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1051Atividade antimicrobiana de leos essenciais de condimentos frente a amostras de Escherichia coli...

Cincia Rural, v.41, n.6, jun, 2011.

Cincia Rural, Santa Maria, v.41, n.6, p.1051-1056, jun, 2011

ISSN 0103-8478

Deise Flores SanturioI* Mateus Matiuzzi da CostaII Grazieli MaboniIII Carlos Pasqualin CavalheiroIMariangela Facco de SIII Marcelo Dal PozzoIII Sydney Hartz AlvesIII Leadir Lucy Martins FriesI

Atividade antimicrobiana de leos essenciais de condimentos frente a amostras deEscherichia coli isoladas de aves e bovinos

Antimicrobial activity of spice essential oils against Escherichia coli strains isolated frompoultry and cattle

Recebido para publicao 23.11.10 Aprovado em 20.03.11 Devolvido pelo autor 08.05.11CR-4430

RESUMO

A discutida questo da substituio do uso deantibacterianos em raes (promotores de crescimento) requerurgentes alternativas. Face s necessidades de inibidoresmicrobianos nesses alimentos, os leos essenciais (OES) seconstituem em alternativa, sob avaliao. Neste estudo, avaliou-se a atividade antimicrobiana dos OES de Origanum vulgare(organo), Thymus vulgaris (tomilho), Cinnamomumzeylanicum (canela), Lippia graveolens (organo mexicano),Zingiber officinale (gengibre), Salvia officinalis (slvia),Rosmarinus officinalis (alecrim) e Ocimum basilicum(manjerico) frente a amostras de Escherichia coli isoladas defezes de aves (n=43) e de bovinos (n=36). A concentraoinibitria mnima (CIM) e a concentrao bactericida mnima(CBM) foram determinadas para cada isolado atravs datcnica de microdiluio em caldo, a partir da mximaconcentrao de 6400g mL-1 de cada OE testado. Observou-se atividade antimicrobiana para os OES de organo, organomexicano, tomilho, canela. Para todas as amostras testadas,independente de sua origem, os OES mais e menos efetivosquanto atividade antimicrobiana foram o organo e a canela,respectivamente. Esses resultados confirmaram o potencialantibacteriano de alguns OES, os quais merecem novasinvestigaes abordando sua adio na alimentao de aves ebovinos.

Palavras-chave: Escherichia coli, leos essenciais, atividadeantimicrobiana.

ABSTRACT

The discussed issue about replacing the use ofantibiotics in animal feed (growth promoters) requires emerging

alternatives. To meet the needs of microbial inhibitors in thesefoods, the essentials oils (EOS) constitute potential alternativesunder evaluation. In this study it was evaluated the antimicrobialactivities of EOs from Oreganum vulgare (oregano), Thymusvulgaris (thyme), Lippia graveolens (Mexican oregano),Cinnamomum zeylanicum (cinnamon), Zingiber officinale(ginger), Salvia officinalis (sage), Rosmarinus officinalis(rosemary) and Ocimum basilicum (basil) against Escherichiacoli strains isolated from poultry (n=43) and cattle faeces (n=36).The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimumbactericidal concentration (MBC) were determined for eachisolate by using the broth microdilution technique, from themaximum concentration of 6400g mL-1 of each OE tested.Antimicrobial activity was observed on the essential oils oforegano, mexican oregano, thymus and cinnamon. For allstrains tested, regardless of their origin, the OES more and lesseffective as antimicrobial activity were oregano and cinnamon,respectively. These results confirm the antimicrobial potentialof some EOs, which deserve further research, addressing theaddition of essential oils in poultry and cattle feeding.

Key words: Escherichia coli, essential oils, antimicrobialactivity.

INTRODUO

Escherichia coli a espcie predominanteentre as bactrias intestinais anaerbicas facultativase no esporuladas, pertencendo famliaEnterobacteriaceae, sendo um bacilo Gram-negativofermentador da glicose e lactose com produo de cido

IDepartamento de Cincia e Tecnologia dos Alimentos, Centro de Cincias Rurais (CCR), Universidade Federal de Santa Maria(UFSM), Av. Roraima, 1000, Prdio 42, Camobi, 97105-900, Santa Maria, RS, Brasil. E-mail:[email protected]. *Autorpara correspondncia.

