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Depto. Tecnologia Agroindustrial e Sócio-Economia Rural Centro de Ciências Agrárias – Campus de Araras

Método s de análises e monitoramento microbiológico em laboratório de

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1

• Profª Sandra Regina Ceccato Anton ini – Doutora no Depto.Tecnologia

Agroindustrial e Sócio-economia Rural, CCA/UFSCar, com pós-doutorado em

genética molecular de leveduras na Universidade de Sheffield, Inglaterra.

Endereço: Depto. Tecnologia Agroindustrial e Sócio-Economia Rural

Centro de Ciências Agrárias

Universidade Federal de São Carlos

Via Anhanguera, km174 – C.Postal 153

13600-970 – Araras - SP

Fone/fax: (19) 3543-2614

e-mail: antonini@cca.ufscar.br

A presente apostila se refere ao curso de treinamento ministrado nas unidades de

Iguatemi-PR, no período de 19 a 21 de fevereiro de 2004, e de Ivaté-PR, no

período de 16 a 18 de fevereiro de 2004, pertencentes à Usina de Açúcar Santa

Terezinha Ltda.

Fevereiro/2004

2

INDICE

1. Introdução………………………………………………………………… 03

2. Monitoramento microbiológico........................................................... 05

3. Leveduras..............................................................................……….. 08

4. Bactérias.....................................…………………………...………….. 10

5. Métodos microbiológicos para controle em processos industriais de

produção de álcool.........…………………………………………………...

15

5.1. Leveduras..………………………………………………………... 15

5.1.1. Contagem direta e determinação da viabilidade celular em

leveduras.......................…………………....………………………………

15

5.1.2. Plaqueamento e diluição em série....…………………………… 19

5.1.3. Meios diferenciais/seletivos para detecção de leveduras

selvagens...............................................................................................

21

5.2. Bactérias..……………………………………………………………. 26

5.2.1. Plaqueamento e diluição em série....…………………………… 26

5.2.2. Coloração de Gram................................................................... 27

6. Preparo de meios de cultivo e soluções ........................................... 30

7. Bibliografia......................................................................................... 33

3

1. INTRODUÇÃO

Fermentação alcoólica é um fenômeno através do qual os açúcares

são transformados em álcool e gás carbônico, por ação das leveduras. A

fermentação dos mostos realiza-se em três fases distintas: pré-fermentação,

fermentação principal e pós-fermentação.

A pré-fermentação se inicia quando o fermento (leveduras) é

adicionado ao mosto devidamente preparado, e se caracteriza por ativa

multiplicação das células e elevação lenta e gradual da temperatura do meio.

Após 5 a 6 horas, com pouca espuma, inicia-se a fermentação

principal, que é reconhecida pela elevação rápida da temperatura, queda da

densidade do mosto por causa do desaparecimento dos açúcares e da formação

equivalente do álcool. A acidez eleva-se abaixando o pH. Essa fase termina

quando as espumas desaparecem, durando de 9 a 10 horas.

A pós-fermentação é caracterizada pela diminuição lenta e gradual

da temperatura do mosto, diminuição do desprendimento do gás carbônico e não

se formam mais espumas. Essa fase dura de 6 a 8 horas; e deve durar o mínimo

possível para evitar a infecção do vinho e do pé-de-cuba, que será utilizado em

nova fermentação. O mosto totalmente fermentado é denominado vinho.

O processo de fermentação é o seguinte:

C6H12O6 → 2 CH2OH + 2 CO2

A Figura 1 mostra um esquema do processo fermentativo para

produção de etanol.

4

Figura 1. Esquema representativo do processo fermentativo para produção de

etanol

5

2. MONITORAMENTO MICROBIOLÓGICO

Além da escolha e da preparação do fermento, algumas condições

ótimas devem ser mantidas durante o processo industrial no sentido de obter

produtividade máxima de etanol a partir dos açúcares fermentescíveis. Entre os

parâmetros a serem considerados, devem figurar, entre outros, o teor de fermento

na dorna, a viabilidade celular, a ocorrência de infecções, o pH, a temperatura e a

concentração de açúcar redutor total no mosto. Há, dessa forma, necessidade de

um rigoroso controle do processo de fermentação, envolvendo a avaliação dos

rendimentos práticos e simultaneamente o monitoramento microbiológico.

