanicum e S.

aromaticum e do eugenol, em concentração equivalente a CFM (1024 µg/mL), indicando que um

dos mecanismos de ação dos componentes avaliados envolve lesão de membrana celular com

consequente morte fúngica. Nas concentrações equivalentes a ½ CFM e ¼ da CFM também

ocorreu lesão de membrana nas células sob ação dos OEs e do eugenol, porém em porcentagens

menores sugerindo dose-dependência.

A capacidade dos OEs de lesionar membrana estaria relacionada com distintos processos

como a sua característica hidrofóbica, responsável pela ruptura da camada bilipidica celular, com

posterior alteração da permeabilidade e perda de conteúdo citoplasmático (BURT, 2004) e

devido à característica lipofílica dos OEs, eles atravessariam a parede e promoveriam o

rompimento e permeabilização das estruturas de membrana (PINA-VAZ, et al., 2004),

resultando em morte da célula fúngica.

Os valores obtidos através desta metodologia estão de acordo com outros relatos

encontrados na literatura. Pinto et al. (2009) atribuíram à S. aromaticum e ao eugenol a

capacidade de lesionar a membrana de leveduras do gênero Candida. Bennis et al. (2004)

analisando o mecanismo de ação do eugenol sobre Saccharomyces cerevisiae concluíram que

este componente não atua somente na membrana fúngica, mas em toda a parede celular.

Braga et al. (2007) através de análise morfológica de C. albicans por microscopia

eletrônica verificaram que o eugenol foi responsável por alteração morfológica da parede e

DISCUSSÃO

62

membrana celular. Esta interferência morfológica desempenha importante papel, uma vez que

interfere em fatores de virulência dos fungos, como por exemplo, as adesinas (CULICI et al.,

2005; PENDRACK; KLOTZ, 1995), e na inibição da transição para formar hifas reduzindo a

capacidade de colonizar o hospedeiro e consequentemente diminuindo a patogenicidade

(DOMER, 1989).

A análise do ensaio de curva de morte dos OEs foi realizada na concentração fungicida

mínima (1024 µg/mL) com o objetivo de determinar o tempo exato, em horas, da morte celular.

O efeito fungicida sobre C. gattii ATCC 24065 (redução ≥ 3log10 UFC/mL a partir do inóculo

inicial) (ESPINELL INGROFF, 1992) foi observado na concentração de quatro vezes a CIM, a

partir de 1 hora para C. zeylancium e S. aromaticum. O interesse da determinação do tempo de

morte está relacionado à implicações no tratamento, uma vez que, poderia aumentar a eficácia

com o ajuste da dose terapêutica.

Os glóbulos vermelhos humanos constituem uma ferramenta útil em estudos de

citotoxicidade de compostos, por serem de fácil obtenção, com características de membrana bem

conhecidas e sua lise é facilmente monitorada pela dosagem da hemoglobina liberada (SITU;

BOBEK, 2000). A avaliação da citotoxicidade realizada neste trabalho mostrou que ambos os

OEs, C. zeylancium e S. aromaticum, promoveram lise das hemácias somente em altas

concentrações (>1024 ug/mL) enquanto que o eugenol, nesta concentração, promoveu a lise em

1,6% das células avaliadas. Estes resultados de citotoxicidade permitem afirmar que estes OEs se

apresentam como compostos de baixa toxicidade, sendo possível a sua aplicação na pesquisa de

novos fármacos. Estudos avaliando a atividade citotóxica do OE de S. aromaticum e do eugenol

em eritrócitos humanos confirmam a baixa toxicidade destes compostos (HE et al., 2007;

MARYA et al., 2012).

CONCLUSÕES

63

8. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos neste trabalho permitiram concluir que:

1- Os OEs de I. verum , J. virginiana e R. centifolia inibiram o crescimento de fungos do

complexo C. neoformans em CIM ≥ 512 µg/mL, apresentando baixo potencial antifúngico.

2- Os OEs de C. zeylanicum e S. aromaticum, apresentaram importante ação antifúngica com

CIM ≤ 256 µg/mL e a atividade fungicida (CFM), em mais de 50% dos isolados, foi

observada na concentração correspondente a 2 vezes a CIM.

