DESVENDANDO AS CLULAS-TRONCO: DOS SONHOS REALIDADE16 a 20 de julho de 2007

Centro de Estudos do Genoma Humano Depto. de Gentica e Biologia Evolutiva Instituto de Biocincias Universidade de So Paulo

Docentes responsveis: Profa. Dra. Eliana Maria Beluzzo Dessen Profa. Dra. Regina Clia Mingroni-Netto

INDICECronograma Apresentao do curso Portiflio como recurso de avaliao Textos de apoio As clulas eucariticas e sua capacidade de diferenciao Diferenciao celular e o controle do gene eucaritico Sinalizao celular O bsico sobre clulas-tronco Clonagem Reprogamao celular Clulas-tronco: progressos cientficos e o futuro das pesquisas Terapia celular o uso de clulas-tronco no tratamento de doenas etapas e questes geradas A polmica das clulas-tronco.embrionrias Desvendando as razes do cncer Clulas-tronco: mocinha e bandida Clula-tronco por encomenda Reproduo assistida Medula ssea e as clulas-tronco hematopoiticas Transplante de medula ssea uma terapia celular bem conhecida Colcha de retalho de leis O artigo 5 o. Da lei No. 11.105, de 2005, no inconstitucional Quando comea a vida? Que vida, biolgica ou moral? Glossrio Atividades: Atividade de acolhimento e contrato pedaggico Levantamento de conceitos Estudo dirigido 1 Identificao de conceitos relativos a clulas-tronco Atividade 1 Diferenciao da hemcia Atividade 2 um caso muito interessante de diferenciao celular Diferenciao no protozorio Naegleria grubei Diferenciao celular em tecido sseo Atividade 3 Diferenciao celular em tecido sseo Atividade 4 Diferenciao de clulas embrionrias: a formao do trofoblasto As primeiras mudanas morfolgicas no embrio Atividade 5 Desenvolvimento muscular Estudo dirigido 2 Clonagem reprodutiva versus clonagem teraputica Atividade 6 Jogo das clulas-tronco Atividade 7 Hematopoiese: seguindo uma via de diferenciao Atividade 8 Regras para o debate Atividade 9 Palavras cruzadas Anexos: Respostas do estudo dirigido 2 Clonagem Gabarito da atividade 2 Diferenciao no protozorio N. gruberi Soluo das palavras cruzadas Bibliografia sobre cncer e clulas-tronco 03 04 06 08 10 18 24 31 36 39 42 43 48 57 58 59 61 63 67 72 77 79 81 85 87 88 90 92 94 96 98 99 101 104 107 108 118 123 124 126 126 128 129

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CRONOGRAMA

Data

Manh

Tarde

16/07

Acolhimento inicial.Apresentao do Diferenciao celular. Oficinas. curso. O gene eucaritico e sua regulao. Levantamento de conceitos. Estruturao do debate sobre tica. Estudo dirigido sobre clulas-tronco.

17/07

Sinalizao celular. Oficinas.

Diferenas entre clulas-tronco embrionrias e de adulto.

Clulas-tronco: definio, tipos e Jogo sobre clulas-tronco. caractersticas. Clonagem reprodutiva clonagem teraputica. Desdiferenciao celular. versus Palavras cruzadas. Preparao do debate

18/07

Cncer e clulas-tronco Reproduo assistida Preparao do debate.

As doenas do sangue e transplantes de medula ssea. Oficina. Preparao do debate

19/07

Perspectivas da aplicao de Debate: A polmica sobre a clulas-tronco em doenas utilizao de clulas-tronco musculares. embrionrias em terapia humana: aspectos legais e ticos. Filme Globo News. Discusso. Discusso de situaes problema.

20/07

Oficina de criao: Como abordar o Apresentao dos grupos. tema clulas-tronco numa feira de Avaliao do curso. cincias? Incio da apresentao dos grupos.

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APRESENTAO DO CURSO Desvendando as clulas-tronco: dos sonhos realidadeObjetivos Ampliar o universo conceitual significativo dos professores de ensino mdio no que se refere a clulas-tronco e suas aplicaes. Capacitar o professor de ensino mdio para acompanhar de maneira crtica a literatura de divulgao cientfica sobre o tema. Utilizar o tema "clulas-tronco como eixo para a integrao de conceitos clssicos da Biologia Celular e Molecular, bem como ponto de referncia para a anlise e discusses no campo da biotica. Considerar o papel do professor em sala de aula como "Agente disseminador de temas que permeiam a discusso de valores ticos e sociais e que exigem um posicionamento crtico acerca de situaes relacionadas rea de Cincias da Natureza e suas tecnologias. Contedo e Metodologia de desenvolvimento Noes de diferenciao e sinalizao celular. Relao gentipo-fentipo. Clulas-tronco: definio, potencialidade e plasticidade. Reprogramao celular. Clulas-tronco embrionrias versus clulas-tronco de adultos. Potencialidades de uso e aplicaes experimentais. Terapia celular. Aplicaes atuais. Clonagem teraputica versus clonagem reprodutiva. Cncer e clulas-tronco. Problemas legais e ticos decorrentes do uso de clulas-tronco. Estratgias e recursos tecnolgicos A metodologia utilizada para desenvolver o contedo acima relacionado variada, com nfase em mtodos no expositivos. Alm de curtas apresentaes orais dialogadas e de palestras de especialistas, diversas atividades didticas/pedaggicas sero utilizadas como facilitadores da aprendizagem: (1) estudos dirigidos; (2) atividades presenciais como jogos didticos ou oficinas (3) Debate, (4) animaes demonstrativas de fenmenos biolgicos, (5) discusso de artigos publicados pela mdia leiga, etc. Formas de acompanhamento e de avaliao dos participantes Avaliao A avaliao ser constituda por duas ferramentas: Avaliao formativa: elaborao de portiflio dirio. O aluno dever registrar as atividades desenvolvidas durante o dia e o seu envolvimento nas mesmas respondendo diariamente as seguintes questes: (1) O que aprendi hoje? O que as atividades me acrescentaram? (2) O que no foi adequado? Considerar nas respostas: o contedo da aula, as atividades e estratgias utilizadas, o relacionamento com o grupo e a prpria participao. As respostas sero por escrito e entregues no final do dia. Um portfolio pode ser definido como um conjunto de diferentes tipos de documentos (anotaes pessoais, experincias de aula, trabalhos pontuais, controles de aprendizagem, conexes com outros temas, fora da escola, representaes visuais, etc.) que proporciona evidncias de conhecimentos que foram sendo construdas durante o aprendizado, as estratgias utilizadas para aprender e a disposio de quem o elabora para continuar aprendendo. Devido brevidade do curso o portifolio a ser elaborado diariamente no final de cada dia ser mais sucinto e registrar o desenvolvimento

