animais de laboratorio

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Animais de laboratrio: o camundongoChorilli, M.1,2; Michelin, D.C.2; Salgado, H.R.N.2*

1Curso de Farmcia, Faculdade de Cincias da Sade, Universidade Metodista de Piracicaba, UNIMEP, Piracicaba, SP, Brasil.2Departamento de Frmacos e Medicamentos, Faculdade de Cincias Farmacuticas, Universidade Estadual Paulista, UNESP,

Araraquara, SP, Brasil.

*Autor correspondente: Hrida Regina Nunes Salgado - Departamento deFrmacos e Medicamentos - Faculdade de Cincias Farmacuticas -Universidade Estadual Paulista - UNESP - Rodovia Araraquara-Ja, km 1- CEP: 14801-902 - Araraquara - SP, Brasil - Telefone: (16) 3301-6967 -E-mail: [email protected]

Recebido 25/04/07 / Aceito 17/07/07

RESUMO

A experimentao animal nas pesquisas cientficas temcontribudo sobremaneira para o desenvolvimento dacincia e tecnologia, promovendo ao longo dos anos adescoberta de medidas profilticas e tratamentos deenfermidades que acometem os seres humanos. Animaisde vrias espcies tm sido utilizados nos ltimos tempos,sendo os camundongos os mais intensamente utilizadose os mais profundamente conhecidos cientificamente. Oobjetivo deste trabalho foi realizar um levantamentobibliogrfico, incluindo os trabalhos do nosso grupo,sobre o emprego de camundongos na experimentaoanimal, abordando sua biologia geral, fisiologia dereproduo, sistemas de criao, gentica, habitao,alimentao, manejo, dor e eutansia, tcnicas de riscodesenvolvidas na experimentao, coleta de sangue,experimentos farmacolgicos e toxicolgicos. Emboratendncias atuais preconizem a utilizao de mtodosalternativos (estudos in vitro, culturas de clulas, etc.),os modelos animais, como os camundongos, apresentamcomo principal vantagem o fornecimento de informaessobre o organismo como um todo, fato que no conseguido com outros mtodos, o que ainda possibilitao seu emprego em pesquisas cientficas.Palavras-chave: experimentao animal; camundongo;biologia geral; tcnicas de risco na experimentao.

INTRODUO

A experimentao animal se reveste de umaimportncia incalculvel nas pesquisas cientficas,contribuindo sobremaneira para o desenvolvimento dacincia e tecnologia. Sua vasta contribuio nos diferentescampos cientficos vem promovendo ao longo dos anos adescoberta de medidas profilticas e tratamentos de inmerasenfermidades que acometem os seres vivos. Como exemplosde contribuies cientficas advindas de estudos realizadosem animais tem-se a descoberta da insulina, desenvolvimentode vacinas contra diversas doenas e a produo de soros.Os animais foram responsveis por descobertas que

permitiram o uso teraputico de antibiticos e o tratamentode diversas doenas, evitando assim epidemias e epizootias,bem como o desenvolvimento de tcnicas de transplantes dergos e a possibilidade do uso de frmacos anestsicos,antidepressivos, entre outros (Fagundes & Taha, 2004;Andrade, 2006).

A idia de utilizao de animais em pesquisassurgiu, principalmente, por questes econmicas. Mesmocom o progresso de mtodos alternativos nos ltimos anos(estudos in vitro, culturas de clulas, etc.), os modelos animaisainda apresentam como principal vantagem o fornecimentode informaes sobre o organismo como um todo, fato queno conseguido com outros mtodos (Heywood, 1987;Ribeiro et al., 1995; Saln, 1995; Snitkoff, 2004).

A cura de muitas doenas deve-se experimentaoanimal, bem como o aprimoramento de inmeras tcnicasde diagnstico. A Tabela 1 relaciona o perodo, as espciesanimais e seus principais usos cientficos relacionados descoberta e/ou tratamento de diversas doenas.

Nos primeiros estudos experimentais, os critriosde seleo de animais no eram bem definidos. A seletividadefoi decorrente do nmero de trabalhos realizados e daidentificao dos animais com os temas estudados (Corbin,1974; Baker et al., 1979; CCAC, 1984). Animais de vriasespcies tm sido utilizados ao longo desses ltimos doissculos de desenvolvimento cientfico, mas dentre todos eleso camundongo , inquestionavelmente, o mais intensamenteutilizado e o mais profundamente conhecido cientificamente.

Os camundongos atualmente empregados emexperimentaes so oriundos daqueles domsticos que,durante muito tempo, vm compartilhando com o homemsuas casas, seus alimentos e suas enfermidades. Elesdisseminaram-se da sia para a Europa e a partir da portodo o mundo, habitando qualquer lugar que o homemtambm habite (Franco, 2006).