O caldo de cana, principalmente na fase de extração, permite o

desenvolvimento de uma série de microrganismos, pois tem concentração de

açúcares, pH e temperatura favoráveis. Os produtos de metabolismo destes

microrganismos são incorporados ao caldo, encontrando-se substâncias como

álcoois, ácidos orgânicos e polissacarídeos que alteram a sua composição

química, podendo causar sérios transtornos nos processos de fabricação. Tanto a

reprodução dos microrganismos como a formação dos metabólitos se fazem às

custas do açúcar inicialmente presente na cana, representando perdas não

desprezíveis, na forma de degradação de açúcar e de álcool não produzido.

Entre os contaminantes que mais aparecem nos processos

fermentativos, ocorrendo inclusive na etapa da fermentação alcoólica,

predominam as bactérias gram-positivas dos gêneros Lactobacillus, Bacillus e

Leuconostoc. A sacarose consumida por esses microrganismos deixará de ser

transformada em álcool ou cristais de sacarose, provocando assim perdas do

açúcar recuperável, o qual será transformado em ácidos orgânicos e dextrana, por

exemplo.

A determinação do número e tipos de bactérias presentes no

processo são parâmetros importantes para o controle da infecção. Técnicas têm

sido propostas para estimar a população bacteriana de amostras coletadas nas

diferentes fases do processo: contagem direta ao microscópio e semeadura em

placas (plaqueamento). O emprego de um ou outro método vai depender das

6

condições e instalações do laboratório da indústria, além de um treinamento

específico aos laboratoristas.

Estudos já realizados revelaram que uma concentração bacteriana

da ordem de 109 UFC/mL leva a uma queda no rendimento alcoólico, chegando a

atingir 100% com Lactobacillus e 60% com Leuconostoc, e redução na viabilidade

das células de leveduras a cerca de 10%.

Existem também bactérias que induzem a floculação de

Saccharomyces cerevisiae, tendo sido observados aumento no tempo de

fermentação e redução de aproximadamente 15% no rendimento fermentativo

como conseqüência desta floculação. Essa acontece provavelmente devido à

presença de uma capa protêica de natureza gelatinosa sobre as bactérias,

acarretando assim a fixação mecânica nas células de leveduras ou através de

uma ponte entre íons de cálcio e polímeros aniônicos da superfície da levedura.

Essas bactérias indutoras de floculação do fermento estão restritas a linhagens de

Lactobacillus, mais particularmente L. fermentum.

A utilização de agentes antimicrobianos reduzem os danos causados

pelos contaminantes, além de medidas como limpeza das moendas, tubulações,

instalações da fermentação e vários outros procedimentos, tais como descarte de

fundo de dorna, returbinação do fermento e tratamento ácido. Porém, o eficiente

controle só é conseguido com o uso de antimicrobianos adequados e na dosagem

correta, pois a aplicação racional desses produtos deve visar apenas a população

de bactérias e não a de leveduras.

O uso contínuo de antibióticos pode levar ao desenvolvimento de

linhagens resistentes, as quais se tornam cada vez menos sensíveis à sua ação,

além do alto custo.

É importante que cada laboratório industrial utilize técnicas para

detecção de sensibilidade das bactérias aos agentes antimicrobianos que sejam

adequadas às suas condições operacionais, permitindo desta forma, verificar

quais são exatamente os antibióticos ou biocidas mais eficientes para a aplicação

industrial.

7

Se para o controle da contaminação bacteriana é possível a

utilização de agentes antimicrobianos, o mesmo não pode ser dito em relação às

leveduras selvagens ou “invasoras”. Algumas unidades industriais têm se

deparado com problemas atribuídos à presença de leveduras contaminantes que,

altamente competitivas dentro das condições existentes, passam a predominar na

população de células presentes. Essas podem vir de fontes como melaço, caldo,

água de lavagem de cana e o próprio solo. A ocorrência dessas leveduras tem

sido freqüentemente associada a ocasiões em que se verificam reduções

significativas da eficiência industrial, com queda no rendimento fermentativo, maior

tempo de fermentação e maior formação de espumas pelo aumento da

viscosidade.