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do programa de ensino e as reflexes dirias do processo de aprendizagem de modo a que o estudante sinta a aprendizagem como algo prprio e no alienada de seus processos pessoais e coletivos. O portfolio nesse caso entendido tambm como uma reconstruo de conhecimento. Ele no se caracteriza como algo descritivo, mas reflexivo. Todos os portiflios so lidos diariamente pelos docentes do curso que podem desse modo realizar um acompanhamento mais personalizado da aprendizagem de cada um dos alunos. Avaliao final: Cada participante dever fazer uma breve apresentao individual com relao a: (a) Quais os contedos/atividades desenvolvidas durante o curso que poderiam ser levadas para a escola? Por qu? (b) De que maneira isso poderia ser feito?

Relao Nominal dos professores Prof. Dra. Eliana Maria Beluzzo Dessen (professora responsvel) Monitoria (mestrandos e doutorandos do Instituto de Biocincias) Adriana Ribeiro de Oliveira Marques, Ana Carolina Susuki Dias Cintra, Fernando Nodari, Lcia Teiceira Machado Paula Cristina Gorgueira Onofre Renato Chimaso dos Santos Yoshikawa, Silvio Ganika Higa, Vivian Lavander Mendona

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PORTFLIO COMO RECURSO DE AVALIAO(adaptado de Hernandez, Fernando. Cultura visual, mudana educativa e projeto de trabalho. Porto Alegre, Artmed, 2000)

A avaliao um processo inerente ao processo de construo de conhecimento. Mais do que memorizar ou recordar informaes ou aplicar frmulas para resolver problemas, o objetivo do processo educativo se prope a aprender a formular problemas e desenvolver a capacidade de buscar, organizar e interpretar a informao dando-lhe sentido e transformando-a em conhecimento. A avaliao compreende trs formas de recolhimento de informaes: avaliao inicial, para perceber o conhecimento prvio de estudantes ao iniciarem o curso; a avaliao formativa, que est na base do processo avaliador e no tem a finalidade de controlar ou qualificar, mas ajudar estudantes a progredir no caminho do conhecimento, e a avaliao somativa, que o processo de sntese, que permite reconhecer se [as] os estudantes alcanaram os resultados esperados (...) e serve como passagem para dar credibilidade oficial aos conhecimentos adquiridos. O portflio representa uma possibilidade alternativa de avaliao, e pode ser, para algumas disciplinas, substituto das avaliaes pontuais em forma de provas e exames. Na educao ele serve como possibilidade de indicar a trajetria de aprendizagem e de novas formas de avaliar o desenvolvimento do conhecimento. Uma das vantagens da realizao do portflio a de perceber o desenvolvimento do programa de ensino e a participao mais ativa de estudantes, o que permite que sintam a aprendizagem como algo prprio e no alienada de seus processos pessoais e coletivos. O portflio uma forma de avaliao dinmica realizada pelo prprio estudante e que reflete seu desenvolvimento e suas mudanas atravs do tempo . Nele inclui-se a avaliao do processo, a maneira de encarar e de interpretar as experincias e os processos de aprendizagem. Definio de um portflio: Podemos definir um portflio como um conjunto de diferentes tipos de documentos (anotaes pessoais, experincias de aula, trabalhos pontuais, controles de aprendizagem, conexes com outros temas, fora da escola, representaes visuais, etc.) que proporciona evidncias de conhecimentos que foram sendo construdas, as estratgias utilizadas para aprender e a disposio de quem o elabora para continuar aprendendo. (...) Um portfoio no significa apenas selecionar, ordenar evidncias de aprendizagem e organiza-las num formato para serem apresentadas. (...) O que caracteriza definitivamente o portflio como modalidade de avaliao no tanto o seu formato fsico (pasta, caixa, CD-ROM, etc.), mas sim a concepo de ensino e aprendizagem que veicula. O portflio no a mera recopilao de apontamentos; mas pode ser entendido como uma reconstruo de conhecimento. Ele no se caracteriza como algo descritivo, mas reflexivo. Assim, um dirio reflexivo uma ferramenta importante para a sua realizao Estabelecer as finalidades de aprendizagem por parte de cada estudante Cada qual explicita o que pretende chegar a aprender. Professora explicita os objetivos. Uma possibilidade: extrair uma frase de cada apontamento de aula (ou leitura) e fazer um comentrio reflexivo, representativo do que foi significativo. Incluir experincias da sala de aula e de fora dela.