O camundongo acompanha o homem h vriosmilnios; existem registros com mais de quatro mil anosacerca desse animal, inclusive em citaes bblicas. Esteroedor, inclusive, chegou a ser adorado em antigascivilizaes orientais, embora, na maioria das vezes, estejaassociado a doenas. Somente no sculo XIX o camundongose transformou em um instrumento de laboratrio. A partir

Revista de Cincias Farmacuticas Bsica e Aplicada Journal of Basic and Applied Pharmaceutical Sciences

Rev. Cinc. Farm. Bsica Apl., v. 28, n.1, p.11-23, 2007ISSN 1808-4532

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de 1900 tornou-se tambm um importante modeloexperimental para os estudos genticos. Em 1909, ClarenceCook Little iniciou a produo de linhagem geneticamentepura a partir de um casal portador de mutaes recessivaspara genes responsveis pela herana da cor da pelagem.Atravs de acasalamentos entre irmos por 20 geraesconsecutivas, foi obtida a primeira linhagem consangnea(inbred) que foi chamada de dba (atualmente DBA) (Santos,2002a).

O camundongo membro da classe Mammalia,ordem Rodentia, famlia Muridae, gnero Mus, espcie Musmusculus. Essa classificao a mais aceita; todavia, hcontrovrsias sobre espcies e subespcies criadas em

laboratrios devido presena de cruzamentos especiais, nosquais os animais apresentam alguns genes ou, at mesmo,cromossomos de espcies diferentes. Como exemplo, tem-se a linhagem C57BL/6, na qual 6,5% do genoma originriode Mus spretus, e no de Mus musculus (Franco, 2006).

Sua introduo como animal de laboratrio deve-se principalmente ao fato de ser pequeno, muito prolfero,ter perodo de gestao curto, ser de fcil domesticao emanuteno. Logo, tornou-se o mamfero mais usado naexperimentao animal (Santos, 2002b).

Diversas vias de administrao de frmacos podemser usadas sem dificuldades, inclusive a venosa e a intratecal(intracerebral). Pode-se provocar fcil sangria pela puno

Perodo Espcies animais Principais usos Cachorro Coelho

Tratamento da raiva Antes de 1900

Galinha Tratamento da deficincia de vitamina do complexo B

Vaca Tratamento da varola Estudos sobre a patogenia da tuberculose

1900-1920

Cachorro Tratamento de raquitismo Mecanismos de anafilaxia

Cachorro Coelho

Desenvolvimento da tcnica de cateterismo cardaco Descoberta da insulina e do mecanismo de diabetes

1920-1930

Cachorro Mecanismo do eletrocardiograma 1930-1940 Gato Desenvolvimento de anticoagulantes

Funo dos neurnios Macaco Coelho

Tratamento da artrite reumatide 1940-1950

Rato Efeito teraputico da penicilina em infeces bacterianas

Macaco Descoberta do fator Rh do sangue Macaco Rato

Vacina da febre amarela Cultivo do vrus da poliomielite, o que levou ao desenvolvimento da vacina

Coelho Macaco Rato

Desenvolvimento da quimioterapia para o tratamento do cncer

1950-1960

Rato Camundongo

Descoberta do DNA

Rato Camundongo

Desenvolvimento de frmacos antidepressivos

1960-1970

Camundongo Interpretao do cdigo gentico e seu papel na sntese de protenas

Macaco Tratamento da lepra 1970-1980 Porco Desenvolvimento da tomografia

computadorizada Rato Coelho

Desenvolvimento de anticorpos monoclonais

1980-1990

Rato Camundongo

Desenvolvimento da terapia gentica

Tabela 1 - Perodo, espcies animais e seus principais usos na descoberta e no tratamentode diversas doenas.

Fonte: Cardoso, 1998.

Animais de laboratrio: o camundongo

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do seio venoso orbital. Representam modelos experimentaisde muitas condies patolgicas humanas. Seueletrocardiograma, embora freqentemente seja registradopara estudo de patologias cardacas e do efeito de frmacossobre o corao, de interpretao muito difcil emdecorrncia da elevada freqncia cardaca, devendo-setomar extremo cuidado para evitar a identificao de falsasalteraes (Junqueira Jr & Ubatuba, 2006).

Printz (2004) cita que o camundongo, embora sejatratado, muitas vezes, como um "tubo de ensaio" paraexperimento molecular ou bioqumico, deve ser tratado comoorganismo vivo complexo em quaisquer experimentaes aque for submetido.

Biologia Geral

O camundongo se caracteriza por ser uma espciecosmopolita adaptada a uma grande variedade de condiesambientais. um animal de hbitos noturnos que se acomodaem qualquer local de tamanho apropriado s suasnecessidades. Geralmente, nasce desprovido de plos, comexceo das vibrissas, com corpo avermelhado, olhosfechados, pavilho auricular fechado e aderido cabea,pesando em mdia um grama (Santos, 2002b).

Apresenta corpo fusiforme e cauda que pode atingircomprimento maior do que o corpo. Sua colorao natural marrom escura no dorso, com um ventre mais claro ecinzento. No possui glndulas sudorparas, e possui cincodedos tanto nas patas posteriores quanto anteriores. Possuitambm audio aguda, respondendo a uma grande variaode freqncias. O olfato altamente desenvolvido, sendo

utilizado no somente para detectar alimento e predadores,mas tambm para determinar vrios sinais de comportamento(Franco, 2006).