A instalação dessas leveduras na fermentação pode acarretar

também sérios problemas operacionais. Nos processos de batelada e batelada-

alimentada, os inconvenientes eram mais facilmente contornados, ao passo que

para os processos contínuos, passaram a constituir um sério problema.

A eliminação dessas linhagens invasoras, quando se detecta prejuízo

considerável ao processo, consiste na substituição do fermento por fermento

adaptado, aliado a uma melhoria na assepsia das tubulações, na qualidade da

água utilizada na diluição do mosto, na eficiência do tratamento térmico/químico

do caldo e controle da temperatura de fermentação.

O permanente monitoramento microbiológico e o aperfeiçoamento de

seus métodos permite o acompanhamento da qualidade do fermento e a detecção

das leveduras selvagens, ou seja, a diferenciação entre a levedura do processo e

a levedura contaminante (selvagem), que nem sempre é muito fácil.

Os meios de cultura diferenciais ou seletivos para isolamento e

quantificação de populações de leveduras contaminantes baseiam-se em

características fisiológicas comuns às leveduras selvagens, mas ausentes em

linhagens do processo, iniciadoras da fermentação. Dentre essas, destacam-se as

nutricionais (variações nas fontes de carbono, nitrogênio e nos fatores de

crescimento) e resistência a certos compostos como antibióticos e corantes.

Entretanto, um único meio não é totalmente satisfatório para a avaliação de todas

8

as leveduras presentes, sendo portanto necessário o emprego de vários tipos de

meios quando se pretende detectar a maioria das leveduras presentes.

Somente com um certo nível de conhecimento da flora e

identificados os tipos predominantes, é possível propor métodos de controle

eficientes e econômicos, ou ainda modificar os processos para impedir a

reinfecção.

3. LEVEDURAS

Leveduras são microrganismos cujo crescimento dominante é na

forma unicelular. A reprodução é assexuada por brotamento multilateral e polar ou

por fissão, e sexuada por meio de ascósporos. As características morfológicas das

leveduras determinadas por microscopia mostram formas esférica e ovóide, pera,

cilíndrica e mesmo alongadas em pseudomicélio (Figura 2).

Em geral, as células de leveduras são maiores do que as bactérias,

mas as menores leveduras não são tão grandes como as maiores bactérias.

Esses microrganismos variam consideravelmente, no que se refere às suas

dimensões, com limites desde 1 a 5 µ de largura e 5 a 30 µ de comprimento.

Cada espécie tem uma forma característica, mas, mesmo em culturas puras, há

consideráveis variações de tamanho e de forma das células individuais,

dependendo da idade e do ambiente. As leveduras não possuem flagelos ou

outros órgãos de locomoção.

Apresenta partes visíveis como parede celular, citoplasma, vacúolos,

glóbulos de gordura, grânulos e núcleo (Figura 3).

9

Figura 2. Morfologia das células de leveduras (Saccharomyces cerevisiae). A,

células brotantes; B, células dispostas em cachos; C, asco e

ascósporos (esporos) característicos; D, pseudomicélio. Todas as fotos

foram tiradas ao microscópio em aumento de 400X (As fotos C e D

foram fornecidas por C.D.Tosta).

10

Figura 3. Esquema de uma célula de levedura.

4. BACTÉRIAS

Embora existam milhares de espécies bacterianas diferentes, os

organismos isolados apresentam uma das três formas gerais: elipsoidal ou

esférica, cilíndrica ou em bastonete e espiralada ou helicoidal (Figura 4). As

bactérias medem aproximadamente 0,5 a 1,0 por 2,0 a 5,0 µ.

