UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

ESCOLA TÉCNICA

CURSO TÉCNICO EM BIOTECNOLOGIA

Fundamentos de Laboratório

Júlio Xandro Heck

Jane Elisabete Marques de Almeida Caon

Porto Alegre, 2006

OS AUTORES

Júlio Xandro Heck é formado em Química Industrial de Alimentos, Mestre em

Microbiologia Agrícola e do Ambiente (ênfase em Tecnologia de Bioprocessos) pela

UFRGS e Doutor em Biologia Celular e Molecular (ênfase em Biotecnologia) pela

UFRGS. Foi bolsista de Pós-doutorado do CNPq e atualmente é professor na Escola

Técnica da UFRGS.

Jane Elisabete Marques de Almeida Caon é formada em Biologia, Especialista

em Programas de Saúde e Mestre em Ecologia pela UFRGS. Professora na Escola Técnica

UFRGS.

APRESENTAÇÃO

Este manual foi desenvolvido com o objetivo de servir como guia básico para o

desenvolvimento do Componente Curricular de Fundamentos de Laboratório, oferecido

para o Curso Técnico em Biotecnologia, da Escola Técnica da UFRGS. Não é nossa

intenção fornecer ao aluno subsídios para a realização de todas as operações utilizadas em

laboratórios de Biotecnologia e nem permitir a utilização eficiente de qualquer

equipamento disponível, pois esta tarefa seria extremamente extensa e, provavelmente, não

teríamos sucesso. No entanto, esperamos que a nossa obra sirva de orientação geral para o

desenvolvimento das atividades cotidianas do Técnico em Biotecnologia e torne mais fácil

o desempenho de suas atividades profissionais.

Os autores

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

ESCOLA TÉCNICA DA UFRGS

Curso de Biotecnologia

Fundamentos de Laboratório

Professor: Charley Christian Staats

Aula 1:

NOÇÕES BÁSICAS DE BIOSSEGURANÇA

ACIDENTES COM SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS E PRIMEIROS SOCORROS

Orientações gerais sobre comportamento em um laboratório de Biotecnologia

1. Ao entramos em um laboratório (de química, bioquímica, microbiologia, etc)

devemos sempre colocar o jaleco (avental, guarda pó, etc). Este procedimento é

IMPRESCINDÍVEL. Não devemos tolerar que pessoas circulem pelo laboratório sem a

vestimenta adequada. Obviamente, o jaleco deve ser limpo e adequado para a função.

2. Não coloque lanches, cigarros e outros materiais sobre as mesas do laboratório,

pois elas podem estar contaminadas com produtos corrosivos ou tóxicos .

3. Mantenha seu lugar de trabalho em perfeito estado de limpeza e evite obstáculos

inúteis na sua bancada de trabalho.

4. É expressamente proibido fumar no ambiente de laboratório.

5. Nunca use tubos de vidro com as bordas cortantes, mesmo em caso de urgência.

Vidro trincados jamais devem ser usados.

6. Não faça força sobre o vidro.

7. Lubrifique os tubos de vidro para introduzi-los nas rolhas. No caso de rolhas de

borracha, use glicerina como lubrificante.

7. Proteja suas mãos com luvas de couro ao colocar rolhas em um tubo.

8. Os frascos com amostras contaminadas com solução ácida, soda cáustica ou

outros materiais corrosivos devem ser lavados com água após serem usados.

9. Vidros quebrados devem ser jogados em recipientes próprios e nunca despejados

no lixo comum.

10. Ao sifonar ou pipetar líquidos, NUNCA FAÇA ISSO COM A BOCA, use

pipetadores apropriados.

11. Materiais tóxicos ou voláteis devem ser manipulados em local apropriado

(capela de exaustão). Na falta desta, fazer esse procedimento ao ar livre, fora do

laboratório, tomando as devidas precauções.

12. Amostras e produtos químicos em recipientes sem rótulos na devem ser usados.

13. Amostras quentes devem ser identificadas como tal.

14. Roupas contaminadas devem ser trocadas imediatamente.

15. O bico de Bunsen deve ser usado somente em lugares isentos de inflamáveis ou

explosivos.

16. Coloque os recipientes contendo produtos em seus lugares apropriados, isso

evitará erros na análise e possíveis acidentes.

17. Jogue o lixo nos locais adequados.

18. No caso de diluições, DERRAME SEMPRE O ÁCIDO NA ÁGUA E NÃO a

água no ácido.

19. Evite tocar em produtos que não conhece.

20. Não procure, com fins recreativos, misturar reativos e produtos sem saber o que

vai acontecer.

21. Evite respirar vapores e fumaças.

22. Rotule os recipientes antes de enchê-los.

23. Não beba água, café, leite, refrigerantes, etc, em locais que sejam apropriados

(béqueres, por exemplo).

24. Não jogue na pia líquidos corrosivos ou inflamáveis que não tenham sido

previamente diluídos.

25. Se, por acaso, quebrar um frasco de vidro, não apanhe os estilhaços com as

mãos. Use uma escova ou vassoura.

26. REDOBRE SUA ATENÇÃO QUANTO ESTIVER FAZENDO ALGUM

EXPERIMENTO NO LABORATÓRIO, POIS SÓ ASSIM PODERÁ INTERPRETAR

CORRETAMENTE OS RESULTADOS E GARANTIR A SUA SEGURANÇA E A DE

TODOS QUE ESTIVEREM NO LABORATÓRIO.

Acidentes com substâncias químicas e primeiro socorros

Vale a pena lembra que é dever de todos o conhecimento dos riscos dos produtos

químicos que estão sendo manipulados no laboratório.

Os procedimentos gerais, em caso de acidentes, estão listados a seguir:

Derramamento de ácidos e bases:

ÁCIDOS: antes de lavar com água é correto adicionar Ca(OH)2 (hidróxido de

cálcio).

BASES: adicionar NAHSO4 (bissulfato de sódio).

Respingos de produtos químicos sobre a pele e mucosas:

1. Lavar com água corrente em abundância, sem esfregar a superfície afetada, até

que seja removido o componente químico em contato com a pele ou a mucosa.

2. Retirar as roupas da pessoa e tomar cuidado para não se contaminar neste

processo. Lavar as roupas separadamente, antes de usar.

3. Procurar atendimento médico, se necessário.

Respingos sobre os olhos

1. Lavar os olhos com água corrente em abundância, forçando levemente as

pálpebras, assegurando que a água banhe-os totalmente.

2. Todos os acidentes causados por agentes químicos que envolvam os olhos

devem receber cuidados médicos.

Inalação de gases

1. Remover imediatamente a pessoa do local e afrouxar as roupas.

2. Se a vítima estiver inconsciente, deite-a e verifique a respiração. Se a respiração

estiver parada, inicie respiração artificial.

3. Procure assistência médica.

Ingestão

1. Se o ocorrer o contato de qualquer produto químico com a boca, enxágüe com

bastante água, tomando cuidado para não engolir. Se o composto químico foi ingerido, beber água para diluí-lo no estômago.

2. Não induzir vômito.

3. Transportar a vítima para o centro médico mais próximo.

O tratamento dos diferentes tipos de intoxicação baseia-se, fundamentalmente, em

terminar a exposição do organismo à substância, promover a excreção, empregar antídotos

ou antagonistas da substância química e, se esta for ingerida, aplicar medidas de sustentação.

A seguir estão apresentados alguns antídotos e suas aplicações.

Antídoto Indicado para acidentes com:

Acetato de amônio (solução 61,5%) para

lavagem gástrica

Formaldeído

Ácido acético 1% Hidróxidos

Hidróxido de cálcio (solução 0,14%) para

administração oral

Ácidos

Amido de milho (80 g/L) Iodo

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Fundamentos de Laboratório

Professor: Charley Christian Staats

Aula 2:

INSTRUMENTOS E MATERIAIS DE LABORATÓRIO

- Agarradores: Utilizados para segurar buretas, balões, erlenmeyers, condensadores e funis

nos suportes.

- Argola: Suporte para funil de separação, funil simples, tela de amianto e frascos que são

coletados sobre a tela de amianto quando aquecidos.

- Balança analítica: Instrumento usado para determinação de massas de reagentes. As

balanças analíticas possuem precisão de 0,0001 g.

- Balão de fundo chato: Empregado para aquecimento ou armazenamento de líquidos ou

solução.

- Balão volumétrico: Balão de fundo chato e gargalo comprido, calibrado para conter

determinados volumes líquidos. Possui um traço de referência, que marca o volume exato.

Utilizado na preparação de soluções de concentrações conhecidas.

- Bastão de vidro: É um bastão de vidro maciço utilizado para agitações e para auxiliar na

transferência de líquidos de um recipiente para outro (direcionador de fluxo).

- Béquer (becker): Recipiente de vidro utilizado para aquecer substâncias, recolher

filtrados, fazer decantações, misturar reagentes, preparar soluções e realizar reações.

- Bico de Bunsen: Bico de gás especialmente construído para usos em laboratórios.

Utilizado para aquecimento até temperaturas de 800ºC. Além deste, utilizam-se outros

métodos de aquecimento em laboratório: banho-maria e banho de óleo.

Como utilizar o bico de bunsen:

1. abrir a chave geral de gás do laboratório.

2. abrir a válvula do registro de gás individual de cada bico (ele está localizado,

geralmente, próximo do bico).

3. verificar se a entrada de ar do bico está aberta. Com ela fechada não é possível

ligar o bico.

4. girar a válvula que liga efetivamente o bico e, com auxílio de um isqueiro ou de

palitos de fósforo, acender o bico.

A altura da chama pode ser controlada através do controle da entrada de ar.

Para desligar: desligar a válvula do registro de gás (item 2), desligar o bico (item 4).

- Bureta: Serve para dar escoamento a volumes variáveis de líquidos. Não deve ser

aquecida. É constituída de tubo de vidro uniformemente calibrado, graduado em décimos

de mililitro. Na parte inferior possui uma torneira. É utilizada para titulações.

- Cadinho de porcelana: Pequeno recipiente de porcelana que resiste a altas temperaturas

(>1000ºC). Utilizado em calcinações, eliminação de substâncias orgânicas, secagens,

aquecimentos e fusões.