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Pensar no grupo: o processo de aprendizagem mais significativo se for proveitoso para todo o grupo. Fazer um acordo pblico por escrito conveniente e, se possvel, presente na sala de aula como forma permanente de compromisso compartilhado. Nomear as fontes relacionadas com o processo (no apenas fontes bibliogrficas): as evidncias de aprendizagem Encontrar um fio condutor que organize a seleo das evidncias que faro parte do portflio Ter presente as perguntas: o que aprendi? De que maneira aprendi?

O portflio propriedade do estudante O trabalho realizado no portflio memria de aprendizagem. Cada portflio criao nica, pois cada qual determina que evidncias e que experincias devem ser includas e faz uma auto-avaliao do seu processo de formao. Ele parte do processo de aprendizagem de cada aluna e cada aluno. Ele pode tornar-se pblico para compartilhar com o grupo e ajudar no processo coletivo de aprendizagem estudantes e docentes podem ir construindo um conhecimento compartilhado mais equilibrado (p.170). Os componentes do portflio a) O propsito Dirio reflexivo: falar sobre os temas, comentando-os, no de forma descritiva, mas de forma reflexiva - tambm com perguntas, questionamentos, dvidas. No mera recopilao dos apontamentos. Estudantes explicitam como imaginam construir o seu portflio. Cada exemplo selecionado para dar evidncia de seu progresso deve ser recolhido, criado e organizado de uma determinada forma para demonstrar sua avaliao. Ter presente o fio condutor mais a explicitao do porqu de ter selecionado cada evidncia.

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AS CLULAS EUCARITICAS E SUA CAPACIDADE DE DIFERENCIAORegina Clila Mingroni Netto e Eliana Maria Beluzzo Dessen

Nosso corpo formado por diversos tipos de clulas O nosso corpo constitudo de trilhes de clulas, organizadas em diversos tipos de tecidos. Todas essas clulas originam-se de uma nica, denominada clula-ovo ou zigoto, que, por sua vez, o resultado da unio de duas outras: o espermatozide e o vulo. medida que o embrio cresce, grupos de clulas vo se tornando diferentes em estrutura e funo, em decorrncia de um processo chamado de diferenciao celular (Figura 1).

vulo sendo fertilizado

Fases iniciais do desenvolvimento embrionrio, a partir do zigoto

Clula nervosa Clulas adiposas

Clulas musculares

Clulas do sangue

Figura 1. O zigoto d origem aos trilhes de clulas diferenciadas de nosso organismo.

Em ltima anlise, esse processo controlado pelo DNA, que o material gentico. Mas, se o DNA contm a informao gentica e essa informao a mesma em todas as clulas do nosso corpo, voc consegue entender como possvel que as clulas possam ser to diferentes? O que se tem concludo das pesquisas cientficas que as clulas dos tecidos se diferenciam por terem diferentes trechos da molcula de DNA, ou seja, diferentes genes em funcionamento. Assim, as modificaes celulares no processo de diferenciao resultam da ativao de certos genes e da inativao de outros: cada tipo de clula possui um conjunto caracterstico de genes ativos. Em conseqncia dessa atividade diferencial, o conjunto de protenas codificadas pelos genes varia dependendo do tipo de clula. Por exemplo, nas clulas do tecido nervoso, esto ativos genes que codificam protenas que tornam as clulas ramificadas e capazes de fazer sinapses. Por outro lado, nas clulas das glndulas salivares, devem estar ativos genes que codificam enzimas secretadas na saliva. claro que os genes que determinam a produo das enzimas da saliva no devem estar ativos em nenhum outro tecido do corpo. A atividade

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diferencial dos genes comea a ser determinada no decorrer do desenvolvimento embrionrio e persiste nos tecidos adultos. Todas as clulas tm duas caractersticas importantes: o grau de diferenciao e a potencialidade. O grau de diferenciao reflete o quanto uma clula especializada. A potencialidade a capacidade que ela tem de originar outros tipos celulares. Quanto maior a potencialidade da clula, geralmente ser menor o seu grau de diferenciao. O zigoto a clula com a mxima potencialidade, pois ele d origem a todos os tipos de clulas. Assim, ele no especializado ou diferenciado. No outro extremo, h clulas com potencialidade nula, como o caso dos glbulos vermelhos. Durante o processo de diferenciao dessas clulas, elas perdem o ncleo. Perderam, conseqentemente, a capacidade de originar clulas iguais a elas. Logo, no tm potencialidade. A compreenso das diferenas de potencialidade celular importante para o entendimento de uma srie de tpicos tratados nesse volume.

Clulas-tronco totipotentes podem originar um organismo inteiro. Ex. Zigoto e primeiras clulas que resultam da diviso do zigoto

Clulas-tronco pluripotentes podem originar quase todos os tipos de tecidos. Ex. Massa interna do blastocisto

CT hematopoitica

outras CT

Clula-tronco multipotente podem originar diversos tipos de tecidos. Ex. Clulas-tronco do adulto

plaquetas

Glbulos brancos

Glbul

hemcias

Figura 2. Classificao das clulas de acordo com sua potencialidade.

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DIFERENCIAO CELULAR E O CONTROLE DO GENE EUCARITICOEliana Maria Beluzzo Dessen (adaptado de Fundamentos de Biologia Celular Alberts e col.)