Aps o parto, a fmea alimenta a ninhada, podendo-se visualizar o leite no estmago dos animais pela manchabranca nos abdomens. Se houver necessidade de seleo deanimais, tal aspecto pode ser levado em considerao, poisanimais que mamam demonstram maior habilidade parasobreviver. Sua pele vai clareando ou escurecendo de acordocom a colorao da linhagem, sendo que os plos comeama aparecer por volta do 3o ou 4o dia. Com uma semana deidade, j apresentam os corpos recobertos de plos; com trsdias, as orelhas se afastam da cabea; com dez dias, abremos olhos e com 15 j comeam a se alimentar de rao.Desmamam geralmente com 18 dias, sendo que em linhagensconsangneas o desmame pode se dar com 28 dias. Nomomento do desmame, os animais so sexados, separados epesados (Santos, 2002b).

A viso pobre. No distingue cores, uma vez quesua retina apresenta poucos cones. O comportamento socialdepende da densidade populacional, sendo que esses animaispodem viver bem adaptados tanto solitariamente quanto emgrandes colnias, com padres de hierarquia muito bemestabelecidos (Bauck & Bihun, 1997).

importante salientar que devido ao seu tamanhopequeno, o camundongo extremamente susceptvel amudanas nas condies ambientais. Pequenas flutuaesna temperatura (2 a 3oC) podem causar modificaes nasua fisiologia (Johnson-Delaney, 1996). A Tabela 2apresenta os principais dados biolgicos e fisiolgicos doscamundongos.

Tabela 2 - Principais dados biolgicos e fisiolgicos dos camundongos.

Fonte: www.reitoria.ufsc.br/prpg/bioterio


Temperatura ambiente ideal 21-22oC ( 2oC) Umidade (UR) 50-55% Consumo de rao/dia/adulto 5g Consumo de gua/dia/adulto 6 mL Puberdade 42 dias de idade Peso na puberdade 20-25g Maturidade sexual 60 dias Ciclo estral 4-5 dias Perodo de gestao 19-21 dias Aleitamento 19-21 dias Vida reprodutiva Macho: 1 ano

Fmea: 6-8 partos Tamanho da ninhada 10-12 filhotes (outbred) Peso ao nascer 1-2g

Idade para desmame 21 dias Peso ao desmame 10-12 g

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Os animais utilizados em experimentaesapresentam significativas diferenas fisiolgicas e a ttulode exemplificao esto citados nas Tabelas 3 e 4 valores depresso arterial e freqncia cardaca em vrias espcies deanimais em repouso.

Fisiologia da Reproduo

O camundongo torna-se apto reproduo aos 60 diasde idade, sendo que os efeitos hormonais iniciais j estopresentes em ambos os sexos ao redor dos 30 dias de idade,evidenciando-se atravs da abertura da vagina nas fmeas e peladescida e aumento dos testculos nos machos (Andrade, 2006).

O ciclo estral completo dura de quatro a cinco dias,ou seja, a cada cinco dias ocorre ovulao, dividindo-se emproestro, estro, metaestro e diestro. O proestro comea coma fase folicular do ovrio, que culmina no estro (cio). Ometaestro e diestro caracterizam-se pela fase lutenica doovrio. Quando agrupadas, porm, as fmeas podempermanecer em anestro (ausncia de ciclo estral)continuamente at que sejam expostas a um macho. A partir

Tabela 3 - Freqncia cardaca em repouso (bpm) para diferentes espcies animais.

Fonte: Dukes, 1960.

Tabela 4 - Presso arterial em repouso, medida por meio de manmetro ptico(mmHg), para diferentes espcies animais.

Fonte: Woodbury & Hamilton, 1937.

desse momento o estro retorna no prazo de at 48 horas,sendo que a este fenmeno d-se o nome de Efeito deWhitten. A presena de lquido seminal na vagina indica aocorrncia da cpula. Esse lquido bem aparente, masdesaparece em 24 horas (Santos, 2002b).

O perodo de gestao de 19-21 dias, exceto parafmeas que estejam amamentando, quando a gestao podese prolongar por seis a 16 dias. Ao nascer, seu sistemaimunolgico no competente. Os dentes, por sua vez,aparecem por volta de nove a 10 dias. A alimentao slidase inicia logo aps o desmame, entre 19 e 21 dias de idade(Andrade, 2006).

Sistemas de Criao

O sistema de criao adotado depende das facilidadesdisponveis e tambm do camundongo a ser produzido.

Os camundongos so geralmente criados a partirde pares monogmicos ou harns. O sistema de criao porpares monogmicos consiste em manter juntos uma fmea eum macho de forma permanente. Esse mtodo facilita o


Espcies animais Freqncia cardaca em repouso (bpm)Cavalo 32 45

Boi 60 70

Ovelha 70 80

Cabra 70 80

Canrio 690 (mdia)Camundongo 630 (mdia)Co 70 120

Gato 110 130

Pomba 220 (mdia)Galinha 200 400

Periquito 550 (mdia)Rato 420 (media)

Espcies animais Presso arteria l em repouso (mmHg)Camundongo 147 / 106 (mdia)Canrio 220 / 154 (mdia)Rato 187 / 138 (mdia)Periquito 180 / 140 (mdia)Pomba 135 / 105 (mdia)

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registro das informaes relacionadas ao par, permiteaproveitar o estro que existe logo aps o parto, mas utilizamuito espao, trabalho e materiais. No sistema tipo harm,coloca-se um macho junto com duas ou mais fmeas, o queapresenta a vantagem de economizar machos, porm dificultaos registros (Andrade, 2006).