- Dessecador: Recipiente de vidro ou porcelana, inteiramente fechado e vedado, que

contém em sua parte inferior uma substância capaz de absorver água. É usado para

conservação de sólidos ou mesmo líquidos, no estado seco, para preservá-los da umidade.

Também é usado para resfriamento de substâncias em atmosfera contendo baixo teor de

umidade.

- Erlenmeyer: Recipiente de vidro utilizado para aquecer e cristalizar substâncias,

especialmente quando estas precisarem ser agitadas. É utilizado também em titulações e

para recolher filtrados. Além dessas aplicações é amplamente utilizado em microbiologia,

para o crescimento de microrganismos e para o preparo de meios de cultura.

- Espátula: Utilizada para retirar reagentes sólidos de frascos. Pode ser de porcelana,

plástico ou metal.

- Estantes para tubos de vidro: Suporte de madeira ou metal, de vários tamanhos, para

tubos de ensaios.

- Frasco lavador (pisseta): Frasco de plástico com tampa. São utilizados para lavagem de

precipitados, cristais, gases, etc. Pode conter água destilada, água acidificada, etanol,

acetona, hidróxido de sódio.

- Funil de separação: Recipiente de vidro, em forma de pêra, que possui uma torneira e

tampa esmerilhada. Utilizado para fazer extrações por meio de solventes e para a separação

em líquidos imiscíveis.

- Funil de vidro simples: É um funil ao qual se adapta o papel filtro, lã de vidro, algodão

simples, etc. Usado para filtrações.

- Gral de porcelana ou vidro: Empregado para pulverizações de substâncias sólidas.

- Kitassato - Usado em conjunto com o funil de Büchner na filtração a vácuo.

- Lâminas: São vidros retangulares, em geral, no formato de 76 x 26, brancos,

transparentes e com espessura não superior a 1,5 mm. Obs: Lâminas e lamínulas nuca se

seguram na face do vidro, mas sempre apenas pelas bordas.

- Lamínulas: São vidros quadradas (18 x 18) ou retangulares (24 x50), com espessura entre

0,1-0,2 mm. Servem juntamente com as lâminas para a inclusão temporária ou permanente

do objeto.

- Mufa: Utilizada para prender, nos suportes universais, os agarradores que não as

contenham em seus cabos.

- Papel filtro: Papel poroso, que retém partículas sólidas, deixando passar apenas a fase

líquida. Quando o líquido é corrosivo se substitui o papel por lã de vidro ou amianto.

Depois de colocado no funil o papel filtro deve ser umedecido, de forma que fique retido

junto à parede.

- Pêra - Usada para pipetar soluções.

- Pinça de madeira: Usada para prender tubos de ensaio durante o aquecimento direto no

bico de Bunsen.

- Pipeta graduada: Consiste de um tubo de vidro estreito geralmente graduado em 0,1 ml.

É usada para medir pequenos volumes variáveis de líquidos. Encontra pouca aplicação

sempre que se deseja medir volumes líquidos com maior precisão. Não deve ser aquecida.

- Pipeta volumétrica: É constituída por um tubo de vidro com um bulbo na parte central.

O traço de referência é gravado na parte do tubo acima do bulbo. É usada para medir

volumes únicos de líquidos com elevada precisão. Não deve ser aquecida.

- Placa de Petri: Recipiente de vidro que pode se apresentar em vários tamanhos, sua

utilidade é muito variada. Tem grande emprego nas culturas de bactérias, culturas de

fungos, protozoários, etc.

- Provetas: Recipiente de vidro, de capacidade variável geralmente indicada em mL.

Utilizada para medir volumes de líquidos, para preparar soluções de concentração

aproximada ou não conhecida.

- Suporte universal: Suporte de ferro utilizado como meio de prender argolas e

agarradores.

- Tenaz: Empregada para segurar cadinhos, tubos e cápsulas quando aquecidos. É

geralmente de ferro ou níquel.

- Termômetro: Usado para medir a temperatura durante o aquecimento em operações

como: destilação simples, fracionada, etc.

- Triângulo de porcelana: Triângulo construído de arame coberto por tubos de porcelana

ou outro material refratário. Utilizado como suporte para cadinhos e cápsulas durante a

calcinação.

- Tripé e tela de amianto: O tripé é o suporte para a tela de amianto. A tela tem a

propriedade de distribuir o calor, evitando que os frascos quebrem quando aquecido no

fogo.

- Tubo de ensaio: Tubos de vidro, cilíndricos, com tamanhos variados, usados em vários

experimentos. Nele, efetuam-se reações simples. Podem sofre variações de temperatura.

- Vidro de relógio: Peça de vidro de forma côncava. É usado para cobrir béqueres, em

evaporações, pesagens de diversos fins. Não pode ser aquecido diretamente na chama do

bico de Bunsen.

Equipamentos de proteção individual (EPIs) recomendados

- Proteção para os olhos: para se proteger contra respingos, aerossóis, combustíveis

ou cacos de vidro, USE ÓCULOS DE PROTEÇÃO.

- Máscara: algumas substâncias, especialmente voláteis, podem exigir o uso de

máscaras respi ratórias.

- Luvas: o manuseio de algumas substâncias tóxicas exige o uso de luvas. Na

maioria dos casos, uma luva de látex já é suficiente.

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Curso de Biotecnologia

Fundamentos de Laboratório

Professores: Jane Caon e Júlio Xandro Heck

Aula 3:

MICROSCOPIA

Conceito

É a arte de empregar o microscópio. O que é um microscópio? A palavra tem origem

grega – mikrós, pequeno, e skoppéoo, observar, ver através de – e significa um instrumento

através do qual se observa coisas pequenas.

Partes do microscópio a) Parte mecânica: pé (base); braço (estativa ou coluna); platina (mesa); canhão (tubo);

parafusos: macrométrico e micrométrico; revólver (tambor); charriot. Compõem o

sistema de suporte e ajuste.

b) Parte óptica: lente ocular; lente objetiva; condensador com diafragma; espelho ou

fonte de luz acoplada. Compõem o sistema de aumento e de iluminação.

a) Parte Mecânica

Pé: É o local de apoio, dá estabilidade ao aparelho e serve de suporte para as demais peças.

Braço: Suporte pesado que sustenta os tubos, a mesa, o condensador, os parafusos macro e

micrométrico.

Platina: Redonda ou quadrangular, pode ser fixa, móvel ou giratória no plano horizontal.

Sobre ela fica a lâmina com o material a ser observado. Apresenta uma abertura no seu

centro permitindo a passagem dos raios luminosos, coletados pelo espelho ou oriundos de

fonte luminosa própria e convergindo sobre o material da lâmina pelo condensador e

diafragma. Os raios chegam através da lente objetiva do tubo e da ocular até o globo ocular

(retina) do observador. A preparação sobre a lâmina é afixada à platina através de duas

presilhas móveis.

Canhão: Nos microscópios monoculares (que possuem uma só ocular), o canhão representa

um cilindro metálico, que pode ser reto ou oblíquo. Os microscópios binoculares (que

possuem duas oculares) podem ser inclinados, com ajuste para as distâncias entre os olhos

de cada observador.

Parafuso macrométrico: É o parafuso maior, de avanço rápido. Possui botões bilaterais,

localizados acima ou abaixo da platina. Utiliza-se primeiro para atingir a aproximação da

focalização grosseira do material. Possui um percurso vertical, com cerca de 7 cm.

Parafuso micrométrico: É o parafuso menor, de avanço lento. Comandado, também por

tambores laterais. Permiti o deslocamento do tubo a apenas dois milésimos de milímetro ou

menos, portanto seu emprego só é utilizado para acertar a focalização do material já visível.

Emprega-lo antes não é indicado, pois perde-se muito tempo tentando obter deslocamentos

maiores. É utilizado para obter um enfoque perfeito da preparação. Entretanto, quando a

preparação já parecer estar perfeitamente focalizada, devemos ter sempre a mão sobre o

parafuso e proceder a pequenas oscilações, que permitam precisar certos detalhes, ou

perceber novos elementos, ainda não vistos.

Revólver: Fica acima da platina. As objetivas se encaixam numa peça rotatória e giram

sempre no sentido do menor para o maior aumento.

Charriot: Peça reguladora localizada na platina e que serve para movimentar a lâmina no

campo. Um parafuso desloca a lâmina para frente e para trás e outro parafuso a desloca

para a esquerda ou para a direita.

b) Parte Óptica

Lente ocular: Encaixada na extremidade superior do tubo, pode ser retirada e substituída

facilmente. Juntamente com a objetiva fornece a imagem do objeto. As oculares fornecem,

geralmente, ampliações iguais às obtidas por lentes ou lupas manuais. Com a ocular de

maior aumento a parte visível da preparação é mais restrita.

Ex. Se examinarmos uma preparação de glóbulos de sangue com a ocular de menor

ampliação, os elementos serão menores, porém mais numerosos em cada campo do

microscópio. Por outro lado, com a ocular de maior ampliação, os elementos serão maiores,

mas em cada campo ver-se-á um número muito mais reduzido de elementos. Se o

microscópio for monocular é conveniente fazer a observação com ambos olhos abertos,

olhando-se com qualquer um dos dois. Quanto menos iluminada estiver a mesa mais fácil

será consegui-lo.

Característica técnica da ocular:

Aumento: O poder de aumento se encontra gravado na ocular.

- a ocular X 4 aumenta 4 vezes a imagem produzida pela objetiva.

- a ocular X 6 aumenta a imagem 6 vezes

- a ocular X 10 aumenta a imagem 10 vezes.

Se a imagem do objeto aumentou 40 vezes mediante a objetiva de X 40 e após 6 vezes

mediante a ocular de X 6, o aumento total será de 6 x 40 = 240 X.

Para calcular o aumento total da imagem do objeto que se observa, multiplicamos o poder

de aumento da objetiva pelo da ocular.