A diferenciao produz uma variedade de clulas especializadas em eucariotos Durante as repetidas divises celulares que ocorrem no zigoto unicelular transformando-o em um organismo multicelular, as clulas individuais sofrem diferenciao celular, isto , tornam-se especializadas em estrutura e funo. a regulao de genes que leva a essa especializao. Genes ativos em clulas de uma asa de mosca em desenvolvimento, por exemplo, so expressos como protenas que tornam as clulas chatas e lisas, formando uma superfcie de vo forte e fina, semelhante a plstico transparente. Noutro exemplo, as clulas dos olhos em desenvolvimento, outros genes esto se expressando e sintetizam as protenas que formam lentes capazes de focalizar luz. Clulas especializadas podem reter todo o seu potencial gentico O zigoto possui um conjunto completo de genes que dar origem a todos os tipos de clulas especializadas do organismo. O que ocorre a esses genes medida que as clulas se diferenciam? Uma hemcia, por exemplo, perde seu ncleo e todo seu DNA. Porm, a maioria das clulas diferenciadas retm o ncleo e um conjunto completo de cromossomos. Quando todos os genes ainda esto presentes as clulas diferenciadas retm seu potencial de expressa-los? Uma maneira de responder a essas questes a experimentao, ou seja, substituir o ncleo de um ovo ou zigoto pelo ncleo de uma clula diferenciada. Se genes forem perdidos ou irreversivelmente inativados durante a diferenciao, o ncleo transplantado no permitir o desenvolvimento de um embrio normal. Experimentos pioneiros de transplantes de ncleos foram realizados pelos embriologistas Robert Briggs e Thomas King na dcada de 1950. Esses pesquisadores destruram os ncleos de vulos de sapo com luz ultravioleta (UV) e, em seguida, transplantaram no vulo anucleado um ncleo de clula intestinal de girino. Muitos dos ovos contendo os ncleos transplantados comearam a se desenvolver, porm, poucos originaram girinos normais. Desse modo os pesquisadores foram capazes de clonar sapos produzir cpias geneticamente idnticas usando ncleos de clulas diferenciadas. Tais estudos mostraram que ncleos de clulas diferenciadas podem reter todo o seu potencial gentico. Evidencias adicionais apareceram em 1997 com a clonagem do primeiro mamfero usando ncleos diferenciados. Nesse caso, os pesquisadores usaram choques eltricos para fundir uma clula de glndula mamria de ovelha com um vulo do qual o ncleo havia sido retirado. O ovo comeou a se dividir, foi implantado no tero de outra ovelha, e desenvolveu-se na celebrada Dolly. Como previsto Dolly parecia-se com sua parental feminina, a clula de mama doadora do ncleo, e no com o vulo doador ou a me de aluguel. Outra indicao que a diferenciao no interfere no potencial gentico o processo natural de regenerao, ou seja, a reposio de partes perdidas do corpo. Quando uma salamandra perde uma perna, por exemplo, certas clulas do toco do membro se diferenciam, e ento se rediferenciam para dar origem a uma nova perna. Em plantas, a habilidade de uma clula diferenciada desenvolver-se em um novo organismo comum. A figura 1C mostra de modo esquematizado uma nica clula, removida da raiz de cenoura e colocada em meio de cultura, pode comear a se dividir e originar uma planta adulta. Essa tcnica pode ser usada para clonar plantas, reproduzindo centenas de milhares de organismos geneticamente idnticos a partir de clulas somticas de um nico indivduo. Desse modo, possvel propagar grande nmero de plantas que tem caractersticas desejveis tais como alta produtividade de frutos ou resistncia a doenas. O fato de uma planta madura poder se desdiferenciar e originar

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todos os tipos de clulas especializadas de uma nova planta uma evidncia que a diferenciao no necessariamente envolve mudanas irreversveis no DNA. Cada tipo de clula diferenciada tem um padro de expresso gnica Se todas as clulas diferenciadas de um organismo contm os mesmos genes, e todos os genes tm o potencial de ser expressar, como as clulas tornam-se especializadas? Como j foi dito, as grandes diferenas entre as clulas em um organismo resultam da expresso seletiva de genes. medida que um embrio em desenvolvimento sofre sucessivas divises, genes especficos so ativados em diferentes clulas durante diferentes perodos de tempo. Grupos de clulas seguem vias de desenvolvimento diversas, e cada grupo desenvolve um tipo particular de tecido. Finalmente, no organismo maduro, cada tipo de clula nervosa ou pancretica, por exemplo, - tem um padro diferente de genes que so expressos. A Tabela abixo ilustra padres de expresso gnica para alguns genes em clulas de trs diferentes tecidos especializados de um mamfero. Os genes para as enzimas da via metablica da glicolise esto ativos em todas as clulas metabolicamente ativas, incluindo clulas do pncreas, do cristalino e nervosas, como exemplificado. Entretanto, os genes que codificam protenas especializadas so expressos apenas por clulas especficas.Clula pancretica Genes das enzimas da via glicoltica Gene do cristalino Gene da insulina Gene da hemoglobina Funcionais Clula do cristalino (embrio) Funcionais neurnio Funcionais