3- O componente majoritário dos OEs de C. zeylanicum e S. aromaticum, o eugenol, exerceu

atividade fungistática nas concentrações de 128 a 512 µg/mL e mais de 70% dos isolados

apresentaram ação fungicida em concentrações 2 vezes o valor da CIM.

4- A associação entre o OE de S. aromaticum com o fármaco anfotericina B mostrou uma

redução em até oito vezes a CIM individual do fármaco demonstrando um importante

aumento em sua atividade antifúngica. Essa associação pode representar uma nova opção

terapêutica para o tratamento da criptococose.

5- A avaliação do tempo da curva de morte evidenciou que C. zeylancium e S. aromaticum

foram capazes de exercer potente atividade fungicida sobre 100% das leveduras de C. gattii

ATCC 24065 no intervalo de tempo de uma hora.

6- O estudo do mecanismo de ação dos OEs obtidos de C. zeylanicum, S. aromaticum

demonstraram que estes foram capazes de inibir a síntese do ergosterol, bem como de

promover lesão de membrana em leveduras do complexo C. neoformans com importante

participação de seu composto majoritário o eugenol.

7- Foi observada uma baixa citotoxicidade dos OEs obtidos de S. aromaticum, C. zeylanicum e

do eugenol em eritrócitos humanos.

8- Nossos resultados sugerem que a utilização dos OEs de C. zeylanicum e S. aromaticum e

seu composto majoritário, o eugenol tem interessante potencial como opção terapêutica

sobre os agentes da criptococose.

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ANEXOS

90

10. ANEXOS

Anexo 1: Laudo técnico de Syzygium aromaticum (Eugenia caryophyllus)

ANEXOS

91

Anexo 2: Laudo Técnico de Illicium verum

ANEXOS

92

Anexo 3: Laudo Técnico de Juniperus virginiana

ANEXOS

93

Anexo 4: Laudo Técnico de Cinnamomum zeylanicum

ANEXOS

94

Anexo 5: Laudo Técnico de Rosa centifolia

ANEXOS

95

Anexo 6: Comprovação emitida pela FERQUIMA do composto majoritário presente no OE de C. zeylanicum (Canela folha).

ANEXOS

96

Anexo 7: Certificado de análise do eugenol emitido pela SIGMA-ALDRICH .

ANEXOS

97

Anexo 8: Artigo científico a ser submetido

TÍTULO: IN VITRO ANTIFUNGAL PROPERTIES OF SYZYGIUM AROMATICUM AND ITS MAIN CONSTITUENT, EUGENOL, AGAINST ISOLATES FROM THE CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS COMPLEX. Ana Flávia Mendonça, Maria do Rosário Rodrigues Silva, Fernando Yano Abrão, Orionalda de Fátima Lisboa Fernandes, Carolina Martins Treméa, Mariana Oliveira and Lúcia Kioko Hasimoto e Souza. Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás (UFG), Goiânia, Brazil Corresponding author: Ana Flávia Mendonça. E-mail: [email protected]

ABSTRACT Cryptococcosis is a fungal opportunistic disease, caused by the yeasts from the Cryptococcus neoformans complex, frequently associated with high rates of morbidity and mortality. Patients infected with the human immunodeficiency virus (HIV), transplanted or in use of immunosuppressive therapies are the main affected. Fluconazole and amphotericin B, applied in the treatment of the disease, are toxic to the patient and, their use for prolonged time, has selected resistant strains, making necessary to search for new compounds that shows good antifungal activity and low levels of toxicity. Thus, the essentials oils (EOs) from plants are promising for this purpose because their antimicrobial property has been already reported. The biological activity of essential oil (EO) from Syzygium aromaticum and its main constituent, eugenol, were investigated on clinical isolates from C. neoformans complex through tests of susceptibility, interaction with drugs like amphotericin B and fluconazole and cytotocicity assays. The EO obtained from S. aromaticum and eugenol, showed good antifungal activity with minimum inhibitory concentrations (MICs) ranging from 128 to 512 µg/mL and minimum fungicidal concentrations (MFCs) ranging from 256 to 1024 µg/mL. S. aromaticum exhibited an increase in its antifungal activity when combined with amphotericin B, decreasing the MIC until 1/8. Eugenol showed no change on its activity when associated with these drugs. Assays of hemolytic activity on human erythrocytes exhibit low toxicity of these compounds. These results demonstrate an effective antifungal activity of the EO from S. aromaticum and eugenol, indicating that these compounds might be promising antifungal agents.

