aplicação e evolução dos métodos moleculares no estudo da ... · • determinação da...

Capítulo 11

Aplicação e Evolução dos MétodosMoleculares no Estudo

da Biodiversidade do Rizóbio

Rosângela Straliotto

Introdução

A palavra biodiversidade é uma forma abreviada de se referir àdiversidade biológica, termo que ganhou muita popularidade nesta últimadécada, especialmente após a declaração da Agenda 21, publicada apósa Conferência Mundial para o Meio Ambiente e Desenvolvimento –Eco-92 –, no Rio de Janeiro. Uma das definições mais úteis de biodi-versidade é dada pela União Internacional para Conservação daNatureza e Recursos Naturais: biodiversidade envolve todas as formasde vida, ecossistemas e processos ecológicos, e abrange a sua hierarquianos âmbitos genético, taxonômico e de ecossistema (MCNEELY et al.,1990, citados por BULL et al.,1992). No conhecimento da biodiversidadepresente nos diferentes ecossistemas está a base do progresso biotecno-lógico esperado em diferentes áreas da ciência aplicada.

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32281

282 Capítulo 11

Todo o progresso biotecnológico inicia-se com a procura e adescoberta de um fenômeno biológico que possa ser explorado; sendoassim, o planejamento eficiente e a otimização dos programas depesquisa visando à busca e à descoberta são tão cruciais quanto qualqueroutra etapa nesse processo (BULL et al., 1992). Na área de microbiologia,a coleta do material biológico nos estudos tradicionais é dirigida aoacaso, utilizando métodos relativamente simples, embora laboriosos,de isolamento e manipulação. Esses métodos são muito empíricos esujeitos a grandes limitações, além de promoverem uma seleção préviada população em estudo conforme o meio de cultivo utilizado, dificul-tando a real análise da biodiversidade. Desse modo, já nessa etapa, oprocesso seguinte de seleção fica comprometido, tornando-se tambémempírico e menos eficiente. O processo de seleção implica avaliar amaior diversidade genética possível, e, a seguir, dispor de um métodoeficiente para a seleção dos materiais a serem testados. Essa diversidadeestá presente na natureza por meio da variabilidade natural ou pelaocorrência de mutações e recombinações genéticas, enquanto a escolhado critério de seleção depende do pesquisador e das condições detrabalho disponíveis. Muitos novos métodos têm revolucionado essa áreada pesquisa, especialmente com o advento dos métodos molecularesde estudo, envolvendo estudos da variabilidade presente no âmbito doDNA. Essas novas metodologias têm provocado uma verdadeirarevolução na nossa habilidade de detectar variabilidade dosmicrorganismos aos níveis dos diferentes taxa e de sua funcionalidade.Além disso, atividades específicas dos diferentes organismos podem sermonitoradas no ecossistema por meio do acompanhamento da atividadede organismos geneticamente modificados, ou detectadas pela seleçãodirigida por sondas moleculares.

Evolução dos estudos taxonômicos em microbiologia

Os estudos taxonômicos foram por muito tempo relegados a umsegundo plano dentro da chamada “ciência aplicada”, objeto de estudosde abnegados cientistas às voltas com inúmeros problemas relativos àdefinição de espécies, especialmente quando se considera o estudo dataxonomia bacteriana. Uma definição interessante dessa ciência foi dada

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32282

283Aplicação e Evolução dos Métodos Moleculares no Estudo da Biodiversidade do Rizóbio

por Wilson (1985) já prevendo as mudanças que começavam a ocorrernesse campo de estudo: “Systematics, the study of biological diversity,is sometimes portrayed as the mere classification of organisms, but infact its range and challenges are among the greatest in biology”. Defato, a busca de organismos que possuem genes de interesse, tantoagronômico quanto industrial, depende das metodologias de classificação,uma vez que estirpes relacionadas dentro de um táxon têm maiorespossibilidades de também possuírem essas características de interesse.Bull et al. (1992) listaram uma série de campos onde a modernasistemática microbiana pode auxiliar nos diversos desafios colocadosaos biotecnologistas:

• Geração de dados de alta qualidade que podem ser usadospara melhorar os sistemas existentes de identificação e classifi-cação microbiana e formular novos métodos para o isolamentoseletivo de microrganismos raros e novos.

• Permição para rápida detecção, circunscrição e identificaçãode organismos novos ou alvo em placas de isolamento primárias,ou mesmo in situ, e o reconhecimento de colônias que surjamde propágulos semelhantes.

• Determinação das condições ecológicas para o isolamentoseletivo.

• Providencias para descrições compreensivas de estirpespatenteadas.

• Determinação da extensão da diversidade procariótica,inclusive determinando a distribuição geográfica de microrga-nismos importantes industrialmente ou agronomicamente,redirecionando a tendência da corrente da ecologia microbiana,de focalizar na função mais do que promover um entendimentodos papéis e das inter-relações entre as taxas específicas nosdiferentes ecossistemas microbianos.

Esse extenso campo de ação só pode ser melhor compreendidono contexto da nova sistemática microbiana, surgida a partir da introduçãoe aplicação de novos conceitos taxonômicos e técnicas surgidas a partirdo final dos anos 50 e início dos anos 60 (BULL et al., 1992). O desenvol-vimento mais significativo iniciou-se com a aplicação dos métodos de

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32283

284 Capítulo 11

taxonomia numérica, molecular e química, e especialmente nos últimos10 anos, com o rápido desenvolvimento no campo do seqüenciamentogenômico e da geração de banco de dados dos genes que codificampara o RNAr (DNAr). Esses avanços têm sido de grande contribuiçãopara a filogenia bacteriana e taxonomia de todos os organismos vivos,assim como as técnicas de fingerprinting molecular. Com o advento daanálise fenética numérica e das técnicas de biologia molecular dentroda taxonomia bacteriana, foi possível determinar objetivamente asrelações inter e intra-específicas.

A chamada taxonomia polifásica iniciou-se 25 anos atrás, e seuobjetivo é a integração dos diferentes tipos de dados e informações(fenotípicas, genéticas e filogenéticas) sobre o microrganismo eessencialmente indica uma taxonomia de consenso (VANDAMME et al.,1996). O termo “taxonomia polifásica” foi utilizado pela primeira vezpor Colwell (1970) e é utilizado para o delineamento de taxa em todosos níveis (MURRAY et al., 1990). Os recentes desenvolvimentos nataxonomia polifásica, também chamada de classificação polifásica ouidentificação polifásica, constituem um enorme avanço na modernataxonomia bacteriana (VANDAMME et al., 1996).

A taxonomia é geralmente tida como um sinônimo de sistemáticaou biossistemática, sendo tradicionalmente dividida em três partes(Vandamme et al., 1996):

• Classificação, isto é, o arranjo ordenado dos organismos emgrupos taxonômicos com base em sua similaridade.

• Nomenclatura, ou seja, identificação das unidades definidasem (1).

• Identificação de organismos desconhecidos, que é o processode definir se um determinado organismo pertence a uma dasunidades definidas em (2).

Duas partes adicionais completam a moderna biossistemática:filogenia e genética de populações (VANDAMME et al., 1996).

Dois termos merecem ser diferenciados: análise fenética e análisefilogenética. Conforme a definição de Abbott et al. (1985), citados porWeising et al. (1995), padrões fenéticos são padrões de semelhança ediferença entre organismos, baseados em muitas características herdáveis.

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32284


Freqüentemente, há descontinuidades, de modo que os padrões revelamagrupamentos com diferentes faixas de variação entre si e vários grausde diferença dentro do grupo. Os padrões filogenéticos mostram comoos padrões fenéticos mudam com o tempo, formando uma árvore comdiferentes ramificações.

Já a definição de espécie em bacteriologia é uma questão aindaem aberto, e, segundo alguns autores, há tantas definições de espéciequanto há taxonomistas e, mesmo assim, muitos destes mudam de opiniãono decorrer de suas carreiras científicas. Mas, antes de ser um problema,essa dificuldade é um padrão de evolução que ocorre em todos os camposdo conhecimento humano, onde o progresso científico somente é possívele está ligado ao progresso tecnológico. Ou seja, à medida que novastecnologias vão surgindo, os estudos vão progredindo e abrangendoum universo cada vez maior do desconhecido, conseqüentemente asteorias vão se modificando e aperfeiçoando. A questão da definição se asbactérias, assim como plantas e animais, podem ser ordenadas em taxadistintos, como gêneros e espécies, permanece portanto em aberto.A definição zoológica de espécie não pode ser aplicada aos organismosprocariotos, pois pressupõe que a “espécie é um grupo de populaçõesque pode ser, ou é potencialmente, intercruzado naturalmente e que éreprodutivamente isolado de outros grupos ou espécies” (RAVIN, 1963,citado por STACKEBRANDT; GOEBEL, 1994). Mesmo após muitos anosde pesquisas, a extensão da sexualidade em bactérias é virtualmentedesconhecida, e o isolamento reprodutivo de estirpes bacterianas podeser descartado (STACKEBRANDT; GOEBEL, 1994). Se o termo espécieé usado, então, para expressar os membros de uma ordem taxonômica,os microbiologistas devem seguir algumas linhas mestras de modo a obterestabilidade, reprodutibilidade e coerência em seus dados taxonômicos.Nesse caso, o termo espécie passa a ser definido como um grupotaxonômico constituído por membros possuidores de característicaspreviamente definidas (STACKEBRANDT; GOEBEL, 1994). Vem daí agrande utilidade da taxonomia polifásica, que busca, conformedestacado acima, esse consenso na descrição das características dosmembros desse grupo.

Atualmente, a espécie, unidade básica da taxonomia bacteriana,tem sido definida como um grupo de estirpes, incluindo a estirpe-padrão,que possui 70% ou mais de homologia de DNA e cuja variação da

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32285

286 Capítulo 11

temperatura de dissociação (∆Tm) do híbrido em estudos de

homologia DNA:DNA seja de 5 oC ou menos (Tm é a temperatura de

dissociação do híbrido determinado por desnaturação passo a passo;∆T

mé a diferença em graus Celcius entre os pares homólogos e os

pares heterólogos formados nas condições-padrão) (WAYNE et al.,1987). O nível exato abaixo do qual os organismos são consideradoscomo pertencentes espécies diferentes varia de autor para autor, e ovalor de 70% acaba sendo mais indicativo do que absoluto (BULL et al.,1992). As características fenotípicas e quimiotaxonômicas devemestar de acordo com essa definição, pois, idealmente, as espéciesgenômicas, definidas utilizando a hibridização de ácidos nucléicos,deveriam corresponder àquelas definidas pela taxonomia numérica(BULL et al., 1992; STACKEBRANDT; GOEBEL, 1994). Essa é a opiniãodo “Ad Hoc Committe on Reconciliation of Approaches to BacterialSystematics” (WAYNE et al., 1987), cujo documento lista uma série derecomendações taxonômicas visando estimular a discussão dessetópico, reforçando a visão de que critérios quimiotaxonômicos (tantofenéticos quanto filogenéticos) devem ser observados quando daproposta ou inferência de níveis hierárquicos. Além disso, atualmente,a classificação bacteriana deve refletir o mais proximamente possívelas relações naturais entre as bactérias, definidas pelas relaçõesfilogenéticas codificadas pelo seqüenciamento do 16S ou 23S RNAr(WOESE, 1987). Como veremos a seguir, nem sempre esse consenso éde fácil obtenção, e vários casos são relatados em literatura ondesurgem conflitos entre os dados gerados segundo os diferentes métodosde abordagem genotípica (FOX et al., 1992).