Inativo

Funcional

Inativo

Funcional Inativo

Inativo Inativo

Inativo inativo

As protenas especializadas que foram usadas como exemplo so as protenas transparentes do cristalino, que formam a lente do olho; o hormnio insulina; e a protena transportadora de oxignio, hemoglobina. Note que os genes para hemoglobina no esto ativos em nenhum dos tipos celulares mostrados na figura. Eles se expressam apenas nas clulas que iro se desenvolver em hemcias. Os genes para insulina so ativados apenas nas clulas do pncreas que produzem hormnio. As clulas nervosas expressam genes para outras protenas especializadas no mostradas. Clulas maduras do cristalino, e as hemcias, por exemplo, atingem um grau mximo de diferenciao, pois elas, aps acumularem produtos proticos, perdem seus ncleos e, assim, todos os seus genes. Vimos ento que as clulas eucariticas tornam-se especializadas porque expressam apenas certos genes. Desse modo, a diferenciao celular em organismos multicelulares resulta da expresso gnica seletiva, assim como a habilidade de bactrias produzirem diferentes enzimas quando necessrias. A seguir ser examinado com mais detalhe o controle da expresso gnica nos eucariotos. A transcrio controlada por protenas que se ligam a seqncias reguladoras de DNA Quando comparados com os procariotos, os eucariotos enfrentam as mesmas tarefas bsicas de coordenao da expresso gnica, porm de um modo muito mais complexo. Alguns genes tm que responder a mudanas nas condies fisiolgicas. Muitos outros so parte de circuitos genticos de desenvolvimento que organizam as clulas em tecidos e tecidos em um organismo inteiro (exceto para os eucariotos

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unicelulares). Nesses casos, os sinais que controlam a expresso gnica so produtos de genes que regulam o desenvolvimento e no sinais do meio externo. Algumas das seqncias de DNA reguladoras so curtas, cerca de 10 pares de nucleotdeos, e atuam como um interruptor gnico, ligando ou desligando o gene, em resposta a um nico sinal. Esse tipo simples de interruptor gnico predomina nas bactrias. Nos eucariotos existem longas seqncias reguladoras de DNA (algumas vezes mais do que 10.000 pares de bases) que atuam como um microprocessador molecular, respondendo a uma variedade de sinais que so por elas integrados e que determinam a taxa de incio da transcrio. As seqncias de DNA reguladoras no funcionam por si s. Para que haja qualquer efeito essas seqncias devem ser reconhecidas por protenas denominadas protenas reguladoras que tm a capacidade de se ligarem ao DNA. a combinao de uma seqncia de DNA e suas molculas de protenas associadas que atuam como interruptor no controle da transcrio. Centenas de seqncias reguladoras de DNA foram identificadas, e cada uma delas reconhecida por uma ou mais protenas reguladoras. As protenas que reconhecem seqncias especificas de DNA o fazem porque a superfcie da protena ajusta-se perfeitamente na dupla hlice de DNA de maneira seqncia-especfica, e assim, diferentes protenas iro reconhecer diferentes seqncias de nucleotdeos. Na maioria dos casos, a protena insere-se no sulco maior da dupla hlice e realiza uma srie de contatos moleculares com os pares de bases. A protena forma pontes de hidrognio, ligaes inicas, e interaes hidrofbicas com as extremidades das bases, usualmente sem romper as pontes de hidrognio que une os pares de bases. Embora cada contato individual seja fraco, os cerca de 20 contatos que so geralmente formados na interface DNA-protena atuam juntos para assegurar que a interao seja altamente especifica e muito forte; de fato as interaes DNA-protenas esto entre as mais firmes e especficas interaes moleculares conhecidas em biologia. Embora cada exemplo de reconhecimento protena-DNA seja nico em seus detalhes, muitas das protenas responsveis pela regulao gnica contm um dos vrios padres estveis de dobramento que formam os chamados motivos estruturais. Essas regies da protena que se apresentam dobradas em motivos estruturais se ajustam ao sulco maior da dupla hlice do DNA e formam associaes estreitas com um curto trecho de pares de bases. A iniciao da transcrio gnica em eucariotos um processo complexo Os interruptores dos genes presentes em bactrias so exemplos vivos da economia e simplicidade freqentemente observada em biologia. Em eucariotos, entretanto, um gene tpico responde a muitos sinais diferentes, e sua regulao , conseqentemente, mais complexa. A polimerase do RNA de eucariotos necessita de fatores gerais de transcrio Nos eucariotos, so vrias as funes atribudas aos fatores gerais de transcrio no processo de incio da transcrio pela polimerase II do RNA: posicionar corretamente a polimerase no promotor, ajudar a separar as duas fitas da molcula de DNA para permitir que a transcrio se inicie e liberar a polimerase do RNA do promotor uma vez iniciada a transcrio. O termo geral refere-se ao fato desses fatores associam-se a todos os promotores transcritos pela polimerase II do RNA. Nesse aspecto, os fatores gerais de transcrio diferem dos repressores e ativadores (descritos em bactrias no texto VI) que atuam em genes ou operons especficos, e das protenas reguladoras dos genes eucariticos (discutidas a seguir), que tambm atuam apenas em genes especficos. A Figura 1 mostra um modelo de como os fatores gerais de transcrio associamse aos promotores utilizados pela polimerase II do RNA. O processo de montagem do complexo de iniciao comea com a ligao do fator de transcrio TFIID a uma curta seqncia de DNA dupla hlice composta por nucleotdeos T e A, conhecida como