Lente objetiva: Fornece a imagem ampliada do objeto. Há objetivas a seco e de imersão. As

objetivas de maior ampliação têm as lentes terminais menores.

a) Objetivas a seco – São as mais correntemente empregadas. Entre a lente frontal e a

lamínula só existe ar. As objetivas, sem indicação específica, são destinadas aos exames a

seco, isto é, nenhum líquido pode ser interposto entre a preparação e a objetiva. É claro que

isto não quer dizer que com elas não se possa examinar um líquido, mas sim que, neste caso

é preciso que o líquido esteja coberto por uma lamínula e não em contato direto com a

objetiva.

b) Objetiva de imersão - A objetiva de imersão promove a maior ampliação do objeto em

estudo, entretanto é menor a quantidade de raios luminosos que atravessam o tubo do

microscópio, para corrigir essa situação e aproveitar a maior quantidade de luz possível,

coloca-se entre a objetiva de imersão e a preparação uma gota de óleo de imersão, evitando

assim a interposição do ar. O uso da objetiva de imersão requer grande luminosidade e o

emprego do condensador. Nunca usar a seco uma objetiva de imersão.

Características técnicas das objetivas:

1. Aumentos: O poder de aumento de cada objetiva se indica por um número gravado no

suporte da lente: a objetiva X 10 aumenta 10 vezes

a objetiva X 40 aumenta 40 vezes

a objetiva X 100 aumenta 100 vezes

(A objetiva X 100 geralmente se encontra marcada com um anel para indicar que se deve

usá-la com óleo de imersão).

2. Abertura numérica (NA): A AN também se acha gravada no suporte da lente, junto a

indicação do poder de aumento. Ex. X 100 / 1.30

- 0,30 na objetiva X 10

- 0,65 na objetiva X 40

- 1,30 na objetiva X 100

A medida que aumenta a AN é maior o poder de resolução (capacidade de perceber

detalhes adjacentes muito próximos, separando-os som nitidez). Ainda, a medida que

aumenta a AN diminui a dimensão da lente frontal. A lente frontal da objetiva X 100 tem o

tamanho de uma cabeça de alfinete, por isso deve-se manejar com cuidado.

3. No suporte da objetiva pode ter outros números:

Ex. X 40 / 0.65

160 / 0,17

A altura recomendada em mm para o tubo do microscópio (entre a objetiva e a ocular), é

geralmente de 160 mm.

A espessura recomendada em mm para a lamínula utilizada sobre a lâmina, 0,17mm.

4. Distância de operação da objetiva: É a distância entre a lente frontal da objetiva e a

lâmina quando a imagem se encontra focada. A medida que o poder de aumento do objeto é

maior diminui a distância de operação.

- objetiva X 10: a distância de operação é de 5 – 6 mm

- objetiva X 40: a distância de operação é de 0,5 – 1,5 mm

- objetiva X 100: a distância de operação é de 0,15 – 0,20 mm

5. Poder de resolução: É a capacidade de distinguir dois pontos muito próximos. A

capacidade de resolução do olho humano é 0,25 mm. Quanto maior for o poder de

resolução da objetiva, mais clara será a imagem e maior a capacidade de por em evidência

detalhes adjacentes muito próximos, separando-os com nitidez.

Condensador com diafragma: Localizado abaixo da platina, sua função principal é fornecer

bastante luz, tornando mais clara a preparação, indispensável nas grandes ampliações

(objetivas de grande aumento) do material a ser observado. Ao se elevar o condensador,

através do parafuso de ajuste, a iluminação é máxima. Ao baixá-lo obtemos uma

iluminação mínima. Alguns microscópios têm filtros coloridos, principalmente azuis de

baixo do condensador. Se pode deixar ou tirar segundo o tipo de preparação que se vá

observar. Pode haver três parafusos colocados ao redor do condensador: um na frente, um a

esquerda e outro a direita. Usam-se para centrar o condensador exatamente em relação ao

objeto em observação.

O diafragma está dentro do condensador. Utiliza-se para reduzir ou ampliar um ângulo,

portanto, também a quantidade de luz que entra no condensador. Fecha-se o diafragma

quando se usam objetivas de pouco aumento, para eliminar os raios laterais. Abre-se o

diafragma na medida em que se aumentam as ampliações, em conseqüência aumenta a NA

e se pode observar detalhes menores do objeto.

Espelho: É encaixado por baixo do condensador. É redondo e possui duas faces: uma plana

e outra côncava. A face plana é usada nos pequenos aumentos, quando quisermos obter um

campo uniformemente iluminado e também para quando usamos a objetiva de imersão. A

face côncava é usada em grandes aumentos. Entretanto estas regras não são absolutas. É

sugerido proceder por tentativas, quando a preparação está sob o microscópio, e

experimentar sucessivamente uma e outra face assim como as diferentes posições do

espelho, até conseguir a visibilidade desejada.

Preparação do microscópio para uso

Procedimentos para centrar corretamente o condensador:

1. Coloque na platina uma preparação em lâmina, sem lamínula. Desça o condensador.

Abra o diafragma. Examine com a objetiva de menor aumento. Observe a preparação

através da ocular e focalize.

2. Feche o diafragma. No campo microscópico aparecerá um círculo borrado de luz

rodeado por um anel escuro.

3. Elevar o condensador lentamente até que as bordas do círculo luminoso estejam

claramente focalizadas.

4. Ajuste, se necessário, a posição do espelho de maneira que o círculo luminoso fique

centrado exatamente ou sobreposto à área clara que está rodeada pela zona escura.

5. Através dos parafusos para centrar o condensador faça os ajustes necessários até que

o círculo luminoso se encontre exatamente no centro do campo microscópico. Repita a

operação quando usar as outras objetivas.

Ajuste do diafragma

Abra o diafragma completamente, Retire a ocular e observe diretamente através do tubo do

microscópio; a lente superior da objetiva aparecerá cheia por um círculo luminoso. Feche o

diafragma lentamente até que este círculo luminoso ocupe somente 2/3 da superfície.

Repita esta operação até usar cada objetiva.

Ajuste da ocular

1. Escolha da ocular: As oculares X 5 ou X 6 proporcionam resultados satisfatórios no

laboratório clínico. Se utilizarmos oculares de maior poder se intensificará o aumento, mas

é provável que não se observe melhor os detalhes.

2. Ajuste da distância interpupilar (distância entre as pupilas dos olhos): Segurar as bases

das oculares com as duas mãos e regular a distância interpupilar até obter uma perfeita

visão binocular.

3. Focalização dos olhos direito e esquerdo: Um dos suportes das oculares, quase sempre o

esquerdo, está provido de um anel para focagem. Se este anel se encontra no suporte da

ocular esquerda, feche o olho esquerdo e, empregando a objetiva X 40, focalize a imagem

para o olho direito pela ocular direita. A seguir feche o olho direito e observe com o olho

esquerdo através da ocular esquerda. Se a imagem se encontra focalizada não é necessário

ajuste. Se a imagem não é clara, faça girar o anel de focagem até obter nitidez de imagem.

Neste momento o microscópio estará ajustado de acordo com a visão binocular própria do

operador.

Focalização da objetiva

1. Emprego da objetiva de menor aumento ( X 5 ou X 10 )

Na observação de uma preparação, inicie sempre pela objetiva de menor aumento.

- Coloque a lâmina sobre a platina, fixe-a com a(s) presilha(s), mova a lâmina com o

charriot até que o objeto fique exatamente no centro do campo.

- Desça o condensador completamente

- “Desça” a objetiva até encontrar-se imediatamente acima da preparação

- Utilizando o parafuso macrométrico de rápido avanço “eleve” a objetiva até

observar uma imagem clara através da ocular

- Faça ajustes com o parafuso micrométrico

- Se a iluminação é insuficiente suba o condensador ligeiramente

2. Emprego da objetiva de maior aumento ( X 40 )

- Sem olhar pela ocular, baixe o condensador até a metade da distância.

- Ainda olhando por fora, “desça” a objetiva até colocá-la imediatamente por cima da

preparação (a distância de operação é muito pequena, cerca de 0,5mm).

- Através do parafuso macrométrico de rápido avanço, “eleve” a objetiva muito

lentamente até que apareça uma imagem borrada no campo microscópico.

- Busque o foco por meio do parafuso micrométrico de avanço lento.

- “Eleve” o condensador para obter suficiente iluminação.

- Se o microscópio não tiver condensador utilize o lado côncavo do espelho.

3. Emprego da objetiva de imersão em óleo

- Utilizar preparações completamente secas

- Colocar uma pequena gota de óleo de imersão sobre a porção que se vai examinar

(de preferência usar óleos sintéticos)

- “Eleve” o condensador até onde possa chegar

- Abra completamente o diafragma

- “Desça” a objetiva X 100 até que entre em contato com o óleo

- Aproxime a objetiva da preparação até onde seja possível, mas evite a pressão na

lâmina (as objetivas modernas tem amortizador).

- Observe através da ocular e gire para cima, muito cuidadosamente, o parafuso

micrométrico, de avanço lento até que a imagem se encontre focalizada.

Observação: Nos microscópios modernos a objetiva não “sobe nem desce”, e sim a

platina que se move através do comando do parafuso macrométrico de avanço rápido e

do parafuso micrométrico de avanço lento. Neste caso os parafusos devem girar em

direção oposta para a focalização da imagem.

Mudança das objetivas

Os microscópios modernos são construídos de tal maneira que quando se muda a

objetiva de menor aumento para a de maior aumento o objeto permanece mais ou

menos focalizado sendo necessário pequeno ajuste com o parafuso micrométrico. Se

isso não acontecer, suba o revólver antes de fazer a mudança para a objetiva de maior

aumento e após focalize novamente. Antes de mudar a objetiva certifique-se que o

objeto examinado encontra-se no meio do campo microscópico (círculo luminoso que

se observa através da ocular), a fim de não perde-lo depois na troca de objetivas.

Cuidados no uso apropriado do microscópio

1. É essencial que você conheça as partes ópticas e mecânicas do microscópio, tendo o

cuidado de ler e absorver as instruções contidas nos manuais que os acompanham,

e/ou seguir as orientações do professor em classe.

2. Mantenha o microscópio livre de poeira, vapores ácidos e do contato com reagentes.

Para mantê-lo seco, cubra com capa de flanela pois evita o pó e a multiplicação de

fungos(Obs.: as capas devem ser lavadas periodicamente).

3. Não manusear o equipamento com as mãos sujas ou molhadas.

4. Jamais comer ou beber próximo ao equipamento.

5. Na remoção do equipamento, segure-o firmemente com uma das mãos no braço e

outra na base. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de trabalho de superfície plana,

evitando qualquer movimentação brusca. Nunca desloque o microscópio com a

lâmpada acesa ou logo após ter sido apagada.