Aplicações da biologia molecular nos estudosde diversidade e taxonomia do rizóbio

A taxonomia do rizóbio sofreu contínuas modificações comoreflexo da evolução no campo da sistemática bacteriana, passando porrevisões periódicas à medida que os estudos ecológicos mostram aocorrência significativa de novos grupos de bactérias. À medida queesses estudos taxonômicos se desenvolvem, é importante correlacionaras diferenças taxonômicas com características fenotípicas, sendo esta

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32286


a visão do Subcomitê sobre a Taxonomia de Rhizobium e Agrobacterium.Uma espécie de manual de padrões de procedimento na descrição denovos gêneros e espécies de bactérias formadoras de nódulos em raízese caule foi proposta por esse subcomitê e publicada por Graham et al.(1991). O subcomitê considera que a descrição de um novo gênero ouespécie deve ser baseada em organismos independentemente isolados,de regiões geográficas distintas, e a descrição da espécie, publicadano International Journal of Systematic and Evolution Microbiology. Aestirpe-padrão deve ser depositada numa coleção de culturasinternacionalmente reconhecida, disponível a outros pesquisadores. Paraa estirpe-padrão e isolados representativos, as seguintes característicasdevem ser consideradas: desempenho simbiótico baseado em parâmetrosselecionados; características morfológicas, culturais e bioquímicas; graude homologia DNA:DNA; hibridização RNAr:DNA e análise do 16SRNAr; polimorfismo no tamanho dos fragmentos de restrição do DNA(RFLPs) e eletroforese de enzimas multilocus (MLEE).

A identificação rápida e confiável de estirpes continua sendo oobjetivo mais importante nos estudos taxonômicos. Nos últimos anos, ointeresse renovado nos estudos de taxonomia microbiana deve muitoao desenvolvimento das técnicas de biologia molecular, que aumentoumuito a disponibilidade de métodos que permitem a identificação eclassificação mais rápida e precisa de microrganismos. Nesse grupo deanálise genotípica estão todas as metodologias direcionadas ao estudodas moléculas de DNA ou RNA.

A velocidade de geração de dados por meio da aplicação detecnologias baseadas em PCR, seqüenciamento automatizado,eletroforese de campo alternado e sondas de oligonucleotídeos éimpressionante e tem levado à formação de diferentes tendências dentroda sistemática bacteriana. Como exemplo, podem ser citados aelucidação de relações filogenéticas, os estudos descritivos combinandoinformações filogenéticas e fenotípicas, os estudos ecológicos com oobjetivo de revelar espécies não cultiváveis de microrganismos, oumesmo evitar os procedimentos de cultivo nos estudos de ecologiamicrobiana do solo, e o desenvolvimento de metodologias de diagnose(STACKEBRANDT; GOEBEL, 1994). Metodologias mais simples como atécnica de hibridização do DNA de colônias, com sondas ligadas a

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32287

288 Capítulo 11

genes cromossomais ou simbióticos (MERCANTE et al., 1998), sãobastante úteis no levantamento da biodiversidade do rizóbio presenteem determinado ecossistema, embora de limitado valor taxonômico.As técnicas de hibridização de ácidos nucléicos e de seqüenciamentotêm tido muita ênfase na sistemática bacteriana, por revelarem relaçõesnaturais entre os diferentes níveis na hierarquia taxonômica, codificadosno DNA (BULL et al., 1992).

Determinação da relação de bases do DNA (%G+C)

O estudo da composição de bases do DNA ainda é uma ferramentaútil e um modo rotineiro de distinguir entre estirpes fenotipicamentesemelhantes, porém geneticamente não relacionadas (BULL et al., 1992).Conforme já discutido, a composição de bases do DNA é parte dospadrões mínimos para a definição de gêneros e espécies (WAYNE et al.,1987). É geralmente aceito que microrganismos mostrando diferençasem mais de 5% de guanina e citosina (G + C) não devem ser consideradosda mesma espécie, e aqueles com mais de 10% de diferença no conteúdoG+C, em relação ao padrão, não devem ser classificados dentro domesmo gênero (BULL et al., 1992). Outros autores consideram que asespécies já seriam distintas a partir de uma diferença de 3% em seu conteúdoG+C (STACKEBRANDT; LIESACK, 1993, citados por VANDAMME et al.,1996). Essa percentagem varia entre 24% e 76% dentro das espéciesbacterianas estudadas até o presente (VANDAMME et al., 1996).

Homologia do DNA

A hibridização de ácidos nucléicos é considerada uma formaconfiável de estabelecer o relacionamento entre diferentes espéciesbacterianas, embora não seja uma metodologia suficientemente precisa,estando sujeita a várias restrições (MARTÍNEZ-ROMERO, 1994;VANDAMME et al., 1996). Classicamente, uma espécie genômica,conforme destacado, engloba isolados com aproximadamente 70% oumais homologia pela hibridização de DNA, embora o nível abaixo doqual um organismo é considerado como pertencente a outra espécie varie

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32288


(MARTÍNEZ-ROMERO, 1994). A hibridização DNA:RNAr também temsido utilizada para determinar relacionamentos filogenéticos (DREYFUSet al., 1988; LAJUDIE et al., 1994).

A principal razão para o uso da homologia de DNA como o critérioprincipal na definição de espécies baseia-se no resultado de numerososestudos em que um alto grau de correlação foi encontrado entre asimilaridade do DNA e similaridade baseada em dados quimiotaxonô-micos, sorológicos e de análise fenética numérica (STACKEBRANDT;GOEBEL, 1994). Essa metodologia está baseada na descoberta inicialde que o DNA de fita simples de duas estirpes diferentes podem sereassociar até um determinado ponto mensurável e formar um DNAhíbrido se as fitas contêm menos de 15% de bases não pareadas(ULLMAN; MCCARTHY, 1973). As medidas de 70% ou mais desimilaridade correlacionam-se com pequenas diferenças na estabilidadedos duplexes formados durante a reassociação (JOHNSON, 1985).A recomendação do comitê que dispõe sobre as metodologias indicadasem sistemática bacteriana propõe uma diferença de 5oC ou menos paraindicar relacionamento no âmbito de espécie, valor baseado em centenasde experimentos de hibridização, utilizando diferentes metodologias(SCHLEIFER; STACKEBRANDT, 1983). Os cálculos originados dessesdados indicam que isolados com 70% de homologia terão no mínimo96% de identidade em suas seqüências, sendo assim, num genoma comoo Escherichia coli, que possui 5 Mpb, 2% de diferença significam 105

nucleotídeos. Isso poderia ser suficiente para gerar mudanças fenotípicasentre estirpes dessa espécie, vindo daí a importância da análisepolifásica, uma vez que é muito pouco provável que essas diferençasvenham a abranger a estrutura primária da maioria dos genes envolvidosnum conjunto de características distintas.

Em alguns casos, a homologia de DNA não está de acordo com afilogenia determinada pelo seqüenciamento do 16S RNAr. Fox et al.(1992), estudando o gênero Bacillus, por exemplo, verificaram que duasestirpes, pertencentes a espécies distintas, possuíam mais de 99,5% desimilaridade em suas seqüências de 16S DNAr, podendo ser assimconsideradas idênticas. No entanto, os dados de homologia de DNAindicam valores de homologia entre elas de 23% a 50%, muito baixospara que sejam consideradas como pertencentes à mesma espécie.Além disso, fenotipicamente, as estirpes podem ser facilmente

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32289

290 Capítulo 11

distinguíveis, podendo ser corretamente classificadas em espéciesdistintas. Nesse caso, o critério baseado em taxonomia polifásica, emque é importante considerar os dados de seqüenciamento, levanta umsério problema de definição de qual parâmetro deve ser considerado maisimportante na definição da espécie. Num levantamento de dados deseqüenciamento e de homologia de DNA de diversas bactérias, essesautores observaram que, quando o nível de similaridade do 16S RNAr éde 99% ou mais, os dados de homologia de DNA podem ou não certificara existência de espécies distintas. Há vários casos, dentro da mesmaespécie, de alta similaridade da seqüência do 16S RNAr e baixos valoresde homologia do DNA. No entanto, o oposto não ocorre, ou seja, estirpesdistintas no seqüenciamento também o são pelos dados de homologia.Os autores sugerem que, no contexto da nomenclatura atual, a soluçãoseria estabelecer-se que a identidade das seqüências do 16S RNAr nãoimplica a identidade das espécies, e organismos que sejamproximamente relacionados dessa forma, mas que não preencham orequisito de 70% de homologia de DNA, possam ser considerados comodiferentes subespécies. O problema com essa definição é que o valorde 70% de homologia foi baseado no que parece ser um nível razoávelde variabilidade genética após extensiva caracterização de numerososisolados. Sendo assim, quando se estabelece um critério baseado no16S RNAr, estaríamos permitindo níveis muito elevados de variabilidadegenética para a definição de espécies em alguns casos.

A segunda alternativa, que seria considerar que os dados baseadosno 16S RNAr não tenham relevância na definição de espécies, tambémnão é apropriada. Isso é mais aparente no caso de 100% de identidadenas seqüências, em que certamente haverá homologia do DNA, sendoos isolados considerados como pertencentes à mesma espécie por amboscritérios. O problema surge quando há pequenas diferenças nasseqüências do 16S RNAr. Nesses casos, a homologia do DNA muitasvezes não faz uma distinção significativa. Tais estirpes, ainda segundoFox et al., podem possuir níveis de homologia de até 30%, podendo serclassificadas como pertencentes ao mesmo “complexo de espécies deRNAr”, cuja homologia não necessariamente deva exceder os 70%. Essanomenclatura é aplicável a espécies que possuem alta probabilidadede pertencer à mesma espécie, e os dados de seqüenciamento servem

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32290


para identificar estirpes que claramente não pertencem ao mesmo grupo.Por sua vez, esses dados nunca poderão estabelecer que o restante davariabilidade seja consistente com a existência de apenas uma espécie.De acordo com Stackebrandt & Goebel (1994), a análise do 16S RNAr émuito útil dentro da abordagem de taxonomia polifásica, e, para definiçãoda espécie, é extremamente importante considerá-la para decidir anecessidade de obtenção dos laboriosos dados de homologia de DNA.De acordo com os dados compilados em literatura, organismos quepossuam menos de 97% de similaridade em suas seqüências do 16SDNAr não irão apresentar dados de homologia de DNA maiores do que60%, independentemente da metodologia utilizada (STACKEBRANDT;GOEBEL, 1994), não sendo provavelmente espécies relacionadas. Comoconclusão, a presença ou ausência de coerência fenotípica deverá sero fator decisivo para descrição de espécies nos casos em que apercentagem de homologia de DNA varie entre 60% e 80%(STACKEBRANDT; GOEBEL, 1994), ou mesmo seja menor do que 40%(MARTÍNEZ-ROMERO, 1994).

Em rizóbio também ocorrem problemas de concordância entre osdados de homologia de DNA e os de seqüenciamento do 16S RNAr,havendo casos de muito baixa homologia de DNA dentro da mesmaespécie (MARTÍNEZ-ROMERO, 1994). A explicação dada pelos autoresé de que a hibridização do DNA envolve também o DNA presente emplasmídeos, que, no caso de algumas espécies de rizóbio, poderepresentar até 45% do genoma. Em virtude do caráter de replicaçãoautônoma e do alto grau de mobilidade entre estirpes e espéciesrelacionadas, essa forma de DNA extracromossomal provavelmentesofre mudanças muito mais rápidas do que o restante do genoma,contribuindo para a alta variabilidade dentro da família Rhizobiaceae,contrariando os resultados de similaridade baseados em outros critérios(MARTÍNEZ-ROMERO, 1994).

Os estudos de homologia do DNA, no consenso das diversasdiscussões levantadas pelos diferentes taxonomistas, com todas as suasrestrições metodológicas e dependência de uma série de parâmetrosfísico-químicos (VANDAMME et al., 1996), ainda são considerados osmétodos mais apropriados no delineamento de espécies e medidas derelações interespecíficas, apesar do desenvolvimento dos métodosmoleculares atuais. Em razão das restrições levantadas, o seqüenciamento

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32291

292 Capítulo 11

do 16S RNAr ainda não se constitui num substituto à altura, embora sejaum auxiliar importante e cada vez mais utilizado pela sua rapidez ereprodutibilidade.