O exame da célula bacteriana revela certas estruturas definidas por

dentro e por fora da parede celular, esquematizadas na Figura 5. As estruturas

externas à parede celular compreendem os flagelos, os pelos (fímbrias) e a

cápsula. A parede celular é uma formação rígida que dá forma à célula. A rigidez

pronunciada da parede celular pode ser facilmente demonstrada, submetendo-se

bactérias de formas diferentes a condições físicas extremas, tais como pressões

osmóticas muito elevadas ou muito baixas ou

11

Figura 4. A diversidade de bactérias. A, Pseudomonas aeruginosa, um bastonete

flagelado; B, Streptococcus, células esféricas dispostas em cadeias;

C, Spirillum volutans, célula espiralada; D, Chondromyces crocatus, as

células em forma de bastonete movem-se juntas, formando uma

estrutura que carrega os esporos; E, Chroococcus, uma cianobactéria

na qual os indivíduos ficam aderidos numa cápsula gelatinosa

(Retirado de Raven & Johnson, 1990).

12

Figura 5. Representação esquemática da organização estrutural de uma célula

bacteriana (Retirado de Pelczar et al., 1980).

temperatura abaixo de zero seguidas de aquecimento; as células manterão sua

forma original. As paredes celulares bacterianas parecem ser indispensáveis ao

crescimento das bactérias e à sua divisão. Células cujas paredes foram removidas

especificamente, isto é, protoplastos, são incapazes de efetuar divisões ou

crescimento normais. Substâncias químicas interessantes são encontradas na

parede celular das bactérias, como por exemplo, o ácido diaminopimélico (DPA), o

ácido murâmico e o ácido teicóico. Essas substâncias são típicas das bactérias e

de microrganismos que com ela se relacionam estreitamente. O componente da

parede celular que determina a forma da bactéria é, em grande parte, o

13

peptoglicano, polímero insolúvel que é um constituinte de todas as paredes

celulares bacterianas.

A parede celular das células gram-negativas é quimicamente mais

complexa. As paredes dos organismos gram-positivos possuem menor quantidade

de aminoácidos, mas os ácidos teicóicos são característicos dessas células. O

conteúdo lipídico das bactérias gram-negativas é consideravelmente maior do que

o dos organismos gram-positivos (Figura 6).

Imediatamente abaixo da parede celular existe uma fina membrana,

ou cobertura, chamada membrana citoplasmática, às vezes também conhecida

como membrana protoplasmática ou, simplesmente, membrana plasmática. As

formações da membrana como as intrusões e extrusões, desempenham papel

variado nos processos de metabolismo e de reprodução, envolvendo-se, por

exemplo, na formação do septo durante o processo de divisão celular das

bactérias.

O material celular, contido dentro da membrana citoplasmática,

constitui o citoplasma, onde podem ser identificados depósitos concentrados de

certas substâncias, como volutina, ácido, entre outros.

As células bacterianas não contém o núcleo típico das células de

animais e vegetais superiores. Possuem, contudo, dentro do citoplasma

“corpúsculos” que são encarados como estrutura nuclear, confinando o DNA da

célula bacteriana a esta área. Não há evidência de uma membrana nuclear

separando o núcleo do citoplasma, o que é característico das células eucarióticas.

Algumas bactérias têm a capacidade de produzir um corpo oval de

parede espessa (um por célula), que é uma célula altamente resistente. Essas

formas resistentes são chamadas de endosporos, ou, mais comumente, esporos.

São extremamente resistentes aos agentes físicos e químicos adversos.

14

Figura 6. As paredes celulares bacterianas e a coloração de Gram. A camada de

peptoglicano é mais grossa nas bactérias gram-positivas, permitindo a

retenção do corante cristal-violeta e corando-se assim de púrpura. As

bactérias gram-negativas não retém esse corante e assim exibem a

coloração vermelha do contracorante (safranina). Além disso, a

concentração de lipídeos nas bactérias gram-negativas é maior que nas

gram-positivas. (Retirado e adaptado de Raven & Johnson, 1990).

15

5. MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS PARA CONTROLE EM PROCESSOS

INDUSTRIAIS DE PRODUÇÃO DE ÁLCOOL

5.1. Leveduras

5.1.1. Contagem direta e determinação da viabili dade celular em

leveduras

Não existe um método absoluto para determinação da viabilidade

celular de uma população de células de levedura. Para estimar a proporção de

células viáveis em uma cultura ou processo fermentativo, métodos baseados no

plaqueamento ou observação microscópica têm sido utilizados. Os métodos de

contagem direta são rápidos e simples, exigem um mínimo de equipamento,

permitindo que seja observada, simultaneamente, a morfologia celular.