IIFundao Universidade Federal do Vale do So Francisco, Petrolina, PE, Brasil.IIIDepartamento de microbiologia e parasitologia, Centro de Cincias da Sade, UFSM, Santa Maria, RS, Brasil.

1052 Santurio et al.


e gs, dentre alguns atributos teis na sua identificao(ITO et al., 2007).

Alimentos de origem animal submetidos aalgum processo, como o caso da carne moda, tmsido identificados como importante veculo detransmisso de E. coli do sorotipo O157:H7 e outrasSTEC (E. coli produtora de toxina Shiga), isoladas detoxinfeces alimentares no homem (GRIFFIN &TAUXE, 1991). Os bovinos tm sido considerados umimportante reservatrio de E. coli, produtoras da toxinaShiga (SARIDAKIS et al.,1997).

Entre os patgenos bacterianos causadoresde infeco em aves, Escherichia coli destaca-se comoum dos principais agentes responsveis por perdaseconmicas na indstria avcola. As E. coli patognicaspara aves (APEC) representam um conjunto de isoladoscapazes de determinar doenas extra-intestinais comoaerossaculite, pericardite e septicemia (ITO et al., 2007),geralmente denominadas como colibacilose.

A colibacilose pode ser controlada pormedidas profilticas e uso de antibacterianos(McMULLIN, 2004). No entanto, a adio deantibacterianos em doses subclnicas (promotores decrescimento) tem gerado preocupaes como aemergncia de bactrias resistentes bem como aindesejada presena de seus resduos em derivadoscrneos, leite e ovos (WHO, 2003). Nesse contexto,alternativas substitutivas aos antibacterianos sourgentemente requeridas tais como o uso de leosessenciais e/ou extratos herbais (BRUGALLI, 2003).

Os leos Essenciais (OES), derivados deplantas utilizadas como condimentos, representamcomplexas misturas de substncias naturais,tradicionalmente utilizadas para acentuar gosto ouaroma de alguns alimentos. Constituem-se desubstncias, cujos componentes incluemhidrocarbonetos terpnicos, lcoois simples, aldedos,cetonas, fenis, steres, cidos orgnicos fixos, emdiferentes concentraes, em que um compostofarmacologicamente ativo majoritrio (SIMES &SPITZER, 2000). A maior parte da atividadeantimicrobiana de OES parece estar associada aoscompostos fenlicos (SIMES & SPITZER, 2000). Oefeito antimicrobiano est relacionado, principalmente, alterao da permeabilidade e integridade damembrana celular bacteriana (LAMBERT et al., 2001).

Este estudo teve como objetivos: a) avaliara atividade antibacteriana in vitro dos leos essenciaisde condimentos Cinnamomum zeylanicum (canela),Lippia graveolens (organo mexicano), Ocimumbasilicum (manjerico), Origanum vulgare (organo),Rosmarinus officinalis (alecrim), Salvia officinalis(slvia), Thymus vulgaris (tomilho) e Zingiberofficinale (gengibre) sobre amostras de E. coli. isoladas

de aves e bovinos; b) comparar a atividade dos OESsobre isolados com perfis de susceptibilidade e deresistncia a antibacterianos diversos.

MATERIAL E MTODOS

MicrorganismosForam estudadas 79 amostras de

Escherichia coli, sendo 43 isoladas de fezes de aves e36 de fezes de bovinos, provenientes do Laboratriode Pesquisas Micolgicas da Universidade Federal deSanta Maria (UFSM). Todas as amostras foram isoladasde animais sadios.