Para se estabelecer uma colnia em um biotrio,alguns fatores devem ser levados em considerao. importante estabelecer trs diferentes colnias para cadalinhagem instalada, a saber: colnia de fundao, colnia deexpanso e colnia de produo (Santos, 2002b).

O objetivo de uma colnia de fundao, ouprodutora de matrizes, autoperpetuar-se, possibilitando suaprpria manuteno. Apresenta acasalamentos monogmicospermanentes, com animais individualmente registrados eidentificados, com o intuito de selecionar os futurosreprodutores, alm de estabelecer parmetros para a seleoe o descarte zootcnico. Para o estabelecimento de umacolnia outbred, o nmero de casais deve ser relativamentegrande, assegurando a heterozigose e a freqncia gnica.Logo, os acasalamentos devem ser monogmicos epermanentes, com cada casal contribuindo somente com umnovo casal para a gerao seguinte. Isto torna a colnia"fechada", evitando desta forma a introduo de novosanimais na mesma, os quais podem modificar a freqnciagnica e a heterozigose. J para o estabelecimento de colniasinbred necessrio pequeno nmero de casais (15-20) osquais devem remontar a um ancestral comum, sendo osacasalamentos monogmicos e cada casal contribuindo comquantos casais forem necessrios para a prxima gerao(Santos, 2002b).

A colnia de expanso deve ser a segunda a serformada, desde que somente se tenha animais consangneos.Sua funo ampliar a produo de colnias de fundao,visto que estas apresentam reduzido nmero de casais. constituda por animais que vm de colnia de fundao,mas tambm pode produzir seus prprios casais parareposio, sendo os acasalamentos sempre monogmicos(UFAW, 1986).

Em seguida, forma-se a colnia de produo, quetem a finalidade de produzir animais suficientes para atendera necessidade dos usurios, de acordo com suasespecificaes, convivendo tanto acasalamentosmonogmicos ou poligmicos, permanentes ou temporrios,dependendo dos animais a serem produzidos. Osacasalamentos so realizados ao acaso, sendo que nenhumanimal originrio dessa colnia utilizado como reprodutor(UFAW, 1986).

Gentica

Os camundongos passaram a ser criados porexibirem vrios fentipos interessantes. Os camundongosalbinos j eram conhecidos muito antes de serem introduzidosem biotrios, alm de variantes com coloraes inusitadas edistrbios neurolgicos. Segundo Leon (2005), oscamundongos so considerados um excelente modelo para

estudos genticos, devido ao seu ciclo de vida relativamentecurto, similaridade gentica a humanos e capacidade defacilmente ter seu genoma manipulado.

Apresentam 20 pares de cromossomos e um grandenmero de mutantes com centenas de colnias geneticamentedefinidas. Essas colnias, segundo Andrade (2006), soobtidas atravs de sistemas de acasalamentos especiais, sendoque os mais utilizados so: endocruzamentos - acasalamentosentre indivduos que possuem ancestrais comuns, produzindoas linhagens "inbred" e os heterocruzamentos - acasalamentosao acaso evitando-se a consanginidade, produzindo-se aslinhagens "outbred".

Nas ltimas dcadas, os geneticistas colocaram disposio dos pesquisadores modelos animais para inmeraspatologias, disfunes ou mal-formaes, em geralreproduzindo os mesmos males observados na espcie humana.Dentre esses pode-se citar o camundongo nude, hairless,obeso, diabtico e com distrofia muscular (Santos, 2002a).

O camundongo nude (HFHllNU) apresenta generecessivo autossmico, situado no cromossomo 11. Oacasalamento ocorre entre macho nu/nu x fmea nu/+; logo,as fmeas devem ser heterozigotas, j que a ausncia de plosimpede que mantenham os filhotes aquecidos e a produode leite muito menor. Esse tipo de acasalamento produz50% de heterozigotos e 50% de homozigotos recessivos,aproveitando-se os machos homozigotos e as fmeasheterozigotas para os prximos acasalamentos. Alm da faltade plos, possuem um timo rudimentar, apresentando, dessaforma, deficincia na produo de linfcitos T, o que fazcom que esta linhagem no rejeite transplantes de outraslinhagens e apresente maior susceptibilidade s infeces.Geralmente so menores, crescem mais lentamente, somenos frteis e morrem mais facilmente, devendo sermantidos em condies germfree (Foster et al., 1983). Deacordo com Keeland (2004), o camundongo nude vem sendoempregado em estudos de crescimento de tumor humano,sendo imprescindveis nas etapas iniciais de estudos pr-clnicos para desenvolvimento de frmacos antitumorais.Furukawa (2003), por sua vez, cita ainda a grandeaplicabilidade deste camundongo no estudo de doenas auto-imunes, como o lupus eritematoso.

Semelhante ao camundongo nude, tem-se ohairless (HR), que apresenta gene recessivo autossmico,situado no cromossomo 14, havendo acasalamento entremacho hr/hr x fmea hr/+. O hairless desenvolve pelagemnormal, mas o plo comea a cair aos 10 dias de idade,podendo voltar a crescer em pequenos tufos que logo caem.Logo, permanece pelado por toda a vida; todavia, noapresenta deficincia imunolgica severa como ocamundongo nude (Green, 1966).

