SEPARAO E CONTAGEM DE CLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFRICO EM GRADIENTE DE FICOLL-HYPAQUE

SEPARAO E CONTAGEM DE CLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFRICO EM GRADIENTE DE FICOLL-HYPAQUE

O Ficoll-Hypaque consiste de uma mistura de polissacardeos neutros hidroflicos de alta densidade que se dissolve prontamente em soluo aquosa. O nome "Ficoll" uma marca registrada atualmente de propriedade da GE Healthcare Bio-Sciences. Os gradientes de Ficoll-Hypaque so utilizados em laboratrios clnicos para separar os componentes celulares do sangue perifrico (eritrcitos, leuccitos, etc.). A mistura Ficoll-Hypaque colocada no fundo de um tubo e o sangue (coletado em presena do anticoagulante EDTA para evitar a coagulao) vagarosamente colocado sobre a fase de Ficoll. Aps ser centrifugado, as duas fases tornam-se bem visveis e a separao ocorre da seguinte maneira: na fase superior fica o plasma e seus constituintes solveis, na interface as clulas mononucleares, em seguida o Ficoll e aps os eritrcitos e granulcitos que ficam sob a forma de um sedimento celular no fundo do tubo.

Contagem das clulas em Cmara de Neubauer Cada quadrante da cmara, coberto por uma lamnula, representa um volume total de 0,1mm3. Como 1 cm3 equivalente a 1,0 mL, a quantidade de clulas por mL e o nmero total de clulas pode ser determinado. A profundidade central da cmara de 1 mm. No desenho figuram 9 grandes reas de 1 mm2 . As 4 reas grandes angulares ( L ) so subdivididas em 16 reas com 0,25 mm de cada lado. Elas servem para contagem de leuccitos. A grande rea central subdividida em 25 grupos quadrados de 0,2 mm de cada lado. Cada grupo consiste de 16 mini-reas com 0,05 mm de lado, tendo cada rea 0,0025 mm2 . Os 5 grupos marcados (E) so usados para contagem de eritrcitos. observado que todas as reas tm uma borda tripla em cada lado. A linha central o limite e determina quando uma clula deve ser includa na contagem ou no.

PROCEDIMENTO

1. Coletar 10 mL de sangue utilizando como anticoagulante a heparina;

2. Centrifugar o sangue a 1.000 rpm por 3 minutos ou pode deixar sedimentar naturalmente;

3. Retirar com pipeta Pasteur aproximadamente 2,0mL de plasma imediatamente acima da interface celular e colocar em um tubo limpo;

4. Acrescentar ao plasma rico em clulas 2,0mL de soluo salina e homogeneizar delicadamente;

5. Pode-se utilizar, em substituio ao plasma, uma suspenso de clulas de bao de camundongo recm preparadas, pois ali tambm se encontram quantidades muito grandes de clulas sanguneas;

6. Depositar cuidadosamente com pipeta Pasteur, os 4,0mL da mistura sobre 2,0mL de Ficoll-Hypaque que se encontra em um tubo de ensaio protegido da luz. essencial que o material depositado no se misture com a soluo de Ficoll formando duas fases bem distintas; 7. Centrifugar a 2.000 rpm por 20 minutos;

8. Com pipeta Pasteur coletar cuidadosamente a nuvem de linfcitos que se formou na interfase e j transferir estas clulas coletadas para um tubo contendo soluo salina. Esta etapa importante pois o Ficoll txico para as clulas e precisa ser rapidamente diludo para no causar lise dos linfcitos;

9. Centrifugar estas clulas diludas em salina a 1.500 rpm por 5 minutos e repetir esta lavagem mais uma vez. Esta lavagem importante para eliminar plaquetas contaminantes que ficam nesta interfase e atrapalham a contagem.

10. Aps a segunda lavagem ressuspender o sedimento celular em 1,0mL de soluo salina e proceder diluio adequada de acordo com as instrues do professor para fazer a contagem.

Nmero de clulas/mL= mdia do nmero de linfcitos por quadrante X inverso da diluio X 104.

Nmero total de clulas= clulas/mL X volume original da suspenso celular

DILUIO DO DNA GENMICO QUANTIFICADOAps a quantificao, o DNA diludo pela frmula C.V=C1.V1 , onde:

C= Concentrao lida de DNA

V= Volume a ser pipetado do DNA concentrado

C1= Concentrao de trabalho

V2= Volume final correspondente entre 500 l a 1.000 lExemplo:

Desejo uma concentrao de 5 ng/lC.V=C1.V1

313 ng/ l . V = 5ng/ l . 500 lV= 5 . 500/ 313

V= 8 l de DNA 492 l de gua ultra pura

*Lembrar que 1 g = 1000 ng/ 1 l = 0.001 ml/ 100 l = 0.1 mlELETROFORESE; FAZER GEL