6. Muita atenção é necessária quando se observa a preparação em meio líquido, pois

há sempre o risco de molhar a lente frontal da objetiva, portanto o conselho é retirar

o excesso de líquido com papel filtro, antes de colocar a lâmina sobre a platina, em

caso de acidente, enxugar imediatamente com lenço de papel absorvente macio.

7. Ao trabalhar com o colega no mesmo microscópio, após a focalização do objeto,

desatarraxar o parafuso para soltar as oculares, e deslocá-la para o colega que

deverá atarraxar suavemente, regulando o ajuste interpupilar.

8. Ao encerrar os trabalhos com o microscópio, desligue a luz, enrole o fio e posicione

a objetiva de menor aumento sobre o orifício da platina.

Limpeza:

- Parte óptica

A nitidez das imagens depende diretamente do estado de limpeza das lentes. Isto pode ser

evitado pelo hábito de limpeza periódica.

1. Oculares

Com a objetiva de menor aumento focalizado em uma preparação, gire as oculares e

verifique se existem partículas que acompanham o movimento: caso existam elas, podem

estar nas duas superfícies e neste caso ambas devem ser limpas com um bulbo de borracha

e cotonete.

Para retirar eventuais manchas de óleo, dedos; umedecer um cotonete com solvente

apropriado (álcool a 70% ou éter), tomando cuidado para não inundar as lentes, e secar

imediatamente com um lenço de papel. Freqüentemente basta projetar o hálito na superfície

das lentes e limpa-las.

Limpe freqüentemente as oculares com lenço de papel fino; pois o contato com os cílios e

mesmo poeira podem sujá-las. Nunca toque as lentes com os dedos, pois a gordura atrai

poeira.

Precaução especial é requerida no uso de solventes hidrocarbonetos, como o xilol, pois

podem penetrar na área de fixação das lentes no suporte dissolvendo a cola, bem como

produzir película sobre as lentes.

2. Objetivas

Cada objetiva deve ser desatarraxada cuidadosamente do revólver e após a limpeza

recolocada na posição original, para tanto, usar a mesma técnica descrita para as oculares.

No entanto, como as superfícies das lentes são menores que as das oculares, recomenda-se

inspeciona-las com uma pequena lupa manual.

Para retirar poeira da face posterior da objetiva, usa-se um pincel de pêlo muito macio.

Após o uso da objetiva de imersão, retirar o excesso de óleo com um papel de filtro e

terminar a limpeza com um cotonete levemente embebido de éter. Jamais usar álcool na

limpeza do óleo de imersão, pois este não é dissolvido pelo álcool, mas forma com ele um

precipitado branco.

- Parte mecânica

Evitar o acúmulo de poeira e areia. Antes de proceder a lubrificação, a sujeira deve ser

retirada.Para lubrificar a cremalheira (peça dentada) do parafuso macro e micrométrico e

condensador, coloque uma pequena quantidade de vaselina neutra e após move-se para

cima e para baixo a fim de espalha-la. Nunca force o parafuso macro e micrométrico que

esteja emperrado ou duro. Para as partes expostas, é suficiente lavá-las usando tecido

umedecido com água e sabão neutro.

TÉCNICAS BÁSICAS DE LIMPEZA

Material de vidro:

1. Lavar com água e sabão

2. Enxaguar com água corrente

3. Enxaguar com água ou álcool acidulado

4. Deixar escorrer e lavar com água destilada

5. Secar com pano limpo.

Álcool acidulado:

Álcool 96%............................................3 partes

Ácido clorídrico ....................................1 parte

Água acidulada:

Água destilada ......................................3 partes

Ácido clorídrico ou acético..................... 1 parte

Para o passo n. 4 também pode utilizar-se:

Dicromato de K .........................................................5 g

Ácido sufúrico a 5% em água destilada ................250 ml

Para lâminas e lamínulas

1. Deixar repousar durante 24 horas na seguinte solução

Dicromato de K ............................................20 g

Ácido sulfúrico concentrado .........................20 ml

Água destilada ........................................... 250 ml

2. Lavar em Água com sabão e deixar em água corrente durante 24 horas

3. Colocar a água destilada durante 24 h

4 Manter por tempo indefinido e, um recipiente fechado com álcool 70%

Para lâminas com corantes e bálsamo

1. Dissolver a quente 100 g de bicarbonato de K em 1 litro de água

2. Deixar esfriar a solução e adicionar gota a gota com um bastão de vidro 100 ml de

ácido sulfúrico concentrado.

3. Deixar as lâminas e lamínulas submersas nesta mistura por 3 dias.

4. Após lavar com água corrente e passar a uma segunda diluição que se prepara como

segue:

Água corrente .....................................50 ml

Soda (NaoH) ......................................10 gotas (em diluição saturada)

5. Permanecer nesta mistura durante 24 horaas para após lavar em água corrente e

colocar em álcool a 70 %.

Outra técnica:

1. Colocar o material na seguinte mistura:

Água da torneira ..........................................1 parte

Álcool 96 % ..................................................1 parte

Xilol .............................................................1 parte

2. Permanecer na mistura por 24 horas

Água atua nos corantes e resíduos

Álcool atua na gordura do manejo e nos corantes alcoólicos

Xilol separa a lâmina da lamínula

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Aula 4:

PESAGEM

BANHO-MARIA

Pesagem

A construção das balanças analíticas assinalou um notável progresso nas últimas

décadas. O aperfeiçoamento na construção das balanças analíticas foi marcado pelo esforço

em aumentar a sensibilidade dos aparelhos e, ao mesmo tempo, simplificar e abreviar a

operação de pesagem.

Em nosso laboratório dispomos de balanças eletrônicas de um prato em grau

analítico (4 casas decimais) e em grau semi-analítico (2 e 3 casas decimais).

Recomendações gerais para o bom uso das balanças:

- As balanças eletrônicas devem estar localizadas em bancadas apropriadas, planas e

construídas em concreto, para evitar oscilações.

- É sempre aconselhável que as balanças sejam ligadas 15 minutos antes do uso para

ambientação e auto-calibração.

- As balanças analíticas são extremamente sensíveis e deve-se ter o máximo cuidado

no seu manuseio e manutenção. Eventuais sujidades devem ser imediatamente limpas.

- Certifique-se da massa máxima que pode ser pesada na balança em questão. Essa

operação é muito importante, pois uma massa excessiva pode danificar enormemente a

balança.

- Antes de iniciar o processo de pesagem, verifique se o prato da balança está limpo

e se ela está zerada (“tarada”). Tare a balança com o recipiente no qual vai ser colocado o

material a ser pesado. Adicione o material e faça a leitura diretamente no mostrador. Em

hipótese alguma coloque o reagente diretamente no prato da balança.

- Conserve-a limpa, tendo o cuidado para não deixar cair reagente sobre a balança.

- Depois do uso, desligue a balança e faça o registro do uso no espaço apropriado.

Exercício: - Determine a massa de um objeto qualquer (anel, brinco, lápis, caneta,

etc) nas duas balanças do laboratório e anote as massas.

- Pese, em um vidro de relógio, 0,250 g de açúcar.

Banho-maria

Os aparelhos de banho-maria são utilizados em procedimentos laboratoriais sempre

que se deseja um controle fino de temperatura. Desta forma, inúmeras reações importantes

devem ser conduzidas neste tipo de aparelho. A maioria dos banhos-maria opera

eficientemente em faixas de temperatura que variam entre a temperatura ambiente e 80ºC.

Dicas importantes:

- na maioria dos banhos, temperaturas menores que a ambiente não podem ser

atingidas, uma vez que não possuem sistema de refrigeração.

- a água usada no banho-maria deve, preferencialmente, ser do tipo destilada e deve

ser trocada sempre que se tornar opaca ou começar a cheirar. Alternativamente pode-se

adicionar algum agente antibacteriano a esta água.

- para evitar evaporação, use sempre uma tampa.

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Aula 5:

PIPETAS

CAPELA DE EXAUSTÃO

Existem vários tipos de pipetas, todas com a mesma finalidade: transferência de

líquidos de um local para outro. A transferência pode ser volumétrica, como na maioria das

pipetas, ou não, como no caso das pipetas de Pasteur.

Os principais tipos de pipetas usadas em biotecnologia são:

- pipetas sorológicas (graduadas): estas são as pipetas-padrão de uso diário.

Normalmente são de vidro, mas também podem ser de plástico. Podem ser de vários

volumes e são usadas rotineiramente na medida de líquidos. A autoclavagem deve ser

evitada, pois prejudica a calibração. A secagem também deve ser cuidadosa, em

temperaturas que não excedam 45ºC.

Modo de usar: Depois de perfeitamente limpa e seca, a pipeta pode ser introduzida

na solução a ser transferida, tendo o cuidado para evitar a formação de bolhas. A sucção

deve ser feita com o auxílio de um pipetador* ou de uma pêra de sucção. Se a pipeta estiver

úmida, deve-se “ambientar” a pipeta com o líquido a ser transferido e em seguida proceder

a transferência.

A pipeta escolhida deve ser o mais próximo possível do volume a ser medido.

A parte externa da pipeta pode ser seca com o auxílio de um papel filtro. Em

seguida, o líquido pode ser escoado da pipeta para o recipiente receptor e a última gotinha

pode ser removida encostando-se a mesma contra a parede do recipiente. Nunca deve-se

soprar a porção do líquido que fica retido na extremidade da pipeta.

* Existem dezenas de pipetadores, portanto, você poderá encontrar aquele que sirva

exatamente a sua necessidade.

- pipetas volumétricas: o modo de utilização destas pipetas é o mesmo das pipetas

sorológicas. Ao contrário das anteriores, medem apenas um volume fixo.

- pipetas de Pasteur: são de vidro ou de plástico. Não são usadas para medir

volumes, apenas para transferências mais grosseiras. São boas para preencher tubos para

balanceamento de centrífugas e para remover e transferir sobrenadantes

- micropipetas: são instrumentos que carregam volumes em microlitros (µL, sendo

1000 µL= 1 mL) por ação da capilaridade ou por bulbos de sucção. São usadas para medir

volumes pequenos e altamente precisos. As mais comuns são as P1 (1 µL) P5 (até 5 µL,

P10 (entre 5 e 10 µL), P20 (entre 10 e 20 µL), P200 (entre 40 e 200 µL), P1000 (entre 200

e 1000 µL) e P5000 (entre 1000 e 5000 µL).

