aspectos bioeletroquÍmicos de dendrÍmeros como nanoplataformas.pdf

7/25/2019 ASPECTOS BIOELETROQUMICOS DE DENDRMEROS COMO nanoplataformas.pdf

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ITAJUB UNIFEI

Programa de Ps Graduao em Materiais para EngenhariaDepartamento de Fsica e Qumica/ Instituto de Cincias Exatas

Dissertao de Mestrado

Alessandra Nogueira Santos

ASPECTOS BIOELETROQUMICOS DE DENDRMEROS COMONANOPLATAFORMAS PARA APLICAES CLNICAS

Itajub / MG

2008


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ASPECTOS BIOELETROQUMICOS DE DENDRMEROS COMO

NANOPLATAFORMAS PARA APLICAES CLNICAS

Dissertao apresentada ao Curso de Mestrado daUniversidade Federal de Itajub, como requisito para a

obteno do ttulo de mestre em Cincias dos Materiais paraEngenharia.

rea de concentrao: Biomateriais

Orientador: Prof. Dr. lvaro Antnio Alencar de Queiroz - UNIFEI

Co-orientador: Prof. Dr. Demtrio A. Werner Soares - UNIFEI

Itajub / MG2008


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ASPECTOS BIOELETROQUMICOS DE DENDRMEROS COMONANOPLATAFORMAS PARA APLICAES CLNICAS


Dissertao apresentada ao Curso de Mestrado daUniversidade Federal de Itajub, como requisito para a

obteno do ttulo de mestre em Cincias dos Materiais paraEngenharia.

rea de concentrao: Biomateriais

Aprovada por:

_____________________________________________ (Orientador)

Prof. Dr. lvaro Antnio Alencar de Queiroz- UNIFEI

_____________________________________________ (Co- orientador)

Prof. Dr.Demtrio Arthur Werner Soares- UNIFEI

_____________________________________________

Prof. Dr. Rodrigo Gribel Lacerda- UFMG

_____________________________________________

Prof. Dr. Alexandre Carlos Brando Ramos- UNIFEI

Itajub / MG2008


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Agradecimentos

A Deus, que mais uma vez permaneceu ao meu lado me dando fora e sade para vencer

todos os obstculos surgidos.

Aos meus pais, Araci Augusto e Diva, pelo esforo contnuo para que eu pudesse ir busca

da realizao de um sonho.

Aos meus filhos, Victor Augusto e Arthur, demonstrando uma maturidade incomum s suas

idades.

Ao meu irmo Fbio Nogueira, exemplo de garra e sabedoria.

Ao professor Dr. lvaro Antnio Alencar de Queiroz, exemplo de competncia, amizade e

acima de tudo, paixo pela cincia.

Ao professor Dr. Demtrio Arthur Werner, por ter acreditado em mim, pela pacincia,

pelos conhecimentos transmitidos e pela co-orientao.

Ao professor Dr. cio pelo incentivo, amizade e pelos ensinamentos.

Ao professor Dr. Luiz Francisco Pontin pela amizade, pacincia, incentivo e pelas

contribuies.

profesora Dra. Ana Cludia pelas colaboraes, amizade e pelos conselhos.

professora Dra.Maria Helena e seu esposo professor Dr. Filiberto, pela amizade e

confiana.

Aos demais professores que de alguma forma contriburam para o meu desenvolvimento

cientfico.

Aos tcnicos de laboratrio Glauber e Kal, por sempre me fornecerem todas as

ferramentas necessrias para o desenvolvimento de meu trabalho e pela amizade.


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s funcionrias da PRPPG, em especial Maria Alta, Snia, Margarete e Cristina.

Aos funcionrios da secretaria do ICE-UNIFEI, em especial Roseli, Marlia, Edvandra, e

Helinho.

Aos profissionais da sade, Dr.Vincius e Dr. Alessandro, exemplos de competncia.

Aos responsveis pelos laboratrios de anlises clnicas Carlos Chagas, Pasteur, Prestolab,

Dalmo Coutinho, Laboratrio Darto; pelas informaes e experincias transmitidas.

Aos amigos mestres Edson Fernandes, Nirton Cristi, Mayler Martins e Vanessa Giarola

pelas contribuies.

Aos colegas de classe, em especial, Wagner, Marcelo, Amaury, Adelaine, Alexandra,

Janderson, Celso, Fabiana, Cristiano, enfim, a todos os colegas, pelo apoio e amizade.

Capes pelo auxlio financeiro.

Por fim, a todos que, com seus conhecimentos, incentivos e crticas colaboraram para o

desenvolvimento deste trabalho.


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Sumrio i

SUMRIO

Lista de Figuras v

Lista de Tabelas ix

Lista de Abreviaturas x

Resumo xii

Abstract xiv

Introduo 1

Captulo 1 Biossensores para a monitorao de hemometablitos 4

1.1 Introduo 4

1.2 Histrico do desenvolvimento dos biossensores e o Estado da arte 5

1.3 Biossensores eletroqumicos 8

1.3.1 Biossensores amperomtricos 9

1.3.2. Biossensores potenciomtricos 12

1.3.3 Biossensores pticos 14

1.3.4 Biossensores piezoeltricos 15

1.3.5 Biossensores trmicos ou calorimtricos 16

1.4 Consideraes parciais 18

1.5 Referncias 19

Captulo 2 A natureza qumica das enzimas 22

2.1 Noes gerais 22

2.2 Classificao das enzimas24

2.3 Mecanismos das reaes catalisadas por enzimas 25

2.4 Stio ativo cataltico 27

2.4.1 Modelo chave-fechadura 28

2.4.2 Modelo do encaixe induzido 28


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Sumrio ii

2.5 Mecanismos catalticos 29

2.6 Fatores que influenciam a atividade enzimtica 33

2.7 Tcnicas de imobilizao 36

2.7.1 Mtodos de imobilizao de enzimas por reteno fsica 37

2.7.1.1 Adsoro 37

2.7.1.2 Reteno em membranas 37

2.7.1.3 Microencapsulamento 37

2.7.1.4 Eletropolimerizao 37

2.7.1.5 Ocluso em matriz polimrica 38

2.7.2 Mtodos de imobilizao qumica 38

2.7.2.1 Ligao covalente 38

2.7.2.2 Ligaes covalentes reticuladas 40

2.8 Cintica enzimtica 41

2.9 Aplicaes das enzimas em biossensores 48

2.9.1 A enzima glicose oxidase (GOx) 48

2.2.2 A enzima colesterol oxidase (COx) 49

2.2.3 A enzima urease 51


2.11 Referncias 54

Captulo 3 - Plataformas nanoestruturadas para a imobilizao de enzimas 58

3.1 O desenvolvimento dos dendrmeros58

3.2 Histrico sobre a Sntese dos Primeiros Dendrmeros 61

3.3 Os dendrmeros e suas propriedades 64

3.4 A sntese de macromolculas dendrticas 66

3.5 Dendrmeros estudados neste trabalho: CHD, PGLD e PPID 67


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Sumrio iii


3.7 Referncias 71

Captulo 4 Os mediadores de eltrons nas reaes enzimticas 73

4.1 O mecanismo de ao das enzimas e o processo de mediao de eltrons 73

4.2 Sistemas utilizados como mediadores de eltrons 74

4.3 Polmeros condutores como mediadores de eltrons 75

4.3.1 As Polianilinas 77

4.3.2 Estrutura de transporte na interface polmero-metal 80


4.5 Referncias 84

Captulo 5 As redes neurais artificiais no processo de transduo de sinais 88

5.1 Inteligncia Artificial 88

5.2 Paralelo entre Redes Neurais Artificiais e Redes Neurais Naturais 89

5.3 Histrico das Redes Neurais artificiais 92

5.4Arquitetura da rede 96

5.5 Funcionamento das redes neurais artificiais 98

5.6 Dificuldades encontradas 100


5.8Referncias 102

Captulo 6 Objetivos da dissertao 105

Captulo 7 Procedimento experimental 106

7.1 Reagentes 106

7.2 Sntese dos dendrmeros PGLD, CHD e PPID e preparo dos bioconjugados 106

7.3 Preparo dos eletrodos enzimticos 109

7.4 Referncias 113


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Sumrio iv

Captulo 8 Resultados e discusses 115

8.1 Caracterizao dos nanotubos de PANI 115

8.2 Caracterizao dos Dendrmeros 119

8.3Biossensores de glicose 121

8.4 Biossensores de colesterol 130

8.5 Biossensores de uria 138

8.6 Determinao dos hemometablitos glicose, colesterol e uria simultaneamente

utilizando uma RNA 145

8.7 Referncias 151

Captulo 9 Concluses 154

Captulo 10 Perspectivas futuras 156


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Lista de figuras v

Lista de Figuras

Figura 1.1 - Representao de um biossensor: biocatalizador 5

Figura 1.2 - Eletrodo de oxignio de Clark. A) Eletrodo de trabalho Pt, B) eletrodo dereferncia Ag/AgCl, C) eletrlito semi-saturado de KCl, D) membrana de

Teflon, E) anel de borracha para fixao, F) fonte de tenso para polarizao

e G) instrumento para medio da corrente de sada 6

Figura 1.3 - Grfico comparativo para os tipos de biossensores mais estudados 8

Figura 1.4 - Representao esquemtica para biossensores amperomtricos segundo o

processo de transferncia de cargas 9

Figura 1.5 Biossensores amperomtricos comerciais utilizados em anlises clnicas 10

