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INFORME DE LABORATORIOBIOLOGIA DE LA CÉLULA IESPECTROFOTOMETRIA

JULIAN PALACIO CANOJOSE LUIS GALLEGO

LEIDY JOHANA RAMIREZMIGUEL ANDRES CAMARGOEDUARDO ANTONIO LUNA

PROFESOR:LUIS CARLOS BURGOS

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIAFACULTAD DE MEDICINA

INSTRUMENTACION QUIRURGICAMEDELLÍN

AGOSTO DE 2011

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TABLA DE CONTENIDO

MARCO TEÓRICO..........................................................................................................................3

ESPECTROFOTOMETRIA........................................................................................................3

ESPECTRO..............................................................................................................................3

ABSORBANCIA...........................................................................................................................3

ABSORBANCIA UV Y VISIBLE.............................................................................................3

ABSORBANCIA DE LA RADIACION INFRARROJA.........................................................4

TRANSMITANCIA.......................................................................................................................4

LEY DE BEER – LAMBERT.......................................................................................................5

ESPECTROFOTOMETRIA VISIBLE Y UV..........................................................................5

ESPECTOMETRIA DE INFRARROJOS..............................................................................6

ESPECTROFOTOMETRIA CONVENCIONAL...................................................................7

FICHAS DE BIOSEGURIDAD.......................................................................................................8

OBJETIVOS.....................................................................................................................................9

MATERIALES, PROCEDIMIENTOS Y METODOLOGÍAS......................................................10

RESULTADOS...............................................................................................................................12

CALCULOS....................................................................................................................................16

ANALISIS.......................................................................................................................................17

CONCLUSIONES..........................................................................................................................18

BIBLIOGRAFIA..............................................................................................................................19

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MARCO TEÓRICO

ESPECTROFOTOMETRIA

ESPECTRO

En un átomo los electrones se hallan dispuestos alrededor del núcleo en orbitas de diferente energía; mientras los electrones permanecen en sus orbitas particulares la energía del átomo permanece constante, pero si un electrón cambia de orbita, cambia también la energía del átomo. La energía de un átomo cambiara si absorbe o emite radiación.A temperaturas normales los átomos de un gas monoatómico se encuentran mayormente en el estado de mínima energía. Si el gas se calienta fuertemente o si se hace saltar una descarga eléctrica atreves del gas, pueden excitarse algunos electrones y moverse a orbitas de mayor energía. Estos átomos excitados no son estables y retornan al estado fundamental emitiendo energía en forma de radiación electromagnética.El espectro de absorción se observa cuando se pasa a través de una sustancia una radiación de una gama de frecuencias. Se absorben aquellas frecuencias que son capaces de producir excitación electrónica.

ABSORBANCIA

ABSORBANCIA UV Y VISIBLE

Proporcionar información cualitativa y cuantitativa sobre moléculas orgánicas inorgánicas y bioquímicas. Se puede clasificar en:Absorción por los compuestos orgánicos: la absorción de la radiación se debe a dos tipos de electrones: los electrones compartidos por varios átomos y que participan directamente en los enlaces y los electrones externos no compartidos, que se localizan principalmente en los átomos de oxigeno, halogenuros, azufre y nitrógeno. La longitud de onda en que absorbe una molécula orgánica va a depender de la fuerza con la que se sujeten los electrones.

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Muchas de las moléculas que no absorben la radiación UV pueden reaccionar con grupos funcionales orgánicos y formar especies que absorben en estas regiones.Absorción por especies inorgánicas: en general absorben bandas amplias de radiación visible, por lo menos en uno de sus estados de oxidación, por consiguiente son coloreados. La absorción de la radiación implica una serie de transiciones entre los orbitales d llenos y vacios del ion metálico, con energías que dependen de la naturaleza de los enlazados. El máximo nivel de absorbencia dependerá de la ubicación en la tabla periódica del elemento, y de su estado de oxidación.Absorción por transferencia de carga: es importante en el análisis cuantitativo, ya que las absortividades molares son particularmente grandes y se logra una alta sensibilidad. Se componen de un grupo donador de electrones enlazados, a otro que los acepta, al absorber la radiación se transfiere un electrón del donador a un orbital que está asociado al aceptor.En la mayoría de los complejos de transferencia de carga, el metal es el que actúa como aceptor del electrón, aunque también existen algunos complejos en los que el metal es el donador.