Polimorfismo nos fragmentosde restrição do DNA (RFLP)

A análise do DNA cromossomal de dois ou mais organismos apóso corte com diferentes enzimas de restrição pode gerar um padrão depolimorfismo entre esses fragmentos, metodologia denominada RFLP.Essa técnica tem sido amplamente utilizada em estudos de diversidade,e o polimorfismo pode ser evidenciado por hibridização dessesfragmentos com seqüências homólogas de DNA marcadas (sondas) comradioatividade ou com compostos que desencadeiam reações deluminescência ou coloração. Em rizóbio, sondas baseadas em diferentesgenes, tanto ligados a características simbióticas (nod, fix) ou nãosimbióticas (operons do RNAr e outras), têm sido utilizadas para detectarpolimorfismos, utilizando diferentes metodologias de marcação edetecção. Essas metodologias combinadas têm sido amplamenteaplicadas para a caracterização da diversidade entre diferentes populaçõesde rizóbio (YOUNG; WEXLER, 1988; KAIJALAINEN; LINDSTRÖM,1989; EARDLY et al., 1990; DEMEZAS et al., 1991; LAGUERRE et al.,1992; THOMAS et al., 1994; URTZ; ELKAN, 1996; PAFFETTI et al., 1996).É uma metodologia relativamente trabalhosa, exigindo controle nasdiversas etapas de preparo do DNA, hibridização e detecção das bandaspolimórficas. Além disso, as enzimas de restrição são reagentes caros,sendo o método pouco adequado aos estudos de diversidade, excetocom fins taxonômicos, como método de referência para validar as demaismetodologias, uma vez que reflete a variabilidade do genoma total.

A técnica pode ser também utilizada para evidenciar polimorfismosresultantes do corte do DNA genômico com enzimas de restrição decorte raro (6 a 8 pb). Nesse caso, em virtude da geração de fragmentosgrandes de DNA, entre Kpb e Mpb, a separação em gel só é possívelpelo uso da técnica de eletroforese em campo de pulso elétrico alternado(pulsed-field electrophoresis) (CORICH et al., 1991; SOBRAL et al., 1991;HAUKKA; LINDSTRÖM, 1994).

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32292


Estudos baseados no DNA ribossomal

Os ribossomos procarióticos são formados por três moléculas deRNA de diferentes tamanhos (5S, 16S e 23S) e encontram-se associadosa cerca de 50 proteínas ribossomais. A molécula do 16S RNAr contémcerca de 1.540 resíduos de ribonucleotídeos e forma, juntamente comaproximadamente 20 proteínas, a subunidade menor, 30S (SSU); amolécula do 23S RNAr (em média 2.450 resíduos de ribonucleotídeos),juntamente com a do 5S RNAr (120 ribonucleotídeos) e aproximadamente20 proteínas, forma a subunidade maior, 50S. Essas duas subunidadesjuntas formam o ribossomo 70S funcional, que catalisa a síntese protéica.Os genes que codificam para o RNAr (operons do RNAr - rrn) tem sidoextensivamente estudados em muitas espécies bacterianas, e o númerode operons varia de uma (em micoplasmas) a doze cópias (em bacilos)por cromossomo (ROSADO et al., 1997). Em rizóbio, uma a três cópiastem sido detectadas: uma em B. japonicum e em R. tropici, três em S.meliloti, R. galegae, R. leguminosarum e R. etli (HAUKKA, 1997). Assimcomo outros genes que ocorrem em múltiplas cópias no genoma, osgenes ribossomais estão sujeitos a um processo de homogeneização, oque significa que todas as cópias tendem a ser similares umas às outras.No entanto, recentes estudos têm detectado que pequenas variaçõespodem existir entre as cópias desses genes, sendo relatada a presençade variações alélicas, ou micro-heterogeneidade, entre os genes do16S de várias espécies bacterianas, inclusive rizóbio (HAUKKA et al.,1996). Nesse caso, mais uma vez fica o questionamento sobre o usodos dados de seqüenciamento do 16S RNAr como parâmetro paraseparação de espécies muito proximamente relacionadas. Nesse limite,a quantidade de seqüências úteis diminui, e a ocorrência de transferênciahorizontal e recombinação genética entre essas cópias heterogêneasinterferem no padrão filogenético (HAUKKA et al., 1996).

Vale a pena ressaltar a sugestão colocada por Vandamme &Ludwig (1994), citados por Vandamme et al. (1996), de se escolher gruposde isolados semelhantes e não apenas a estirpe referência, nos estudosfilogenéticos, de modo a obter árvores filogenéticas mais confiáveis.Os autores destacam que é importante não restringir a análise aos táxons

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32293

294 Capítulo 11

mais proximamente relacionados, mas incluir grupos de organismosaparentemente não relacionados. Esses procedimentos diminuem oefeito de pequenas diferenças características da estirpe e não daespécie.

As moléculas das diferentes espécies de RNAr são particularmenteimportantes nos estudos de ecologia microbiana, sendo consideradascronômetros moleculares nos estudos de evolução, por preencheremtodos os requisitos que definem um marcador filogenético (ROSADOet al., 1997):

• Os RNArs estão presentes e têm a mesma função em todos osmicrorganismos.

• Eles se originaram de um ancestral comum, portanto sãohomólogos.

• Suas seqüências de nucleotídeos são altamente conservadasem algumas regiões, porém possuem regiões altamentevariáveis.

• As moléculas do 16S e 23S RNAr são relativamente grandes econtêm suficientes seqüências informativas para permitircomparações estatisticamente significativas.

• A estrutura primária dessas moléculas possui sítios de evoluçãoindependente, conseqüentemente contém suficiente regiõesvariáveis para permitir a discriminação entre diferentesmoléculas.

• Um grande número de seqüências está disponível via base dedados pela internet, permitindo o alinhamento de seqüências ea identificação das regiões distintas.

O fato de essas moléculas possuírem sítios de rápida e outros delenta evolução permite que se avalie as relações filogenéticas tantoentre organismos muito proximamente relacionados quanto entre osfilogeneticamente muito distantes.

A caracterização da seqüência do 16S RNAr tem sido amplamenteutilizada em estudos evolucionários, taxonômicos e ecológicos, nãoapenas para definir taxas mas também para detectar quais taxas estãopresentes (FOX et al., 1992; OLSEN et al., 1994). A amplificação direta

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32294


via PCR do 16s RNAr, a partir de amostras de solo, tornou possível oestudo da diversidade microbiana sem a necessidade de cultivar omicrorganismo (WARD et al., 1990). Comparações entre as seqüênciasde nucleotídeos completas ou parciais do 16S RNAr têm sido amplamenteutilizadas para avaliar relações filogenéticas entre muitas espécies deRhizobium (JARVIS et al., 1992; LAGUERRE et al., 1993; LUCAS et al.,1995; BERKUM et al., 1996; BARRERA et al., 1997).

As moléculas do 23S RNAr são bem maiores do que as do 16SRNAr, contendo mais informação genética que podem ser muito úteisem estudos filogenéticos (LUDWIG et al., 1992). No entanto, o bancode dados de seqüenciamento do 23S ainda é restrito, dificultando acomparação de novas seqüências. Tesfaye et al. (1997) amplificarampor PCR uma região hipervariável do 23S DNAr de Rhizobium edeterminaram as relações filogenéticas entre várias estirpes por meioda comparação entre suas seqüências de nucleotídeos. As variaçõesnas seqüências do 23S DNAr estudadas foram consistentes com asrelações filogenéticas determinadas pela especificidade na nodulaçãode diferentes hospedeiras e/ou análise das seqüências do 16S DNAr.Nesse estudo, os autores distinguiram entre estirpes de Rhizobium,Agrobacterium e Bradyrhizobium, e os táxons representados por R.leguminosarum bv. trifolii, R. meliloti e R. etli foram claramente maisrelacionados uns aos outros do que às estirpes de B. japonicum, consis-tente com a teoria de origem evolucionária distinta ou divergênciaancestral desses dois gêneros (SPRENT, 1994). Além disso, pela análiseda estrutura secundária da molécula do 23S DNAr, os autores detectaramseqüências variáveis nas regiões chamadas de D (hélices 55-59,numeração em E. coli) e E (hélice 63), as quais podem servir paradiferenciar espécies particulares e/ou estirpes por apresentaremcaracterísticas discriminatórias inclusive no âmbito de estirpes. Sondasespecíficas para essas regiões podem ser desenhadas e usadas comoferramenta para análise de populações de Rhizobium no campo.

A estrutura primária da molécula do 16S RNAr é altamente con-servada, e espécies que possuem 70% ou mais de homologia do DNAusualmente possuem mais de 97% de identidade em suas seqüências.Essa diferença de 3% ou 45 nucleotídeos não está distribuída ao acasoao longo da estrutura primária da molécula, mas está concentrada

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32295

296 Capítulo 11

principalmente nas chamadas regiões hipervariáveis (STACKEBRANDT;GOEBEL, 1994). Alguns autores defendem o estudo das diferenças emsimilaridade apenas nessas regiões como medida da distânciafilogenética entre estirpes. No entanto, há vários argumentos contráriosa essa escolha, uma vez que a quantidade de nucleotídeos diferentes,não concentrados nessas regiões, é substancial (STACKEBRANDT et al.,1992) e, por omissão, poderiam perder-se informações que, em termosestatísticos, já são bastante escassas. Em segundo lugar, as regiõeshipervariáveis são específicas de cada táxon, e precisam serdeterminadas para cada novo organismo pelo seqüenciamentocompleto da molécula. A análise de seqüências muito curtas tem umainfluência negativa na estabilidade da árvore filogenética, mas, se,em razão de alguma limitação, o número de nucleotídeos a seranalisado tiver que ser reduzido a algumas centenas, deve-se tomarmuito cuidado ao escolher a região a ser analisada, de modo a obter omesmo grau de similaridade dado pelo completo seqüenciamento damolécula. Stackebrandt & Goebel (1994) mostram uma tabela ondeos valores de similaridade obtidos em determinadas seqüências podemapresentar até dez pontos percentuais de diferença em relação aograu de similaridade obtido pelo seqüenciamento total. No entanto, aseleção prévia criteriosa de seqüências menores adequadas facilita otrabalho de seqüenciamento, e, em rizóbio, uma região de 260 pb do16S DNAr, amplificada pelos primers Y1 e Y2 (YOUNG et al., 1991),tem sido bastante útil nos trabalhos de diversidade (OYAIZU et al.,1993; HAUKKA et al., 1996), por conter uma parte relativamentevariável da molécula, com alta densidade de informações. O uso dessaregião amplificada nos trabalhos de seqüenciamento permitiu determinarcom um bom nível de precisão as relações filogenéticas entre asdiferentes espécies (EARDLY et al., 1992; JARVIS et al., 1992, LAGUERREet al., 1993; Lucas et al., 1995). No entanto, em R. galegae, diferentesposições filogenéticas foram obtidas com as seqüências parciais oucom a seqüência total do 16S RNAr (NOUR et al., 1994; WILLEMS;COLLINS, 1993). Essa inconsistência pode ser atribuída à naturezaaltamente conservada das seqüências da subunidade menor aliada aeventos de recombinação entre genes divergentes, uma vez que essaespécie possui três cópias desse gene (EARDLY et al., 1996).