O camundongo obeso (LEPOB) apresenta um generecessivo autossmico, situado no cromossomo 6. Oacasalamento ocorre entre machos ob/+ x fmeas ob/+. Oscamundongos mutantes obesos no possuem a protenaleptina, encontrada no tecido adiposo em condies normais.Os mutantes podem ser identificados com quatro semanasde idade, aumentando de peso rapidamente at atingir quase


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trs vezes o peso normal. Exibem hiperfagia, hiperglicemiasemelhante a diabetes, intolerncia glicose, elevados nveisde insulina plasmtica e obesidade caracterizada peloaumento do nmero e do tamanho dos adipcitos (Godard& Gunet, 1999). A Figura 1A exibe um camundongo obeso.

O camundongo diabtico (LEPRDB) possui generecessivo autossmico situado no cromossomo 4, sendo oacasalamento entre macho db/+ x fmea db/+. Diabetes nocamundongo foi proposta como uma mutao no gene quecodifica o receptor da leptina. A elevao da insulinaplasmtica inicia-se dos 10 aos 14 dias de idade, e a elevaoda glicose sangnea por volta da quarta semana. Oscamundongos apresentam polifagia, polidipsia e poliria(The Jackson Laboratory, 1997).

H tambm camundongos mutantes que apresentamdistrofia muscular por apresentarem gene recessivoautossmico situado no cromossomo 10, sendo oacasalamento entre machos dy/+ e fmeas dy/+ heterozigotas.As lamininas so uma famlia de glicoprotenas da matrizextracelular presentes nas membranas basais, que ajudamna adeso, migrao, proliferao e diferenciao celulares.As suas molculas consistem em uma cadeia pesada (alfa) eduas leves (beta e gama). Em camundongos mutantes, noh a produo da cadeia alfa 2, levando distrofia muscularcongnita (Santos, 2002a). A Figura 1A mostra um exemplode camundongo obeso. A Figura 1B exibe um camundongonude.

Kasper & Smith Jr (2004) citam a utilizao demodelos de camundongos transgnicos para cncer deprstata. Segundo os autores, a principal vantagem demodelos de camundongos transgnicos que seu genomapode ser facilmente manipulado. Alm disso, variveis comogentica da populao, mutaes genticas, dieta e estgiodo tumor podem ser mais precisamente controladas emcamundongos transgnicos. Tais alteraes podem ocorrerda seguinte forma: um gene de interesse pode ser expresso,mutado ou recolocado por um novo alelo. Ento, alteraesgenticas, como as causadas por uma mutao em um genenormal ou supra-expresso de um oncogene ou fator decrescimento, podem ser introduzidas no genoma docamundongo para investigar seus efeitos na tumorognese.Processo semelhante a este para obteno de camundongostransgnicos tem sido utilizado por Yan & Matzuk (2001)para estudo de patologias ovarianas; Nakamura et al. (2002)para pesquisas de anormalidades na pigmentao cutnea;Shiohara et al. (2004) para dermatite atpica e Schneider etal. (2006) para investigao de doenas neurolgicas.

Figura 1. (A) Exemplo de camundongo obeso; (B)Exemplo de camundongo nude.Fonte: Andrade, 2006.

Habitao, Alimentao e Manejo

Habitao

Um biotrio o local onde os animais vivem e aspessoas apenas trabalham. Os animais que vivem em biotriotm uma existncia no natural e apesar de estarem protegidosde qualquer dano a que estariam expostos na natureza,dependem totalmente do homem para todas as suasnecessidades e seu bem-estar. Fatores como temperatura, luz,ventilao, umidade, rudo e qualidade do ar devem sercontrolados o mximo possvel (Andrade, 2006).

Vrios tipos de gaiolas podem ser utilizadas para amanuteno de camundongos. As mais indicadas so as depolicarbonato ou polipropileno, por serem feitas de materialautoclavvel. Em geral, os camundongos devem dispor deuma rea mnima de 65 cm2 por indivduo quando agrupadose uma fmea com a ninhada deve dispor de aproximadamente650 cm2 (Andrade, 2006). A Figura 2 exibe exemplo de gaiolapara camundongos.

Figura 2. Exemplo de gaiola paracamundongos.Fonte: Andrade, 2006.

Para maior conforto do animal em gaiola, o pisodeve ser recoberto por material apropriado chamado de cama,visando o conforto prprio, nidificao e absoro daumidade das excretas, permitindo assim a criao de umhabitat prximo ao natural. A cama pode ser um substratoou material qualquer que atenda a finalidade, desde que sejamacia, isenta de odor, apresente alta capacidade de absoro,seja constituda de partes pequenas e finas e isenta de resduosqumicos de agrotxicos. Deve ser de fcil obteno e nopoluente. Embora sejam utilizados materiais comovermiculita e palha de arroz, entre outras, o mais adequado a maravalha de pinus (Passos et al., 2006).

Outro material bastante utilizado o papelabsorvente em folhas que em geral colocado em gaiolas dearame ou ao inox com piso suspenso. Esse material poderequerer trocas mais freqentes, porm permite melhorobservao do desperdcio de rao e melhor exame dascaractersticas das fezes e urina (Andrade, 2006).