Este aspecto é extremamente importante porque a tolerância da

levedura ao seu produto de fermentação, o etanol, é bastante significante em

relação à eficiência de produção de álcool em fermentações em escala industrial.

Tem sido verificado também que a presença de álcoois superiores (n-butanol,

isoamílico), ácidos graxos e seus ésteres mesmo em baixas concentrações,

juntamente com o etanol, agem de maneira sinergística intoxicando a célula da

levedura, levando-a à morte e consequentemente diminuindo a viabilidade celular.

No controle da viabilidade celular nos processos de produção de

levedura (fermento prensado) e fermentação alcoólica (álcool), a coloração das

células da levedura com azul de metileno ou eritrosina e o cultivo por

plaqueamento são os mais empregados.

A técnica de coloração com azul de metileno consiste em se

misturar partes iguais da suspensão de levedura (amostra), adequadamente

diluída, e da solução corante (azul de metileno). As células com alta atividade

fisiológica não se colorem, enquanto as células inativas (mortas) apresentar-se-ão

coloridas de azul (Figura 7). A porcentagem ou o número de células viáveis é

determinado transferindo-se com uma pipeta de Pasteur a amostra para a câmara

16

de Neubauer. Trata-se de uma lâmina especial, precisamente dividida em

quadrados de 1 mm2 de área (Figura 8); a lâmina é coberta com uma lamínula,

que deixa um volume, sobre cada quadrado, de 10-4 cm3 ou 0,1 mm3 (equivalente

a 1 mL).

Figura 7. Determinação da viabilidade celular de leveduras com azul de metileno.

As células coradas de azul são células mortas enquanto as incolores

são células viáveis (A foto foi cedida por C.D. Tosta).

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Figura 8. A Câmara de Neubauer. A. O círculo indica a área aproximada coberta

pelo aumento de 100 vezes ao microscópio (10X ocular e 10X

objetiva) de uma câmara de contagem padrão. B. Aspecto de um

quadrado integrante do quadrado médio, mostrando que devem ser

contadas as células que tocam as linhas do topo e da esquerda do

quadrado, desprezando aquelas que tocam a linha de baixo e da

direita do quadrado.

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Procedimento

1- Fazer a diluição conveniente em um tubo de ensaio.

2- Após a diluição, transferir 0,3 mL para um tubo de ensaio e adicionar 0,3 mL da

solução de azul de metileno-citrato de sódio.

3- Homogeneizar a mistura em agitador de tubos.

4- Colocar a lamínula na Câmara de Neubauer e com auxílio da pipeta Pasteur,

transferir um pequeno volume da amostra preparada.

5- Levar ao microscópio óptico e com a objetiva de 40X, fazer a contagem das

células nos campos : 5 campos na segunda coluna e 5 campos na quarta

coluna (total de 10 campos), ou os 4 retículos centrais em cada um dos 25

campos (total de 100 retículos). Contar aproximadamente 40 células por

campo ou 3 células por retículo. No primeiro caso, escolher 2 limites em cada

quadrado nos quais serão desprezadas as células que forem encontradas em

cima desses limites. Por exemplo, contar as células que estão nos limites

superior e lateral esquerdo do quadrado e desprezar as do limite inferior e

lateral direito.

6- Com o contador, marcar o número de células viáveis (células que não se

colorem com azul de metileno) e células inviáveis (células coloridas de azul

intenso).

Viabilidade (%)= (Número de células vivas / Número total de células) X 100

No. total de células/mL = no. células nos 10 campos X 2,5 X diluição X 104

ou

No. total de células/mL = no. células nos 100 retículos X 4 X diluição X 104

19

5.1.2. Plaqueamento e diluição em série

A semeadura em placas ou plaqueamento revela o número de

células de leveduras capazes de se multiplicarem e formarem colônias em meios

de cultivo apropriados e sob condições de incubação adequadas. Cada colônia

desenvolvida é suposta ter sido originada a partir de uma unidade viável, a qual

pode ser um organismo ou muitos.