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32296


Os genes ribossomais de algumas espécies ou estirpes contêm oschamados elementos de inserção (intervening sequence – IVS),principalmente nos genes que codificam para o 23S RNAr, sendo aocorrência desses IVS restritos a determinadas regiões dessa molécula(HAUKKA, 1997). A presença de duas IVS (IVS I e IVS II) foi detectadaem rizóbio, e a possibilidade de utilização destas seqüências em estudosecológicos, por meio do desenho de primers específicos, é bastantepromissora (SELENSKA-POBELL; EVGUENIEVA-HACKENBERG, 1995;SELENSKA-POBELL et al., 1997). Uma seqüência de inserção de 72nucleotídeos foi encontrada pela primeira vez nos genes do 16S RNArem R. tropici (WILLEMS; COLLINS, 1993). A diferença no tamanho dogene provocada por essa inserção serve para o reconhecimento deestirpes diferentes após a amplificação por PCR da região que a contéme análise em gel de agarose (LINTON et al., 1994).

Young & Haukka (1996) destacam diversas limitações no uso dasubunidade menor do RNAr (SSU RNAr) em estudos filogenéticos etaxonômicos. A primeira delas seria a ocorrência de recombinação dosgenes ribossomais entre espécies diferentes, o que afeta uma dascondições necessárias para o estabelecimento de filogenias, que é ainexistência de transferência genética interespecífica nessa região,garantindo a evolução independente das diferentes linhagens. Outrotipo de recombinação, entre os genes do 16S RNAr e outros genes, foiverificada em Rhizobium leguminosarum e R. etli por Eardly et al. (1995),em que diferenças significativas no seqüenciamento da molécula do 16SDNAr não refletem necessariamente grandes divergências no genomatotal, avaliado por análise de isoenzimas (MLEE – multilocus enzymeeletrophoresis). Como o 16S RNAr é uma molécula altamenteconservada, não é útil para discriminar espécies muito proximamenterelacionadas, onde pode haver uma identidade de seqüências, espe-cialmente no seqüenciamento parcial. Os autores destacam ainda oproblema da heterogeneidade nas seqüências entre espécies e mesmodentro de uma mesma espécie. Isso tem se tornado cada vez maisevidente à medida que outros isolados além das estirpes-padrão vãosendo seqüenciados, ou mesmo vários isolados de uma mesma estirpe.Finalmente, um problema técnico foi verificado no uso dessa metodo-logia, que é a detecção de alguns erros em seqüências presentes nabase de dados do EMBL, provocados por uma série de fatores listadospor Vandamme et al. (1996).

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32297

298 Capítulo 11

Apesar de todas essas limitações, o desenvolvimento dos métodosrápidos de PCR e de seqüenciamento tem consolidado o papel dosgenes ribossomais na filogenia bacteriana. Os genes que codificampara o 16S RNAr são os mais populares nesses estudos, em virtude deseu tamanho adequado para as análises de seqüenciamento. Alémdisso, há um extensivo banco de dados disponível para comparaçõesusando a molécula do 16S, o que não ocorre para a 23S. SegundoYoung & Haukka (1996), as filogenias baseadas no 16S RNAr são, demodo geral, corretas, embora não em todos os detalhes. Muitostrabalhos têm mostrado a utilidade das informações provenientes doseqüenciamento do RNA, além dos estudos filogenéticos (YOUNGet al., 1991; EARDLY et al., 1992; LAGUERRE et al., 1993; SEGOVIAet al., 1993; WILLEMS; COLLINS, 1993), no desenho de sondas eprimers que podem ser específicos no âmbito de gênero, espécie oumesmo estirpe (LUDWIG; SCLEIFER, 1994; TESFAYE et al., 1997).Mesmo se consideradas as limitações, essa metodologia, de modogeral, confirma os resultados obtidos por uma série de outrasabordagens para um grande número de estirpes (VANDAMME et al.,1996), e seu valor parece inquestionável para a taxonomia polifásica.

Reação de polimerase em cadeia

Um parêntesis é apropriado para enfatizar a importância datecnologia da reação da polimerase em cadeia (Polymerase ChainReaction – PCR) nos diferentes estudos de ecologia e sistemáticabacteriana. Poucas tecnologias nos últimos anos provocaram um impactotão profundo na biotecnologia quanto a PCR, inicialmente descrita porMullis & Faloona (1987). A técnica de PCR baseia-se na repetição cíclicada extensão enzimática de novas fitas de DNA a partir de primers(iniciadores). Esses primers, pequenas seqüências de oligonucleotídeos,anelam-se em dois extremos opostos de cada uma das fitas de DNAque servem como moldes e a amplificação envolve repetições cíclicasde altas temperaturas necessárias para a desnaturação do DNA(usualmente 94oC); seguidas de uma temperatura mais baixa quepossibilite o anelamento dos primers (entre 37°C e 60°C) e uma

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32298


temperatura intermediária, adequada para que ocorra a reação dapolimerase termoestável, permitindo a extensão e cópia de ambas asfitas do DNA a partir do ponto de anelamento dos primers. Essa técnica,resumidamente, resulta na amplificação enzimática in vitro de umaseqüência-alvo de DNA.

A relativa simplicidade dessa tecnologia mudou radicalmente aforma de se fazer genética e biologia molecular comparada com algunsanos atrás. O próprio autor da metodologia, ao descrever o processo desua invenção, espanta-se de o método não ter sido anteriormentedescoberto, mesmo cerca de 15 anos depois de todos os elementosnecessários para sua implementação (Taq DNA polimerase, dNTP’s,etc.) estarem disponíveis (MULLIS, 1990). O impacto do PCR é fácil decompreender, uma vez que a técnica se aplica a um dos problemasfundamentais em biotecnologia que é a busca de seqüências gênicasde interesse. Ao se procurar uma simples seqüência gênica de, digamos,mil nucleotídeos entre cerca de cem mil genes em um genoma deaproximadamente 3 bilhões de nucleotídeos, mesmo uma quantidadeem torno de 3 mg de DNA poderá conter apenas uma cópia dessaseqüência ou gene. Ou seja, ela estará altamente diluída e misturadacom um grande número de moléculas com propriedades físico-químicassemelhantes, o que torna virtualmente impossível a obtenção de grandesquantidades dessa molécula-alvo, purificada pelos procedimentospadrões de separação. Antes do advento do PCR, a clonagem molecularera a única alternativa para superar essas dificuldades. Esse procedi-mento requer a construção de vetores e sondas por uma série de etapasdemoradas, incluindo a restrição do DNA, ligação a vetores, transfor-mação bacteriana, cultivo e plaqueamento seguido de detecção dosclones, usualmente por meio de sondas, isso sem citar as etapas desubclonagem, etc. Com o PCR, após cerca de 30 ciclos de amplificaçãoe menos de 2 horas, a quantidade de DNA-alvo é aumentada exponen-cialmente, e, após a separação dos produtos por eletroforese em gel deagarose e coloração adequada, estes podem ser visualizados a olhonu. Pode-se então proceder a diversos tipos de manipulação desse DNA,dependendo do tipo de problema a ser resolvido, tendo sido já ressaltadasua importância nos estudos de seqüenciamento, os quais antigamentedependiam dessas trabalhosas etapas de clonagem. Felice & Alshinawi(1996) apresentam uma descrição simplificada dos princípios,

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32299

300 Capítulo 11

componentes e aplicações dessa tecnologia, e mais detalhes podemser encontrados em diversos livros como o de Innis et al. (1990).

Em estudos de diversidade de microganismos, a técnica de PCRé utilizada em várias metodologias, como a análise de restrição doDNA ribossômico amplificado (Amplified Ribossomal DNA RestrictionAnalysis – Ardra), polimorfismo das seqüências intergênicas (intergenesequences – IGS) do DNA ribossômico, Denaturing Gradient GelElectrophoreis – DGGE –, Temperature Gradient Gel Electrophoresis –TGGE –, Single-Strand-Conformation Polymorphism – PCR-SSCP –,PCR de seqüências repetitivas de DNA (rep-PCR usando primers REP,ERIC ou BOX), PCR com primers randômicos (RAPD, AP-PCR) e AmplifiedFragment Lengh Polymorphism – AFLP. Algumas dessas técnicas serãodescritas a seguir conforme sua importância nos estudos de diversidadede rizóbio.

Técnicas de fingerprinting do DNA baseadas em PCR

A mais divulgada delas é uma técnica que consiste na amplificaçãodo DNA utilizando primers randômicos Random Amplified PolymorphicDNA – RAPD-PCR. Essa técnica envolve o uso de um primer geral-mente composto de 10 nucleotídeos, sob baixa temperatura deanelamento (36oC). Os produtos são separados e detectados combrometo de etídio em um gel de agarose (WILLIAMS et al., 1990). Essecomposto se intercala entre as bases do DNA, emitindo fluorescênciasob luz ultravioleta. Um outra técnica, que envolve o uso de primersmais longos, de 20 a 34 nucleotídeos de comprimento em reações deanelamento a baixa temperatura, seguidas de reações a altas temperaturasde anelamento (60oC), é denominada de Arbitrarly Primed PolymeraseChain Reaction – AP-PCR. Os produtos do AP-PCR são marcados comµ32P nos últimos ciclos de reação, submetidos a eletroforese evisualizados por auto-radiografia (WELSH; MCCLELLAND, 1990).Essas técnicas envolvem a amplificação de regiões desconhecidas doDNA genômico com primers arbitrariamente construídos, produzindopadrões complexos de bandas que “identificam” o organismo. Essesestudos não requerem que se conheça previamente as seqüências doorganismo a ser estudado. Em rizóbio, essas técnicas foram utilizadas

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32300


nos estudos de diversidade por Harrison et al. (1992); Kay et al. (1994);Leung et al. (1994); Vanrossum et al. (1995); Richardson et al. (1995),Selenska-Pobell et al. (1996); Paffetti et al. (1996); Sá et al. (1997).Harrison et (1992) foram os primeiros a utilizarem o método de RAPDpara caracterizar estirpes de R. leguminosarum. Esses autores testaram21 primers buscando discriminar diferentes isolados dessa espécie,sendo um deles (SPH1) suficiente para discriminar 11 entre 12 isolados.Esse primer foi posteriormente utilizado para caracterização de estirpesde Bradyrhizobium (VANROSSUM et al., 1995). Há uma boa correlaçãoentre os dados de relacionamento genético obtidos entre diferentesestirpes por MLEE e por RAPD (LEUNG et al., 1994). A análise combinadade seqüências de RNAr amplificadas por PCR e digeridas a seguir comenzimas de restrição de corte freqüente (sítios de 4 pb), gerando padrõesde RFLPs, tem sido extensivamente utilizada nos estudos de diversidadede rizóbio, metodologia que passou a ser denominada análise derestrição do DNA ribossomal amplificado (Ardra). Essa técnica foiinicialmente utilizada por Laguerre et al. (1994) e a topologia das árvoresfilogenéticas obtidas por mapeamento dos sítios de restrição e poralinhamento de seqüências apresentam-se muito bem relacionadas,mostrando que o método é uma ferramenta poderosa para a estimativarápida de relações filogenéticas (LINDSTRÖM et al., 1998). Essa metodologiafoi aprimorada por meio da construção de uma base de dados de sítiosde restrição nos genes que codificam para o DNAr 16S na famíliaRhizobiaceae (LAGUERRE et al., 1997). A análise dos mapas dos sítiosde restrição (MRSP) do RNAr 16S é mais confiável porque elimina oproblema do aparecimento de fragmentos de restrição de tamanhosimilar, mas que correspondem a diferentes sítios de restrição. Vinuesaet al. (1998) utilizou essa metodologia para a caracterização de isoladosde Bradyrhizobium que nodulam diversas leguminosas arbóreas.