ABSORBANCIA DE LA RADIACION INFRARROJA

Es una técnica también usada en la química analítica, puede dar información acerca de la naturaleza de los compuestos, de la existencia o no de grupos funcionales y de la estructura de las moléculas. Aunque tiene menos aplicaciones en el análisis cuantitativo que la absorción UV o visible. Con excepción de las moléculas diatómicas mononucleares; todas las moléculas orgánicas e inorgánicas absorben la radiación infrarroja. La absorción de la radiación infrarroja lleva a una serie de transiciones entre los niveles de energía de vibración de los estados energéticos electrónicos, con la más baja excitación. La forma en que puede vibrar una molécula está relacionada con el número de sus enlaces y por tanto, con el número de átomos que la componen.

TRANSMITANCIA

La transmitancia es la cantidad de energía que atraviesa un cuerpo en determinada cantidad de tiempo. Existen diferentes clases de transmitancia, pero nos centraremos en la transmitancia óptica.Transmitancia óptica: se refiere a la cantidad de luz que atraviesa un cuerpo, en una determinada longitud de onda. Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslúcido, una parte de esa luz es absorbida por el mismo, y otra fracción de ese haz de luz atravesará el cuerpo, según su transmitancia.Esta cifra puede estar expresada también en porcentaje.

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LEY DE BEER – LAMBERT

Es una relación empírica, que relaciona, la absorción de la luz con las propiedades del material atravesado.La forma original de esta ecuación fue la ley de Lambert, que se refiere a la absorción de la luz por sólidos homogéneos. La suposición que se hace es que cada incremento igual de solido, a través del cual pasa la luz, absorbe la misma fracción de luz.

Esta fórmula también se podría explicar de la siguiente manera:A = k.c.l

La ley de Beer es una modificación de la ley de Lambert para hacer aplicable a las soluciones. Beer encontró que al aumentar la concentración del soluto absorbente de luz en la disolución, se obtenía el mismo efecto que si hubiera un aumento proporcional en el espesor absorbente de luz. Un aumento del soluto en el mismo volumen de solución aumentara el espesor efectivo de la capa absorbente de luz en el mismo factor. La reducción de intensidad, dl, que se produce cuando la luz atraviesa una capa de espesor dl que contiene una especie absorbente J a una concentración molar J es proporcional al espesor de la capa, a la concentración de J y a la intensidad I, incidente de la capa (pues la velocidad de absorción es proporcional a la intensidad) La ley de Beer – Lambert implica que la intensidad de la radiación electromagnética transmitida a través de una muestra a un número de onda dado, disminuye en forma exponencial en función del espesor de la muestra de la concentración molar. Coeficiente de absorción o extensión molar: El coeficiente de extensión molar depende de la frecuencia de la radiación incidente y es mayor donde la absorción es más intensa. El valor máximo de del coeficiente de absorción molar, es un índice de la intensidad de una transición. Sin embargo dado que las bandas de absorción se esparcen sobre un intervalo de números de onda, la estimación del coeficiente de absorción para un número de onda único no daría un verdadero índice de la intensidad de la transición.

ESPECTROFOTOMETRIA VISIBLE Y UV

La espectroscopia de absorción molecular en la región UV y visible tiene su principal aplicación en el análisis cuantitativo y es uno de los métodos preferidos en los laboratorios clínicos y químicos. La radiación electromagnética que

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podemos percibir como luz visible oscila entre 400 y 750 nanómetros. Por debajo de esta cifra está la radiación UV, y por encima el infrarrojo. Una absorción de luz UV (200 – 400 nm) corresponde a incrementos de energía de 70 – 140 Kcal mol; estos valores son intermedios entre las energías superiores, requeridas para la fotoionización de un enlace covalente simple, y las energías menores precisas para las transiciones vibratorias y rotatorias. La absorción de luz en el UV próximo implica el desplazamiento de electrones móviles.Cuanto más móvil sea el sistema de electrones, su desplazamiento ocurrirá con mayor facilidad, y por lo tanto se requiere menos energía para estas transiciones electrónicas. Es decir los sistemas móviles de electrones absorberán luz de menor frecuencia y por tanto, de mayor longitud de onda. La movilidad de los electrones aumenta cuando dos o más centros no saturados se conjugan.El grupo responsable de la absorción de luz en una molécula se denomina cromoforo, y aquello grupos que aumentan la movilidad del sistema electrónico, aunque no absorben por sí mismos, se llaman auxocromos.La conjugación de un grupo cromoforo con otro, no solo produce un desplazamiento bato crómico (corrimiento de una banda de absorción a longitudes de onda mayores) sino que en general aumenta la absorción, y, cuando los grupos cromoforos no se conjugan, su absorción es aditiva. Cuando el numero de enlaces dobles conjugados aumenta continua el desplazamiento bato crómico, hasta que, la absorción tiene lugar en región visible del espectro es decir entre 400 y 750 nm.Las estructuras absorbentes más importantes son los compuestos aromáticos y los bencénicos. Aquí la disposición de los orbitales proporciona un sistema muy móvil, que con mucha facilidad está influenciado por la presencia de grupos funcionales ligados al núcleo.