KEY WORDS: Cryptococcus neoformans; Syzygium aromaticum; antifungal agents. RESUMO A criptococose é uma doença fúngica oportunística, causada por leveduras do complexo Cryptococcus neoformans, frequentemente associada com altas taxas de morbidade e mortalidade. Pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), transplantados ou em uso de terapias imunossupressoras são os principais afetados. Fluconazol e anfotericina B, aplicados no tratamento da doença, são tóxicos para o paciente e, o seu uso por períodos prolongados, tem selecionado cepas resistentes, sendo necessária a busca por novos compostos

ANEXOS

98

que apresentem boa atividade antifúngica e baixos níveis de toxicidade. Portanto, os óleos essenciais (OEs) das plantas são promissores para esta finalidade uma vez que sua propriedade antimicrobiana já tem sido descrita. A atividade biológica do óleo essencial (EO) de Syzygium aromaticum e o seu principal constituinte, eugenol, foram investigados sobre isolados clínicos do complexo C. neoformans através de testes de suscetibilidade, interação com os fármacos anfotericina B e fluconazol e ensaio de citotoxicidade. O OE obtido de S. aromaticum e o eugenol, demonstraram boa atividade antifúngica com concentrações inibitórias mínimas (CIMs) variando de 128 a 512 µg/mL e concentrações fungicidas mínimas (CFMs) variando de 256 a 1024 µg/mL. S. aromaticum exibiu um aumento em sua atividade antifúngica quando associado à anfotericina B, com diminuição da CIM em até 1/8. O eugenol não alterou sua atividade quando associado a estes fármacos. Ensaios da atividade hemolítica em eritrócitos humanos demonstraram baixa toxicidade destes compostos. Estes resultados demonstram uma eficaz atividade antifúngica do OE de S. aromaticum e eugenol, indicando que estes compostos podem ser agentes antifúngicos promissores. DESCRITORES: Cryptococcus neoformans; Syzygium aromaticum; antifúngicos. INTRODUCTION

Cryptococcosis, whose etiologic agent is an encapsulated yeast classified in the Cryptococcus neoformans complex, has become one of the most important opportunistic infections (Crowe et al. 1991, Chayakulkeeree & Perfect 2006) with a high prevalence in Brazil, especially in HIV-positive patients (Pappalardo & Melhem 2003). In the world this disease is considered a problem of public health (Del Poeta & Casadevall 2012). According to Infectious Diseases Society of American (IDSA) the main drugs used in the treatment of cryptococcosis are ampothericin B, fluconazole, fluocitosin and itraconazole (Perfect, 2010). However, these medications can cause side effects, cytotocicity (Amichai & Grunwald 1998) and their prolonged use, specially amphotericin B and fluconazole, increase the number of cases of resistant isolates (Srinivasan et al. 2014). These facts underscore the need to look for more effective and less toxic antimicrobial agents that can be used in the development of new therapeutic strategies (Lin 2009). Therefore, its of great importance the evaluation of the antifungal activity of exctracts and essential oils from plants, which can serve for the selection of natural compounds that can be use as new active ingredients in drugs development (Violante et al. 2012).

Syzygium aromaticum (Eugenia caryophyllata), commonly known as India’s clove, is classified in the Myrtaceae family (Pinto et al. 2009, Alitonou et al. 2012). It is a spice widely used in cooking and in the treatment of dental and respiratory problems, headache and sore throat, mainly in Asian countries and Australia (Gurib-Fakim 2006, Chaieb et al. 2007). This plant also presents antimicrobial properties (Alitonou et al. 2012) comprising antifungal activity (Pinto et al. 2009). The major phenolic component of S. aromaticum and other aromatic plants is eugenol (Ahmad et al. 2010) whose antifungal properties have been described in literature (Gayoso et al. 2005, He et al. 2007).