Uma modificação dessa técnica consiste na análise da região daseqüência intergênica (IGS) do operon DNAr 16S-23S. Essa região foiamplificada em rizóbio, utilizando primers específicos que flanqueiam essaregião, gerando um fragmento de cerca de 1.350 pb, digerido a seguircom enzimas de restrição (NOUR et al., 1994; PAFFETTI et al., 1996).Jensen et al. (1993) estudaram, por meio dessa metologia, cerca de 300estirpes pertencentes a diferentes gêneros de bactérias, concluindo que,dependendo do nível de variabilidade da espécie, os resultados obtidos

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32301

302 Capítulo 11

pela análise de restrição da IGS não são suficientes para discriminaçãointra-específica. Os resultados obtidos por Paffetti et al. (1996), em umapopulação de 96 isolados de R. meliloti, também revelaram um baixonível de polimorfismo, havendo um elevado grau de homogeneidadeno tamanho das bandas amplificadas, tendo sido detectados três padrõesdistintos de restrição do IGS. Já Vinuesa et al. (1998), num estudoenvolvendo nove isolados de leguminosas arbóreas e diversas estirpesde referência, observaram que a análise de agrupamento dos padrõesde RFLP obtidos da IGS com três enzimas de restrição revelaram seisagrupamentos distintos, enquanto por Ardra com quatro enzimas apenastrês haviam sido detectados. Nesse estudo, os autores procederam auma análise conjunta dos dados provenientes da análise de restriçãoda IGS e do DNAr 16S, uma vez que essas se constituem em regiõesgenômicas contíguas. A partir dessa análise, foi possível obter umagrupamento de consenso, dividindo as estirpes nos mesmos seisgenótipos distintos definidos pela análise do IGS, mas em concordânciacom os resultados de Ardra.

A presença de seqüências repetitivas (rep-elements) no genomabacteriano tem sido estudada e utilizada para caracterização genotípica.Foram desenvolvidos primers para amplificação de três famílias doschamados elementos repetitivos, resultando nas técnicas de REP-PCR(repetitive extragenic palindromic sequences – PCR), ERIC-PCR(enterobacterial repetitive intergenic consensus – PCR) e BOX-PCR(VERSALOVIC et al., 1994). Essas seqüências correspondem a 35-40 pbpara REP; 124-127 pb para a ERIC e 154 pb no elemento BOX, o qualconsiste de três subunidades (boxA, boxB e boxC). Quando um desseselementos repetitivos é detectado dentro de uma distância amplificáveldurante a reação de polimerase em cadeia, um produto de PCR detamanho característico é gerado, de modo que o genoma pode gerarum padrão do tipo impressão digital (fingerprinting) em um gel. Maioresdetalhes sobre a metodologia e as referências originais podem serencontrados em Versalovic et al. (1994). O método é uma poderosaferramenta para estudar a diversidade genética intra-específica e noâmbito de estirpe, fornecendo uma informação complementar àcaracterização prévia por outras metodologias. A análise da impressãodigital gerada a partir de genomas distintos tem sido usada para separaçãode estirpes muito proximamente relacionadas de B. japonicum (JUDD

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32302


et al., 1993; VINUESA et al., 1998), R. tropici (BERKUM et al., 1994),R. leguminosarum bv., trifolii (LEUNG et al., 1994), R. galegae (SELENSKA-POBELL et al., 1995) e R. meliloti (ROSSBACH et al., 1995). Essasmetodologias foram utilizadas por Laguerre et al. (1997) para detectarum maior nível de polimorfismo entre tipos genômicos separados pelaanálise de restrição do DNAr 16S. Nesse trabalho, 44 isolados de rizóbiode Astragalus, Oxytropis e Onobrychis analisados foram distribuídos em14 tipos baseados na análise de restrição do RNAr 16S e em 34 gruposREP, utilizando primers para REP e ERIC, confirmando sua altacapacidade para detectar heterogeneidade genética.

Os padrões específicos obtidos para cada estirpe podem serarmazenados em uma base de dados e analisados usando-se programasespecíficos para comparação, tais como Gelcompar (SCHENEIDER &BRUIJN, 1996) ou Pro-Score (DNA Proscan, Inc., Nashville, Tenn.).Niemann et al. (1997), num estudo comparativo do poder de resoluçãodos métodos de RAPD e ERIC para discriminar isolados de R. meliloti,procederam à análise dessas impressões digitais (fingerprints) geradaspelas diferentes estirpes por meio do uso de primers marcados em umseqüenciador automatizado a laser fluorescente (ALF-DNA sequencer).Segundo os autores, não houve influência do uso de primers marcadoscom fluoresceína nas reações de RAPD ou ERIC, permitindo o arquivoe processamento “on-line” dos padrões de PCR gerados. A automaçãodessas técnicas representou um avanço na geração de dados. Alémdisso, a reproducibilidade dos padrões obtidos por esta estratégia,que antes era uma limitação da técnica, foi sensivelmente aumentada.Os resultados desse teste comparativo indicaram que, embora ambosos métodos sejam adequados para revelar o relacionamento genéticoentre estirpes proximamente relacionadas, a técnica de RAPD-PCR élevemente mais discriminatória do que a de ERIC-PCR. Isso pode serexplicado pelas menores chances de que os primers arbitrários deRAPD liguem-se aos elementos repetitivos das diferentes estirpes.Como desvantagem, o método de RAPD exige o teste com um grandenúmero de primers para gerar o nível de polimorfismo necessário demodo a obter um alto poder discriminatório, ou seja, é mais laboriosoque ERIC-PCR. No entanto, o maior poder de resolução do RAPD foidado pelos padrões de RFLP gerados após a hibridização do DNAcom uma sonda contendo uma seqüência de inserção (IS), o qual foi

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32303

304 Capítulo 11

utilizado como um método de referência para fins comparativos, apesarde pouco adequado à análise de grande número de isolados.

Outras técnicas têm sido publicadas utilizando a técnica de PCRna detecção e identificação de estirpes de rizóbio. Hartmann et al.(1996) descrevem uma metodologia baseada na amplificação específicada seqüência RSa, estruturalmente semelhante à seqüência de inserção(IS). Essa seqüência, que ocorre em múltiplas cópias no genoma, consistede um fragmento de DNA de 1,195 Kpb, originalmente isolado de B.japonicum (HAHN; HENNECKE, 1987). O número de cópias dessaseqüência em alguns isolados de B. japonicum pode ser extremamenteelevado, variando de 86 a 175, e esses isolados não apresentaramdiferenças em suas propriedades simbióticas, embora apresentemcrescimento mais lento (MINASAWA et al., 1998). A amplificação dessaseqüência foi utilizada para a identificação de estirpes de B. japonicume B. elkanii (HARTMANN et al, 1992; HARTMANN et al., 1996),mostrando alta especificidade para essas espécies quando testada emcomparação com 13 espécies de rizóbio e duas de Agrobacterium(HARTMANN et al., 1996). Primers específicos foram desenhados paraessa seqüência, podendo a análise de diversidade ser efetuada por meioda amplificação direta por PCR ou por hibridização de colônias comsondas de RSa (HARTMANN et al., 1996). Ambos os métodos se mostrarameficientes e podem ser utilizados por exemplo no controle de qualidadede inoculantes ou em estudos ecológicos, substituindo os métodossorológicos (HARTMANN et al., 1996).

Laguerre et al. (1996) compararam o poder de resolução elimitações de algumas técnicas de fingerprinting do DNA baseadas emPCR para caracterizar e classificar estirpes de diferentes biovares de R.leguminosarum. As técnicas utilizadas foram: RFLP da seqüênciaintergênica do DNAr amplificada por PCR Restriction IntergenicSequence Analysis – (Risa –, análise por PCR das seqüências repetitivas(REP-PCR) e RAPD. Estas foram comparadas com as técnicasconvencionais de análise de RFLP de DNA hibridizados com sondaspara regiões cromossômicas e de genes ligados a característicassimbióticas (nod e nif). Os métodos mais rápidos e com maior poderdiscriminatório foram os baseados em fingerprinting do DNA por meioda técnica de PCR. Esses refletiram a variabilidade genômica, mas nãoa variabilidade das regiões simbióticas nas espécies e biovares de

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32304


R. leguminosarum. Os padrões gerados pelos primers REP e RAPD,conforme já discutido, geram padrões complexos de bandas de intensi-dade variável, que dificultam a estimativa quantitativa do relacionamentogenético entre as diferentes estirpes. Além disso, são métodos que aindaapresentam baixa reprodutibilidade em diferentes condições laboratoriais,dificultando a comparação dos dados gerados por diferentes laboratórios.No entanto, apesar dessas limitações, esses métodos são simples e podemser um meio eficiente de proceder à caracterização de um grande númerode isolados em condições experimentais bem padronizadas. A análiseda região IGS mostrou um poder discriminatório suficiente para agruparestirpes geneticamente relacionadas com base num padrão simples,reproduzível e facilmente analisável de bandas de restrição. No entanto,limitações como variabilidade no tamanho dessa seqüência, tanto entreespécies como entre genótipos distintos, e a presença de vários genesde tRNA nessas regiões foram levantadas pelos autores. Conformedestacado, quando se considera outros gêneros de rizóbio, o poder dediscriminação intra-específica baseado em RFLP de seqüênciasintergênicas do DNAr pode ser extremamente baixo (JENSEN et al., 1993;PAFFETTI et al., 1996). Como conclusão, pelo menos paraR. leguminosarum e seus biovares, os autores consideram que os métodosavaliados mostraram um bom nível de concordância com os métodosde classificação genotípica convencionais baseados na análise derestrição do DNA, sendo uma alternativa conveniente e que apresentaa mesma faixa de resolução e a mesma possibilidade de caracterizar ogenoma total ou regiões específicas. Como são mais rápidos, eliminandoos procedimentos de extração e hibridização do DNA, tornam-se maisadequados para a identificação em larga escala de coleções bacterianase para o estudo de grandes populações no âmbito intra-específico.

Considerações finais

“Em bactérias, a reprodução e a troca de genes cromossomaisentre indivíduos proximamente relacionados são funções distintas eindependentes, não vinculadas em um único processo como nas plantase animais. Sendo assim, toda a reprodução em bactérias é assexual e

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32305

306 Capítulo 11

toda a troca gênica é devido a outros processos que não a recombinaçãorecíproca” (DYKHUIZEN; GREEN, 1991). A natureza clonal da estruturade populações em E. coli tornou-se um paradigma para todos as popu-lações bacterianas (GORDON et al., 1995). Há, portanto, um consensogeral de que não ocorre uma recombinação extensiva dentro docromossoma do Rhizobium; conseqüentemente, essas bactérias secomportariam como clones, apresentando ligação gênica entre osdiferentes marcadores moleculares (PIÑERO et al., 1988; SOUZA et al.,1992). Sendo assim, seria suficiente fazer um levantamento da ocorrênciade regiões gênicas específicas, características da espécie, para se teruma noção do genoma completo (MARTÍNEZ-ROMERO, 1994).No entanto, com o objetivo de avaliar a estrutura genética daspopulações de rizóbio, Gordon et al. (1995) analisaram dados MLEEem R. meliloti (Sinorhizobium meliloti) e em R. leguminosarum bv. viciaee outros dados de diversos autores, chegando à conclusão que oparadigma da estrutura clonal não é sempre verdadeiro em rizóbio.Em R. etli bv. phaseoli, Souza et al. (1994) encontraram valores baixosde desequilíbrio de ligação em três populações distintas, sugerindo apresença de forças evolucionárias que mantêm um número grande degenótipos recombinantes. Houve ainda distinção entre o nível dediversidade encontrado em populações de rizóbio associadas ao feijoeiroselvagem e às espécies cultivadas. A conclusão é que, dentro do gêneroRhizobium, espécies distintas possuem diferentes níveis derecombinação genética, de modo que algumas espécies ou biovarespodem possuir uma estrutura de populações pan-mítica, enquanto outrastêm estrutura aproximadamente clonal. Essas evidências sugerem quedeve ser tomado bastante cuidado na seleção dos marcadoresmoleculares a serem utilizados nos estudos populacionais em rizóbio.