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seqncia TATA ou TATA box. Ao ligar-se ao DNA, o fator TFIID causa uma dramtica distoro local na molcula de DNA. Tal distoro funciona como um sinal para a subseqente montagem de outras protenas no promotor. A seqncia TATA um componente presente em praticamente todos os promotores utilizados pela polimerase II do RNA e localiza-se cerca de 25 nucleotdeos a montante (upstream) do stio de incio da transcrio. Aps a ligao do primeiro fator geral de transcrio ao DNA, outros fatores tambm se ligam, juntamente com a polimerase II do RNA, para formar o complexo de iniciao da transcrio. Protenas reguladoras controlam a distncia a expresso de genes eucariticos As bactrias utilizam protenas reguladoras (ativadoras e repressoras) para regular a expresso de seus genes. As clulas dos eucariotos utilizam a mesma estratgia bsica. Embora seja necessria a presena conjunta dos fatores gerais de transcrio e da polimerase do RNA para o incio da transcrio in vitro (veja figura 1), dentro das clulas essas protenas sozinhas no conseguem iniciar a transcrio de modo eficiente. Praticamente todos os promotores eucariticos necessitam tambm de protenas ativadoras que auxiliam a associao dos fatores gerais de transcrio e da polimerase do RNA. Os stios do DNA aos quais se ligam as protenas ativadoras dos genes eucariticos foram denominados enhancers, desde que sua presena aumenta dramaticamente a taxa de transcrio. Foi muito surpreendente para os bilogos quando, em 1979, foi descoberto que essas protenas ativadoras podiam se ligar a segmentos muito distantes do promotor, a milhares de pares de bases. Alm disso, esses ativadores eucariticos podem influenciar a transcrio quando se ligam a montante (upstream) ou a jusante (dowstream) do gene. Como as seqncias enhancers e as protenas ligadas a elas funcionam a distncias to grandes? Como elas se comunicam com o promotor? Vrios modelos de ao distncia foram propostos, mas o mais simples deles parece se aplicar para a maioria dos casos. O segmento de DNA compreendido entre o enhancer e o promotor dobra-se permitindo que as protenas ligadas ao enhancer fiquem em contato ou com a polimerase do RNA ou com um dos fatores gerais de transcrio ligados ao promotor (Figura 2). Desse modo, o segmento de DNA compreendido entre o enhancer e o promotor DNA atuaria como uma estrutura de ligao que aproximaria a protena ligada ao enhancer, localizado a milhares de pares de bases, permitindo sua interao com o complexo de protenas ligadas ao promotor. Em eucariotos, as protenas reguladoras ligadas a seqncias reguladoras distantes do promotor podem aumentar ou ento diminuir a atividade da polimerase do RNA ligada ao promotor. Uma das maneiras de ao de tais protenas influenciar a montagem do complexo de iniciao. Protenas ativadoras iro facilitar a montagem do complexo enquanto repressoras impedem a montagem correta. O empacotamento do DNA em nucleossomos no promotor pode afetar a iniciao da transcrio As protenas da cromatina e o DNA so parceiros no controle das atividades do material gentico dentro da clula. O cromossomo um complexo nucleoprotico intrincadamente enovelado e com muitos domnios (Figura 3), nos quais a estrutura da cromatina local est estreitamente relacionada manuteno de genes na configurao ativa ou silenciada, e a outras atividades da clula tais como a replicao do DNA, o emparelhamento e segregao dos cromossomos, e a manuteno da integridade do telmero e centrmero. Algumas regies do genoma (heterocromatina, telmero e centrmero) esto empacotadas com caractersticas estruturais especificas. Esse empacotamento diferencial definido por histonas modificadas, ou pela associao de protenas adicionais no histnicas, ou ento por molculas de RNA reguladoras, que surpreendentemente tambm esto implicadas na organizao da cromatina. Por exemplo, o X inativo dos

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mamferos est enriquecido por variantes de histonas como a macro H2A, quase trs vezes maior que a H2A. No centrmero dos vertebrados, uma das histonas do octmero, a H3, substituda pela variante CENP-A. Esta por sua vez, forma um complexo com outras protenas do centrmero, influenciando assim o empacotamento da cromatina centromrica. Uma vez que os nucleossomos esto localizados ao longo do DNA em intervalos regulares e com pouca especificidade, provvel que eles ocorram sobre regies promotoras. Tais nucleossomos podem ser deslocados quando a transcrio do gene ativada, embora ainda no seja completamente entendido como ocorre esse deslocamento. Sabe-se, porm que a clula possui protenas especializadas cuja funo deslocar nucleossomos dos promotores e liberar o caminho para a montagem dos fatores gerais de transcrio. Outra possibilidade que, como um preldio para a iniciao, as histonas nas vizinhanas do promotor sejam quimicamente modificadas, um passo que desestabiliza os nucleossomos afetados. Nucleossomos formados em seqncias reguladoras de DNA podem tambm interferir com a expresso gnica bloqueando a ligao de protenas. Entretanto, nem sempre isso ocorre. Enquanto h evidencias de que algumas seqncias reguladoras so mantidas expostas em regies livres de nucleossomos, certas protenas reguladoras parecem capazes de ligarem-se s seqncias do DNA mesmo quando essas se encontram incorporadas em nucleossomos, possivelmente desestabilizando e desmontando parcialmente o nucleossomo nesse processo. A clula tem vrias estratgias para assegurar que o inicio da transcrio ocorra num DNA empacotado em nucleossomos. Entretanto, tambm claro que quanto mais compacta for a forma da cromatina (aquela encontrada em cromossomos mitticos, cromossomos X inativos, e outras regies da cromatina interfsica) mais resistente ela ser ao inicio da transcrio. Presumivelmente, isso ocorre porque as protenas reguladoras, os fatores gerais de transcrio, e a polimerase do RNA no podem ter acesso ao DNA quando ele est to densamente empacotado. Genes eucariticos so regulados por uma combinao de protenas Nos eucariotos, as seqncias que controlam a expresso de um gene podem se espalhar por longos segmentos de DNA. Em animais e plantas no raro encontrar seqncias reguladoras localizadas a 50.000 pares de nucleotdeos, embora a maioria desse DNA sirva apenas como espaador e no seja reconhecido por protenas reguladoras do gene. As protenas reguladoras de genes no funcionam individualmente para ligar ou desligar um gene. Enquanto essa idia cabe para muitos ativadores e repressores de bactrias, a maioria das protenas que regulam os genes dos eucariotos funcionam como parte de um comit de protenas reguladoras, todas necessrias para fazer com que o gene se expresse na clula certa, em resposta s condies corretas, no tempo certo, e com nvel de expresso adequado. O termo controle combinatorial refere-se ao modo como grupos de protenas trabalham juntas para determinar a expresso de um nico gene. Como mostrado na figura 4, muitas protenas diferentes ligam-se a seqncias reguladoras para influenciar o inicio da transcrio nos eucariotos. A maioria dos genes eucariticos possui regies reguladoras contendo numerosos stios para ambos os tipos de protenas: com ao ativadora e repressora. Padres estveis de expresso gnica podem ser transmitidos para as clulas filhas Embora todas as clulas procariticas e eucariticas sejam capazes de ligar e desligar genes, organismos multicelulares necessitam de mecanismos especiais de controle para gerar e manter seus diferentes tipos de clulas. Uma vez que uma clula de um organismo multicelular tenha se diferenciado em um tipo especfico, ela geralmente ir