ESPECTOMETRIA DE INFRARROJOS

La radiación infrarroja usada más frecuentemente es espectrometría abarca el intervalo 2 – 15 u. la energía de dicha radiación, cuando se absorbe corresponde a 5 Kcal mol, por lo que es demasiado pequeña para promover tránsitos electrónicos; pero bastante grande para originar las transiciones vibratorias en el estado fundamental de la molécula. Esto significa que las curvas de absorción de infrarrojos son mucho más específicas que las de las regiones UV y visibles.Los átomos de una molécula están vibrando constantemente con una frecuencia definida, absorbiéndose energía radiante de tales frecuencias con cualquier vibración que perturbe el equilibrio dipolar de la molécula.El estudio de las vibraciones por medio de la ley de Hooke supone que el sistema de enlaces es independiente del resto de la molécula; esto puede ser cierto para los enlaces en que participa el hidrogeno, o otros átomos monovalentes, pero no ocurre lo mismo en los enlaces que constituyen el esqueleto de una molécula compleja. Por esto el espectro de infrarrojo puede dividirse en dos regiones:

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De 7 – 11 u (1350 – 900 cm). Esta es la región de identificación de huellas dactilares. Puede utilizarse para caracterizar un compuesto muy específico. De 2.5 – 7 y 11-15 u. en estas regiones pueden reconocerse muchos grupos funcionales.Se utiliza sobre todo para análisis cualitativos, (tiene mayor utilidad cuando se aplica en un compuesto puro).Pero también se realizan análisis cuantitativos en el infrarrojo, ya que los espectros vibratorios obedecen la ley de Beer.

ESPECTROFOTOMETRIA CONVENCIONAL

En los métodos espectrofotométricos convencionales, se mide directamente la absorbancia del analito, o después de que ha reaccionado con un reactivo y se forma un producto capaz de absorber la radiación. Las separaciones previas en ocasiones ayudan a eliminar las especies que pueden absorber e interferir con la determinación espectrofotométrica del analito.También es frecuente tratar la muestra con un reactivo selectivo de modo que en la reacción se forme una especie que absorba en una región donde no haya interferencias. Otras veces se puede separar el producto por extracción o con otro método de separación.

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FICHAS DE BIOSEGURIDAD

Naranja de metilo (C14H14N3NaO3S)Es un colorante azoderivado, con cambio de color de rojo a naranja-amarillo entre pH 3,1 y 4,4.Temperatura de Ebullición: No reportado; temperatura de Fusión: > 300°CDensidad (Agua1):1.0 kg/L a 20°C; Presión de Vapor; No reportado; Densidad de Vapor (Aire1): 11.3.DL50 (oral-rata): 60 mg/kg.Causa irritaciones por inhalación, contacto con la piel y ojos, por ingestión causa vomito, diarrea y irritaciones en el tracto gastrointestinal.Las medidas de protección que se deben de utilizar son: Guantes, bata (manga larga) y calzado cerrado. Aunque cabe nombrar que para una mejor protección se recomienda también utilizar lentes protectores.Agua destiladaAgua osmotizada.No existe ningún riesgo para las personas ni para el medio ambiente.Para su manejo no se requiere utilizar ninguna indumentaria de protección. Punto. De ebullición: 100ºC Punto. de fusión: 0ºC Densidad relativa: 1g/cm3

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OBJETIVOS

Interactuar con la absorbancia de algunos compuestos.

Alcanzar el punto máximo de absorbancia según la longitud, de una mezcla estable.

Adquirir conocimiento de la absorción de luz en algunos compuestos junto al manejo del espectrofotómetro.

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MATERIALES, PROCEDIMIENTOS Y METODOLOGÍAS

Los materiales utilizados en el laboratorio de espectrofotometría fueron:

Cinco tubos de ensayo para examinar cinco soluciones de concentraciones distintas, además de un tubo adicional que contenía una muestra problema que fue utilizada en la tercera práctica del laboratorio y sus respectivas etiquetas enumeradas.