Modo de usar:

- coloque a ponteira (tip) adequada.

- aperte o êmbolo da pipeta até o atingir o primeiro estágio.

- coloque a ponteira dentro da solução a ser pipetada (segurando o êmbolo

apertado). Solte o êmbolo vagarosamente, certificando-se para que a ponteira esteja sempre

dentro da solução. Este movimento deve ser lento, para que a solução não “suba” muito

rapidamente. Jamais se deve permitir que o líquido atinja o interior da micropipeta. Ele

deve sempre ficar confinado na ponteira (ou tip).

- Descarte a solução, empurrando o êmbolo. Na maioria das micropipetas o êmbolo

deve ser empurrado duas vezes para liberar o conteúdo da ponteira. Empurre até que você

sinta uma resistência e então empurre de novo, gentilmente. Esse empurrão final expele a

última gotinha do volume e deve ser dado o mais suavemente possível para evitar a

formação de aerossóis.

Estas pipetas devem sempre ser manipuladas com extremo cuidado, pois são

relativamente caras e frágeis. Devem ser calibradas a cada poucos meses durante o ano,

dependo da freqüência de uso. Algumas podem ser calibradas no próprio laboratório,

seguindo o procedimento sugerido pelo fabricante; outras devem ser calibradas por

profissionais.

Este tipo de pipeta JAMAIS PODE SER AUTOCLAVADA. No entanto, as

ponteiras podem, portanto, podem ser utilizadas em operações que exijam esterilidade.

Exercício:

- praticar o emprego de pipetas sorológicas e micropipetas, pipetando 6 mL de água

destilada com o auxílio da pipeta sorológica de 10 mL e 500 µL de água (ou 150 µL) com

uma micropipeta (P1000 ou P200).

CAPELA DE EXAUSTÃO

Os produtos químicos voláteis e aqueles que liberam vapores tóxicos devem ser

manipulados, exclusivamente, em capelas de exaustão. As características recomendáveis

para a construção de capelas, dentro dos padrões aceitáveis, são descritas a seguir:

- as capelas devem ser construídas, preferencialmente, em aço inoxidável, porém é

aceitável que sejam construídas em alvenaria com cúpula de aço inoxidável, para facilitar a

limpeza.

- a área máxima do balcão deve ser de 3 m x 0,80 m e altura de 85 cm.

- as janelas devem possuir movimentação vertical e armação com contrapeso.

- o sistema de escoamento de esgoto deve ser resistente a agentes corrosivos.

- deve possuir uma entrada de ar auxiliar ou secundária, para manter a mesma vazão

de ar com a janela fechada.

- deve possuir um sistema de filtros funcionando.

- deve possuir peitoril, para conter pequenos vazamentos.

- o fluxo de ar de uma capela deve ser laminar e potente.

Como usar uma capela de vapores químicos:

1. Ligue a capela e verifique se a exaustão está funcionando (é possível ouvir

ou sentir). Nem o ar condicionado nem o ventilador devem estar

funcionando perto da capela, pois isso poderá interferir nas correntes de ar

dentro da mesma.

2. A janela deve estar abaixo da altura do queixo do manipulador! Abaixe a

janela até a altura indicada na parte frontal da capela. Quanto mais baixa a

altura, ou seja, quanto mais fechada a janela, mais proteção haverá.

3. Trabalhe, no mínimo, 20 cm dentro da capela.

4. Prenda os papéis e outros materiais leves. Eles podem ser sugados pelo

sistema de exaustão.

5. Não bloqueie as fendas de exaustão traseiras ou o espaço entre a borda

dianteira de metal e a superfície de trabalho.

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Aula 6:

PREPARO DE SOLUÇÕES E DILUIÇÃO

Soluções

O preparo de soluções é um procedimento extremamente importante para o

Biotecnologista, pois do preparo correto das soluções dependerá o sucesso de todos os

experimentos realizados.

Solução é uma dispersão homogênea de duas ou mais espécies de substâncias. As

soluções podem ser formadas por qualquer combinação dos 3 estados físicos da matéria:

gases, líquidos e sólidos, porém são sempre constituídas de uma única fase. Nosso estudo

se restringirá a soluções binárias líquidas, isto é, soluto sólido ou líquido, dissolvido em

solvente líquido. Existem várias classificações para as soluções, a citar:

- Classificação 1: solução saturada, não-saturada e super-saturada,

- Classificação 2: soluções diluídas e não diluídas,

- Classificação 3: soluções moleculares e iônicas,

- etc.

No entanto, estudar os diferentes tipos de soluções não é o objetivo deste

componente e por isso ficaremos restritos à parte prática.

Informações teóricas úteis no preparo de soluções:

- Concentração simples: é o quociente entre a massa do soluto (em gramas) e o

volume de solução (em litros).

C = m/V (em gramas/litro)

- Molaridade: é o quociente entre o número de moles do soluto e o volume de

solução (em litros).

M = n/V (em moles/litro), sendo n = m/MM

m = massa

MM = massa molar

- Normalidade: quociente entre o número de equivalentes-grama (e1) do soluto e o

volume de solução, em litros.

N = m/E1.V,

sendo E=MM/valência (número de H ou OH ionizáveis)

E = Equivalente grama

m = massa

V = volume (litro)

- Relação entre molaridade (M) e normalidade (N)

N = M.x,

sendo x o número de H ou OH ionizáveis.

- Soluções em porcentagem

As soluções em porcentagem são baseadas em 100 mL (ou, ocasionalmente, em 100

g). Quase todas as soluções que você calcular serão soluções (p/v), nas quais o peso em

grama do pó é misturado com o volume em mL. No entanto, existem 3 modos de de

expressar a concentração em porcentagem:

1. porcentagem de peso por volume (p/v). Gramas do soluto por 100 mL do

solvente. Exemplo: NaCl 20% (p/v) - dissolver 20 g de NaCl em um dado

volume de água (aprox. 60 mL) e completar o volume em balão

volumétrico de 100 mL.

2. porcentagem por volume (v/v). mL do solvente por 100 mL de solução.

Usado para diluir uma solução estoque concentrada. Diluir uma solução

de SDS 10% até 1% (v/v) - 10 mL da solução concentrada + 90 mL de

água.

3. porcentagem por peso (p/p). Gramas do soluto por 100 g do solvente.

Exemplo: Solução de sacarose a 10% (p/p) – pesar 10 g de sacarose e

adicionar 90 mL de água.

Modo de preparar soluções:

1. Faça os cálculos apropriados e descubra a massa do soluto a ser pesada.

2. Pesar em balança analítica, em béquer de tamanho pequeno (40 – 80 mL), a

massa calculada.

3. Dissolver o sólido com água destilada. Pode-se utilizar um bastão de vidro para

auxiliar nessa operação. IMPORTANTE: Não esquecer do volume final da

solução no momento de adicionar água ao béquer. Esse volume adicionado deve

estar distante do volume final da solução.

4. Transferir o conteúdo do béquer para o balão volumétrico apropriado. O bastão

de vidro pode ser utilizado com “direcionador de fluxo”.

5. Realizar a “lavagem” do béquer com água destilada, sem exceder o volume final

da solução, para assegurar que todo o sólido pesado seja transferido ao balão.

6. Ajustar o volume final com o menisco do balão volumétrico. Fechar o balão

volumétrico com a tampa apropriada e homogeneizar.

7. Estocar em recipiente adequado e devidamente identificado.

Toda solução, uma vez preparada, deve ser CORRETAMENTE identificada.

Esta identificação deve ser feita com fica adesiva apropriada e em tamanho que

permita uma fácil visualização. Nesta identificação deve constar:

- nome da solução (por exemplo, Hidróxido de sódio),

- concentração da solução (0,1 M; 20%, etc),

- data em que foi preparada,

- responsável pelo preparo (Fulano de Tal),

- cuidados especiais (por exemplo, “manter sob refrigeração”)

OBS 1. Em alguns casos, dependendo do grau de precisão exigido pela solução,

pode-se utilizar uma proveta ao invés de balão volumétrico.

OBS 2. Em outros casos, como em meios de cultura para microbiologia, a solução

pode ser preparada simplesmente adicionando-se o volume de água (medido em

proveta) ao béquer contendo o material pesado.

Diluição

Diluir uma solução significa adicionar a ela um solvente puro e inúmeras vezes essa

operação será fundamental em procedimentos químicos, bioquímicos, microbiológicos, etc.

Lei geral da diluição:

C1V1 = C2V2

Sendo,

C1= concentração da solução inicial

C2= concentração da solução final (nova solução)

V1= volume da solução inicial a ser medido (esta é a incógnita da equação!!!)

V2= volume final (volume que se deseja preparar)

Exercícios:

1. Preparar 100 mL de uma solução 0,1M do sal fictício XY, cuja massa

molar é 30 g, utilizando balão volumétrico.

2. Preparar 40 mL de uma solução 5% (p/v) do sal fictício XY, utilizando

proveta para aferição do volume.

3. Preparar 10 mL de uma solução 0,2 M do sal fictício XY a partir de uma

solução concentrada a 1M.

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Aula 7:

UTILIZAÇÃO DE PROTOCOLOS, CATÁLOGOS E INTERPRETAÇÃO DE

RÓTULOS DE REAGENTES.

ARMAZENAMENTO DE PRODUTOS QUÍMICOS

Protocolos

Os protocolos são as “receitas” que devemos usar para a realização de um

experimento. Um protocolo pode ser obtido de:

- outro pesquisador/aluno/colega de laboratório: o melhor lugar para conseguir

um protocolo é de outro investigador d laboratório, pois o protocolo será apropriado para os

recursos e a especialidade do laboratório, podendo conter detalhes importantes sobre os

detalhes do experimento.

- um livro de protocolos: existem muitos manuais de laboratórios disponíveis

comercialmente, com protocolos simples e claros para muitos campos da biotecnologia. Os

manuais do laboratório ou do curso também são uma boa fonte para protocolos simples. A

desvantagem de protocolos comerciais é que você terá que adequá-lo ao seu laboratório.