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permanecer diferenciada, e se for capaz de dividir-se, toda a sua prognie ser do mesmo tipo celular. Algumas clulas altamente especializadas nunca se dividem aps a diferenciao, como por exemplo, clulas da musculatura esqueltica e neurnios. Mas h vrios outros tipos de clulas diferenciadas, tais como fibroblastos, clulas da musculatura lisa, e clulas do fgado (hepatcitos), que iro se dividir muitas vezes durante a vida do organismo. Todos esses tipos celulares originam, quando se dividem, apenas clulas como elas mesmas: clulas de musculatura lisa no originam clulas do fgado. Isso significa que as mudanas na expresso gnica do origem as clulas diferenciadas devem ser lembradas e transmitidas para suas clulas filhas em todas as divises subseqentes, ao contrrio das mudanas temporrias na expresso gnica que ocorrem nas clulas de procariotos e eucariotos. Por exemplo, nas clulas ilustradas na figura 13, a produo de cada protena reguladora, uma vez iniciada, deve ser perpetuada nas clulas filhas em cada diviso celular. Como isso deve ocorrer? H vrias maneiras de assegurar que as clulas filhas lembrem que tipos de clulas espera-se que elas sejam. Uma das mais simples delas por meio de uma ala de feedback positivo, onde uma protena reguladora chave ativa a transcrio do gene que a codifica alm de ligar genes especficos de outros tipos celulares (figura 5). Por exemplo, a protena reguladora MyoC funciona com esse tipo de feedback. Outra maneira de manuteno do tipo celular atravs da propagao fiel da estrutura da cromatina da clula parental para a clula filha mesmo com um evento de replicao entre elas. Um exemplo disto o fenmeno da inativao do cromossomo X nos mamferos. O evento de inativao de um dos cromossomos X, o de origem paterna ou o de origem materna, ocorre no incio do desenvolvimento embrionrio e, a partir da, o mesmo cromossomo X inativado por muitas geraes seguidas. O mecanismo molecular por meio do qual o estado da cromatina transmitido no ainda totalmente conhecido em detalhesincio da transcrio

RNA polimerase

Figura 1.Incio da transcrio de um gene eucaritico pela polimerase II do RNA. Para que a transcrio possa se iniciar so necessrios vrios fatores gerais de transcrio denominados, TFIIA, TFIIB e assim por diante. (A) o promotor contm uma seqncia de DNA denominada TATA Box, localizada a cerca de 25 nucleotdeos do stio de incio de transcrio. (B) O fator TFIID reconhece a seqncia TATA, se liga a ela, e permite a ligao do fator TFIIB. (C a E) os demais fatores de transcrio e a polimerase ligam-se ao promotor como em uma linha de montagem.

transcrio

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Protena ativadora

Incio da transcrio Ligao de fatores gerais de Transcrio, polimerase do RNA, mediadores, etc.

Incio da transcrioFigura 2. Modelo de ativao gnica distncia. Nesse exemplo, os fatores gerais de transcrio, os fatores de transcrio e a polimerase do RNA por si s no se associam eficientemente ao promotor e uma protena reguladora ligada ao enhancer necessria para estimular o processo de montagem do complexo de iniciao.O dobramento do DNA permite o contato entre a protena reguladora ligada ao enhancer e o complexo de iniciao ligado ao promotor. No desenho, a linha interrompida indica a grande distancia que geralmente existe entre o enhancer e o promotor.

DNA

Colar de contas

Fibra cromatnica de 30nm A fibra se organiza em alas

Figura 3. Esquema de alguns dos nveis de empacotamento da cromatina do cromossomo mittico altamente condensado. O nvel deorganizao melhor compreendido aquele em que o DNA nu associa-se s histonas formando os nucelossomos. As estruturas que correspondem aos nveis seguintes de organizao so mais especulativas.

Segmento condensado

Cromossomo mittico Cada molcula de DNA foi empacotada em cromossomos mitticos que 10.000 vezes mais curto que o DNA entendido.