Dos pipetas graduadas a mililitros, las cuales permitían la correcta medición de soluto y solvente utilizado dentro de las soluciones trabajadas.

Un pipeteador automático, que permitía la captación de la cantidad indicada de soluto o solvente dentro del proceso del laboratorio.

Un recipiente que contenía agua destilada, la cual fue usada como solvente para la sustancia que se trabajó.

Un recipiente adicional que sirvió como contenedor del soluto trabajado en el laboratorio, el cual en el caso particular del presente grupo fue naranja de metilo (327.34 g/mol) a 100 mg/mL.

Un espectrofotómetro con dos cubetas de cuarzo, instrumentos principales en el laboratorio de espectrofotometría, puesto que su utilización ayudó a la cuantificación de las sustancias a partir de la longitud de onda con las que se trabajó.

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Procedimientos:El procedimiento consistió, en primera estancia, en determinar el punto máximo de absorbancia de la sustancia correspondiente a cada grupo, en el caso particular del presente grupo de informantes, fue, como antes se mencionó, el naranja de metilo (327.34 g/mol) a 100 mg/mL. Al principio de esta primer práctica se calibró el espectrofotómetro a cero, con el “Blanco” (solución con todos los componentes de la solución menos la sustancia trabajada, esto es, sin el colorante, es decir, agua destilada), con una solución de 5 mL de agua destilada y 5 mL de naranja de metilo, luego se procede a hallar las absorbancias a diferentes longitudes de onda, y como punto máximo de absorbancia, en el caso particular, se obtuvo, a una longitud de onda de 460 nanómetros, una absorbancia de 0.145.En segunda estancia, pasamos a elaborar una curva de calibración del naranja de metilo en diferentes concentraciones, como acto primordial a esta práctica, se elaboraron cinco soluciones a diferentes concentraciones, luego, en el espectrofotómetro, fueron medidas las absorbancias de cada una de ellas, teniendo en cuenta el punto máximo de absorbancia de la práctica anterior, entonces, como resultado, se obtuvo una tabla con valores ascendentes, de la cual derivaría una gráfica concentración versus absorbancia con una línea ascendente.Por último, pasamos a determinar la concentración de una muestra problema, la cual nos fue asignada por uno de los monitores del laboratorio, entonces, puesto que de la solución se desconocía su concentración, se procedió a averiguarla por dos medios, uno de ellos era una interpolación, esto es, una comparación en la gráfica elaborada a partir de la curva de calibración. El otro medio era por una fórmula que contiene la absorbancia y la concentración estándares, que se tenían identificadas gracias a los puntos anteriores, y la absorbancia y concentración problemas o desconocidas, de las cuales se podía conocer la absorbancia y poder despejar la concentración de manera efectiva.Metodología:La metodología utilizada fue la de una guía preestablecida y una delimitación teórica respecto a los procedimientos a trabajar antes de comenzar con la actividad, una breve presentación de los monitores y la ejecución de la práctica de laboratorio, con la ayuda de los mencionados tutores y el profesor a cargo del ejercicio, se desarrollaron las prácticas propuestas en función de demostrar y aplicar la ley de Lambert-Beer.

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RESULTADOS

Determinación del espectro de absorción de un colorante dado.

λ A

400nm 0.092

420nm 0.118

440nm 0.136

460nm 0.145

480nm 0.130

500nm 0.090

520nm 0.045

540nm 0.013

560nm 0.0

Para determinar el espectro de absorción se utilizó metil-naranja C14H14N3NaO3S con una concentración estándar 100mg/ml a diferentes longitudes de onda (λ) y se encontró que a la longitud de onda de 460nm la sustancia presenta la máxima Absorbancia ya que como se muestra en la tabla tenemos valores inferiores de (A) con longitudes de onda mayores o menores.

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380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 5800

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

A

λ

Curva de calibración del colorante asignado. La sustancia antes de los 460nm la cantidad de energía radiante o flujo radiante que es absorbido como función de la longitud de onda de dicha energía presenta una Absorbancia menor y después de los 460nm la Absorbancia vuelve a caer

Tubo N° 1 2 3 4 5SLN Colorante 1ml 2ml 3ml 4ml 5mlAgua Destilada 9ml 8ml 7ml 6ml 5ml

Absorbancia 0,025 0,052 0,080 0,122 O,145

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Ubicamos la (λ) en 460nm que es la máxima Absorbancia y variamos la concentración en cinco tubos como podemos ver en la tabla. Para obtener la siguiente curva.