- seção de “materiais e métodos” dos artigos científicos: esse é o lugar menos

confiável para achar um protocolo. Essas seções são notórias pela ausência de detalhes que

são deixados de lado devido a problemas de espaço ou por “outros motivos”.

Quando você for fazer um experimento a partir de um protocolo novo algumas

considerações são importantes:

- leia o protocolo atentamente para ver se ele faz sentido para você. Faça o

experimento mentalmente, passo a passo. Certifique-se que você está, de fato, entendo cada

passo.

- mude o protocolo conforme suas necessidades e reescreva-o. Isso serve para

tornar os passos mais compreensíveis ou alterar algum equipamento conforme a

necessidade. “Decodifique” a linguagem do protocolo para a sua linguagem.

- prepare todos os reagentes listados no protocolo e certifique-se de ter tudo o

que precisa. Certifique-se que todos os reagentes estão preparados e na concentração

exigida. Assegure-se que os equipamentos que você precisará não estarão sendo usados

quando você precisar deles!

- siga o protocolo exatamente na primeira vez que fizer o experimento. Se não

der certo, repita, e só então, em não dando certo novamente, faça alterações. Tente não ser

uma variável do experimento.

- modifique o protocolo baseado em sua própria experiência. Isso só acontece

depois de algum tempo de prática. É importante anotar as modificações realizadas e

reescrever o protocolo.

Exemplos de protocolos:

Exemplo 1. Método de determinação de atividade proteásica

1. Adicionar 150 L de extrato enzimático a tubos de microcentrífuga (eppendorfs)

contendo 250 L de uma solução-substrato com 2% de azocaseína em tampão

fosfato de sódio 0,05 M e pH 7,0 (1)

.

2. Incubar a mistura a 37ºC por 30 minutos e no final deste período adicionou-se

ácido tricloroacético (TCA) a 10% em cada tubo.

3. Após 15 minutos, necessários para assegurar completa precipitação de

fragmentos maiores de azocaseína, centrifugar os tubos a 14000 g por 5 minutos.

4. Transferir 1 mL do sobrenadante para um tubo de ensaio contendo 1 mL de

hidróxido de sódio 1,0 M. A absorbância desta solução é determinada a 440 nm

em espectrofotômetro

5. Para cada amostra enzimática prepara-se um branco, misturando, nesta ordem,

enzima, TCA e substrato azocaseína.

Exemplo 2: o mesmo procedimento, mas apresentado de outra forma.

Em 250 L de uma solução-substrato com 2% de azocaseína em tampão fosfato de

sódio 50 mM e pH 7,0 adicionaram-se 150 L de extrato enzimático. A mistura foi

incubada a 40ºC por 40 minutos e no final deste período adicionou-se ácido tricloroacético

(TCA) a 10% em cada tubo. Para cada amostra enzimática preparou-se um branco,

misturando, nesta ordem, enzima, TCA e substrato azocaseína. Preparou-se, também, um

reagente branco substituindo a enzima por solução tampão. Após assegurada a completa

precipitação de fragmentos maiores de azocaseína, centrifugou-se os tubos a 14000 g por 5

minutos. Transferiu-se 1 mL do sobrenadante para um tubo de ensaio contendo 1 mL de

hidróxido de sódio 1,0 M. A absorbância desta solução foi determinada a 440 nm em

espectrofotômetro.

Catálogos de reagentes

Os catálogos de reagentes são auxiliares extremamente úteis em um laboratório de

biotecnologia. Eles são fornecidos pelos fabricantes ou pelos vendedores dos reagentes.

Cada empresa fabricante de reagentes possui o seu catálogo, atualizado anualmente. Os

catálogos fornecem informações técnicas importantes sobre os reagentes, soluções,

enzimas, equipamentos e todos os produtos fabricados/vendidos pela empresa.

Nos catálogos são encontradas informações como: fórmula química, peso

molecular, densidade, ponto de fusão e ebulição, coeficiente de extinção molar, toxicidade,

incompatibilidades, etc.

Interpretação de rótulos de reagentes

Os rótulos de reagentes fornecem algumas informações que orientam o

biotecnologista no preparo do reagente. Fornecem uma quantidade menor de informações

que o catálogo, mas na falta dele oferece informações básicas importantes (fórmula, peso

molecular e densidade). Além disso, observando-se o rótulo pode-se ter uma idéia da

toxicidade e dos cuidados que se deve ter ao manusear o reagente.

À seguir, alguns pictogramas normalmente encontrados em rótulos de reagente

Armazenamento de produtos químicos

Para armazenamento de produtos químicos, deve-se considerar as características de

todas as substâncias, prevenindo, desta forma, a ocorrência de eventuais acidentes no

laboratório. Estes produtos devem ser agrupados por espécies químicas e não por ordem

alfabética. Assim, é possível separa-los em categorias:

- inflamáveis,

- tóxicos,

- explosivos,

- corrosivos,

- oxidantes,

- gases.

Dicas gerais:

- os solventes perigosos (clorofórmio ou éteres não estabilizados) ou inflamáveis

(éteres, cetonas, ésteres) não devem ser estocados em grandes quantidades.

- anotar a data de chegada de todos os reagentes e deixar apenas a quantidade

mínima destas substâncias no laboratório, verificando a data de validade de cada

substância.

- armazenar sempre nos recipientes ou frascos originais.

- armazenar os agentes corrosivos em uma prateleira baixa ou em armários

especialmente separados para tais substâncias.

- Os produtos químicos devem ser armazenados em área fria, seca e ventilada.

- Não transformar as bancadas em armários!!

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Aula 8:

SEPARAÇÃO SÓLIDO/LÍQUIDO (decantação e filtração)

LAVAGEM DE MATERIAIS DE LABORATÓRIO

Separação sólido líquido

A – Decantação

Um dos métodos mais simples de separação de misturas heterogêneas em

laboratórios é a decantação. A decantação serve para a separação de misturas heterogêneas,

sejam misturas heterogêneas sólido-líquido ou misturas heterogêneas líquido-líquido.

No caso da decantação sólido-líquido, deixa-se o sólido sedimentar no fundo do

béquer e então, cuidadosamente, verte-se a maior parte do líquido para outro béquer, com

auxílio de um bastão de vidro, conforme a figura 1.

B- Filtração

Um dos problemas comuns em laboratórios é separar um líquido de um sólido.

Frequentemente utiliza-se a filtração para este fim. A filtração consiste na separação de um

sistema bifásico fazendo-se passar a fase líquido (filtrado) através de um meio que retenha

a fase sólida (precipitado). O filtro mais econômico é o de papel.

Uma das maneiras de preparar o papel filtro é a seguinte:

- o papel filtro cortado de forma circular é dobrado pela metade e depois esta

metade é novamente dobrada, adquirindo aproximadamente um quarto do tamanho original.

A segunda dobra deve ser feita de maneira que fique um intervalo de 5 mm entre as duas

pontas, como na figura 2.1.

- Em seguida, abre-se o papel de tal maneira que adquira a forma de um cone e

coloca-se no funil de modo que o corte no papel fique aderido ao vidro. Par uma rápida

filtração, o papel deve ser ajustado no funil de modo que o ar não penetre entre o papel e o

funil. Para isso, coloca-se um pouco de água destilada sobre o papel para ajustá-lo às

paredes do funil, conforme a figura 3. Quando o funil estiver bem selado, o líquido ficará

retido na coluna do funil e o seu peso ajudará a puxar o líquido através do papel.

- A fim de não perder material, deve-se usar a técnica da figura 4. Cuide para que a

superfície do líquido dentro do funil não alcance o topo do papel.

- O processo de filtração pode ser acelerado através de uma filtração por sucção, a

chamada filtração a pressão reduzida. Como neste processo a sucção é forte, é necessário

um funil especial, chamado funil de Büchner. Neste caso, o papel não é dobrado. O papel,

de forma circular, é cortado de maneira que fique a meia distância entre a última linha de

furos e a parede do funil, nunca podendo “subir pelas paredes” do mesmo, o que causaria

vazamentos. Para a obtenção do vácuo necessário para este tipo de filtração pode se usar

uma trompa d’água ou um bomba de vácuo. (figura 5).

Lavagem de materiais de laboratório

A lavagem de materiais (vidrarias e outros instrumentos) é um procedimento

extremamente importante em qualquer laboratório. Desta operação, certamente, dependerá

o sucesso de todos os experimentos futuramente realizados com a vidraria em questão.

Todo material utilizado em algum experimento, depois de devidamente descartado o

resíduo do experimento, deverá ser cuidadosamente lavado com água corrente em

abundância (água comum), detergente e escova/esponja. Depois disso, deverá ser

extensivamente enxaguado com água destilada. Só depois dessas operações é que o

material poderá ser colocado no local de secagem.

- existem no mercado várias escovas próprias para lavagem de materiais de

laboratório e você deverá escolher aquela que melhor se adaptar ao material a ser lavado.

- na lavagem dos materiais é comum a utilização de detergentes de cozinha

(detergente comum), principalmente por estes serem de preços mais acessíveis. No entanto,

existem detergente próprios para a lavagem de materiais de laboratório. No mercado são

encontradas várias marcas diferentes com os mais variados preços. O mais utilizado é o

Extran

, que pode ser encontrado na forma alcalina, ácida e neutra, a qual será escolhida

conforme o tipo de material a ser lavado.

- é prática comum durante as operações de lavagem o laboratorista recorrer ao

artifício de deixar o material “de molho”, ou seja, imerso em uma solução de água com

detergente por algum tempo, para facilitar a operação de lavagem.

- em alguns casos, quando o material a ser lavado está com resíduos firmemente

aderidos a sua superfície, o laboratorista pode recorrer ao emprego de soluções

extremamente corrosivas, como a conhecida Solução Sulfocrômica. Essa solução é

composta por ácido sulfúrico concentrado e dicromato de potássio e é efetiva na limpeza de

materiais que estejam sujos com matéria-orgânica (proteínas, açúcares, etc). No entanto, o

uso deste tipo de solução tem sido desaconselhado, principalmente pelos potencias efeitos

carcinogênicos do cromo em humanos, o que torna a sua manipulação altamente arriscada.