Alimentao

Os camundongos apresentam um bom


A B

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desenvolvimento quando recebem dietas padronizadas paraanimais de laboratrio. Em geral essa dieta apresentada naforma de "pellets" o que reduz o desperdcio e torna o alimentofcil de ser manuseado e oferecido em comedouros localizadosnas tampas das gaiolas. Deve-se ressaltar o cuidado na estocagemdesse tipo de alimento. Antes de ser apresentada ao animal, arao deve ser mantida em local frio, seco, escuro, bem ventiladoe limpo. A gua deve ser oferecida em bebedouros ou atravsde sistema automtico usando vlvulas (Andrade, 2006).

Manejo

Qualquer animal deve ser manipulado de maneira firmee relaxada a fim de se evitar estresse desnecessrio. Se houverqualquer dvida quanto habilidade de manipular o animal, apessoa dever solicitar o auxlio de algum mais experiente.

Os camundongos so animais de pequeno porte;logo, so geis e ativos. Os adultos podem ser levantadospela base da cauda, mas o seu peso dever ser suportadopelas mos do manipulador ou por outra superfcie, to logoseja possvel. Se qualquer outra parte da cauda que no sejaa base for utilizada, o animal ficar em condies de atacaro manipulador (Andrade, 2006).

A sexagem dos adultos fcil, por meio davisualizao dos testculos. Nos animais mais jovens, quandoos rgos sexuais no so to obviamente diferentes, a distnciaano-genital o principal critrio para a diferenciao. Nessescasos, existe uma clara separao entre o nus e o pnis dosmachos enquanto que a distncia entre o nus e a aberturagenital nas fmeas bem menos evidente (Santos, 2002b).

Para uma total imobilizao do camundongo,segura-se a pele da nuca com o polegar e o indicador, virando-se a mo de maneira que ele fique com o abdmen voltadopara cima (Garvey et al., 1977). Prende-se ento a caudaentre o terceiro e quarto dedo conforme mostra a Figura 3.

Figura 3. Manejo de camundongos.Fonte: Andrade, 2006.

Manejo da dor em camundongos

Segundo Rivera (2002), os sintomas de dorespecficos observados em camundongos variam entre asdiferentes linhagens. Geralmente apresentam: aumento dotempo de sono, perda de peso/desidratao; piloereo epostura encurvada; isolamento do resto do grupo e gritos aoserem tocados.

Para controle da dor em camundongos, pode-se utilizar

analgsicos opiides e antiinflamatrios no esteroidais(AINEs). Os opiides, como morfina, meperidine, fentanil,etorfina, entre outros, so empregados em casos de dor moderadaa severa, causando como efeitos colaterais vmitos, depressorespiratria e hipotenso. J os AINEs, como dipirona, aspirina,naproxeno, cetoprofeno, entre outros, so usados no controleda dor de intensidade leve a moderada e so muito teis quandoo uso de opiides no possvel. Estes agentes antiinflamatriospossuem tambm uma pequena ao analgsica central (Green,1982; Montgomery Jr, 1987; Soma, 1987; LASA, 1990;Flecknell, 1994; Wolfenson & Lloyd, 1994; NRC, 2003).

Eutansia em camundongos

Segundo Cardoso (2002), eutansia significa mortesem dor ou sofrimento. Para tanto, diversas tcnicas podemser utilizadas, as quais devem ser humanitrias, no causandoterror ou sofrimento ao animal, no impressionar ousensibilizar as pessoas que assistem ao ato, ter um tempomnimo para a perda da conscincia, no produzir alteraesque prejudiquem a interpretao das leses, ser de fcilaplicao, ao rpida e baixo custo, no permitir oespalhamento de sangue pelo local, evitando-secontaminaes que possam propiciar disseminao dedoenas infecto-contagiosas e no oferecer perigo aoprofissional que o execute.

Dentre os mtodos utilizados para realizao daeutansia, tm-se os mtodos fsicos e os mtodos qumicos,utilizando-se tanto gases inalantes como agentesfarmacolgicos no-inalantes (Animal Welfare Institute, 1968).

Os mtodos fsicos, como deslocamento cervical,traumatismo craniano, decapitao, exanginao, tiro porarma de fogo ou eletrocusso, s devem ser empregadosquando outros mtodos podem invalidar uma determinadainformao ou pesquisa, principalmente aquelas relacionadascom os processos bioqumicos do animal. Os mtodosqumicos utilizando agentes farmacolgicos inalantes, comoanestsicos ou gases, ou agentes farmacolgicos noinalantes, como pentobarbital sdico ou hidrato de cloral,so os mtodos de escolha de melhor resoluo e maisestticos, no causando traumas aparentes ao animal (OPS,1968; CCAC, 1984; Fiocruz, 1993; De Luca et al., 1996).

A Tabela 5 apresenta os mtodos de eutansiarecomendados e aceitos sob restrio para vrias espciesanimais, de acordo com a Resoluo no 714, de 20 de junhode 2002, do Conselho Federal de Medicina Veterinria -CFMV (Conselho, 2002).

Entende-se por mtodos recomendados aqueles queproduzem consistentemente uma morte humanitria, quandousados como mtodos nicos de eutansia. J os mtodosaceitos sob restrio so aqueles que, por sua natureza tcnicaou por possurem um maior potencial de erro por parte doexecutor ou por apresentarem problemas de segurana,podem no produzir consistentemente uma morte humanitria.Tais mtodos devem ser empregados somente diante da totalimpossibilidade do uso dos mtodos recomendados naResoluo no 714 de 2002 (Conselho, 2002).