Figura 1.6 - Representao esquemtica de um biossensor amperomtrico de primeira gerao 11

Figura 1.7 (A) Estrutura de um MOSFET (a) em comparao com um ISFET (b).(B) Estrutura fsica de um MOSFET 13

Figura 1.8 Montagem de um ENFET. (A) Substrato de Silcio, (B) Dopagem e

formao de xido, (C) Deposio da membrana on-seletiva e (D)

imobilizao da enzima e membrana protetora 14

Figura 1.9 Ilustrao de um biossensor ptico 15

Figura 1.10 (A) Microbalana de cristal de quartzo; (B) Foto de um transdutor 16

Figura 1.11 (A) Diagrama esquemtico de um biossensor calorimtrico;

(B) Ilustrao de um termistor do tipo NTC 18

Figura 2.1 - Diagrama energtico de reao catalisada e de reao no-catalisada 26Figura 2.2 - Modelo chave-fechadura. A interao entre a enzima (com estrutura rgida) e seu substrato 28

Figura 2.3 - Modelo do encaixe induzido. A ligao do substrato enzima induz

uma mudana conformacional na enzima produzindo um melhor encaixe 29

Figura 2.4 - Catlise por proximidade e orientao 30

Figura 2.5 - Representao esquemtica do mecanismo para a reao catalisada pelo on Metlico 31

Figura 2.6 - Reao cido-base geral: hidrlise de um ster 32

Figura 2.7 - Representao de uma catlise covalente. Onde X = RCOO-, RNH2, ArOH, His, ROH, RSH 33

Figura 2.8 - Efeito da temperatura sobre a velocidade de uma reao catalisada por enzima 34

Figura 2.9 - Atividade enzimtica versuspH 35

Figura 2.10 - Ilustrao das tcnicas de imobilizao enzimtica 36

Figura 2.11 - Ligao covalente da enzima (com agrupamento amina) na superfcie

do eletrodo. (A) Complexao com cloreto cianrico, (B) ligao

covalente por silanizao, (C) complexao com carbodiimina e (D) glutaraldedo 40

Figura 2.12 - Acoplamento qumico de uma molcula de glutaraldedo a duas enzimas 41


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Lista de figuras vii

Figura 7.3 Ilustrao do biossensor preparado neste trabalho atravs da tcnica de imobilizao

fsica dos bioconjugados nos nanotubos de polianilina 110

Figura 7.4 Unidade fonte medidora Keithley modelo 237 utilizado na caracterizao do

dispositivo biossensor 111

Figura 7.5 Ilustrao da configurao da rede neural artificial utilizada neste trabalho 113

Figura 8.1 Vista lateral e frontal da configurao atmica de uma seo de um nanotubo de

carbono. A estrutura cristalina deste tubo particular denotada como (7, 7) 115

Figura 8.2 Micrografia MEV de PANINTs contendo os dendrmeros bioconjugados depositados

eletroquimicamente em eletrodos de Al. Ampliaes: 5000 (A) e 15.000 x (B) 118

Figura 8.3Oxidao da molcula de glicose pela ao da enzima glicose oxidase 121

Figura 8.4 A relao entre a corrente resposta e o potencial dos biossensores PGLD (A),

CHD (B) e PPID (C) em NaPBS pH 7,4 a 37 oC. Concentrao de Glicose: 20 mM 122

Figura 8.5 Curva de corrente-tempo para os biossensores PGLD (A), CHD (B) e PPID (C),

a 300 mV, pH 7,4 e 37 oC, em soluo de glicose de 20 mM 123

Figura 8.6 A relao entre corrente resposta e concentrao de glicose para os biossensores

PGLD (A), CHD (B) e PPID (C) em 0,1 M NaPBS e pH 7,4 a 37 oC 125

Figura 8.7 Grfico eletroqumico de Lineweaver-Burk para os biossensores PGLD (A),

CHD (B) e PPID (C). PGLD: [I]-1= 0,02708[S]-1+0,00474 (r2= 0.999),

CHD: [I]-1= 0,04351[S]-1 +0,00648 (r2=0.997) e PPID:

[I]-1=0,09491[S]-1 +0,01258 (r2=0.994) 126

Figura 8.8 Sensibilidade em funo do tempo de armazenamento para glicose medida

para os biossensores de PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). As barras verticais

representam a divergncia medida em trs sensores diferentes. Quando no

em uso, os sensores foram armazenados em NaPBS (0.1 M, pH 7,4) a 4 oC 129

Figura 8.9 Representao da reao de catlise da enzima colesterol oxidase 130

Figura 8.10 A relao entre a corrente resposta e o potencial dos biossensores

PGLD (A), CHD (B) e PPID (C) em PBS pH 7.02 a 37 oC. Concentrao

de colesterol: 1 mmol.dm-3 131

Figura 8.11 Dependncia de tempo da corrente resposta para os biossensores

PGLD (A), CHD (B) e PPID (C) a 0.8 V em PBS pH 7,4 a 37 oC.

Concentrao de colesterol: 1 mM 133Figura 8.12 A relao entre corrente resposta para o PGLD (A), CHD (B)

e PPID (C) eletrodos enzimticos e concentrao de colesterol

de 0,1 M PBS, pH 7.02 a 37 oC e 0,8 V 134

Figura 8.13 Grfico eletroqumico de Lineweaver-Burk para os biossensores de

colesterol PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). PGLD (A):

[I]-1 =0.0096 [S]-1 0.01142 (r2=0.941), CHD (B): [I] -1 = 0,0159 [S]-1-0,0171 (r2=0.950)

e PPID: [I]-1=18,621 [S]-1 + 2,977 (r2=0.854) 136


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Lista de figuras viii

Figura 8.14 Sensibilidade em funo do tempo de armazenamento para medida

de colesterol para os biossensores de PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). As barras verticais

representam a divergncia medida em trs sensores diferentes. Quando no em uso, os

sensores foram armazenados em 0,1 M PBS, pH 7,4 a 4 oC 137

Figura 8.15 Esquema do biossensor de uria 138

Figura 8.16 A relao entre corrente resposta e o potencial para os biossensores PGLD (A),

CHD (B) e PPID (C) em 0,1 M NaPBS, pH 7,02 e 37 oC. Concentrao de uria: 10 mM 140

Figura 8.17 Dependncia do tempo da corrente resposta para os biossensores PGLD (A), CHD (B)

e PPID (C) a 0.8 V em PBS pH 7,4 a 37 oC. Concentrao de uria: 10 mM 141

Figura 8.18 A relao da corrente resposta dos eletrodos enzimticos PGLD (A), CHD (B)

e PPID (C) e a concentrao de uria em 0,1 M PBS, pH 7,02 a 37 oC e 0,6 V 142

Figura 8.19 Grfico eletroqumico de Lineweaver-Burk para os biossensores de uria

baseados nos sistemas PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). PGLD (A):

[I]-1 =0.168[S]-1 9.86.10-4(r2=0.990), CHD (B): [I]=0,321[S]-1-0,0011 (r2=0.994)

e PPID: [I]-1=0.305 [S]-1 + 0.016 (r2=0.999) 143

Figura 8.20 Sensibilidade em funo do tempo de armazenamento para uria medida para

os biossensores de uria baseados nos sistemas PGLD (A), CHD (B)

e PPID (C). As barras verticais representam a divergncia medida em

trs sensores diferentes. Quando no em uso, os sensores foram

armazenados em 0,1 M PBS, pH 7,4 a 4 oC 145

Figura 8.21 Resultados esperados versus resultados obtidos para o treinamento da RNA

para as concentraes de glicose. Ajuste pelo mtodo dos quadrados mnimos:

Y = 1,023 (+0,014) [Glicose] - 0,335 (+0,177), R= 0,999 149


para as concentraes de colesterol. Ajuste pelo mtodo dos quadrados mnimos:

Y =0,943 (+ 0,025) [Colesterol] 0,02452 (+ 0,0159), R = 0,997 150


para as concentraes de uria. Ajuste pelo mtodo dos quadrados mnimos:

Y = 0,998 (+ 0,008) [Uria] 0,500 (+ 0,0190), R = 0,999 151


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Lista de tabelas ix

Lista de Tabelas

Tabela 1.1 Alguns eletrodos enzimticos utilizados em determinaes analticas 7

Tabela 2.1 Velocidade de reaes no catalisadas e catalisadas por enzimas 23

Tabela 2.2Classificao das enzimas segundo a Unio Internacional de Bioqumica e Biologia Molecular 25

Tabela 5.1 Quadro comparativo entre crebro e o computador 91

Tabela 5.2 Comparativo entre computadores e neurocomputadores 91

Tabela 8.1 Os trs estados de oxidao mais importantes da polianilina: leucoesmeraldina,

esmeraldina (isolante e condutora) e pernigranilina 117

Tabela 8.2 Caractersticas fsico-qumicas caractersticas do PPID, CHD e PGLD sintetizados neste trabalho 120

Tabela 8.3 Parmetros cinticos eletroqumico para a GOx imobilizada em dendrmeros bioconjugados 127

Tabela 8.4 Parmetros cinticos eletroqumico para a CHO imobilizada em dendrmeros bioconjugados 135