Como para uma maior precisão da análise somente deverão ser

contadas as placas com número de colônias entre 30 e 300, uma diluição da

amostra deverá ser feita antes de se proceder a sua mistura com o meio de

cultura (Figura 9).

Procedimento

1- Tomar 1 mL da amostra (suspensão de células) e transferir para um tubo de

cultura com 9 mL de água ou solução salina esterilizada (diluição 1:10 ou 10-

1).

2- Homogeneizar em agitador de tubos.

3- Pipetar 1 mL da diluição anterior para outro tubo com 9 mL de água ou solução

salina esterilizada e ter-se-á uma diluição 1:100 ou 10-2. Diluições maiores

podem ser obtidas tomando-se 1 mL de cada diluição sucessiva e colocando

em tubos com 9 mL de água ou solução salina, até se atingir a diluição

desejada.

4- Fazer a semeadura em placas de Petri, pipetando 1 mL e adicionando-se o

meio de cultivo adequado liquefeito e resfriado a uma temperatura de 45-46oC.

Agitar a placa com movimentos horizontais para distribuir as células com

uniformidade (plaqueamento em profundidade). Semear no mínimo 2 placas de

cada diluição e escolher 3 diluições.

5- Incubar a 32oC por 24-48 horas.

20

Cálculo: número de colôn ias na placa X índ ice de diluição da amostra = número de bactérias/mL (Por exemplo, considerando -se que a placa que recebeu a diluição de 1/10.000 contém 32 colôn ias, pod e-se estimar que existem 32 X 10.000 = 320.000 bactérias/mL da amostra ou 3,2 X 105

Figura 9. Contagem em placa e diluições seriadas. Na diluição seriada, o inóculo é

diluído em uma série de tubos de diluição. No exemplo apresentado,

cada tubo de diluição subseqüente conterá um décimo do número de

bactérias presentes na anterior. Posteriormente, as amostras destes

tubos serão transferidas para placas de Petri contendo meio de cultura

onde ocorrerá o crescimento das colônias e a contagem. O número de

colônias será utilizado na determinação da quantidade de bactérias

presentes na amostra original (Retirado de Tortora et al., 2003).

21

6- Alternativamente, pode-se inicialmente colocar o meio de cultura (WLN) nas

placas de Petri, esperar a solididificação e a seguir, pipetar 0,1 mL espalhando

o inóculo com alça de Drigalsky (plaqueamento em superfície). A Figura 10

mostra a metodologia utilizada para contagem em placas, comparando as

técnicas de plaqueamento em superfície e em profundidade (´pour-plate´).

Fazer a contagem de cada placa e para estimar o número de colônias,

escolher as placas que apresentem de 30 a 300 colônias. Calcular a média das

colônias das duas placas e multiplicar pelo fator de diluição para se obter o

número de colônias. Se for utilizado o plaqueamento em superfície, multiplicar

por 10. A Tabela 1 traz as regras para interpretar e reportar a contagem em

placas.

5.1.3. Meios diferenciais / seletivos para detecção de leveduras

selvagens

Embora a diferenciação entre a levedura alcoólica (processo) e a

levedura contaminante (selvagem) não seja muito fácil, a presença desta pode ser

detectada utilizando-se meios diferenciais/seletivos, isto é, o meio empregado

deve permitir somente o desenvolvimento da levedura contaminante. Entretanto,

um único meio não é totalmente satisfatório para a avaliação de todas as

leveduras presentes, sendo portanto necessário o emprego de vários tipos de

teste quando se pretende detectar, senão todas, mas a maioria das leveduras

contaminantes presentes.

De um modo geral, os meios seletivos ou diferenciais podem ser

classificados em:

a- meios para detecção de leveduras contaminantes não Saccharomyces

b- meios para detecção de leveduras contaminantes (selvagens)

Saccharomyces

22

Figura 10. Metodologia utilizada para a contagem de colônias em placa (Retirado

de Tortora et al., 2003).