A

0

2

4

6

8

10

12

0,03 0.06 0,09 0,12 0,15

Concentración (M)

Determinación de la concentración de la muestra problema.

Se entrega una muestra problema de metil naranja a la que se le mide la Absorbancia esta es: 0,134 medida también con una longitud de onda de 460nm al igual que la muestra estándar que utilizamos con una Absorbancia 0,145 y con una concentración conocida y calculada de 0,15M.

Utilizando la ecuación que relaciona Absorbancia y concentración se calculo una concentración de la muestra problema de 0,138M.

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Extrapolando en la curva de calibración:

0,01 0,03 0.06 0,09 0,12 0,15

Concentración (M)

La extrapolación arroja un dato alejado al cálculo de: 0,0125

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CALCULOS

Para los cálculos en la curva de Absorbancia se requirió hallar la concentración en Molaridad:

1°) 1mol de metil naranja -------------x-----------327,34g

0,0003moles <----------------------- O,1g } 100mg/ml—tubo 1

2°) 1mol de metil naranja ------------x------------327,34g

0,0006moles -------------------------------0,2g} tubo 2

3°) 1mol de metil naranja ------------x------------327,34g

0,0009moles -------------------------------0,3g} tubo 3

4°) 1mol de metil naranja ------------x------------327,34g

0,0012moles ---------------------------------0,4g } tubo 4

5°) 1mol de metil naranja ------------x------------327,34g

0,0015moles--------------------------------0,5g } tubo 5

0,0003 moles 0,0006moles

1°) M=-------------------= 0,03 2°) M=--------------------------=0,06

0,01l 0,01l

0,0009moles 0,0012moles

3°) M=-----------------------= 0,09 4) M= -----------------------=0,12

0,01l 0,01l

0,0015moles

4°) M=----------------------------=0,15

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0,01l

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[?] de metil naranja

Λ= 460nm

A=0,134

Aplicando la ecuación: Ae/Ce=Ap/Cp

Ae= 0,145= Absorbancia estándar. Ce= 0,15 concentración del estándar.

Ap= 0,134 Absorbancia problema. Cp=concentración del problema.

Ae/Ce=Ap/Cp

0,145 0,134

---------------= ------------------

0,15M X

0,134 . 0,15M

X=------------------------= 0,138

0,145

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ANALISIS

El espectro de absorción del colorante asignado muestra una creciente al comenzar porque la concentración es muy parecida a la del blanco, entonces comienza a separarse poco a poco del rango inicial y alcanza su punto máximo de absorbancia, para así, entonces, permitir asegurar que la concentración es la que juega el papel más importante dentro de la solución, puesto que si tiene muy poca, va a ser una absorbancia baja, porque “se absorben aquellas frecuencias que son capaces de producir excitación electrónica”, pero luego desciende debido a que ya no existe un equilibrio en la solución que le permita al colorante absorber la intensidad incidente optimizando la transmitancia mucho más que la absorbancia.

La absorbancia es directamente proporcional a la concentración, por tanto, siempre que la concentración de colorante se aumente, la absorbancia aumenta también.

Toda vez que exista una gráfica interpolable, será posible, por medios gráficos determinar la concentración de las sustancias problema pero debido a que es un medio gráfico, arroja un margen de error considerable, además, el espectrofotómetro presenta falencias para determinar la absorbancia.

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CONCLUSIONES

La absorbancia es la capacidad que tiene algunos compuestos para absorber la radiación electromagnética, pudimos observar cómo, dependiendo de la concentración y la longitud a la cual se le aplique un rayo, puede alcanzar un punto máximo de absorción.

Según esto la longitud y la absorbancia son proporcionales hasta alcanzar el punto máximo y de allí empieza a descender.

Según la concentración varia la absorbancia del compuesto.Variando la cantidad de solvente (Siendo agua destilada) se puede disminuir la absorbancia.

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BIBLIOGRAFIA

BARNARD, J.A. y CHAYEN, R. Métodos modernos de análisis químico, capitulo 3 (pág. 57, 62, 68, 69, 70, 75) España, 1970, ediciones urmoATKINS, P. Química física, capitulo 13 (pág. 432 – 434) China, 2008, Editorial panamericana.DOUGLAS, A. Química analítica, capitulo 23 (pág. 614 – 620) 3ra edición, México, 2005, international Thompson editores S.A