Tabela 8.5 Parmetros cinticos eletroqumico para a urease imobilizada em dendrmeros bioconjugados 144

Tabela 8.6 Concentraes das solues dos hemometablitos glicose, uria e colesterol

para treinamento da rede neural 147

Tabela 8.7 Erro obtido durante o teste da rede neural para os hemometablitos colesterol,

glicose e uria em ensaios in vitro 148


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Lista de abreviaturas x

Lista de Abreviaturas

ISFET- trasnsistores de efeito de campo on-seletivos

MOSFET- transistor de efeito de campo metal-xido semicondutor

ENFET- Enzyme-field effect transistor

ENFETs- Transistores de Efeito de Campo Enzimticos

FET- transistor de efeito de campo

GOx- glicose oxidase

POx- peroxidase

NTC-Negative Temperature Coefficient

(S)- substrato(E)- enzima

(P)- produto

IUBMB- Unio Internacional de Bioqumica e Biologia Molecular

(Ea)- energia de ativao

(ES)- enzima-substrato

(EP)- enzima-produto

KM- constante cintica de uma reao

Vmax- velocidade mxima

FAD- flavina adenina dinucletido

FADH2- Flavina adenina dinucleotdeo reduzida

COx- colesterol oxidase

PAMAM Poli(amidoamina)

G-nmero de gerao

PGLD- poliglicerol dendrtico

PPID- poli(propileno imina) dendrticoCHD- quitosana dendrtico

Unifei- Universidade federal de Itajub

ICP- polmeros intrinsecamente condutores

PANI- polianilina

CTC- complexo de transferncia de carga


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Resumo xii

Resumo

Hoje em dia, os dendrmeros representam um interessante e promissor material orgnicosendo usado em desenvolvimento de novos materiais para a indstria farmacutica, tais como

sistemas de liberao de drogas e, mais recentemente, como propriedades sensoras para protenas

e hemometablitos. As propriedades intrnsecas dos dendrmeros como a monodispersividade,

elevados grupos funcionais perifricos em macromolculas e boas propriedades biocompatveis

destas nanopartculas, tem conduzido para sua difuso e usados em uma variedade de aplicaes

na medicina e biotecnologia. Neste trabalho foram desenvolvidos biossensores de glicose,

colesterol e uria baseados em poliglicerol bioconjugado (PGLD), poli(propileno imina) (PPID) e

dendrmeros de quitosana (CHD). Os dendrmeros PGLD, PPID e CHD foram bioconjugados

com as enzimas glicose oxidase (GOx), colesterol oxidase (COx) e urease para obter dendrmeros

com propriedades sensoras de glicose, colesterol e uria. Os dendrmeros bioconjugados PGLD,

PPID e CHD foram atrados em nanotubos de polianilina (PANINTs) durante polimerizao

eletroqumica template de anilina. Os PANINTs foram usados como mediadores de eltrons,

devido sua alta habilidade para promover as reaes de transferncia de eltrons, envolvendo

catlise enzimtica. A resposta de corrente observada em enzimas transformadas na interface do

eletrodo demonstrou que nanotubos de polianilina so eficientes mediadores para desenvolverbiossensores. As respostas de corrente para as propriedades dos hemometablitos glicose,

colesterol e uria bioconjugados com PGLD, PPID e CHD, e GOx, COx e urease, ocorreram s

tenses de 400 mV, 700 mV e 600 mV, respectivamente. Foi obtido que a corrente resposta para

os bioconjugados PGLD, PPID e CHD facilmente atinge o estado de saturao. Os resultados

correspondentes corrente de saturao mais acentuada para o biossensor de PGLD do que para

os bioconjugados CHD e PPID. A constante aparente de MichaelisMenten (KappM) d indicaes

da cintica enzima-substrato para os bioconjugados PPID, CHD e PGLD e foi calculada a partir

da equao eletroqumica de LineweaverBurk. O biossensor baseado em PGLD, PPID e CHD

mostrou uma boa performance em concentraes de interesse clnico de glicose, colesterol e

uria. A afinidade enzimtica para o substrato (KappM), indica que a atividade cataltica enzimtica

decai na ordem PGLD>CHD>PPID. O resultado mostra que o PGLD aparenta ser um candidato

bastante promissor para o desenvolvimento de biossensores de alta performance, em comparao

com os dendrmeros CHD e PPID. Uma rede neural artificial, tipo Back-Propagation com trs


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Resumo xiii

camadas de neurnios, foi treinada e aplicada, predizendo a quantia dos hemometablitos glicose,

colesterol e uria atravs da resposta de corrente dos biossenssores desenvolvidos. A rede neural

desenvolvida para determinao de hemometablitos mostrou-se ser eficiente em ambas fases, de

treinamento e teste, respectivamente.


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Abstract xiv

Abstract

Today, dendrimers represent a promising and interesting organic material being used in

developing new materials for pharmaceutical industry such as drug delivery systems and more

recently, intelligent materials with sensing properties to proteins and haemometabolites. The

intrinsic properties of dendrimers like as monodispersity, highly functional groups at

macromolecule periphery and good biocompatible properties of these nanoparticles has led to

their widespread use in a variety of applications in medicine and biotechnology. In this work

glucose, cholesterol and urea biosensors based on bioconjugated polyglycerol (PGLD),

poly(propylene imine) (PPID) and chitosan dendrimers (CHD) were developed. The dendrimers

PGLD, PPID and CHD were bioconjugated with the enzymes glucose oxidase (GOx), cholesterol

oxidase (COx) and urease to obtain dendrimers with glucose, cholesterol and urea sensing

properties. The bioconjugated PGLD, PPID and CHD dendrimers were entrapped in polyaniline

nanotubes (PANINTs) during template electrochemical polymerization of aniline. PANINTs

were used as electron mediator due to their high ability to promote electron-transfer reactions

involving enzyme catalysis. The current response observed in enzymes transformations at

electrodes interfaces demonstrated that polyaniline nanotubes are an efficient mediator for

biosensors design. The response current properties to haemometabolites glucose, cholesterol andurea of PGLD, PPID and CHD bioconjugated with GOx, COx and urease occurs at 400 mV, 700

mV and 600 mV, respectively. It was found that the response current of the PGLD, PPID and

CHD bioconjugates easily reaches to steady state. The results about the current saturation peak

for the PGLD biosensors are meaningfully higher than CHD and PPID bioconjugates. The

apparent MichaelisMenten constant (KappM), which gives an indication of the enzymesubstrate

kinetics for the PPID, CHD and PGLD bioconjugates were calculated from the electrochemical

LineweaverBurk equation. The based PGLD, PPID and CHD biosensors showed a good

performance in glucose, cholesterol and urea concentrations of clinical interest. The enzyme

affinity for the substrate (KMapp) indicate that the enzyme catalytic activity declines in the

crescent order PGLD>CHD>PPID. The results show that PGLD appears to be a very promising

candidate for development of high-performance biosensors relatively to the CHD and PPID

dendrimers. An artificial neural network Back-Propagation type with three layers of neurons was

trained, and applied, in predicting the amount of haemometabolites glucose, cholesterol and urea


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Abstract xv

in relation to the current response of developed biosensors. The neural network developed for

determining the haemometabolites was shown to be efficient in both, training phase and the test,

respectively.


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Introduo

Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas

1

Introduo

O aumento da longevidade humana visto ao longo do ltimo sculo, fez com que umgrande nmero de indivduos viesse a atingir uma idade crtica para o desenvolvimento de

inmeras doenas. Consequentemente, como resultado da maior longevidade humana h o

aparecimento de morbidades relacionadas ao envelhecimento, como: hipercolesterolemia,

hiperglicemia e elevao nos nveis de uria no sangue.

A hipercolesterolemia um importante fator de risco cardiovascular porque o colesterol

exerce efeito pr-oxidante que leva ao aumento na produo de radicais livres, os quais tm

importante papel na gnese da aterosclerose. A hiperglicemia, caracterizada pelo excesso de

acar no sangue, uma disfuno causada pela falta de insulina, pela diminuio na produo

ou ainda pela incapacidade de exercer suas funes. J o excesso de uria no sangue, um

indicativo forte de que o indivduo possue doenas renais e hepticas.

Tendo em vista a problemtica acima mencionada, verifica-se a importncia do controle

dos nveis de glicose, colesterol e uria no fluido sanguneo, uma vez que estes esto sujeitos a

flutuaes contnuas. As consequncias do descontrole dos nveis de glicose, colesterol e uria

so diabetes melito, infarto do miocrdio, amputao de membros inferiores, hemodilise, perda

da viso dentre outras. Surge ento a necessidade de se criar um dispositivo que monitore

diariamente os nveis destes hemometablitos simultaneamente.

A aplicao ideal de um biossensor multienzimtico seria a produo de um dispositivo

implantvel para monitoramento contnuo dos metablitos. Este dispositivo estaria conectado a

um microprocessador de controle de um sistema de liberao de frmacos pela pele, que

controlaria os nveis de glicose, colesterol e uria.

A evoluo dos mecanismos utilizados na monitorao de hemometablitos, seu

funcionamento e suas aplicaes so apresentados no captulo 1. Como pode ser observado nestecaptulo, os biossensores amperomtricos so ainda os mais pesquisados em funo de suas

caractersticas nicas, tais como transferncia direta de eltrons entre a enzima e a superfcie do

eletrodo trabalhando a baixos potenciais.