The antifungal activity from the EO obtained from S. aromaticum and eugenol, was evaluated in vitro against Candida species and dermatophytes from onychomycosis. Both

ANEXOS

99

compounds used in the study were considered as an option in the handling of drugs that act in this mycosis due to significant activity against these yeasts and molds (Gayoso et al. 2005). Filamentous fungi, such as Aspergillus niger, by agar disc diffusion technique, had its growth inhibited in the presence of the clove’s essential oil (Pawar & Thaker 2006). There are few papers in the literature that describes the activity of S. aromaticum EO and eugenol against C. neoformans, so the present work was an attempt to understand the mechanism of antifungal activity of these compounds against Cryptococcus species for its application in the treatment of the cryptococcosis alone or in combinatorial therapies. MATERIALS AND METHODS

Microorganisms

All the 17 isolates from the C. neoformans complex used in this study belongs to the culture collection of the Mycology Laboratory of the Tropical Pathology and Public Health Institute of Federal University of Goiás, Brazil. Fifteen of them were clinical isolates from human immunodeficiency virus-infected patients, obtained from Tropical Diseases Hospital Dr. Anuar Auad, Goiânia, Goiás, Brazil (Ethics Committee Protocol no. 004/03) and the others were C. neoformans ATCC 28957 and C. gattii ATCC 24065. Candida parapsilosis ATCC 22019 was used as reference strain for susceptibility tests. The stock cultures were maintained on Sabouraud dextrose agar medium (SDA, Difco) at 25°C.

Essential oil and eugenol

The essential oil obtained from S. aromaticum was commercially acquired from Ferquima

Industria e Comercio Ltda. (Vargem Grande Paulista, São Paulo, Brazil). The eugenol was commercially acquired from Sigma-Aldrich (St. Louis-Mo-EUA).

Antifungal susceptibility testing

Broth microdilution protocols based on the CLSI reference document M27- S4 (CLSI, 2012) were used to determine MIC values for the 17 isolates from the C. neoformans complex. Briefly, twofold serial dilutions, in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) broth, with final concentrations ranging from 2 to 1024 µg/mL for S. aromaticum and eugenol were tested, and the inoculum was prepared in a saline sterile solution (NaCl-0.85%) with 103 yeasts/mL. After 72 hours the minimal inhibitory concentration (MIC) were defined as the lowest test concentrations causing complete growth inhibition. To determine minimal fungicidal concentration (MFC) values, after reading the corresponding MIC values, 10 µL of samples from the concentrations corresponding to MIC, twofold MIC and fourfold MIC were subcultured on Sabouraud dextrose

ANEXOS

100

agar. MFC were determined as the lowest concentration which there was no visible or just one colony growth after incubation at 35°C for 72 hours (De Logu et al. 2005).

In vitro interaction of S. aromaticum and eugenol with amphotericin B and fluconazole

The drug interaction with the EO and eugenol was studied using the chequerboard

microdilution assay in 96 well microtitre plates. Assays were performed with all isolates. The effect of the association between the compounds and amphotericin B and fluconazole was determined by the FICI (Fractional Inhibitory Concentration Index) calculation. FICIs were defined as synergistic for values ≤ 0.5, indifferent for 0.5 < FICI ≤ 4 and antagonistic for values > 4 (White et al. 1996). Hemolytic assay

Human erythrocytes were collected in tubes containing EDTA, following the method of He et al. (2007) with modifications, and they were centrifugated for 10 min. at 2,000 rpm and washed three times in PBS. After that, the erythrocytes were diluted 1:5 in PBS and 50 uL was added to twofold dilution series (50 uL) of EO or eugenol or amphotericin B. The tubes were incubated with shaking for 30 min. at 37°C and then centrifuged for 5 min. at 3,000 rpm. The supernatant fluid was transferred to a microtiter plate and the absorbance was measured spectrophotometrically at 560nm. Triton X-100 1% was used as control promoting total hemolysis. The percentage of hemolysis was calculated as follows: [(A560 of EO/eugenol/amphotericin B treated sample – A560 of buffer treated sample)/ (A560 of Triton X-100 treated sample – A560 of buffered treated sample)] x 100%.