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Espcies animais Mtodos recomendados

Mtodos aceitos sob restrio

Anfbios

Barbitricos, anestsicos inalveis (em algumas espcies), dixido de carbono

(CO2), monxido de carbono (CO), metano sulfonato de tricana (TMS,

MS222), hidrocloreto de benzocana, dupla seco da medula espinhal.

Pistola de ar comprimido, pistola, atordoamento e

decapitao, decapitao e seco da medula espinhal.

Animais selvagens de vida livre

Barbitricos intra-venosos (IV) ou intra-peritonais (IP), anestsicos

inalveis, cloreto de potssio com anestesia geral prvia.

CO2, CO, nitrognio (N2), argnio, pistola de ar comprimido, pistola, armadilhas (testadas

cientificamente). Animais de zoolgicos

Barbitricos, anestsicos inalveis, CO2, CO, cloreto de potssio com

anestesia geral prvia.

N2, argnio, pistola de ar comprimido, pistola.

Aves Barbitricos, anestsicos inalveis, CO, CO, pistola. N2, argnio, deslocamento

cervical, decapitao.

Ces Barbitricos, anestsicos inalveis, CO2, CO, cloreto de potssio com


N2, argnio, pistola de ar comprimido, eletrocusso

com sedao prvia.

Cavalos Barbitricos, cloreto de potssio com anestesia geral prvia, pistola de ar

comprimido.

Hidrato cloral, (IV, aps sedao), pistola,

eletrocusso com sedao prvia.

Coelhos Barbitricos, anestsicos inalveis, CO2, CO, cloreto de potssio com


N2, argnio, deslocamento cervical (

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De acordo com Olfert et al. (1998), os mtodos deeutansia mais aceitveis para camundongos referem-se utilizao de anestsicos por inalao em cmara especial,barbitricos e irradiao com microondas. Incluem-se entreos mtodos aceitveis o contato do animal com uma misturade gs carbnico e oxignio, ou ainda a exposio aomonxido de carbono. No caso de utilizao de barbitricos,deve-se utilizar sobredosagem de forma a deprimir o sistemanervoso central e produzir inconscincia irreversvel e morte.

A Resoluo no 714/2002 cita alguns mtodos deeutansia que so inaceitveis, como embolia gasosa,traumatismo craniano, incinerao in vivo, hidrato de cloral(para pequenos animais), clorofrmio, gs ciandrico ecianuretos, descompresso, afogamento, exsanginao (semsedao prvia); imerso em formol, bloqueadoresmeuromusculares (uso isolado de nicotina, sulfato demagnsio, cloreto de potssio e todos os curarizantes), almda estricnina (Conselho, 2002).

Tcnicas de risco desenvolvidas na experimentao comcamundongos

O uso adequado de animais utilizados em modelosexperimentais exige a formao de profissionais qualificadospara atender as necessidades e as exigncias para a realizaodestes procedimentos associados experimentao para finsdidtico-cientficos, desenvolvimento e inovaestecnolgicas e ensaios laboratoriais, conforme mostramnossos dados (Marona, 2003). Segundo Presgrave (2002),quando se lida com camundongos, deve-se ter em mente anecessidade de proteo no apenas dos animais, mas tambmdo pesquisador, evitando-se, dessa forma, a ocorrncia demordidas e arranhes. Logo, determinados procedimentos ecuidados devem obrigatoriamente ser utilizados em qualquertipo e etapa do manuseio com animais. Assim, imprescindvel a utilizao de EPIs (Equipamentos deProteo Individual) e, se necessrio, EPCs (Equipamentosde Proteo Coletiva).

Dentre os EPIs, destacam-se as luvas, culos deproteo, mscara cirrgica, gorros e jaleco. Dentre os EPCs,tem-se os de uso geral, como extintores de incndio echuveiros e outros mais especficos e que devem serempregados em casos particulares, como capela de fluxolaminar e capela de exausto, alm de caixa para descarte dematerial prfuro-cortante (NRC, 1989; Teixeira & Vale, 1996;Grist, 1997).

Coleta de sangue em camundongos

A coleta de sangue de camundongos necessriapara uma grande variedade de estudos cientficos e h umagrande diversidade de mtodos disponveis. Deve-se atentarpara a coleta de sangue porque ela pode estressar o animal,podendo interferir nos dados da pesquisa. So descritas naliteratura tcnicas que no requerem anestesia para coleta de

sangue, tcnicas que precisam de anestesia e procedimentosterminais. Dentre as tcnicas que no requerem anestesia,destaca-se a coleta de sangue da veia safena e da veia dorsalpedal. Exemplo de coleta que requer anestesia a tcnica deretirada de sangue da veia jugular, alm de procedimentosterminais, como puno cardaca (Hoff, 2000; Bronstad, 2001).

A escolha correta do local em que o sangue sercoletado, bem como a tcnica empregada para tal fim, deextrema importncia. Van Herck et al. (1998) citam, porexemplo, que a coleta de sangue dos sinos orbitais poderesultar em problemas irreversveis como ulceraesoculares.

Hoff (2000) cita uma srie de fatores que devemser considerados na escolha da tcnica e do local de coletade sangue em camundongos, como a freqncia da coleta,uso de anestsicos, efeito nos parmetros sangneos, volumerequerido, dentre outros, com o objetivo de se obter dadosmais confiveis, de forma a estressar de maneira menosintensa os animais empregados nos estudos.