Uma vez que as enzimas so os biocatalizadores responsveis pela gerao do sinal no

transdutor, o captulo 2 trata da natureza qumica das enzimas, suas classificaes, grupos aos


23/178

Introduo


2

quais pertencem e aponta os mecanismos das reaes catalisadas por estes compostos, vantagens

e desvantagens. apresentando ainda neste captulo os modelos para os mecanismos de catlise

enzimtica bem como os fatores que influenciam a atividade do biocatalizador. As tcnicas de

imobilizao fsicas e qumicas das enzimas tambm so tratadas neste captulo. Um outro fatorque deve ser levado em considerao a cintica da enzima; neste intuito a equao

eletroqumica de Michaelis-Menten foi estudada e sua linearizao foi feita a partir do grfico de

Lineweaver-Burk. Para finalizar o captulo, uma abordagem do uso das enzimas glicose oxidase,

colesterol oxidase e urease estudadas nesta dissertao no emprego de biossensores e seus

mecanismos foram relatados.

As enzimas para serem imobilizadas, necessitam de um suporte ideal, com este intuito,

estruturas altamente ramificadas, com peso molecular uniforme e com elevada concentrao de

grupos funcionais em suas periferias foram estudadas no captulo 3. Macromolculas dendrticas

de poliglicerol (PGLD), quitosana (CHD) e poli(propileno imina) foram sintetizados, purificados

e caracterizados anteriormente pelo grupo de biomateriais da Unifei. O captulo 3 aborda

essencialmente algumas caractersticas destas macromolculas.

Uma das principais preocupaes na construo de biossensores amperomtricos a

velocidade de transferncia de eltrons do stio ativo da enzima para a superfcie do eletrodo o

qual transmite o sinal para o sistema que ir converter o sinal da reao biolgica em um sinal

eltrico. O captulo 4 trata dos mediadores de eltrons mais utilizados, em especial a polianilina

(PANI) que um polmero condutor. Os polmeros intrinsecamente condutores podem combinar

as propriedades mecnicas e a processabilidade dos polmeros convencionais com um

comportamento eltrico, tico e/ou mecnico semelhantes ao de metais e semicondutores

inorgnicos.

Houve a necessidade de um sistema que pudesse tratar estatisticamente os dados das

reaes das concentraes dos substratos em relao aos picos de corrente gerados pela reao

enzima/ substrato. No captulo 5, um sistema inteligente denominado Rede Neural, foi utilizadocom o intuito de distinguir os valores das concentraes dos hemometablitos: uria, colesterol e

glicose. tratado neste captulo as aplicaes das redes neurais, seus mecanismos de

funcionamento e sua evoluo no decorrer do tempo. Um paralelo entre a rede neural utilizada e a

rede neural natural (do crebro humano), foi traado; afinal a rede neural foi projetada a partir do


24/178

Introduo


3

modelo do crebro humano. Foi utilizado o algoritmo backpropagation como mtodo de

aprendizagem.

O captulo 6 define os principais objetivos desta dissertao.

No captulo 7 descrita a metodologia experimental adotada para este trabalho e nocaptulo 8 os resultados obtidos com relao resposta do biossensor so discutidos.

No captulo 9 so apresentadas as principais concluses obtidas neste trabalho.


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Captulo 1- Biossensores para a monitorao de hemometablitos


4

Captulo 1- Biossensores para a monitorao dehemometablitos

1.1- Introduo

A enzimologia clnica surge como um meio de desenvolver e utilizar exames clnicos que

ofeream o mximo de informao com um mnimo de invasibilidade, auxiliando no diagnstico

de doenas, no prognstico de quadros clnicos diversos e na avaliao do estado nutricional dos

pacientes.

A histria da enzimologia relativamente recente, tendo dado seus primeiros passos a

partir dos trabalhos publicados por Vitor Henri em 1901, e por Leonor Michaelis entre 1910 e

1914. Estas pesquisas ofereceram subsdio terico para que em 1927, King e Armstrongutilizassem pela primeira vez a enzima fosfatase alcalina para o diagnstico clnico. Em meados

da dcada de 1940, as enzimas sricas j eram utilizadas como meio auxiliar de diagnstico.1

O mtodo mais utilizado nos laboratrios de anlises clnicas o mtodo enzimtico, por

ser de baixo custo e simples. Assim, o exame rotineiro de hemometablitos realizado por este

mtodo, identificando a concentrao de glicose, colesterol, uria, dentre outros metablitos.

Os hemometablitos de interesse neste trabalho so a glicose, o colesterol e a uria. Por

serem de suma importncia nos diagnsticos de doenas e necessitarem de monitoramento

constante.

As anlises clnicas so de custo elevado uma vez que dependem de instrumentos de

grande porte caros, funcionrios devidamente qualificados e local apropriado dentre outros

custos. Alm disso, trazem ao paciente certo incmodo pelo fato da amostragem do fludo

biolgico para realizao das anlises clnicas, podendo assim ser considerado um mtodo

invasivo.

Os biossensores surgem ento como alternativa para substiturem os mtodos

colorimtricos convencionais do laboratrio clnico. A anlise pode ser feita pelo prprio

paciente a qualquer hora do dia e local, necessitando apenas de uma nica gota de sangue.

Alm de ser uma ferramenta analtica pouco invasiva, os dispositivos biossensores geram

no sistema de sade uma economia considervel em relao aos exames convencionais. Outra

vantagem do uso de biossensores para o monitoramento de hemometablitos se deve ao fato de


26/178



5

que h pacientes que necessitam de monitoramento dirio dos nveis desses hemometablitos,

como por exemplo, os pacientes diabticos.

1.2- Histrico do desenvolvimento dos biossensores e o Estado da arte

Biossensores so dispositivos eletrnicos capazes de converter uma reao biolgica/

bioqumica em um sinal apropriado. Este sinal pode ser potenciomtrico, amperomtrico,

condutimtrico, ptico, piezeltrico ou entalpimtrico.2-3 O sinal produzido proporcional

concentrao de analito, tambm conhecido como substrato. Com isso, ocorre a unio da

especificidade e sensitividade dos sistemas biolgicos com o poder da engenharia, oferecendo

uma ferramenta muito poderosa para ser utilizada em anlises clnicas.

As espcies imobilizadas nos biossensores agem como biocatalizadores necessrios paradeteco dos respectivos analitos. Estas espcies imobilizados nas superfcies dos transdutores

podem ser de vrios tipos, tais como, tecidos celulares, microorganismos, organelas, membranas,

enzimas, anticorpos, dentre outros.4

A Figura 1.1 mostra os componentes bsicos de uma biossensor. Em (a), tem-se o

biocatalizador, onde ocorre a reao bioqumica responsvel pela gerao do sinal, em (b) tem-se

o transdutor, em (c) o amplificador e em (d) a apresentao do resultado.

(a) (b) (c) (d)

Figura 1.1-Representao de um biossensor: biocatalizador.5

Em 1962, Clark e Lions desenvolveram o primeiro biossensor, o qual ficou conhecido

como eletrodo enzimtico 6(ver Figura 1.2). A partir deste marco, diversos tipos de biossensores

foram desenvolvidos para os mais diversos tipos de anlises clnicas, obtendo maior destaque as

anlises biomdicas. O monitoramento de hemometablitos no sangue humano (como glicose,

colesterol e uria), a deteco de atividades bacterianas (principalmente em alimentos), a


27/178



6

deteco de tipos especficos de protenas bem como a determinao da concentrao de certos

ons em solues biolgicas, tem despertado a ateno de vrios pesquisadores.7-8

Figura 1.2 Eletrodo de oxignio de Clark. A) Eletrodo de trabalho Pt, B) eletrodo de referncia

Ag/AgCl, C) eletrlito semi-saturado de KCl, D) membrana de Teflon, E) anel de borracha para

fixao, F) fonte de tenso para polarizao e G) instrumento para medio da corrente de sada.9

Os biossensores ou eletrodos enzimticos so usados em uma srie de determinaes

analticas (Tabela 1.1), das quais, a deteco da taxa de glicose no sangue (analito de informaovital para o controle do diabetes) destaque.10


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7

Tabela 1.1-Alguns eletrodos enzimticos utilizados em determinaes analticas.11

Analito Enzima Espcie monitorada

Glicose Glicose oxidase Pt(H2O2)/O2

Uria Urease NH3/NH4

cido rico Uricase O2

lcool lcool oxidase O2

L-tirosina Tirosina descarboxilase CO2

Oxalato Oxalato oxidase O2

Salicilato Salicilato hidroxilase O2

Creatinina Creatininase NH3

Ascorbato Ascorbato oxidase O2

L-lisina lisina descarboxilase CO2

Accar Invertase ou glicose oxidase Pt(H2O2)/O2

Lactato Lactato dehidrogenase O2

Penicilina Penicilinase Ph

Os biossensores geralmente so classificados de acordo com o sinal que gerado no

transdutor. Os biossensores amperomtricos so os tipos mais usados e pesquisados, como pode

ser verificado na Figura 1.3. Porm, existem outros tipos de biossensores baseados em outros

tipos de sinais, dos quais, os mais usados sero brevemente abordados nos tpicos seguintes.


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8

0

50

100

150

200

250

300350

400

450

1998

2000

2002

2004

2006

2008

Anos

BiossensoramperomtricoBiosensor ptico

BiosensorcalorimtricoBiosensorpotenciomtrico

Figura 1.3Grfico comparativo para os tipos de biossensores mais estudados. Fonte: Scielo.