O potencial de transferência lateral de genes ligados à especificidadehospedeira e à patogenicidade é outra consideração particularmenteimportante na classificação e análise filogenética de bactérias do soloassociadas a plantas. Por exemplo, em experimentos de hibridização,Courier e Nester (1976) encontraram que os padrões de homologia deplasmídeos ligados à indução de tumores em 15 estirpes de Agro-bacterium não estavam correlacionados com os seus padrões dehomologia do cromossomo. Em rizóbio, Kaijalainen & Lindström (1989)estudaram os padrões de RFLP para isolados de R. galegae, tentando

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32306


correlacionar a divergência taxonômica com o isolamento geográficodas estirpes. Essa espécie nodula duas espécies de leguminosas, Galegaofficinalis e Galega orientalis. Quando foram utilizadas sondas obtidasa partir de genes associados com os atributos específicos da fixação denitrogênio (genes nod, comuns da nodulação, e nif, fixação denitrogênio), os padrões de restrição mostraram alta especificidadehospedeira e pouca correlação geográfica. No entanto, quando os RFLPseram comparados utilizando sondas não associadas a esses atributos,muitos agrupamentos de isolados distintos foram obtidos. Neste caso,quatro estirpes isoladas de G. officinalis foram mais relacionadas aosisolados de G. orientalis.

Como os genes ligados aos atributos de fixação de nitrogênio emRhizobium estão codificados em plasmídeos, os chamados plasmídeossimbióticos, transmissíveis entre as diferentes espécies (YOUNG;WEXLER, 1988; GENIAUX; AMARGER, 1993), essa troca genéticamascara os dados de similaridade, que podem ser distintos no âmbitode genes não envolvidos na simbiose (LAGUERRE et al., 1992). Nestecaso, a falta de correlação geográfica dos padrões de RFLP observadosé aparentemente uma conseqüência direta da transferência deseqüências simbióticas entre duas populações geograficamente distintasde bactérias. O mesmo parece ter ocorrido no caso de R. etli eR. leguminosarum (SEGOVIA et al., 1993). Em estudos anteriores,baseados na análise de MLEE de R. leguminosarum bv. phaseoli, Piñeroet al. (1988) chegaram à conclusão de que esse biovar, definido emfunção da especificiade hospedeira, é um conjunto de estirpes polifilé-ticas, geneticamente heterogêneas, chegando a compor 11 espéciesevolucionárias. Torna-se evidente, diante desses estudos, que os trabalhosessencialmente baseados em características fenotípicas codificadas porplasmídeos resultam em esquemas de classificação artificiais. Conseqüen-temente, os autores sugerem que uma classificação mais adequada deRhizobium spp. deve ser baseada na variação alélica dos genescromossomais mais do que em características simbióticas codificadaspor plasmídeos, evidência levantada também por Eardly et al. (1990)estudando a estrutura genética de populações de R. meliloti (S. meliloti).

Parece grande a complexidade dos relacionamentos entre asdiferentes espécies quando se consideram características codificadas

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32307

308 Capítulo 11

por plasmídeos em comparação com os dados de seqüenciamento do16S RNAr. Haukka et al. (1998) estudaram a diversidade e filogenia dosgenes nodA e nifH em 52 isolados de rizóbio de Acacia senegal e Prosopischilensis. Esses isolados, procedentes de duas origens distintas, África eAmérica Latina, possuíam círculo de hospedeiros similar e estavamclassificados como pertencentes aos gêneros Sinorhizobium eMesorhizobium por meio da análise das seqüências do RNAr 16S. Nesseestudo, de acordo com os diferentes níveis hierárquicos, fatores distintosinfluenciaram a evolução dos genes ligados a características simbióticasem comparação com a filogenia determinada pelo RNAr 16S. Apenasno mais alto nível hierárquico analisado as filogenias dos genes nifH edo RNAr 16S mostraram-se similares, por exemplo, as seqüências nifHentre as espécies da subdivisão gama e alfa de Proteobacteria mostraram-se bastante distintas. Os padrões de restrição dos genes simbióticosdividiram as estirpes em três grupos distintos: sinorrizóbio de origemafricana, sinorrizóbio de origem latina e um último grupo envolvendoos mesorrizóbios de ambas origens. Dentro de um grande grupo desinorrizóbio de origem africana, tipos semelhantes de genes simbióticosforam encontrados em diferentes espécies, sugerindo a transferênciagenética desses genes por meio dos limites espécie-específicos. Noúltimo nível hierárquico analisado, as estirpes, várias combinações entreos tipos nod e nif foram encontradas em diferentes backgrounds de RNAr16S.

A questão dos plasmídeos simbióticos tem um papel crítico naevolução das populações de Rhizobium, os quais tem uma históriaevolucionária diferente da história evolucionária das estirpes que oscontém (YOUNG; HAUKKA, 1996).

Na falta de métodos para determinar rapidamente o relaciona-mento genético entre um grande número de estirpes, as espécies deRhizobium e de outras bactérias do solo associadas a plantas (p. ex.Agrobacterium, Bradyrhizobium, Corynebacterium, Erwinia, Pseudo-monas e Xanthomonas) têm sido tradicionalmente definidas com baseem características fenotípicas, tais com círculo de hospedeiras, morfo-logia de colônias, crescimento em meios seletivos e várias propriedadesmetabólicas (JORDAN, 1984; SCHAAD, 1980). Embora há muito tempojá se saiba que características fenotípicas, particularmente as de círculo

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32308


de hospedeiros, não se constituem em uma base confiável para oestabelecimento de filogenias (WILSON, 1944), seu contínuo uso emsistemática se justifica com base na sua conveniência e significânciaagronômica. Com o desenvolvimento de métodos moleculares para adeterminação de genótipos cromossomais em bactérias, tornou-sepossível estimar o relacionamento filogenético entre estirpes. Métodostão diversos quanto o seqüenciamento de nucleotídeos dos genesribossomais (WOESE, 1987) ou a detecção eletroforética do polimorfismode isoenzimas, MLEE (SELANDER et al., 1986), indicam que as filogeniasbaseadas em características fenotípicas às vezes apresentam concordânciacom as filogenias baseadas em dados genotípicos, mas freqüentementepodem mostrar profundas inconsistências (FOX et al., 1980).

Para finalizar, vale a pena destacar o potencial de uma ferramentavaliosa, de fácil acesso aos pesquisadores dos países subdesenvolvidos,que consiste na ampla base de dados atualmente disponível na redemundial de computadores para o estudo de sistemática bacteriana,inclusive com a disponibilização de programas de domínio público paraa análise dos dados. Informações relevantes para a comparação deseqüências, padrões eletroforéticos de proteínas e DNA estão disponíveisem rede, facilitando o intercâmbio de informações e promovendo odesenvolvimento de projetos cooperativos. Canhos et al. (1993, 1996)apresentam uma visão geral dessas ferramentas, com exemplos deprogramas e base de dados com os respectivos mecanismos decomunicação para o acesso a esses importantes recursos.

Referências

BARRERA, L. L.; TRUJILLO, M. E.; GOODFELLOW, M.; GARCÍA, F. J.;HERNÁNDEZ-LUCAS, I.; DÁVILA, G.; BERKUM, P. van; MARTÍNEZ-ROMERO, E. Biodiversity of bradyrhizobia nodulating Lupinus spp.International Journal of Systematic Bacteriology, Washington, v. 47,p. 1086-1091, 1997.

BERKUM, P. van; BEYENE, D.; EARDLY, B. D. Phylogenetic relationshipsamong Rhizobium species nodulating the common bean (Phaseolus

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32309

310 Capítulo 11

vulgaris L.). International Journal of Systematic Bacteriology, Washington,v. 46, p. 240-244, 1996.

BERKUM, P. van; NAVARRO, R. B.; VARGAS, A. A. T. Classification ofthe uptake hydrogenase-positive (Hup+) bean rhizobia as Rhizobiumtropici. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 60,p. 554-561, 1994.

BULL, A. T.; GOODFELLOW, M.; SLATER, J. H. Biodiversity as a sourceof innovation in biotechnology. Annual Review of Microbiology, PaloAlto, v. 46, p. 219-252, 1992.

CANHOS, V. P.; MANFIO, G. P.; BLAINE, L. D. Software tools anddatabases for bacterial systematics and their dissemination via globalnetworks. Antonie van Leeuwenhoek, Delft, v. 64, p. 205-229, 1993.

CANHOS, V. P.; MANFIO, G. P.; CANHOS, D. A. L. Networking themicrobial diversity information. Journal of Industrial Microbiology,Amsterdam, v. 17, p. 498-504, 1996.

COLWELL, R. R. Polyphasic taxonomy of the genus Vibrio: numericaltaxonomy of Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, and related Vibriospecies. Journal of Bacteriology, Washington, v. 104, p. 410-433, 1970.

CORICH, V.; GIACOMINI, A.; OLLERO, F. J.; SQUARTINI, A.; NUTI, M.F. Pulsed-field electrophoresis in counter-clamped homogeneous electricfields (CHEF) for fingerprinting of Rhizobium spp. FEMS MicrobiologyLetters, Haren, v. 83, p. 193-198, 1991.

COURRIER, T. C.; NESTER, E. W. Evidence for diverse types of largeplasmids in tumor-inducing strains of Agrobacterium. Journal ofBacteriology, Washington, v. 126, p. 157-165, 1976.

DEMEZAS, D. H.; REARDON, T. B.; WATSON, J. M.; GIBSON, A. H.Genetic diversity among Rhizobium leguminosarum bv. trifolii strainsrevealed by allozyme and restriction fragment lengh polymorphismanalyses. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 57,p. 3489-3495, 1991.

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32310


DREYFUS, B. L.; GARCIA, J. L.; GILLIS, M. Charactherisation ofAzorhizobium caulinodans gen. nov. s. nov., a stem nodulting nitrogenfixing bacterium isolated from Sesbania rostrata. International Journalof Systematic Bacteriology, Washington, v. 38, p. 89-98, 1988.

DYKHUIZEN, D. E.; GREEN, L. Recombination in Escherichia coli andthe definition of biological species. Journal of Bacteriology, Washington,v. 173, p. 7257-7268, 1991.

EARDLY, B. D.; MATERON, L. A.; SMITH, N. H.; JOHNSON, D. A.;RUMBAUGH, M. D.; SELANDER, R. K. Genetic structure of naturalpopulations of the nitrogen-fixing bacterium Rhizobium meliloti. Appliedand Environmental Microbiology, v. 56, p. 187-194, 1990.

EARDLY, B. D.; WANG, T. S.; BERKUM, P. van. Corresponding 16S rRNAgene segments in Rhizobiaceae and Aeromonas yield discordantphylogenies. Plant and Soil, Dordrecht, v. 186, p. 69-72, 1996.

EARDLY, B. D.; WANG, T. S.; WITTAM, T. S.; SELANDER, R. K. Specieslimits in Rhizobium populations that nodulate the common bean(Phaseolus vulgaris L.). Applied and Environmental Microbiology,Washington, v. 61, p. 507-512, 1995.

EARDLY, B. D.; YOUNG, J. P. W.; SELANDER, R. K. Phylogenetic positionof Rhizobium sp strain Or191, a symbiont of both Medicago sativa andPhaseolus vulgaris, based on partial sequence of the 16S rRNA and nifHgenes. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 58, p.1809-1815, 1992.

FELICE, A. E.; ALSHINAWI, C. Polymerase chain reaction in molecularbiotechnology; appropriate technology for developing countries. WorldJournal of Microbiology and Biotechnology, Oxford, v. 12, p. 467-471,1996.

FOX, G. E.; STACKEBRANDT, R. B.; HESPELL, R. B.; GIBSON, J.;MANILOFF, J.; DYER, R. S.; WOLF, R. S.; BALCH, W. E.; TANNER, R. S.;MAGRUM, L. J.; ZABLEN, L. B.; BLAKEMORE, R.; GUPTA, R.; BONEN,L.; LEWIS, B. J.; STAHL, D. A.; LUEHRSEN, K. N.; CHEN, K. N.; WOESE,

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32311

312 Capítulo 11

C. R. The phylogeny of prokaryotes. Science, Washington, v. 209, p.457-463, 1980.

FOX, G. E.; WISOTZKEY, J. D.; JURTSHUK JR., P. How close is close:16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee speciesidentity. International Journal of Systematic Bacteriology, Washington,v. 42, p. 166-170, 1992.