Além disso, essa solução é muito corrosiva e exige atenção redobrada durante a

manipulação.

- uma vez limpo o material, este deverá ser abundantemente enxaguado com água

destilada. Essa operação é crítica, pois nenhum resíduo do material utilizado no

experimento ou durante a lavagem poderá permanecer presente no material, sob risco de

interferir nos futuros experimentos. Portanto, não economize na água destilada. Quando

trabalha-se com proteínas, é aconselhável, antes desta operação de enxágüe com água

destilada, realizar um enxágüe preliminar com hidróxido de sódio 0,1 M.

- em experimentos de Biologia Molecular é aconselhável, em sendo possível, não

reutilizar os materiais que são descartáveis, pois quantidades-traço de DNA poderão não ser

devidamente eliminadas pela lavagem e acabaram interferindo nas análises seguintes.

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Aula 9:

ESTERILIZAÇÃO E ASSEPSIA

(autoclaves, capela de fluxo laminar, luz UV, estufas e gases)

Em muitas operações utilizadas em Biotecnologia é estritamente necessário que se

trabalhe em condições estéreis, ou seja, sem a presença de nenhum organismo

contaminante, ou, no máximo, com a presença de apenas um organismo (o seu organismo

de trabalho).

Autoclaves

As autoclaves funcionam submetendo o material a altas temperaturas (maiores que

100ºC), que são atingidas graças ao aumento da pressão interna do equipamento. Se você

não estiver familiarizado com a operação da autoclave em questão, peça auxilio a um

colega que já tenha trabalhado com a autoclave. IMPORTANTE: apesar de o princípio de

utilização de todas as autoclaves ser o mesmo, cada autoclave possui características

próprias e por isso, na primeira vez que você for usa-la, é importante que alguém o

acompanhe.

Dicas de utilização:

- Verifique se o frasco ou recipiente que você vai autoclavar é resistente à

temperatura que será usada. Em geral, utiliza-se temperatura de 121ºC por 15 – 30 minutos.

- Deixe livre pelo menos, um quarto do volume do frasco ou do recipiente. Assim

haverá espaço para que os líquidos fervam e, mais do que isso, é o ar presente neste espaço

o responsável pela esterilização (o princípio pelo qual a autoclave elimina microrganismos

é o calor úmido).

- Certifique-se que as tampas estejam frouxas para prevenir que o aumento da

pressão interna quebre o frasco e para permitir a entrada do ar úmido.

- Cole um pedaço de fita para autoclave (se o seu laboratório tiver a fita) em cada

item a ser autoclavado. Esta fita é sensível ao calor e mostrará alteração de cor somente

após o processo.

Modo de uso da autoclave:

- ligue a autoclave na rede elétrica, certificando-se da voltagem correta.

- coloque água no interior da autoclave. A quantidade de água varia de equipamento

para equipamento, mas, em geral, existe uma indicação do nível mínimo de água que a

autoclave deve conter. É fundamental que a resistência esteja toda coberta pela água. Essa

operação é fundamental, se ela não for corretamente realizada a resistência da autoclave

será destruída durante o processo.

- ligue a chave seletora da autoclave no “no máximo” para que a água comece a

aquecer. Essa operação pode ser feita alguns minutos antes de o seu material estar pronto,

para que no momento de colocar o material a água já esteja quente. Isso fará você ganhar

alguns minutos.

- coloque o material a ser autoclavado no cesto da autoclave, não esquecendo dos

cuidados que foram explicados acima.

- feche e aperte bem a tampa da autoclave, mas não ao ponto de ter dificuldade na

hora de abri-la novamente. Certifique-se que a válvula lateral, responsável pelo controle da

pressão ESTEJA ABERTA NESTE MOMEMENTO.

- quando a saída de vapor d’água for perceptível, indicando que a saturação do ar

interno com água foi atingida, feche a válvula lateral. Agora a autoclave está

completamente vedada e a pressão e a temperatura internas começarão a subir (isto pode ser

acompanhado pelo manômetro.

- quando a temperatura desejada for atingida, coloque a chave seletora no médio e

comece a contar o tempo.

- passado o tempo devido, desligue a chave seletora e espere a autoclave retornar a

temperatura ambiente naturalmente. NÃO ABRA VÁLVULA NENHUMA!

- quando a pressão baixar completamente a autoclave pode ser aberta. Mas tenha

cuidado, pois o material estará extremamente quente. Use luvas termorresistentes.

Estufas

A esterilização de alguns materiais também pode ser feita em estufas. Neste caso,

em virtude de o calor seco ser menos eficiente que o calor úmido, empregam-se

temperaturas mais elevadas e tempos mais longos. O material a ser esterilizado, em geral

utensílios, deve ser recoberto com papel.

Esterilização com gases

Uma forma de esterilizar materiais, principalmente em experimentos de cultura

vegetal, é utilizar gases com atividade antimicrobiana. Utilizam-se pastilhas de formalina

(formaldeído) que são colocadas em uma câmara fechada juntamente com o material a ser

esterilizado. Com a sublimação da pastilha libera-se o gás responsável pela esterilização.

Capelas de fluxo laminar

Em virtude de o ar atmosférico estar cheio de poeira e de microrganismos é

necessário trabalhar em um ambiente que esteja livre destes agentes contaminantes. Uma

alternativa interessante contornar este problema é trabalhar em uma capela de fluxo

laminar, que promove a filtração e a recirculação do ar no ambiente de trabalho. O fluxo de

forma uma “cortina” que impede a passagem de ar externo para dentro da capela e de

dentro para fora. Isso protege o manipulador do conteúdo da capela e protege o

experimento do ambiente externo.

Modo de trabalho:

- antes de iniciar o trabalho na capela de fluxo laminar ligue a lâmpada ultravioleta

que existe na capela. Este tipo de luz possui atividade microbicida, ou seja, elimina os

microrganismos que possam estar presentes na capela (Nota: apesar de existirem

controvérsias quanto a eficiência deste procedimento, ele ainda é amplamente utilizado). A

lâmpada deve ficar acesa por aproximadamente 15 minutos, durante os quais você não

deverá colocar as mãos dentro da capela, pois a luz UV provoca sérias queimaduras.

- Desligue a lâmpada UV e ligue a circulação de ar da capela.

- Baixe o vidro da abertura da capela.

- Limpe a superfície da capela com etanol 70%.

- Coloque o material para dentro da capela.

- Inicie o trabalho.

Dicas importantes:

- nunca obstrua o fluxo de ar da capela com papéis, instrumentos ou equipamentos.

- se precisar colocar uma tampa estéril esterilizada na superfície da capela, coloque-

a virada para vaixo.

- evite movimentos com as mãos para dentro e para fora da capela.

- evite usar fogo dentro da capela, apesar de isso, às vezes, ser necessário.

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Aula 10:

PURIFICAÇÃO DE ÁGUAS

(água destilada, deionizada e ultra-pura)

A água é um importante componente das soluções e não simplesmente um líquido

onde se dissolvem as coisas. A qualidade da água, a composição e o pH podem afetar

drasticamente os experimentos. Não faltam exemplos de experimentos que não

apresentarem os resultados esperados em virtude da má qualidade da água utilizada.

Existem várias classificações gerais da qualidade da água de acordo com seu grau

de pureza:

1. Água de torneira: a qualidade dessa água varia muito e sua composição depende

da localização geográfica da fonte, da época do ano, da quantidade de chuva, da

composição dos canos, etc. Alguns minerais podem inibir reações enzimáticas ou impedir o

crescimento celular. Por isso, ela não deve ser usada, a não ser para lavagem de vidrarias e

utensílios de laboratório.

2. Água com grau de laboratório: esta é a água adequada para preparar soluções e

fazer os experimentos. Ela foi previamente tratada por algum dos métodos conhecidos, a

citar:

Água destilada:

A destilação é um processo há muito estabelecido para a purificação da água, no

qual a água é aquecida até evaporar e o vapor é condensado e recolhido. O equipamento é

relativamente econômico, mas tem um grande consumo de energia – usa tipicamente 1kW

de eletricidade por litro de água produzida. Dependendo do design do destilador, a água

destilada pode ter uma resistividade de aproximadamente 1 MΩ-cm e será estéril quando

acabar de ser produzida se for utilizado equipamento especificamente concebido para o

efeito, mas não continuará estéril sem um armazenamento muito cuidadoso. Além disto,

impurezas voláteis como dióxido de carbono, sílica, amoníaco e uma variedade de

compostos orgânicos passarão para a água destilada.

Quais são as desvantagens da destilação?

A destilação produz água purificada lentamente. Não é um processo de resposta a

pedido. Por este motivo, é necessário destilar uma determinada quantidade de água e

armazená-la para utilizar mais tarde. Este armazenamento da água destilada pode constituir

um problema se o reservatório em que a água é armazenada não for fabricado num material

inerte. Os íons ou plastificantes serão lixiviados do reservatório e irão recontaminar a água.

Além disto, as bactérias desenvolvem-se muito bem em água que esteja arada durante

algum tempo. Em áreas de água dura, os destiladores têm de ser limpos frequentemente

com ácido, devido à acumulação de incrustações, a não ser que a água de alimentação seja

pré-tratada.

Água deionizada

Neste sistema utilizam-se colunas de troca iônica, contendo tanto resinas trocadoras

de cátions quanto resinas trocadoras de ânions, as quais removem os íons inorgânicos da

água (Ca+2

, Mg+2

, Cl-1

). Em seguida efetua-se uma destilação normal, para remover os íons

restantes e materiais orgânicos.

As colunas de troca iônica devem ser trocadas frequentemente.

Água ultra-pura (“água Milli-Q

”)

Alguns laboratórios têm necessidades especiais em relação à água e exigem águas

de alto grau de pureza. Esta água é obtida pela combinação de processos de osmose reversa

(a água passa por uma membrana semipermeável por onde as impurezas não podem passar)

com deionização. A ultrafiltração, a adsorção em carvão ativo para eliminar matéria

orgânica e a luz ultravioleta podem ser usados em alguns equipamentos para complementar

a purificação deste tipo de água.

Experimentos de Biologia molecular, Bioquímica e análises de traços de elementos

são exemplos de aplicação deste tipo de água.