1.3- Biossensores eletroqumicos

Os biossensores eletroqumicos so dispositivos capazes de fornecer sinais analticos do

meio operacional atravs do uso de componentes biolgicos como parte do sensor. O

biocomponente responsvel pela alta seletividade molecular e pela formao de produtos

detectveis, se o analito em si no for eletroativo.12 A deteco eletroqumica pode ser

amperomtrica (medindo-se uma diferena de cargas), potenciomtrica (medindo-se uma

diferena de potencial), condutomtrica (medindo-se mudanas na condutncia entre eletrodos),

impedanciomtrica (medindo-se mudanas de impedncia no eletrodo).13-14 No entanto, os

biossensores amperomtricos so os mais pesquisados, em funo de seu relativo baixo custo de

construo, potencial para miniaturizao, facilidade de automao e construo de equipamentos

simples e portteis.


30/178



9

1.3.1- Biossensores amperomtricos

Os biossensores amperomtricos fornecem a possibilidade de se captar um sinal eltrico

que seja proporcional concentrao de analito. A linearidade da resposta do biossensor faz com

que este seja recalibrado. Se o oxignio suprido por uma membrana de espessura de rea A, acorrente i pode ser aproximada pela Equao 1.1; onde D o coeficiente de difuso, e p a

solubilidade e a presso parcial de O2na membrana, respectivamente, e F 96500 C.

d

pFADI 4= (1.1)

Atravs da aplicao de um nvel de tenso contnua apropriada, a concentrao de

substrato pode ser medida pela transferncia de carga entre a superfcie do eletrodo e o substrato.

Os biossensores amperomtricos, se dividem em trs grupos, segundo o processo envolvido na

transferncia de carga; primeira, segunda e terceira gerao; como ilustrado na Figura 1.4.

Figura 1.4-Representao esquemtica para biossensores amperomtricos segundo o processo

de transferncia de cargas.15


31/178



10

Em suma, os biossensores amperomtricos baseiam-se em reaes de transferncia de

cargas (oxi-reduo) entre o material biocataltico e o analito com um eletrodo de referncia

polarizado a uma tenso pr-definida.14

O primeiro biossensor amperomtrico foi desenvolvido por Updike e Hicks em 1967 paraa medida de glicose, no qual se fazia uso do eletrodo enzimtico desenvolvido por Clark e

Lions.16

A maior parte dos biossensores utilizados para a anlise de hemometablitos se baseiam

no uso de mediadores, com limites de leitura de cerca de 10 a 600 mg.dL -1. Esses biossensores

so vendidos em lotes (10, 25 ou 50 biossensores, para o caso da Accu-Chec) separadamente do

dispositivo eletrnico para anlise. Os preos no mercado para a Accu-Chec (o mais comum),

variam, aproximadamente R$2,50 cada fita, dependendo da quantidade de fitas no lote e do local

de compra. A Figura 1.5 ilustra um modelo comercial de um biossensor amperomtrico, utilizado

na monitorao de hemometablitos tais como; colesterol, uria e glicose.

Figura 1.5-Biossensores amperomtricos comerciais utilizados em anlises clnicas.5

Os biossensores amperomtricos de primeira gerao baseiam-se na diminuio da

concentrao de oxignio, no qual os dois eletrodos so separados da amostra por uma membrana

de gs permevel. Neste caso, o oxignio difundido atravs da membrana reduzido num

eletrodo catodicamente polarizado na presena de um eletrodo de referncia. Os biossensores

amperomtricos, podem ser baseados tambm na deteco da concentrao de perxido de

hidrognio que oxidado em um eletrodo polarizado anodicamente, gerando o sinal eltrico.16A

Figura 1.6, ilustra um biossensor amperomtrico de primeira gerao.


32/178



11

Figura 1.6-Representao esquemtica de um biossensor amperomtrico de primeira gerao.16

Os biossensores amperomtricos de primeira gerao trabalham a elevados potenciais e se

baseiam na diminuio da concentrao de oxignio, onde dois eletrodos so separados da

amostra por uma membrana permevel a gs. Deste modo, o oxignio difundido atravs da

membrana reduzido em um eletrodo catodicamente polarizado na presena de um eletrodo de

referncia.

Um biossensor de segunda gerao se baseia no uso de um mediador para transferncia de

carga entre o stio ativo da enzima e a superfcie do eletrodo.17 Esses mediadores podem ser

materiais orgnicos, inorgnicos ou complexos de metais de transio e ainda polmeros

condutores.Finalmente, os biossensores de terceira gerao se caracterizam pela transferncia direta

de eltrons entre a enzima e a superfcie do eletrodo trabalhando a baixos potenciais.18

As principais aplicaes dos biossensores amperomtricos so na indstria, na medicina e

no monitoramento do meio ambiente. Eles do uma anlise mais precisa do analito a ser medido,


33/178



12

pois a relao entre a quantidade de substrato e o sinal gerado varia linearmente de acordo com a

equao 1.2.19

anFAvI= (1.2)

sendo I a corrente criada na reao, n o nmero de eltrons transferidos, A rea do eletrodo, F a

constante de Faraday e va a velocidade com que a reao ocorre, sendo esta proporcional

concentrao do substrato.

1.3.2- Biossensores potenciomtricos

Os biossensores potenciomtricos so dispositivos ons-seletivos os quais so constitudos

de uma membrana contendo enzimas imobilizadas onde a reao catalisada enzimaticamente gera

ou absorve ons de hidrognio, alterando o pH do meio. Uma diferena de potencial criada entre

um eletrodo de referncia e o eletrodo on-seletivo.20

A resposta de um biossensor potenciomtrico dada pela equao de Nerst.21

ln([i])zFRTEE 0 += (1.3)

sendo E o potencial medido, E0 o potencial caracterstico do meio, R a constante universal dos

gases, T a temperatura absoluta, z o nmero de cargas trocadas na reao, F a constante de

Faraday e [i] a concentrao de ons livres na soluo.

Um desenvolvimento recente de eletrodos on-seletivos, a produo de trasnsistores de

efeito de campo on-seletivos (ISFETs).22 Um ISFET um MOSFET (Transistor de efeito de

campo metal-xido semicondutor) modificado. A diferena, que o eletrodo porta do MOSFET

substitudo por um eletrodo de referncia contido em uma soluo e em contato com o xido da

regio da porta, agora no mais existente. O contato entre o xido e o eletrodo de referncia

feito geralmente atravs da soluo. Uma alterao do potencial da soluo controla o fluxo de


34/178



13

corrente entre a fonte e o dreno do ISFET. A Figura 1.4 ilustra a estrutura de um ISFET em

comparao a um MOSFET.

(A)

(B)

Figura 1.7- (A) Estrutura de um MOSFET (a) em comparao com um ISFET (b). (B) Estrutura

fsica de um MOSFET.9-23

Atravs da imobilizao de enzimas no eletrodo porta, estes dispositivos eletrnicos

podem ser aplicados em biossensores. So os chamados ENFETs (Transistores de Efeito de


35/178



14

Campo Enzimticos), ilustrado na Figura 1.5. Neste caso a reao catalizada pela enzima que

altera o potencial do meio, sendo esta alterao proporcional concentrao do analito.24

A vantagem desses dispositivos a possibilidade do uso da microeletrnica na sua

produo, possibilitando a confeco em larga escala. Em contra partida, a principal desvantagem a dificuldade de isolamento do FET do meio reacional, o que pode influenciar o desempenho do

biossensor.22

Figura 1.8- Montagem de um ENFET. (A) Substrato de Silcio, (B) Dopagem e formao dexido, (C) Deposio da membrana on-seletiva e (D) imobilizao da enzima emembrana protetora.9

1.3.3- Biossensores pticos

Biossensores pticos baseiam-se na determinao das mudanas de absoro entre os

reagentes e produtos da reao, ou na medida da sada de luz por um processo luminescente.25A

forma mais comum envolve o uso de tiras colorimtricas, as quais, contm enzimas oxi-redutoras

e um cromgeno. O produto gerado na reao entre a enzima e o analito (na maioria das vezes

H2O2), oxida o cromognio. A absorvncia do composto formado proporcional concentrao

do analito a ser determinada.

O uso mais comum de biossensores pticos o controle do diabetes pela determinao do

nvel de glicose no sangue usando-se as enzimas glicose oxidase (GOx) e peroxidase (POx),


36/178



15

juntamente com o composto que no obsorve luz na regio visvel. O perxido de hidrognio

(H2O2) resultante da oxidao da glicose pela GOx, na presena da POx, oxida o composto sem

absorvncia no visvel em um composto colorido. A avaliao das tiras tingidas feita pelo uso

de medidores portteis de reflectncia ou pela comparao com uma cartilha coloridapreviamente elaborada.

A Figura 1.5 ilustra um biossensor ptico comercial de ltima gerao. O paciente pode

acompanhar a concentrao dos hemometablitos de interesse analisando a cor da lente e

comparando esta resposta com uma tabela de cores do estojo, para verificar a qualquer hora do

dia a concentrao dos hemometablitos.

Figura 1.9-Ilustrao de um biossensor ptico.