GENIAUX, E.; AMARGER, N. Diversity and stability of plasmid transferin isolates from a single field population of Rhizobium leguminosarumbv. viciae. FEMS Microbiology Ecology, Haren, v. 102, p. 251-260, 1993.

GORDON, D. M.; WEXLER, M.; REARDON, T. B.; MURPHY, P. J. Thegenetic structure of Rhizobium populations. Soil Biology andBiochemistry, Oxford, v. 27, p. 491-499, 1995.

GRAHAM, P. H.; SADOWSKI, M. J.; KEYSER, H. H.; BARNET, Y. M.;BRADLEY, R. S.; COOPER, J. E.; DE LEY, D. J.; JARVIS, B. D. W.;ROSLYCKY, E. B.; STRIJDOM, B. W.; YOUNG, J. P. W. Proposed minimalstandards for the description of new genera and species of root- andstem-nodulating bacteria. International Journal of SystematicBacteriology, Washington, v. 41, p. 582-587, 1991.

HAHN, M.; HENNECKE, H. Conservation of a symbiotic DNA regionin soybean root nodule bacteria. Applied and EnvironmentalMicrobiology, Washington, v. 53, p. 2253-2255, 1987.

HARRISON, S. P.; MYTTON, L. R.; SKOT, L.; DYE, M.; CRESSWELL, A.Characterization of Rhizobium isolates by amplifications of DNApolymorphisms using random primers. Canadian Journal of Microbiology,Ottawa, v. 38, p. 1009-1015, 1992.

HARTMANN, A.; CATROUX, G.; AMARGER, N. Bradyrhizobiumjaponicum strain identification by RFLP analysis using the repeatedsequence RS-alpha. Letters in Applied Microbiology, Oxford, v. 15,p. 15-19, 1992.

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32312


HARTMANN, A.; GOMEZ, M.; GIRAUD, J. J.; REVELLIN, C. Repeatedsequence RSa is diagnostic for Bradyrhizobium japonicum andBradyrhizobium elkanii. Biology and Fertility of Soils, Berlin, v. 23, p. 15-19, 1996.

HAUKKA, K. Genetic diversity and phylogeny of rhizobia isolated fromtropical tree legumes. 1997. Dissertação (Mestrado) - Department ofApllied Chemistry and Microbiology, University of Helsinki, Helsinki.

HAUKKA, K.; LIDSTRÖM, K. Pulsed-field electrophoresis for genotypiccomparison of Rhizobium bacteria that nodulate leguminous trees. FEMSMicrobiology Letters, Haren, v. 119, p. 215-220, 1994.

HAUKKA, K.; LIDSTRÖM, K.; YOUNG, P. W. Diversity of partial 16SrRNA sequences among and within strains of african rhizobia isolatedfrom Acacia and Prosopis. Systematic and Applied Microbiology,Stuttgart, v. 19, p. 352-359, 1996.

HAUKKA, K.; LIDSTRÖM, K.; YOUNG, P. W. Three pylogenetic groupsof nodA and nifH genes in Sinorhizobium and Mesorhizobium isolatesfrom leguminous trees growing in Africa and Latin America. Applliedand Enviromental Microbiology, Washington, v. 64, p. 419-426, 1998.

INNIS, M. A.; GELFAND, D. H.; SNINSKY, J. J. PCR protocols – a guideto methods and applications. San Diego: Academic, 1990. 482 p.

JARVIS, B. D. W.; DOWNER, J. L.; YOUNG, J. P. W. Phylogeny of fast-growing soybean-nodulating rhizobia supports synonymy ofSinorhizobium & Bradyrhizobium and assignment to Rhizobium fredii.International Journal of Systematic Bacteriology, Washington, v. 42,p. 93-96, 1992.

JENSEN, M. A.; WEBSTER, J. A.; STRAUS, N. Rapid identification ofbacteria on the basis of polymerase chain reaction-amplified ribossomalDNA spacer polymorphism. Applied and Environmental Microbiology,Washington, v. 59, p. 945-952, 1993.

JOHNSON, J. L. DNA reassociation and RNA hybridization of bacterialnucleic acids. Methods in Microbiology, v. 28, p. 33-74, 1985.

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32313

314 Capítulo 11

JORDAN, D. C. Family III Rhizobiaceae. CONN. 1938. In: KRIEG, N. R.,(Ed.). Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Baltimore: Williamsand Wilkins, 1984. p. 234-256.

JUDD, A. K.; SHNEIDER, M.; SADOWSKY, M. J.; BRUIJN, F.J. de. Useof repetitive sequences and the polymerase chain reaction tecnique toclassify genetically related Bradyrhizobium japonicum serocluster 123strains. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 59,p. 1702-1708, 1993.

KAIJALAINEN, S.; LINDSTRÖM, K. Restriction fragment lenghpolynmorphism analysis of Rhizobium galegae strains. Journal ofBacteriology, Washington, v. 171, p. 5561-5566, 1989.

KAY, H. E.; COUTINHO, H. L. C.; FATTORI, M.; MANFIO, G. P.;GOODACRE, R.; NUTI, M. P.; BASSAGLIA, M.; BERINGER, J. E. Theidentification of Bradyrhizobium japonicum strains isolated from italiansoils. Microbiology, New York, v. 140, p. 2333-2339, 1994.

LAGUERRE, G.; ALLARD, M. R.; REVOY, F.; AMARGER, N. Rapididentification of Rhizobia by restriction fragment lengh polymorphismanalysis of PCR-amplified 16S rRNA genes. Applied and EnvironmentalMicrobiology, Washington, v. 60, p. 56-63, 1994.

LAGUERRE, G.; BERKUM, P. van; AMARGER, N.; PRÉVOST, D. Geneticdiversity of rhizobial symbionts isolated from legume species within thegenera Astragalus, Oxytropis, and Onobrychis. Applied andEnvironmental Microbiology, Washington, v. 63, p. 4748-4758, 1997.

LAGUERRE, G.; FERNANDEZ, M. P.; EDEL, V.; NORMAND, P.;AMARGER, N. Genomic heterogeneity among French Rhizobium strainsisolated form Phaseolus vulgaris. International Journal of SystematicBacteriology, Washington, v. 43, p. 761-767, 1993.

LAGUERRE, G.; MAVINGUI, P.; ALLARD, M. R.; CHARNAY, M. P.;LOUVRIER, P.; MAZURIER, S. I.; RIGOTTIER-GOIS, L.; AMARGER, N.Typing of rhizobia by PCR DNA fingerprinting and PCR restriction

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32314


fragment length polymorphism analysis of chromosomal and symbioticgene regions: application to Rhizobium leguminosarum and its differentbiovars. Applied and Environmental Microbiology, Washington,v. 62, p. 2029-2036, 1996.

LAGUERRE, G.; MAZURIER, S. I.; AMARGER, N. Plasmid profiles andrestriction length polymorphism of Rhizobium leguminosarum bv. viciaein field populations. FEMS Microbiology Ecology, Haren, v. 101, p. 17-26, 1992.

LAJUDIE, P. de; WILLEMS, A.; POT, B.; DEWETTINCK, D.;MAESTROJUAN, G.; NEYRA, M.; COLLINS, M. D.; DREYFUS, B.;KERSTERS, K.; GILLIS, M. Polyphasic taxonomy of rhizobia: emendationof the genus Sinorhizobium and description of Sinorhizobium meliloticomb. nov., Sinorhizobium saheli sp. nov., and Sinorhizobium terangasp. nov. International Journal of Systematic Bacteriology, Washington,v. 44, p. 715-733, 1994.

LEUNG, K.; STRAIN, S. R.; BRUJIN, F. J.; BOTTOMLEY, P. J. Genotypicand phenotypic comparisons of chromosomal types within na indigenoussoil population of Rhizobium leguminosarum bv. trifolii. Applied andEnvironmental Microbiology, Washington, v. 60, p. 416-426, 1994.

LINDSTRÖM, K.; LAGUERRE, G.; NORMAND, P.; RASMUSSEN, U.;HEULIN. T.; JARVIS, B. D. W.; LAJUDIE, P. de; MARTÍNEZ-ROMERO,E.; CHEN, W. -X. Taxonomy and phylogeny of diazotrophs.In: ELMERICH, C.; KONDOROSI, A.; NEWTON, W. E., (Ed.). Biologicalnitrogen fixation for the 21st century; proceedings of the 11th InternationalCongress on Nitrogen Fixation, Institut Pasteur, Paris, France, july20-25, 1997. Dordrecht: Kluwer, 1998. p. 559-570. (Current Plant Scienceand Biotechnology in Agriculture, v.31).

LINTON, D.; DEWHIRST, F. E.; CLEWLEY, J. P.; OWEN, R. J.; BURNENS,A. P.; STANLEY, J. Two types of 16S rRNA gene are found inCampylobacter helveticus: analysis, applications and characterizationof the intervening sequence found in some strains. Microbiology,Reading, v. 140, p. 847-855, 1994.

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32315

316 Capítulo 11

LUCAS, I. H.; SEGOVIA, L.; MARTINEZ-ROMERO, E.; PUEPPKE, S. G.Phylogenetic relationships and host range of Rhizobium spp. that nodulatePhaseolus vulgaris L. Applied and Environmental Microbiology,Washington, v. 61, p. 2775-2779, 1995.

LUDWIG, W.; KIRCHHOF, G.; KLUGBAUER, N.; WEIZENEGGER, M.;BETZEL, D.; EHRMANN, M.; HERTEL, C.; JILG, S.; TATZEL, R.;ZITZELSBERGER, H.; LIEBL, S.; HOCKBERGER, M.; SHAH, J.; LANE,D.; WALLNÖFER, P. R.; SCHEIFER, K. H. Complete 23S ribossomal RNAsequences of gram-positive bacteria with a low DNA G+C content.Systematic and Appllied Microbiology, Stuttgart, v. 15, p. 487-501, 1992.

LUDWIG, W.; SCHLEIFER, K. H. Bacterial phylogeny based on 16Sand 23S rRNA sequence analysis. FEMS. Microbiology Reviews,Amsterdam, v. 15, p. 155-173, 1994.

MARTINEZ-ROMERO, E. Recent developments in Rhizobium taxonomy.Plant and Soil, Dordrecht, v. 161, p. 11-20, 1994.

MERCANTE, F. M. M.; CUNHA, C. O.; STRALIOTTO, R.; RIBEIRO-JÚNIOR, W. Q.; VANDERLEYDEN, J.; FRANCO, A. A. Leucaenaleucocephala as a trap host for Rhizobium tropici strains from the brazilian“Cerrado” region. Revista de Microbiologia, São Paulo, v. 29, p. 49-58,1998.

MINASAWA, K.; ISAWA, T.; NAKATSUKA, Y.; ICHIKAWA, N. NewBradyrhizobium japonicum strains that posses high copy numbers of therepeated sequence RSalfa. Applied and Environmental Microbiology,Washington, v. 65, p. 1845-1851, 1998.

MULLIS, K. B. The unusual origin of the polymerase chain reaction.Scientific American, New York, April, p. 56-65, 1990.

MULLIS, K. B.; FALOONA, F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via apolymerase chain reaction. Methods in Enzymology, San Diego, v. 155,p. 355-350, 1987.