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Seqncias reguladoras do geneDNA espaador

Fatores gerais de transcrioProtenas Reguladoras do gene

RNA polimerase

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Incio da transcrio

Figura 4. Seqncias reguladoras de um gene eucaritico tpico. O promotor a seqncia de DNA onde a polimerase do RNA e os fatores gerais de transcrio se ligam. As seqncias reguladoras do gene so usadas como stios de ligao de protenas reguladoras cuja presena no DNA afetam a taxa de incio de transcrio. As seqncias reguladoras podem estar localizadas adjacentes ao promotor, muito longe dele na direo 5 (montante) ou, a 3do gene (jusante).

III

II I

Figura 5. Esquema do modo como uma ala de feedback positivo pode criar a memria celular. A protena A uma protena reguladora que ativa sua clula progenitora que experimentou um sinal transitrio que deu incio produo da protena. (I) A protena A no normalmente produzida, pois ela necessria para sua prpria transcrio. (II) sinal transiente liga o gene A, (III) O efeito do sinal transiente lembrado em todas as clulas descendentes.

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SINALIZAO CELULAR Adriana Ribeiro de Oliveira-Marques adaptado de Alberts e col. 2004. Os organismos multicelulares possuem um elaborado sistema de comunicao celular. Tal sistema depende de: 1. molculas-sinal extracelulares, produzidas por clulas para sinalizar clulas vizinhas ou mais distantes 2. um elaborado sistema de protenas que cada clula contem e que a habilita a responder a um conjunto particular de sinais de modo clula-especfico. Essas protenas incluem: a. protenas receptoras de superfcie celular que se ligam a molcula sinal b. uma variedade de protenas sinalizadoras intracelulares que distribuem o sinal para partes apropriadas da clula. Entre essas protenas esto: quinases, fosfatases, protenas que se ligam a GTP e protenas que interagem com as anteriormente citadas. c. no final de uma via de sinalizao intracelular esto protenas alvo, que so alteradas quando a via est ativa e mudam o comportamento da clula. Dependendo do efeito do sinal, essas protenas alvo podem ser reguladoras, canal de ons, componentes da via metablica, partes do citoesqueleto, etc Princpios gerais da comunicao celular Para facilitar a compreenso de como ocorre a sinalizao celular vamos fazer uma analogia com a transmisso de uma mensagem por telefone. Uma pessoa fala ao telefone e sua voz convertida num sinal eltrico. O sinal amplicado e a mensagem carregada na forma de impulsos eltricos pelo fio do telefone. Na extremidade oposta o sinal eltrico convertido em onda sonora que captada pelo ouvido e finalmente expressada na forma de impulsos no encfalo de quem a recebeu. Em passos sucessivos ao longo dessa via de comunicao, formas diferentes de sinais so usadas para representar a mesma informao: o ponto crtico na transmisso ocorre quando a informao convertida de uma forma em outra. Esse processo de converso chamado transduo de sinal. Os sinais que passam entre as clulas so mais simples que as mensagens humanas: um tipo particular de molcula produzido por uma clula a clula sinalizadora e detectada por outra a clula alvo por meio de protenas receptoras, que reconhecem e respondem de modo especifico molcula sinal. A protena receptora realiza o primeiro passo numa srie de processos de transduo na extremidade final da via de sinalizao, na clula alvo, aonde o sinal extracelular que chega convertido num sinal intracelular que direciona o comportamento da clula. Os dois pontos chave dizem respeito recepo e a transduo do sinal. Quando os bilogos referem-se a sinalizao celular, so esses dois aspectos que eles geralmente tem em mente. A seguir sero brevemente descritos os diferentes tipos de sinais que as clulas enviam umas para as outras. Sinais podem atuar em curta ou longa distncia As clulas num organismo multicelular usam centenas de tipos de molculas extracelulares para enviar sinais uma para as outras protenas, peptdeos, aminocidos, esterides, derivados de cidos graxos e at gases dissolvidos mas h apenas uma dezena de modos bsicos de comunicao. A maneira mais pblica de se comunicar transmitir o sinal pelo corpo todo secretando na corrente sangunea do organismo (Figura 1D). Molculas sinais usadas dessa maneira so chamadas hormnios, e em animais, as clulas que produzem hormnios so chamadas clulas endcrinas.

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Menos publico o processo conhecido como sinalizao parcrina. Nesse caso, as molculas sinal difundem localmente pelo meio extracelular, relembrando as clulas nas vizinhanas da clula secretora: elas atuam como mediadores locais (Figura 1B). Muitas das molculas-sinal que mediam a inflamao nos locais de infeco ou proliferao celular em cicatrizao funcionam dessa maneira. Um terceiro modo de comunicao a sinalizao neuronal. Assim como na sinalizao hormonal, mensagens so freqentemente entregues em longas distancias; na sinalizao neuronal, entretanto, mensagens so liberadas em linhas privadas para clulas individuais de modo muito rpido (Figura 1C). O axnio de um neurnio termina em junes especializadas (sinapses) nas clulas alvo distantes do corpo celular neuronal. Quando ativada por sinais do meio ou por outros nervos, o neurnio manda impulsos eltricos ao longo do axnio com velocidade superior a 100 metros por segundo. Chegando ao axnio terminal, os sinais eltricos intracelulares so convertidos em uma forma qumica extracelular: cada impulso eltrico estimula o terminal a secretar um pulso de um sinal qumico chamado neurotransmissor. Neurotransmissores difundem atravs do estreito gap (