26

1.3.4- Biossensores piezoeltricos

Esses tipos de biossensores contm cristais piezoeltricos em seus transdutores com

espcies imobilizadas. A Figura 1.10 ilustra os componentes de um biossensor piezoeltrico.

Todos os cristais piezoletrico vibram na presena de um campo eltrico. A frequncia (f)

dessa vibrao depende da espessura e do corte do cristal, sendo que cada cristal possui um

frequncia de vibrao caracterstica. Esta frequncia caracterstica muda quando o cristal

absorve ou desadsorve molculas em sua superfcie, de acordo com a Equao 1.4.27


37/178



16

A

mfkf p

=

2

(1.4)

sendo f a variao da freqncia caracterstica, m a variao da massa do material adsorvido,

k uma constante dependente cristal e A a rea de superfcie adsorvida. Como a variao de

frequncia proporcional variao de massa do material adsorvido, tal variao pode ser

determinada por circuitos eletrnicos.27

Um bom exemplo de um biossensor piezoeltrico um transdutor para a deteco de

formaldedo gasoso.28Este basicamente formado por dehidrogenase imobilizada em um cristal

de quartzo. Este sistema sensvel ao formaldedo gasoso.

O principal inconveniente destes dispositivos a interferncia da umidade atmosfrica namedida e a dificuldade em us-los para a determinao de analitos em soluo.29 Entretanto,

biossensores piezoeltricos so relativamente baratos, pequenos e capazes de dar uma resposta

rpida.30A exemplo, a Figura 1.10 ilustra uma microbalana de quartzo que realiza medidas de

massa e viscosidade em processos que ocorrem em superfcies, prximos a superfcies ou no

interior de filmes finos. Realiza tambm, medidas de freqncia e resistncia.

Figura 1.10-Microbalana de cristal de quartzo (A); Transdutor de preciso de massa (B).31-32

1.3.5 - Biossensores trmicos ou calorimtricos

Muitas reaes que so catalizadas enzimaticamente so exotrmicas, ou seja, geram

calor. Dessa forma, os biossensores calorimtricos baseiam-se na medida da variao de

temperatura entre a entrada e a sada de uma pequena coluna contendo um biocatalizador


38/178



17

(enzima) imobilizado temperatura constante. Tal medida efetuada atravs de termistores, que

so semicondutores sensveis temperatura.33

Os termistores, usados para detectar a mudana de temperatura funcionam variando sua

resistncia eltrica com a temperatura, obedecendo relao:

= 21T

1

T

1B

2

1 eR

R (1.5)

onde, R1e R2so as resistncias dos termistores nas temperaturas absolutas T1e T2, e B uma

temperatura constante caracterstica do termistor.A principal vantangem de um biossensor calorimtrico sua aplicabilidade geral e a

possibilidade de uso em solues densas e fortemente coloridas. Porm existe a dificuldade de se

manter a temperatura do biocatalizador constante, fato que pode levar desnaturao da enzima,

prejudicando assim, o funcionamento do biossensor.

A Figura 1.11 ilustra o funcionamento de um biossensor calorimtrico. O fluxo de

amostra (a) atravessa a caixa separadora externa (b) para o controlador de calor (c) dentro de um

bloco de alumnio (d), de onde flui para o termistor de referncia (e) e no bioreator de cama

acumulado (f) 1 ml de volume, contendo o biocatalizador onde a reao acontece. A mudana de

temperatura determinada pelo termistor (g) e o produto final (h).


39/178



18

Figura 1.11- (A) Diagrama esquemtico de um biossensor calorimtrico; (B) Ilustrao de um

termistor do tipo NTC.34-35

O NTC (Negative Temperature Coefficient) um termistor ou componente eletrnico

semicondutor sensvel a temperatura, utilizado para controle, medio ou polarizao de circuitos

eletrnicos. Possui um coeficiente de variao de resistncia que varia negativamente conforme a

temperatura aumenta, ou seja, a sua resistncia eltrica diminui com o aumento da temperatura.35

1.7- Consideraes parciais

Biossensores so dispositivos compactos, capazes de fornecer uma resposta quantitativa

para o monitoramento de diversos analitos. Eles so classificados de acordo com o sinal que

gerado (amperomtrico, ptico, potencimtrico etc) na reao entre o analito e o materialbiolgico (na maioria das vezes enzimas) imobilizado na superfcie de um elemento transdutor.

A simplicidade relativa das anlises promovidas pelos biossensores faz deste dispositivo

um excelente candidato para monitorao diria dos nveis dos hemometablitos.

Os biossensores enzimticos so alternativas interessantes para o monitoramento dos

hemometablitos, pelo baixo custo e elevada seletividade.


40/178



19

Os biossensores enzimticos vm sendo empregados em um grande nmero de

determinaes analticas, principalmente em anlises clnicas. A monitorao da taxa de glicose

dentre outras anlises como concentrao de uria, cido rico, colesterol, oxalato, creatinina,

lisina, lactato, e cistena, esto entre os principais metablitos, cujas concentraes plasmticas,teciduais ou urinrias so relevantes para o diagnstico clnico.36-37

O elemento principal de um biossensor o biocatalizador utilizado no reconhecimento do

analito a ser quantificado. Neste sentido, uma anlise mais detalhada a respeito do mecanismo de

atuao dos sistemas enzimticos apresentada no captulo seguinte.

1.8- Referncias

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43/178

Captulo 2- Natureza qumica das enzimas


22


2.1- Noes gerais

O componente fundamental de um biossensor enzimtico so as enzimas. As enzimas so

biocatalisadores que apresentam alta seletividade; observada especialmente para as enzimas

glicose oxidase, colesterol oxidase e urease, utilizadas no presente trabalho.

A palavra enzima foi introduzida por Kuhne em 1878 para designar a ocorrncia no

levedo de algo responsvel pela sua atividade fermentativa. Berzelius, 50 anos antes, tinha

reconhecido a presena de fermentos de ocorrncia natural que promoviam reaes qumicas e

antecipou o conceito de catalisadores biolgicos. Berzelius classificou os fermentos em

organizados e no-organizados com base na presena ou ausncia de microorganismos intactos.Kuhne aplicou a palavra enzima aos fermentos derivados de extratos de levedos.1

Em 1897 Bchner preparou um filtrado de extratos de levedo que foi o primeiro extrato

enzimtico removido de clulas vivas que pode catalisar a fermentao. A natureza qumica das

enzimas permaneceu controversa. Em 1926, Sumner cristalizou a ureasea partir de extratos de

feijo, no entanto, a preparao tinha pequena atividade cataltica e outros investigadores

atriburam o efeito cataltico a contaminantes e no protena. Willstntter, por outro lado,

purificou a peroxidase com elevada capacidade cataltica e ausncia de outras protenas. No

incio dos anos 30, Northrop e colaboradores cristalizaram a pepsina e a tripsina demonstrando

definitivamente que as enzimas eram protenas.2

As enzimas so protenas com a funo especfica de acelerar reaes qumicas que

ocorrem sob condies termodinamicamente no favorveis. Elas aceleram consideravelmente a

velocidade das reaes qumicas em sistemas biolgicos quando comparadas com as reaes

correspondentes no catalisadas. Consegue-se isso atravs do abaixamento da energia de ativao

necessria para que ocorra uma reao qumica, resultando no aumento da velocidade da reao e

possibilitando o metabolismo dos seres vivos. A capacidade cataltica das enzimas torna-as

adequadas para aplicaes industriais, como na indstria farmacutica ou na alimentar.

Em sistemas vivos, a maioria das reaes bioqumicas d-se em vias metablicas, que so

sequncias de reaes em que o produto de uma reao utilizado como reagente na reao

seguinte. Diferentes enzimas catalisam diferentes passos de vias metablicas, agindo de modo a

no interromper o fluxo nessas vias. Cada enzima pode sofrer regulao da sua atividade,


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23

aumentando-a, diminuindo-a ou mesmo interrompendo-a, de modo a modular o fluxo da via

metablica que se requer.

Algumas enzimas so capazes de aumentar a velocidade de certas reaes cerca de 1014

vezes, sem requerer condies extremas de temperatura, presso e pH. 3A Tabela 2.1 ilustra asvelocidades de reaes catalisadas e no catalisadas por enzimas.

Tabela 2.1- Velocidade de reaes no catalisadas e catalisadas por enzimas.3

A reao catalisada por uma enzima pode ser ilustrada como:

Substrato (S) Produto (P)

A enzima atua sobre o substrato (S) que se transforma em produto(P). Na ausncia de

enzima pouco produto (ou nenhum) formado, mas em presena da mesma, a reao se processa

em alta velocidade. Como a maioria das reaes reversvel, os produtos da reao numa direo

tornam-se substratos para a reao inversa.

As enzimas so os catalisadores mais especficos que se conhece, tanto para o substrato

como para o tipo de reao efetuada sobre o substrato como para o tipo de reao efetuada sobreo substrato. A especificidade inerente da enzima reside em uma cavidade ou fenda de ligao do

substrato, que est situada na superfcie da protena enzimtica. A cavidade, denominada stio

ativo, um arranjo de grupos presentes em cadeias laterais de certos aminocidos que ligam o

substrato por ligaes no-covalentes. Muitas vezes, os resduos de aminocidos que formam o

Enzima (E)


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24

stio ativo ficam em regies distantes, na seqncia primria, mas prximos no stio ativo, pelo

enovelamento de cadeia polipeptdica (estrutura terciria).