Teste de suscetibilidade aos antimicrobianosOs testes de suscetibilidade aos

antimicrobianos foram realizados pelo mtodo dedifuso em gar (CLSI M31-A3; 2008) utilizando-se:ampicilina (10g), sulfametoxazol+trimetoprim (25g),ceftriaxona (30g), ciprofloxacina (5g), gentamicina(10g), estreptomicina (10g), cido nalidxico (30g),ceftiofur (30g), amoxicilina (10g), amoxicilina+cidoclavulnico (30g), imipenem (10g), doxiciclina (30g),obtidos comercialmente (DME; Araatuba, So Paulo,Brasil).

leos essenciaisForam utilizados os leos essenciais de

canela, organo mexicano, manjerico, organo, alecrim,slvia, tomilho e gengibre, obtidos comercialmente, emfrasco mbar, lacrados, com volumes de 5ml ( Essential7.com; Roewell, New Mexico, USA).

Determinao das concentraes inibitrias mnimasAps pesagem de 1g, cada leo essencial

foi diludo com metanol at atingir a concentrao de640mg ml-1 (soluo I). A seguir, foi diludo naproporo de 1:100 em Caldo Muller-Hinton, obtendo-se a concentrao de 6400g ml-1 (soluo II). Combase no documento M31-A3 do CLSI (2008), volumesde 100l de caldo Muller-Hinton eram distribudos nospoos de uma placa de microtitulao. Em seguida,100l da soluo II eram acrescidos ao primeiro poo e,aps homogeneizao, transferia-se para o segundo eassim sucessivamente, obtendo-se concentraesfinais de 3200, 1600, 800, 400, 200, 100g ml-1. Ascolnias de E. coli foram desenvolvidas no garMuller-Hinton, suspensas em soluo salina 0,085%obtendo-se uma turvao equivalente ao tubo 0,5 daEscala Mac Farland (1x108UFC ml-1). Desta suspenso,inoculava-se 10l (1x105UFC ml-1) em cada poo jcontendo os leos essenciais. As microplacas eramincubadas durante 24h/35C, em condies deaerobiose. A CIM consistiu na menor concentrao do



leo essencial capaz de causar inibio total docrescimento bacteriano. Esses ensaios foram realizadosem triplicata.

Determinao das concentraes bactericidas mnimasDefinidas como as menores concentraes

dos leos essenciais capazes de causar a morte doinculo, foram determinadas a partir dos poos onde,aps 24h de incubao no havia crescimentobacteriano visveis. Destes transferia-se uma alquotade 10l para a superfcie do gar Muller-Hinton. Aps24h de incubao a 35C, registrava-se a menorconcentrao dos leos essenciais, nos quais no seevidenciava crescimento bacteriano. Esses ensaiosforam tambm realizados em triplicatas.

Anlise estatsticaO teste no paramtrico de Mann-Whitney

foi empregado para comparar duas amostrasindependentes, visando a observar se os diferentesgrupos em estudo apresentavam perfis desuscetibilidade semelhantes ou no, frente adeterminado leo essencial.

RESULTADOS

Os isolados includos neste estudoevidenciaram variaes na suscetibilidade frente aosdiferentes leos essenciais (OES). As mdiasgeomtricas para as Concentraes Inibitrias Mnimas(CIMs) e Concentraes Bactericidas Mnimas (CBMs),frente a E. coli isoladas de bovinos foram: Origanumvulgare [CIM=831,4g ml-1 e CBM=915,4g ml-1],

Lippia graveolens [CIM=1131,4g ml-1 eCBM=1345,4g ml-1], Thymus vulgaris [CIM=2095,1gml-1 e CBM=2262,7g ml-1], Cinnamomun zeylanicum[CIM=4354,5g ml-1 e CBM=5486,4g ml-1] e frente a E.coli isolados de aves foram Origanum vulgare[CIM=750,1g ml-1 e CBM=895,5g ml-1], Lippiagraveolens [CIM=1508,7g ml-1 e CBM=2173,4g ml-1],Thymus vulgaris [CIM=1941,5g ml-1 e CBM=2005,1gml-1] Cinnamomun zeylanicum [CIM=3098,5g ml-1 eCBM=4075,3g ml-1]. No presente estudo, os OES degengibre, manjerico, alecrim e slvia no evidenciaramatividade antibacteriana frente aos microrganismosavaliados. A mdia geomtrica das CIMs indicou queo OE de organo foi o mais ativo para os isolados deaves do que de bovinos (P



promotores de crescimento (HUGHES et al., 2008). NoBrasil, h crescente presso pelas mesmas restries,por isso alternativas substitutivas aos antimicrobianostradicionalmente utilizados esto sob investigao(BRUGALLI, 2003).