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32316


MURRAY, R. G. E.; BRENNER, D. J.; COLWELL, R. R.; De VOS, P.;COODFELLOW, M.; GRIMONT, P. A. D.; PFENING, N.; STACKE-BRANDT, E.; ZAVARSIN, G. A. Report of the as hoc comittee onapproaches to taxonomy within the Proteobacteria. International Journalof Systematic Bacteriology, Washington, v. 40, p. 213-215, 1990.

NIEMANN, S.; PÜHLER, A.; TICHY, H. -T.; SIMON, R.; SELBITSCHKA,W. Evaluation of the resolving power of three different DNA fingerprintingmethods to discriminate among isolates of a natural Rhizobium melilotipopulation. Journal of Applied Microbiology, London, v. 82, p. 477-484,1997.

NOUR, S. M.; FERNANDEZ, M. P.; NORMAND, P.; CLEYET-MAREL,J. C. Rhizobium ciceri sp nov. consisting of strains that nodulate chickpeas(Cicer arietinum L.). International Journal of Systematic Bacteriology,Washington, v. 44, p. 511-522, 1994.

OLSEN, G. J.; WOESE, C. R.; OVERBEEK, R. The winds of (evolutionary)change: breathing new life into microbiology. Journal of Bacteriology,Washington, v. 176, p. 1-6, 1994.

OYAIZU, H.; MATSUMOTO, S.; MINAMISAWA, K.; GAMOU, T.Distribution of rhizobia in leguminous plants surveyed by phylogeneticidentification. Journal of General and Applied Microbiology, Tokyo, v. 39,p. 339-354, 1993.

PAFFETTI, D.; SCOTTI, C.; GNOCCHI, S.; FANCELLI, S.; BAZZICALUPO,M. Genetic diversity of na italian Rhizobium meliloti population fromdifferent Medicago sativa varieties. Applied and EnvironmentalMicrobiology, Washington, v. 62, p. 2279-2285, 1996.

PIÑERO, D.; MARTÍNEZ, E.; SELANDER, R. K. Genetic diversity andrelationships among isolates of Rhizobium leguminosarum biovarphaseoli. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 54,p. 2825-2832, 1988.

ROSADO, A.; DUARTE, G.; SELDIN, L.; VAN ELSAS, J. D. Molecularmicrobial ecology: a minireview. Revista de Microbiologia, São Paulo,v. 28, p. 135-147, 1997.

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32317

318 Capítulo 11

ROSSBACH, S.; RASUL, G.; SCHNEIDER, M.; EARDLEY, B.; BRUIJN,F. J. de. Structural and functional conservation of the Rhizopinecatabolism (moc) locus limited to selected Rhizobium meliloti strainsand unrelated to their geographical origin. Molecular Plant MicrobeInteractions, St. Paul, v. 8, p. 549-559, 1995.

SÁ, N. M. H. de; KATTAH, L. da S.; SELDIN, L.; VASCONCELOS, M. J.V.; PAIVA, E. Genomic heterogeneity within bean nodulating Rhizobiumstrains isolated from Cerrado soils. Soil Biology and Biochemistry,Oxford, v. 29, p. 1011-1014, 1997.

SCHAAD, N. W. Laboratory guide for identification of plant pathogenicbacteria. Minnesota: American Phytopathological Society, 1980.

SCHLEIFER, K. H.; STACKEBRANDT, E. Molecular systematics ofprokaryotes. Annual Review of Microbiology, Palo Alto, v. 37,p. 143-187, 1983.

SCHNEIDER, M.; BRUIJN, F.J. de. Rep-PCR mediated genomicfingerprinting of rhizobia and computer-assisted phylogenetic patternanalysis. World Journal of Microbiology and Biotechnology, Oxford,v. 12, p. 163-174, 1996.

SEGOVIA, L.; YOUNG, J. P. W.; MARTÍNEZ-ROMERO, E. Reclassificationof american Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli type I strains asRhizobium etli sp. nov. International Journal of Systematic Bacteriology,Washington, v. 43, p. 374-377, 1993.

SELANDER, R. K.; CAUGANT, D. A.; OCHMAN, H.; MUSSER, J. M.;GILMOUR, M. N.; WHITTAM, T. S. Methods of multilocus enzymeeletrophoreis for bacterial population genetics and systematics. Appliedand Environmental Microbiology, Washington, v. 51, p. 873-884, 1986.

SELENSKA-POBELL, S.; EVGUENIEVA-HACKENBERG, E. Fragmentationof the large subunit rRNA in the family Rhizobiaceae. Journal ofBacteriology, Washington, v. 177, p. 6993-6998, 1995.

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32318


SELENSKA-POBELL, S.; DÖRING, H.; EVGUENIEVA-HACKENBERG,E. Unusual organization of the 23S rRNA genes in Rhizobiacea. SoilBiology and Biochemistry, Oxford, v. 29, p. 905-909, 1997.

SELENSKA-POBELL, S.; EVGUENIEVA-HACKENBERG, E.; RADEVA, G.;SQUARTINI, A. Characterization of Rhizobium ‘hedysari’ by RFLPanalysis of PCR amplified rDNA and by genomic PCR fingerprinting.Journal of Applied Bacteriology, Oxford, v. 80, p. 517-528, 1996.

SELENSKA-POBELL, S.; GIGOVA, L.; PETROVA, N. Strain-specificfingerprints of Rhizobium galegae generated by PCR with arbbitrary andrepetitive primers. Journal of Applied Bacteriology, Washington, v. 79,p. 425-431, 1995.

SOBRAL, B. W. S.; HONEYCUTT, R. J.; ATHERLY, A. G. The genomes ofthe family Rhizobiaceae: size, stability, and rarely cutting restrictionendonucleases. Journal of Bacteriology, Washington, v. 173, p. 704-709,1991.

SOUZA, V.; EGUIARTE, L.; AVILA, G.; CAPPELLO, R.; CALLARDO, C.;MONTOYA, J.; PI¨NERO, D. Genetic structure of Rhizobium etli biovarphaseoli associated with wild and cultured bean plants (Phaseolusvulgaris and Phaseolus coccineus) in Morelos, Mexico. Applied andEnvironmental Microbiology, Washington, v. 60, p. 1260-1268, 1994.

SOUZA, V.; NGUYEN, T. T.; HUDSON, R. R.; PIÑERO, D.; LENSKI, R.Hierarchical analysis of the linkage disequilibrium in Rhizobiumpopulations: evidence of sex? Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America, Washington, v. 89, p. 8389-8393, 1992.

SPRENT, J. I. Evolution and diversity in the legume – Rhizobium symbiosissymbiosis: chaos or theory? Plant and Soil, Dordrecht, v. 161, p. 1-10,1994.

SPRENT, J. I. Nodulation in legumes. Kew: Royal Botanic Gardens, 2001.146 p.

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32319

320 Capítulo 11

STACKEBRANDT, E.; GOEBEL, B. M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present speciesdefinition in bacteriology. International Journal of SystematicBacteriology, Washington, v. 44, p. 846-849, 1994.

STACKEBRANDT, E.; LIESACK, W.; WITT, D. Ribossomal RNA and rRNAsequence analysis. Gene, Amsterdam, v. 115, p. 255-260, 1992.

TESFAYE, M.; PETERSEN, D. J.; HOLL, F. B. Comparison of partial 23SrDNA sequences from Rhizobium species. Canadian Journal ofMicrobiology, Ottawa, v. 43, p. 526-533, 1997.

ULLMANN, J. S.; McCARTHY, B. J. The relationship between mismatchedbase pairs and the thermal stability of DNA duplexes. Biochimica etBiophysica Acta, Amsterdam, v. 294, p. 416-424, 1973.

URTZ, B. E.; ELKAN, G. H. Genetic diversity among Bradyrhizobiumisolates that effectively nodulate peanut (Arachis hypogaea). CanadianJournal of Microbiology, Ottawa, v. 42, p. 1121-1130, 1996.

VANDAMME, P.; POT, B.; GILLIS, M.; De VOS, P.; KERSTERS, K.;SWINGS, J. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterialsystematics. Microbiological Reviews, Washington, v. 60, p. 407-438,1996.

VANROSSUM, D.; SCHUURMANS, F. P.; GILLIS, M.; MUYOTCHA, A.;VANVERSEVELD, H. W.; STOUTHAMER, A. H.; BOOGERD, F. C.Genetic and phenetic analyses of Bradyrhizobium strains nodulatingpeatnut (Arachis hypogeae L.) roots. Applied and EnvironmentalMicrobiology, Washington, v. 61, p. 1599-1609, 1995.

VERSALOVIC, J.; SCHNEIDER, M.; BRUIJN, F. J. de; LUPSKI, J. R.Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-basedpolymerase chain reaction. Methods in Molecular and Cellular Biology,New York, v. 5, p. 25-40, 1994.

VINUESA, P.; RADEMAKER, J. L. W.; BRUIJN, F. J. de; WERNER, D.Genotypic characterization of Bradyrhizobium strains nodulatingendemic woody legumes of the Canary Islands by PCR-restriction

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32320


fragment lengh polymorphism analysis of genes encodinga 16S rRNAand 16S-23S rDNA intergenic spacers, repetitive extragenicpalindromic PCR genomic fingerprinting, and partial 16S rDNAsequencing. Applied and Environmental Microbiology, Washington,v. 64, p. 2096-2104, 1998.

WARD, D. M.; WLLER, R.; BATESON, M. M. 16S rRNA sequences revealnumerous uncultured microorganisms in a natural comunity. Nature,London, v. 345, p. 63-65, 1990.

WAYNE, L. G.; BRENNER, D. J.; COLWELL, R. R.; GRIMONT, P. A. D.;KANDLER, P.; KRICHEVSKY, M. I.; MOORE, L. H.; MOORE, W. E. C.;MURRAY, R. G. E.; STACKEBRANDT, E.; STARR, M. P.; TRÜPER, H. G.Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches tobacterial systematics. International Journal of Systematic Bacteriology,Washington, v. 37, p. 463-464, 1987.

WEISING, K.; NYBOM, H.; WOLF, K.; MEYER, W. DNA fingerprints inplants and fungi. Boca Raton: CRC, 1995. 322 p.

WELSH, J.; McCLELLAND, M. Fingerprinting genomes using PCR witharbitrary primers. Nucleic Acids Research, v. 19, p. 303-306, 1991.

WILLEMS, A.; COLLINS, M. D. Phylogenetic analysis of rhizobia andagrobacteria based on 16S rRNA gene sequences. International Journalof Systematic Bacteriology, Washington, v. 43, p. 305-313, 1993.

WILLIAMS, J. G. K.; KUBELIC, A. R.; LIVAK, K. J.; RAFALSKI, J. A.;TINGEY, S. V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers areuseful as genetic markers. Nucleic Acids Research, London, v. 18,p. 6531-6535, 1990.

WILSON, E. O. Time to revive systematics. Science, Washington, v. 230,p. 1227-1229, 1985.

WILSON, J. K. Over five hundred reasons for abandoning the crossinoculation groups of legumes. Soil Science, Baltimore, v. 58, p. 61-69, 1944.

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32321

322 Capítulo 11

WOESE, C. R. Bacterial evolution. Microbiological Reviews, Washington,v. 51, p. 221-271, 1987.

YOUNG, J. P. W.; DOWNER, H. L.; EARDLY, B. D. Phylogeny of thephototrophic Rhizobium strain BTai1 by polymerase chain reaction-based sequencing of a 16S rRNA gene segment. Journal of Bacteriology,Washington, v. 173, p. 2271-2277, 1991.

YOUNG, J. P. W.; HAUKKA, K. E. Diversity and phylogeny of rhizobia.New Phytologist, Oxford, v. 133, p. 87-94, 1996.

YOUNG, J. P. W.; WEXLER, M. Sym plasmid and chromosomal genotypesare correlated in field populations of Rhizobium leguminosarum. Journalof General Microbiology, London, v. 134, p. 2731-2739, 1988.

Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32322

aplicação e evolução dos métodos moleculares no estudo da ... · • determinação da...

Documents