Algumas enzimas tm outra regio na molcula, o stio alostrico, afastada do stio ativo.

No stio alostrico molculas pequenas especficas se ligam e causam alteraes na conformaoprotica que afetam o stio ativo, aumentando ou reduzindo a atividade enzimtica.

A maioria das enzimas necessita de molculas orgnicas ou inorgnicas pequenas,

essenciais sua atividade e denominadas coenzimas e co-fatores.

2.2- Classificao das enzimas

Com a descoberta de grande nmero de enzimas, houve a necessidade de sistematizao

da nomenclatura. A Unio Internacional de Bioqumica e Biologia Molecular(IUBMB) adotaramum sistema racional e prtico de nomenclatura identificando as enzimas em seis classes, de

acordo com a natureza da reao qumica que catalisam. Para cada enzima, so atribudos dois

nomes e um nmero de classificao de quatro dgitos que identificam as classes, as subclasses e

as sub-subclasses.

Na classificao internacional sistemtica, as enzimas so divididas em seis grupos de

acordo com o tipo de reao catalisada, como pode ser visto na Tabela 2.2.


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25

Tabela 2.2- Classificao das enzimas segundo a Unio Internacional de Bioqumica e Biologia

Molecular(IUBMB).4

1. Oxirredutases(reaes de oxirreduo ou transferncia de eltrons Desitrogenases e Oxidases)1.1 atuando em CH-OH1.2 atuando em C=O1.3 atuando em C=O-1.4 atuando em CH-NH21.5 atuando em CH-NH-1.6 atuando em NADH, NADPH

2. Transferases(transferem grupos funcionais como amina, fosfato, acil, carboxil Quinases eTransaminases)

2.1 grupo com um carbono2.2 grupos aldedo ou acetona2.3 grupos acil2.4 grupos glicosil2.5 grupos fosfatos2.6 grupos contendo enxofre

3. Hidrolases(reaes de hidrlise de ligao covalente Peptidases)3.1 steres3.2 ligaes glicosdicas3.3 ligaes peptdicas3.4 outras ligaes C-N3.5 anidridos cidos

4. Liases(catalisam a quebra de ligaes covalentes e remoo de molculas de gua, amnia e gscarbnico Dehidratases e Descarboxilases)

4.1 =C=C=4.2 =C=O4.3 =C=N-

5. Isomerases(reaes de interconverso entre ismeros ticos ou geomtricos Epimerases)5.1 racemases

6. Ligases(catalisam reaes de formao de novas molculas a partir da ligao entre duas pr-existentes, sempre s custas de energia Sintetases)

6.1 C-O6.2 C-S6.3 C-N6.4 C-C

2.3 Mecanismos das reaes catalisadas por enzimas

Para reagirem, as molculas presentes em uma soluo devem colidir com orientao

apropriada e com a quantidade de energia que lhes permitiam formar o complexo ativado,

denominado estado de transioque representa os reagentes em seu estado ativado. Para atingir o

estado de transio, necessita-se de uma quantidade de energia definida como energia de ativao

(Ea) ou mais comum em bioqumica energia livre de ativao, G (o smbolo () indica o

processo de ativao). Sob condies fisiolgicas, a velocidade das reaes pode ser aumentada

pela reduo da energia livre de ativao conseguida pela ao das enzimas.2-3


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26

A comparao do perfil energtico das reaes catalisadas e no-catalisadas mostrada na

Figura 2.1 para a reao:

A+B C+D

Na Figura 2.1, o estado de transio correspondente ao ponto de mais alta energia da

reao no-catalisada a medida da energia livre de ativao, G. Ou ainda, G a energia

livre do estado de transio subtrada da energia livre dos reagentes. No complexo ativado

(estado de transio do sistema), os reagentes esto em forma intermediria de alta energia e no

podem ser identificados nem como reagentes nem como produtos. O complexo do estado de

transio aquele em que pode ser decomposto em produtos ou voltar aos reagentes.

5

No estadode transio o exato momento onde o substrato se transforma em produto, este estado

corresponde ao mximo de energia.

Figura 2.1- Diagrama energtico de reao catalisada e de reao no-catalisada.6


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27

A diferena entre os valores da energia de ativao de uma reao catalisada e de uma

reao no-catalisada indica a eficincia do catalisador.

A velocidade de uma reao inversamente proporcional ao valor de sua energia livre de

ativao. Quanto maior o valor de G, menor ser a velocidade da reao. Os catalisadoresaumentam a velocidade da reao reduzindo a energia livre de ativao.5

Trs propriedades distintas das enzimas permitem que elas exeram papel central na

promoo e regulao dos processos celulares, caracterizando-as como componentes vitais aos

sistemas vivos.7

i) Elevada especificidade da reao. Como em geral, cada reao sob condies apropriadas

catalisada por uma enzima especfica. Diante de vrias rotas potencialmente possveis, a enzima

escolhe a com menor energia livre de ativao.

ii) Condies reacionais mais brandas. A atividade de cada enzima dependente do pH, da

temperatura, da presena de vrios co-fatores e das concentraes de substratos e produtos.

iii) Capacidade de regulao da concentrao e da atividade. Permite o ajuste fino do

metabolismo em diferentes condies fisiolgicas.

2.4- Stio ativo cataltico

Stio ativo a regio na superfcie da enzima onde ocorre a catlise. O substrato liga-se ao

stio ativo por ligaes no-covalentes (interaes eletrostticas, pontes de hidrognio, interaes

de van der Waals e interaes hidrofbicas). Os grupos que participam das ligaes so a

carboxila do cido glutmico ou do cido asprtico, o grupo -amino da lisina, o amidazol da

histidina, a hidroxila da serina etc.

Somente uma pequena poro do substrato onde ocorre transformao est ligada

enzima. Isso no implica, entretanto, que os aminocidos no stio ativo estejam um ao lado do

outro na estrutura primria da protena. Em conseqncia das dobras e enovelamento da enzima

(estrutura secundria e terciria), certos resduos de aminocidos podem estar distantes um do

outro na sequncia primria, ainda que juntos no stio ativo da protena completa.

A especificidade da ligao enzima-substrato depende do arranjo precisamente definido

de tomos no stio ativo. Uma das explicaes para a elevada especificidade das enzimas que

suas estruturas tridimensionais permitem um perfeito encaixe com o substrato. Dois modelos


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28

foram propostos para explicar a especificidade enzimtica, o modelo chave-fechadura e o modelo

do encaixe induzido.

2.4.1- Modelo chave-fechaduraFoi sugerido por Emil Fischer, em 1894, que esse fato era devido a que tanto as enzimas

como os substratos apresentam formas geomtricas complementares, fazendo com que encaixem

de maneira precisa umas nos outros.7Este processo muitas vezes referido como modelo chave-

fechadura. No entanto, apesar de deste modelo explicar a especificidade das enzimas, falha em

explicar a estabilizao dos estados de transio que as enzimas exibem. A Figura 2.2 ilustra o

modelo chave-fechadura descrito por Emil Fischer.

Figura 2.2 -Modelo chave-fechadura. A interao entre a enzima (com estrutura rgida) e seu

substrato.7

2.4.2- Modelo do encaixe induzido

Em 1958, Daniel Koshland sugeriu uma modificao ao modelo de chave-fechadura: uma

vez que as enzimas exibem estruturas flexveis, os stios ativos alteram a sua forma de maneira

continuada atravs de interaes com o substrato, enquanto esse mesmo substrato vai interagindocom a enzima.8 Como resultado, o substrato no se liga simplesmente a um stio ativo que

rgido. As cadeias laterais dos aminocidos que formam os stios ativos sofrem uma reorientao

de maneira a que as suas posies potenciem a ao cataltica da enzima. Em alguns casos, como

nas glicosidases, a molcula de substrato tambm sofre alteraes de conformao medida que

vai se aproximando do stio ativo.9 O stio ativo continua a sofrer modificaes at que o


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29

substrato esteja completamente ligado e neste momento em que a conformao final e a carga

so determinadas.10 A Figura 2.3 ilustra o modelo encaixe-induzido descrito por Daniel

Koshland.

Figura 2.3- Modelo do encaixe induzido. A ligao do substrato enzima induz uma mudana

conformacional na enzima produzindo um melhor encaixe.8

2.5- Mecanismos catalticos 11

As reaes qumicas envolvidas na transformao dos substratos variam com os

mecanismos de ao das enzimas. Os principais tipos de mecanismos catalticos que as enzimasutilizam so: (i) efeitos de proximidade e orientao, (ii) catlise eletrosttica, (iii) catlise cido-

bsica e (iv) catlise covalente.

(i) Efeitos de proximidade e orientao

Os substratos se aproximam dos grupos funcionais catalticos da enzima em uma

orientao espacial apropriada para que a reao possa ocorrer. Aps o correto posicionamento

do substrato, uma modificao na conformao da enzima resulta em um complexo enzima-

substrato orientado. Essa orientao leva o complexo enzima-substrato ao estado de transio,

como pode ser visto na Figura 2.4.