Experimentos toxicolgicos com camundongos

Segundo Wilson (1993), o pequeno tamanho doscamundongos a maior desvantagem para sua utilizao emalguns estudos toxicolgicos. Embora quantidades usuais desangue possam ser retiradas dos camundongos sem causarmorte, provvel que a fisiologia do animal seja afetada,dificultando observaes subseqentes. Os tecidos tambmso pequenos, causando dificuldades em comparaes comhumanos. Os camundongos tm sido bastante utilizados emestudos para verificao de carcinogenicidade (Kelland, 2004).

Experimentos farmacolgicos com camundongos

Os camundongos so utilizados em diversosmodelos experimentais para avaliao da atividadefarmacolgica de extratos vegetais e de formas farmacuticas.

O ensaio sobre a motilidade intestinal foidesenvolvido no final da dcada de 1950 por Janssen &Jageneau (1957) e Wong & Way (1981). Vrios estudosforam realizados pelo nosso grupo utilizando camundongospara avaliao da motilidade intestinal de extratos vegetais(Marona et al., 1992; Michelin & Marona, 2004; Figueiredoet al., 2005; Salgado et al., 2005; Salgado et al., 2006). Esteensaio foi modificado em estudo realizado em nossolaboratrio com a finalidade de observar o bem-estar animal.Neste trabalho, utilizamos como valor mensurvel o tempode evacuao e, desta forma, os animais no foramsacrificados (Marona & Lucchesi, 2004). Isto posto, esteestudo veio ao encontro das necessidades das pesquisascientficas, com a proposio de nova tcnica apoiada nosprincpios de tica e de bem-estar dos animais.

Tambm, nosso grupo participou de uma pesquisa emque se avaliou a atividade antiesquistossomose de lipossomasde fosfatidilcolina contendo praziquantel utilizandocamundongos como modelo experimental (Mouro et al., 2005).


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CONSIDERAES FINAIS

A busca incessante de novas tcnicas que promovamo bem-estar animal um aspecto relevante na otimizao deexperimentos biolgicos, conforme mostram dados de nossogrupo (Marona & Lucchesi, 2003; Marona & Lucchesi,2004). importante destacar que os camundongos so osvertebrados mais utilizados nas pesquisas cientficas. Estefato deve-se s semelhanas genticas entre as espcies, umavez que 99% dos genes humanos foram mapeados emcamundongos, o que permite o estabelecimento demecanismos envolvidos nas desordens genticas dasespcies. O camundongo a espcie geneticamentemodificada mais utilizada nas pesquisas, com cerca de 97%do total. Milhes de animais so ainda usados para buscar acura de doenas e o desenvolvimento de novos produtos,vacinas, medicamentos ou cosmticos. A Figura 4 ilustra opercentual de animais utilizados em pesquisa cientfica.

ratos 26,6%

Outros 0,45%

aves 4,7%Artio e

Perissodactyla 1,26%

camundongos 54%

macacos 0,09%

coelhos 2,3%

cobaias 3%

outros roedores 1%

animais de sangue frio 6,6%

Figura 4. Percentual de animais utilizados em pesquisascientficas.Fonte: CEC, 2005.

coelho7%

co6%

primata1%

porco3%

rato43%

camundongo40%

ratocamundongocoelhocoporcoprimata

Figura 5. Percentual de animais utilizados em pes-quisas cientficas citado nos principais veculos dedivulgao.Fonte: Fagundes & Taha, 2004.

Na Figura 5, possvel observar que 90% dosanimais utilizados em pesquisas apresentadas em peridicosde divulgao internacional so roedores e lagomorfos.

Finalmente, importante salientar a busca portcnicas alternativas que venham substituir a utilizao deanimais em experimentos cientficos, tanto na busca pornovos frmacos e vacinas como nos procedimentos de curade doenas.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq (Braslia, Brasil), CAPES (Braslia,Brasil), FAPESP (So Paulo, Brasil), FUNDUNESP (SoPaulo, Brasil) e ao PADC-FCF-UNESP (Araraquara, Brasil),pelo apoio financeiro aos nossos projetos. Maria de FtimaRodrigues Lopes, pelo apoio tcnico nos cuidados com osanimais de laboratrio.

ABSTRACT

Laboratory animals: the mouse

The animal experimentation in the scientific research hascontributed excessively for the development of scienceand technology, promoting to long of the years thediscovery of prophylactic measures and treatments fordiseases that attack the humans. Animals of some specieshave been used in the last times, being the mouse themore intensely used and more deeply knownscientifically. The objective of this work was to carrythrough a bibliographical survey including data of ourresearch group, about the use of mice in the animalexperimentation, approaching its general biology,reproduction physiology, creation systems, genetics,habitation, feeding, handling, pain and euthanasia,techniques of risk developed in the experimentation,blood collection, pharmacological and toxicologicalexperiments. Although current trends praise the use ofalternative methods (in vitro studies, cells cultures, etc.),the animal models, as the mouse, present as mainadvantage the supply of information on the organism asa whole, fact that is not obtained with other methods,what still it makes possible its utilization in scientificresearch.Keywords: animal experimentation; mouse; general biology;techniques of risk in the experimentation.

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