As propriedades antimicrobianas dos leosessenciais de plantas aromticas so reconhecidasdesde a Antiguidade (SIMES & SPITZER, 2000).Neste estudo, avaliou-se a atividade antibacteriana deOES, obtidos de plantas condimentares sobre E. colipatognica para aves e bovinos. Os OES de organo,organo mexicano, tomilho e canela evidenciaramatividade antimicrobiana frente a E. coli com variadoperfil de susceptibilidade a antibacterianos.

A destacada atividade antimicrobiana do O.vulgare frente a E. coli de vrias origens confirmou

estudos anterioes. SMITH-PALMER et al. (1998) eHFERL et al. (2009) relataram importante atividadeantimicrobiana do OE de organo frente a bactriasGram positivas e Gram negativas, incluindo E. coli.BURT et al. (2003) observaram que os leos essenciaisde organo e tomilho possuem significativa atividadebacteriosttica e bactericida frente E. coli O157:H7,isoladas de fezes de bovinos. Os compostos fenlicoscarvacrol e timol, enquanto fraes majoritrias,garantem tais atividades. Essa atividade tambm temsido relatada frente a fungos leveduriformes sensveise resistentes aos antimicticos (POZZATTI et al., 2010).

A Lippia graveolens (organo mexicano oulipia) uma planta condimentar originria do Mxico. Acomposio de seu OE exibe significativos teores decarvacrol (0,47-24,84%) e timol (0,22-60,6%) (SNCHEZ

Tabela 2 - Relaes entre o perfil de resistncia de E. coli a antimicrobianos e a susceptibilidade a leos essenciais.

--------------------------Variaes das CIMs (g ml-1)-------------------------Subgrupo (n) Perfil de resistncia

Ov Lg Tv Cz

1 (16) no resistente 400-800 800-3200 1600-3200 32002 (3) DOX 400-800 1600-3200 1600-3200 32003 (4) AMO 400-1600 1600-3200 1600 1600-64004 (1) EST 400 1600 1600 32005 (3) DOX-EST 400-1600 1600-3200 1600-3200 1600-32006 (5) EST-AMO 400-1600 1600-3200 1600-3200 32007 (1) SUT-EST 1600 1600 1600 32008 (1) AMP-AMO 800 3200 1600 32009 (1) DOX-AMOX 1600 3200 3200 320010 (2) AMP-EST-AMO 800 800-3200 1600 320011 (1) AMC-EST- AMO 800 1600 1600 320012 (1) DOX -EST-AMO 400 1600 3200 320013 (1) DOX-AMC-AMO 400 1600 3200 320014 (1) AMC-EST-GEN 1600 1600 1600 320015 (1) CTF-NAL-EST-AMO 1600 3200 3200 3200

E. c

oli d

e av

es

16 (1) SUT-DOX-EST-GEN 800 1600 1600 3200

1 (9) no resistente 400-1600 800-1600 1600-6400 3200-64002 (14) AMO 400-1600 800-1600 1600-6400 3200-64003 (1) DOX 800 1600 3200 32004 (4) EST 800 800-1600 1600-3200 3200-64005 (1) EST-AMO 800 800 1600 32006 (1) NAL-EST 1600 800 3200 32007 (1) AMC-AMO 800 1600 1600 64008 (2) NAL-AMO 400-800 1600 1600 3200-64009 (3) AMC-EST-AMO 1600 800 1600 320010 (5) SUT-DOX-AMC-EST-AMO 800 800 1600 3200

E. c

oli d

e bo

vino

s

11 (5) AMP-DOX-AMC-EST-AMO 1600 1600 3200 3200

AMP = ampicilina ; SUT = sulfametoxazol+trimetoprim; GEN = gentamicina; EST= estreptomicina; NAL = cido nalidixico ; AMO =amoxicilina; AMC = amoxicilina + cido clavulnico; CTF = ceftiofur; DOX = doxiciclina; CIMs = Concentraes Inibitrias Mnimas; (n)nmero de isolados; Ov = Oreganum vulgare; Lg = Lippia graveolens;Tv = Thymus vulgaris.



et al., 2010). Vrios estudos j evidenciaram atividadeantimicrobiana (CIM=2000g ml-1) sobre E. coli ATCC11229 (SNCHEZ et al., 2010); todavia, no presenteestudo, detectou-se melhor potencial antimicrobianoMG das CIMs=1508,7g ml-1 (E. coli de aves) e MGdas CIMs=1131,4g ml-1 (E. coli de bovinos) que orelatado por SANCHEZ et al. (2010).