Princípios de osmose reversa

A osmose reversa (OR) é um processo que resolve muitos dos problemas da

destilação e da troca iônica. Para explicar a osmose reversa, vejamos primeiro a osmose.

Este é um processo natural que ocorre sempre que uma solução diluída é separada de uma

solução concentrada por uma membrana semi-permeável. A água, levada por uma força

causada pela diferença na concentração – a pressão osmótica – passa através da membrana

para a solução concentrada. O fluxo de água continua até a solução concentrada ficar

diluída e a contra-pressão impedir a continuação do fluxo através da membrana (equilíbrio

osmótico). Quando é aplicada uma pressão superior à pressão osmótica no lado da

membrana onde se encontra a maior concentração, o sentido normal do fluxo osmótico é

invertido, a água pura passa da solução concentrada através da membrana (impermeável às

impurezas) e é assim separada dos seus contaminantes. Este é o princípio básico da osmose

reversa.

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Aula 11:

CENTRIFUGAÇÃO

A finalidade de uma centrífuga é separar substâncias imiscíveis em uma mistura

heterogênea. E muitos experimentos realizados em Biotecnologia utilizam-se de

centrífugas. São usadas para concentrar proteínas, extrair DNA e separar péletes de células.

Importante: a presença de centrífugas em todos os cantos do laboratório não deve

ser motivo de descuido. Ela é um instrumento importante e complicado que pode ser

facilmente danificado e causar ferimento ferimentos no manipulador, quando for mal

utilizada.

Existem vários tipos de centrífugas e nos laboratórios elas são normalmente

chamadas pelo nome do fabricante. As centrífugas de alta velocidade são construídas com

unidade de refrigeração, necessárias devido ao calor gerado pela alta velocidade. Outras

centrífugas estão disponíveis tanto em modelos refrigerados como não refrigerados. O frio

também serve para preservar a amostra que está sendo centrifugada.

Os principais tipos de centrífugas são:

- Centrífuga de bancada,

- Microcentrífuga,

- Centrífuga de alta velocidade,

- Ultracentrífuga

Regras gerais de trabalho na centrífuga:

- não coloque para centrifugar materiais radioativos, com risco biológico ou

infecciosos antes de ter certeza de que está usando o material adequado.

- Equilibre todos os tubos com seus suportes, tampas, proteção e pinos. Não

equilibre somente os tubos e sim todo o sistema. Se for preciso usar um tubo para equilibrar

encha- o com água.

- Se houver folha de registros, seja meticuloso ao anotar as informações. Isso é

importante para manter um controle sobre o uso do equipamento.

- Limpe a centrífuga toda vez que usa-la. Use um pano úmido.

- Conheça as limitações de velocidade da centrífuga e do rotor e não ultrapasse

esses limites.

- Use os tubos e os suportes apropriados. Isso é especialmente importante em

centrifugações de alta velocidade. Os tubos não devem ficar frouxos nem apertados demais

nos suportes ou no rotor.

- Preencha os tubos até aproximadamente 2 cm da borda. Se você encher demais

poderá ter vazamentos.

- Não use tubos com qualquer tipo de rachadura. Descarte estes tubos

imediatamente.

- Não se esqueça de tampar o rotor.

- Feche a tampa das centrífugas refrigeradas no intervalo de uso para evitar

condensação.

- Remova as amostrar da centrífuga imediatamente. Nunca deixe as amostras

paradas por muito tempo. O pélete pode se tornar disperso.

Como centrifugar

1. escolha os tubos apropriados ao volume e à natureza do que você vai centrifugar.

Use o menor número de tubos possível e procure usar aqueles de volume mais próximo ao

do que você precisa.

2. escolha uma centrífuga e um rotor apropriados a sua amostra. Saiba a que

velocidade a amostra deve centrifugada e se deve ser refrigerada ou não.

3. Equilibre os tubos. Cada tubo deve ser centrifugado com um tubo do mesmo peso

colocado do lado oposto. O mesmo deve ser feito para todo rotor e toda centrífuga.

Importante: somente os tubos colocados frente a frente devem ser de mesmo peso.

Como equilibrar os tubos:

- tubos de microcentrífuga podem ser ajustados pelo volume n não pelo peso.

- tubos de ultracentrífuga e centrífugas de alta velocidade devem ser pesados

individualmente em uma balança.

4. coloque os tubos na centrífuga, sempre na mesma orientação. Se ele tem uma

assimetria, tal como uma aba na borda, coloque sempre cada tubo no suporte da mesma

maneira. Dessa forma você saberá onde procurar o pélete.

5. Coloque a cobertura no rotor.

6. Feche a tampa da centrífuga.

7. Programe a centrífuga, ajustando a velocidade de aceleração, o tempo, a

temperatura e velocidade de desaceleração.

8. Inicie o processo. Espere até que a centrífuga atinja a velocidade programada, só

depois se ausente da sala, pois se houver algum problema de desbalanço esse geralmente

aparece neste intervalo de tempo.

9. Quando a centrifugação terminar, remova os tubos cuidadosamente para não

misturar o pélete novamente.

10. Remova o sobrenadante. Isso pode ser feito vertendo-se o líquido

cuidadosamente ou por aspiração com micropipeta ou pipeta de Pasteur.

Como determinar a velocidade da centrífuga

A velocidade da centrífuga será dada como força gravitacional (g) ou rotações por

minuto (rpm). A força g é também chamada RCF (relative centrifuge force- força

centrífuga relativa). Os protocolos normalmente determinam a velocidade em g, pois esta

pode ser reproduzida facilmente, ao contrário das rotações por minuto.

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Aula 12:

Potenciometria (medida de pH)

Em inúmeros casos, dentro da área de Biotecnologia, é fundamental conhecer o

potencial Hidrogeiônico (pH) do material em questão. E isso normalmente deve ser

realizado de forma rápida e precisa. Para tanto, utiliza-se um aparelho chamado

potenciômetro (pHmetro), que permite a medida direta do pH das soluções (materiais) em

questão.

A grande maioria dos pHmetros utilizados em Biotecnologia utiliza eletrodos

indicadores de vidro, de forma combinada , ou seja, o eletrodo indicador e o eletrodo de

referência estão combinados em um única peça.

Procedimentos para medida de pH utilizando pHmetros equipados com eletrodos

indicadores de vidro

Antes da medição:

1. remover a capa plástica de vedação do orifício usado para enchimento do

eletrodo de modo a estabelecer equilíbrio com a pressão atmosférica;

2. retirar a capa plástica que protege o bulbo de vidro durante a estocagem, ela

contém KCl 3M que garante a hidratação da membrana. Enxaguar o eletrodo

com água destilada para retirar resíduos e eventuais cristalizações do sal no

eletrodo;

3. Verificar a necessidade de completar o nível da solução interna com a solução

de enchimento, normalmente KCl 3M saturado com AgCl.

4. Calibrar o eletrodo com as soluções-tampão escolhidas conforme a faixa de

trabalho desejada. Entre uma solução e outra, lavar o eletrodo com água

destilada. A medida é direta e o valor de pH é aquele em que houver

estabilização do valor apontado no display.

IMPORTANTE: O eletrodo é uma peça extremamente frágil e cara. Por isso

manipule-o cuidadosamente. Use apenas os dedos na sua limpeza.

Na medição:

1. mergulhar o eletrodo de modo que sua junção fique abaixo do nível da solução a

ser medida.

IMPORTANTE: O pH varia em função da temperatura. E existe uma grande variação entre os aparelhos no que diz respeito ao ajuste de temperatura, por isso procure se informar da

forma com que o ajuste deve ser feito no aparelho que você irá utilizar.

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Aula 13:

ESPECTROSCOPIA VISÍVEL/ULTRAVIOLETA

A espectroscopia visível/ultravioleta é uma ferramenta amplamente utilizada em

experimentos químicos, bioquímicos, microbiológicos, etc, uma vez que inúmeras

metodologias analíticas se baseiam na absorção da luz polarizada pelas espécies analisadas.

FUNDAMENTO

A Espectroscopia pode ser conceituada como um procedimento analítico através

do qual se determina a concentração de espécies químicas mediante a absorção de energia

radiante (luz).

A luz pode ser entendida como uma forma de energia, de natureza ondulatória,

caracterizada pelos diversos comprimentos de onda (, expressos em nm, normalmente) e

que apresenta a propriedade de interagir com a matéria, sendo que parte de sua energia é

absorvida por elétrons da eletrosfera dos átomos constituintes das moléculas.

Uma solução quando iluminada por luz branca, apresenta uma cor que é resultante

da absorção relativa dos vários comprimentos de onda que a compõem. Esta absorção, em

cada comprimento de onda, depende da natureza da substância, de sua concentração e da

espessura da mesma que é atravessada pela luz.

Esquema simplificado de um sistema espectrofotométrico

- a luz emitida por uma fonte (normalmente uma lâmpada de tungstênio para

comprimentos de onda no visível e de Deutério no ultravioleta) passa por um

monocromador que seleciona apenas o comprimento de onde desejado (luz

monocromática). A luz atinge a amostra, de comprimento de onde b. Alguma quantidade de

luz é absorvida de forma que I0 > I. A luz que não é absorvida é detectada por uma célula

fotoelétrica e medida em um galvanômetro.

Quando a luz (I0) é absorvida pela amostra a sua intensidade diminui (I).

Io I

b

Relação entre cor observada e cor absorvida

Comprimento de onda

(nm)

Cor absorvida Cor observada

380 – 440 Violeta Amarelo

440 – 500 Azul Laranja/vermelho

500 – 550 Verde Roxo/violeta

550 – 580 Amarelo Violeta/azul

580 – 620 Laranja Azul

620 – 680 Vermelho Azul/verde

680 - 780 Roxo Azul

A lei de Beer

A Lei de Lambert-Beer é a lei que rege a espectroscopia e diz o seguinte: a

absorbância é proporcional à concentração da espécie química absorvente, sendo constantes

o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores.

Verifica-se uma relação linear entre absorbância ou densidade ótica e concentração, e de

uma relação logarítmica entre transmitância e concentração.

A lei de Beer:

A = a.b.c

sendo

A= Absorbância (adimensional – sem unidade)

a = coeficiente de extinção molar (constante)

b= espessura atravessada pelo feixe luminoso

c= concentração