23

24

Os meios diferenciais (seletivos) para isolamento e quantificação de

populações de leveduras contaminantes baseiam-se em características

fisiológicas comuns às leveduras selvagens, mas ausentes em linhagens

utilizadas em processos fermentativos para a produção de álcool. Dentre essas

características, destacam-se as nutricionais (variações nas fontes de carbono,

nitrogênio e nos fatores essenciais de crescimento) e resistência a certos

compostos como antibióticos, corantes, etc.

Vários são os meios propostos para a detecção de leveduras

contaminantes, Saccharomyces ou não Saccharomyces, entretanto, todos

apresentam variações, o que demonstra que para se conhecer melhor a presença

de leveduras contaminantes durante o decorrer de uma safra, o uso de um só

meio diferencial não será suficiente, principalmente quando se trata de leveduras

contaminantes pertencentes ao gênero Saccharomyces.

Como exemplo de meios seletivos (Figura 11), pode-se citar:

Meios Saccharomyces

cerevisiae

Outras

Saccharomyces

Não

Saccharomyces

WLN + actidione (WLD) (-) (-) (+)

LWYN (-) (+) (+)

Meio de Lisina (-) (-) (+)

Em trabalho realizado por Ceccato-Antonini & Silva (2000), concluiu-

se que os meios acima citados foram eficientes no isolamento de leveduras

selvagens, embora o meio de Lisina tenha propiciado o isolamento de

Saccharomyces e o meio LWYN, de outros gêneros, como não era esperado. A

contagem de colônias nesse último meio mostrou-se difícil, devido ao grande

número de microcolônias desenvolvidas, possivelmente resistentes à

concentração de cristal-violeta utilizada.

25

Figura 11. Meios seletivos/diferenciais para isolamento de leveduras selvagens.

Aspecto das placas inoculadas com fermento em meio WLD, diluição

10-1 (A); WLN, diluição 10-7 (B); Lisina, diluição 10-1 (C) e LWYN,

diluição 10-1 (D).

26

Procedimento

1- Coletar as amostras em frascos estéreis e mantê-las sob refrigeração até o

processamento.

2- Os frascos das amostras serão homogeneizados por agitação cuidadosa, sendo

transferidos 10 mL das amostras para tubos de centrífuga estéreis,

assepticamente.

3- Centrifugar-se-á a 3000 rpm por 5 minutos, sendo os sobrenadantes

descartados, adicionando-se em seguida solução salina estéril para

ressuspensão das células.

4- As amostras serão novamente centrifugadas, desprezando-se os

sobrenadantes e ressuspendendo-se as células a um volume final de 10 mL

com solução salina estéril. A partir da recomposição do volume inicial, as

amostras serão submetidas a diluição em série.

5- Os plaqueamentos serão realizados em duplicata para duas diluições, de cada

amostra, em cada um dos meios a serem analisados.

WLN – diluições 10-7 e 10-8

WLD – plaqueamento direto e 10-1

Lisina Ágar – plaqueamento direto e 10-1

LWYN – plaqueamento direto e 10-1

6- Utilizar-se-á a técnica de espalhamento de 0,1 mL da suspensão de células em

superfície e a incubação das placas a 28ºC por 72 horas, quando serão feitas

as contagens das colônias.

5.2. Bactérias

5.2.1. Plaqueamento e diluição em série

Proceder como descrito no ítem 5.1.2., utilizando-se o meio Ágar

Nutriente.

27

5.2.2. Coloração de Gram

A coloração de Gram é um método muito utilizado na identificação

de bactérias. É um método de coloração diferencial que utiliza um corante primário

(cristal violeta) e um contracorante (safranina). Após o uso do cristal violeta,

segue-se a aplicação de uma solução de lugol, o qual é chamada de mordente,

pois se combina com o corante para formar um composto colorido insolúvel. Após

a descolorização com álcool, aplica-se o contracorante safranina.

Os organismos que resistem à descolorização e retem o comlexo

cristal-violeta apresentam cor púrpura e são chamadas Gram-positivas. Aquelas

células que descolorizam e perdem o complexo cristal violeta-iodo, aceitam o

corante safranina e ficam vermelhas. São as Gram-negativas.

A maioria das células vivas, incluindo tecidos animais, são Gram-

negativas. É a característica Gram-positiva que é distintiva. Algumas bactérias,

leveduras e alguns fungos fillamentosos são Gram-positivos.