Com base na composio mdia quantitativadas fraes majoritrias carvacrol e timol nos OES deorgano (carvacrol 66%; timol 1,0%) (HFERL et al.,2009) lipia (carvacrol 38%; timol 3.0%) (SANCHES etal., 2010) e tomilho (carvacrol 80%). HFERL et al. (2009) relataramfraca atividade do OE de folhas da canela (eugenol =74%) frente a E. coli. Em contrapartida, BASKARANet al. (2009) ressaltaram a frao cinamaldedo comomais ativa do que carvacrol, eugenol e timol. Assim, aatividade do OE de canela dependente da parte dovegetal do qual extrado, o que pode justificar asdiscrepncias acima apontadas.

Frente aos OES de alecrim, slvia, manjericoe gengibre, os resultados aqui apresentados noevidenciaram atividade antimicrobiana. Todavia,VIUDA-MARTOS et al. (2008) e DELAMARE et al.(2007) relataram atividade antimicrobiana dos OES deslvia e alecrim frente a Staphylococcus spp,Enterobacter gergoviae, E. amnigenus, Lactobacillussakei, e L. curvatus. A disparidade entre os resultadosencontrados neste trabalho e os relatados por essesautores pode ser atribuda composio dos OES ous tcnicas empregadas. Neste estudo, foi utilizada atcnica de microdiluio em caldo, com base nodocumento M31- A3 do CLSI (2008) para determinaodas CIMs e CBMs. A inexistncia de uma tcnicainternacionalmente padronizada para avaliao de OESe extratos vegetais permite que diferentes protocolossejam utilizados, o que compromete as comparaesde resultados VIUDA-MARTOS et al. (2008) e SMITH-PALMER et al. (1998).

No presente estudo, a atividade dos OESsobre os subgrupos de E. coli com diferentes perfis deresistncia foi independente do maior ou menor padrode resistncia aos antibacterianos, o que est de acordocom outros autores. SI et al. (2008) relataram a atividadedo OE de organo sobre E. coli ESBL (extended-spectrum -lactamase) resistentes a mltiplosantibacterianos; MAHBOUBI & BIDGOLI (2009)relataram que o OE de Zataria multiflora (condimentoiraniano semelhante ao tomilho) composto por timol(38%), carvacrol (15,3%) e p-cimene (10,2%) apresentouatividade antimicrobiana similar frente a isolados deStaphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA)e sensveis (MSSA). Frente a Candida, sensveis eresistentes ao fluconazol. POZZATTI et al. (2010)relataram atividade antifngica dos OESindependentemente do perfil de resistncia dosmicrorganismos.

O grande nmero de isolados e a variadaprocedncia garantiram a heterogeneidade das amostrasde E. coli para melhor avaliar a atividade antimicrobianadestes OES. A constatao de que a atividade dos OESde organo, organo mexicano, tomilho e canela independente da susceptibilidade aos antibacterianostestados refora a condio desses OES comocandidatos a substituir antibacterianos, usados naalimentao de aves e bovinos.

CONCLUSO

Este estudo permitiu concluir que: a) osleos essenciais de organo, organo mexicano,tomilho e canela apresentaram atividade bactericidafrente a E. coli isolados de aves e bovinos; b) o leoessencial de organo apresentou atividadeantimicrobiana (CIMs e CBMs) superiores aos leosessenciais de organo mexicano, tomilho e canela; c) asusceptibilidade aos leos essenciais foi semelhanteentre subgrupos de isolados, independente daresistncia aos antimicrobianos testados.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Conselho Nacional deDesenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), pelo apoiofinanceiro.

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