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30

Figura 2.4 Catlise por proximidade e orientao.12

(ii) Catlise por ons metlicos

A fora das interaes eletrostticas est relacionada com a capacidade das molculas

solventes vizinhas em reduzir os efeitos de atrao entre os grupos qumicos. Como a gua

excluda do stio ativo quando o substrato se liga, a constante dieltrica local muitas vezesbaixa. A distribuio de cargas nos stios ativos das enzimas pode influenciar a reatividade

qumica do substrato. Uma ligao mais eficiente do substrato reduz a energia livre do estado de

transio, que acelera a reao (ver Figura 2.5).


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31

Figura 2.5 Representao esquemticado mecanismo para a reao catalisada pelo on

Metlico.12

(iii) Catlise cido-base geral

Os grupos qumicos podem se tornar mais reativos pela adio ou remoo de prtons(ver Figura 2.6). Os stios ativos das enzimas contm cadeias laterais que podem atuar como

doadores ou receptores de prtons. Esses grupos so denominados cidos gerais ou bases gerais.

Por exemplo, a cadeia lateral da histidina (grupo imidazol) muitas vezes atua como catalisador

cido e/ou bsico em concerto porque tem pKa na faixa de pH fisiolgico.


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32

Figura 2.6Reao cido-base geral: hidrlise de um ster.12

(iv) Catlise covalente

Acelera a velocidade da reao pela formao de uma ligao covalente transitria entre a

enzima e o substrato. Um grupo nucleoflico da cadeia lateral do catalisador forma uma ligao

covalente instvel com um grupo eletroflico do substrato. O complexo enzima-substrato entoforma o produto (ver Figura 2.7).

SEM CATALISADOR

COM CATALISADOR


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33

Figura 2.7- Representao de uma catlise covalente.Onde X = RCOO-, RNH2, ArOH, His,

ROH, RSH.13

2.6- Fatores que influenciam a atividade enzimtica

Vrios fatores influenciam a atividade enzimtica, incluindo a temperatura, pH,

concentrao do substrato, tempo e produto da reao.14

Com relao temperatura, as reaes qumicas so afetadas de acordo com a lei de

VantHoff. Quanto maior a temperatura, maior a velocidade da reao. A velocidade aumenta

porque mais molculas adquirem energia suficiente para atingir o estado de transio. Em reaescatalisadas por enzimas, a velocidade acelerada pelo aumento da temperatura at atingir uma

temperatura tima na qual a enzima opera com a mxima eficincia. Como as enzimas so

protenas, os valores de temperatura tima situam-se entre 35 a 40C e dependem do pH e da

fora inica. Acima dessa temperatura, a atividade das enzimas declina adruptamente por

desnaturao protica. Sob condies de hipotermia, a atividade enzimtica deprimida. As

relaes acima descritas so ilustradas na Figura 2.8.


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34

Figura 2.8- Efeito da temperatura sobre a velocidade de uma reao catalisada por enzima.15

A concentrao de ons hidrognio afeta as enzimas de vrios modos. Primeiro, a

atividade cataltica das enzimas est relacionada ionizao de aminocidos no stio ativo. Por

exemplo, a atividade cataltica de certas enzimas necessita a forma protonada da cadeia lateral do

grupo amina. Se o pH torna-se suficientemente alcalino de tal modo que o grupo amino perde seu

prton, a atividade da enzima pode ser reduzida. Alm disso, os substratos podem tambm ser

afetados. Se um substrato contm um grupo ionizvel, as mudanas no pH afetam a capacidade

de ligao ao stio ativo. Segundo alteraes nos grupos ionizveis podem modificar a estrutura

terciria das enzimas. Mudanas drsticas no pH promovem a desnaturao de muitas enzimas.16-

17-18A Figura 2.9 ilustra a atividade enzimtica versus pH de uma enzima.


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35

Figura 2.9- Atividade enzimtica versuspH (considerando-se os outros fatores constantes).19

Enzimas tal como a quimotripsina (enzima que hidrolisa protena) ou a triosefosfato

isomerases so ativas sem necessitar a presena de outro fator. No entanto, quase um tero das

enzimas conhecidas requer um componente no protico para sua atividade, denominado cofator.

Os cofatores podem ser ons metlicos Fe++, Mn++, Mg++,Zn++, ou molculas orgnicas, muitas

delas derivadas de vitaminas do complexo B.

Certas molculas podem inibir a ao cataltica de uma enzima, denominadas de

inibidores. Estes podem ocupar temporariamente o centro ativo por semelhana estrutural com o

substrato original (inibidor competitivo) ou alterar a conformao espacial da enzima, impedindo

sua unio ao substrato (inibidor no competitivo).

Em anlises clnicas as condies ideais para anlise so similares

s do fluido fisiolgico, ou seja, pH 7,4 e temperatura de 37C.

Em um biossensor a enzima encontra-se normalmente imobilizada na superfcie doeletrodo. necessrio analisar as tcnicas de imobilizao a serem utilizadas para que se possa

obter uma melhor atividade enzimtica, a partir do melhor mtodo de imobilizao para o

processo requerido.


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37

2.7.1 Mtodos de imobilizao de enzimas por reteno fsica

2.7.1.1 Adsoro

As enzimas se unem ao suporte mediante ligaes fracas como fora de Van der Waals ou

ligaes de hidrognio. Sobre o ponto de vista mecnico, so pouco estveis e a unio ao suporte fraca (podendo haver desoro devido mudana de temperatura, pH, pelo substrato, solvente

ou conveco), porm, o mtodo o mais simples e pode ser realizado em condies brandas de

imobilizao, preservando-se a enzima (mudana conformacional mnima ou nula). Coloca-se

uma gota da soluo aquosa contendo a enzima em contato com a superfcie do suporte que, aps

seco, estar pronto para uso.23

2.7.1.2 Reteno em membranas

A reteno de enzimas em membranas polimricas foi a primeira tcnica descrita para

fabricao de biossensores, onde a enzima foi colocada sobre o eletrodo e retirada por uma

membrana polimrica dialtica. Uma membrana adicional semipermevel pode barrar elementos

interferentes e possibilitar somente a passagem dos produtos da reao enzimtica.24

2.7.1.3 Microencapsulamento

Nesta tcnica, as enzimas esto envolvidas por membranas semipermeveis que permitema passagem de molculas de substrato e produto, mas no da enzima; so de forma esfrica com

tamanhos entre 1 a 100 micrometros de dimetro.21 A enzima e um monmero hidroflico so

misturados em soluo aquosa e adicionados em solvente orgnico insolvel em gua. Com a

adio de monmero hidrofbico, se inicia a reao de polimerizao, levando formao de

microesferas.24Com este mtodo pode-se encapsular simultaneamente uma grande variedade de

enzimas, o que faz com que reaes que se sucedem em mltiplas etapas possam ser levadas a

cabo. Os principais tipos de membranas utilizadas so: Teflon, Nafion, colgeno acetato de

celulose e policarbonato.

2.7.1.4 Eletropolimerizao

No mtodo da imobilizao enzimtica por eletropolimerizao, um monmero em

soluo contendo a enzima, ao se polimerizar pela ao de um potencial eltrico, sofre deposio

na superfcie do eletrodo aprisionando simultaneamente a enzima. O monmero eletricamente


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38

oxidado em potencial que facilita o crescimento de radicais livres do monmero e, este,

adsorvido pela superfcie do eletrodo onde uma srie de reaes ocorre para a formao da matriz

polimrica.25

O processo ser regido pelo potencial do eletrodo e pelo tempo de reao, o que permite ocontrole da espessura do filme resultante. Para algumas reaes de polimerizao, devido a

acidez do meio, este pode no ser o mais adequado, pois a enzima pode sofrer desnaturao e ter

sua atividade cataltica comprometida.

2.7.1.5 Ocluso em matriz polimrica

Neste mtodo, a enzima retida dentro de uma rede polimrica tridimensional insolvel

em gua. A ocluso pode ser feita em gel 26(a soluo de enzima misturada a um monmero,que ento polimerizado a um gel, retendo a enzima), em eletrodos de pasta de carbono 27 (a

enzima pode ser misturada a uma pasta consistindo de p de grafite e um leo e a pasta pode ser

misturada a diferentes componentes) e em polmeros (a enzima pode ser adicionada a um

monmero, em soluo aquosa, e este ser quimicamente polimerizado junto com a enzima). A

enzima tambm pode ser imobilizada dentro de matrizes slidas porosas.28

2.7.2- Mtodos de imobilizao de enzimas por ligao qumica

Pode-se imobilizar a enzima em um suporte, ou eletrodo, por meio de reaes qumicas

especficas deste com grupos funcionais presentes na estrutura protica, tais como amino grupos,

grupos carboxlicos, grupo imidazol da histidina e etc. Os mtodos qumicos incluem ligao

covalente e reticulao.21

2.7.2.1- Ligao covalente

Este mtodo consiste no uso de grupos qumicos do suporte, por meio da ativao damatriz slida, e conseqente unio com a enzima. Dos 20 aminocidos que compem a estrutura

enzimtica, os mais empregados para ligarem-se ao suporte so principalmente a lisina, cistena,

tirosina e histidina, e em menor grau, a metionina, triptofano, arginina e os cidos asprtico e

glutmico. O restante, devido ao carter hidrofbico, no se encontra expostos na superfcie

protica, e no podem ento intervir nas ligaes. A ativao da matriz pode consistir em

7/25/2019 ASPECTOS BIOELETROQUMICOS DE DENDRMEROS COMO nanoplataformas.pd

aspectos bioeletroquÍmicos de dendrÍmeros como nanoplataformas.pdf

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