RESULTS

The MIC values of the EO obtained from S. aromaticum against isolates from the C.

neoformans complex observed in this study showed antifungal activity with inhibition of 23.5% in a concentration of 128 µg/mL. At these concentration, eugenol was capable to inhibit only 5.9 % of the isolates. The MFCs values obtained for these compounds showed that more than 50% of all tested isolates were fungicidal in concentrations twofold the values of CIM. These results are shown in Table 1.

ANEXOS

101

Table 1. In vitro antifungal activity of Syzygium aromaticum and eugenol against 17 isolates from the C. neoformans complex.

Concentration ( µg/mL) S. aromaticum Eugenol

MIC (%) MFC (%) MIC (%) MFC (%) 128 23.5 0 5.9 0 256 76.5 11.8 41.2 0 512 0 76.4 52.9 47 1024 0 11.8 0 53

The association between the EO obtained from S. aromaticum and amphotericin B

demonstrated FICIs values ranging from 0.155 to 0.37. The association of these EO with fluconazole showed FICIs values ranging from 1.25 to 8.125 and for 7 isolates FICIs were > 4.0. The association of eugenol and amphotericin B or fluconazole showed in all isolates were classified as indifferent, ranging from 0.56 to 1.25 and 1.03 to 2.25 respectively.

The effects of EO of S. aromaticum on human red blood cells showed that in concentrations ranging from 1024 to 128 µg/mL does not occur hemolysis and for eugenol the hemolysis observed was < 1.6%.

DISCUSSION AND CONCLUSIONS

The search for antimicrobial agents derived from plants have become increasingly growing, since the treatment of fungal infections is not always effective despite the tremendous progress in medicine in the recent decades. The great diversity of chemical components obtained from plants makes them become widely researched due to the potential for the development of new drugs (Vila et al. 2013). Our findings suggest options for expanding the utility of the EO obtained from S. aromaticum and its main constituent, eugenol as active principles for the development of new drugs.

EO from S. aromaticum demonstrated antifungal activity against C. neoformans using different methodologies, agar dilution and disk diffusion (Viollon & Chaumont, 1994, Kirui et al. 2014), confirming the results obtained in our work, showing potential antifungal activity of this EO.

Similar to our values for MICs with eugenol, Lemos et al. (2005) demonstrated that 90% of isolates from C. neoformans were inhibited in a concentration of 250 µg/mL. The results of MICs obtained with the use of eugenol, in our work, showed that this compound is important for the antifungal activity of the EO, but other components in smaller quantity may also contribute to this activity. The MFCs values showed important fungicidal activity for more than 50% of the isolates tested with EO or eugenol in concentrations twofold MICs values.

In the association assay, the best result observed was that the interaction between the EO of S. aromaticum and amphotericin B showed high synergism (100% of the tested isolates). Our

ANEXOS

102

findings are encouraging in view of the growing treatment failures and the resistance that have already been related with the use of fluconazole and amphotericin B and suggest a way of treating resistant agents of cryptococcosis through a drug combination approach.

Human red blood cells provide a handy tool for studying the toxicity of compounds (Ahmad et al. 2011). These cytotoxicity results have revealed that the EO/eugenol present as compounds of low toxicity been possible its application in the research for new drugs. Studies evaluating the cytotoxicity activity of S. aromaticum and eugenol in human erythrocytes confirm the low toxicity of these compounds (He et al. 2007, Marya et al. 2012).

To conclude, this work suggests that the clove oil from S. aromaticum and its main constituent, eugenol has interesting antifungal activity against the agents of the cryptococcosis. Besides, these compounds presented low toxicity and a high synergistic effect between the EO of S. amoraticum and amphotericin B. All these put together should encourage further studies in order that the use of these components as a new antifungal can become a reality. REFERENCES

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