Procedimento

1- Colocar uma gota de água sobre uma lâmina de vidro.

2- Com a alça de platina, retirar assepticamente uma pequena porção da cultura

e emulsioná-la na gota, a fim de obter uma suspensão uniforme. Espalhar

suficientemente para obter um esfregaço fino. Não esquecer de anotar na

lâmina a procedência do esfregaço.

3- Secar a preparação ao ar ou na chama do bico de gás.

4- Fixar o esfregaço, passando a lâmina três vezes diretamente na chama.

5- Antes de corar, deixar que a lâmina esfrie completamente.

6- Para a coloração, seguir o procedimento da Figura 12.

28

Figura 12. Procedimento da coloração de Gram. 1- Um esfregaço de cocos e

bacilos fixado com calor é primeiramente coberto com um corante

púrpura básico (coloração primária) como a violeta-genciana ou

cristal-violeta, e então o corante é lavado. 2- O esfregaço é coberto

com iodo (um mordente) e lavado. Neste momento, ambas as

bactérias gram-positivas e gram-negativas adquirem cor púrpura. 3- A

lâmina é lavada com etanol ou uma solução de álcool-acetona (um

descolorante) e então lavada com água. Agora, as células gram-

positivas estão púrpuras e as gram-negativas estão incolores. 4- Na

etapa final, a safranina é adicionada como contracorante, e a lâmina é

lavada, seca e examinada microscopicamente. As bactérias gram-

positivas retêm o corante púrpura, mesmo após a lavagem com álcool.

As bactérias gram-negativas aparecem de cor rosada, pois adquirem o

contracorante safranina (Retirado de Tortora et al., 2003).

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7- Examinar ao microscópio com objetiva de imersão e determinar se as culturas

são Gram-positivas (células coradas de roxo) ou Gram-negativas (células

coradas de vermelho), Figura 13. Utilizar sempre um padrão de bactéria gram-

negativa (por exemplo, Escherichia coli) e um padrão gram-positivo (por

exemplo, Bacillus thuringiensis) para comparação com a bactéria-teste.

Figura 13. Microfotografia de bactérias coradas pelo Gram. O Staphylococcus

aureus (púrpura) é gram-positivo, e a Escherichia coli (rosa) é gram-

negativa (Retirado de Tortora et al., 2003).

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6. Preparo de meios de cultivo e soluções

WL Nutrient Medium (WLN) – meio de cultivo para enumeração de

leveduras totais

-extrato de levedura ............................. 0,4 g

-caseína hidrolisada ............................... 0,5 g

-glicose.................................................... 5,0 g

-fosfato monopotássico*.......................... 55,0 mg

-cloreto de potássio*................................ 42,5 mg

-cloreto de cálcio*.................................... 12,5 mg

-sulfato de magnésio*.............................. 12,5 mg

-cloreto férrico*........................................ 0,25 g

-sulfato de manganês*............................. 0,25 g

-verde de bromocresol............................ 2,2 mg

-ácido nalidíxico*..................................... 5,0 mg

-ágar ....................................................... 2,0 g

-ampicilina*.............................................. 5,0 mg

-água destilada q.s.q. ............................. 100 mL

Os ingredientes assinalados com asterisco devem ser incorporados

ao meio na forma de soluções previamente preparadas.

Esse meio pode ser adquirido da Acumedia (referência 7488 A).

WL Differential Agar (WLD) – meio de cultivo para enumeração e

isolamento de leveduras resistentes à cicloheximida.

O meio WLD é obtido por adição do agente antifúngico cicloheximida,

na forma de solução, ao meio WLN, para uma concentração final de 5 ppm.

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Meio de lisina – meio de cultivo para isolamento de leveduras não

pertencentes ao gênero Saccharomyces .

-bacto yeast carbon base...................... 1,17 mg

-lisina...................................................... 0,10 g

-ágar ....................................................... 2,0 g

-ácido nalidíxico....................................... 5,0 mg

-ampicilina .............................................. 5,0 mg

-água destilada q.s.q. ............................. 100 mL

Os antibióticos serão incorporados ao meio na forma de soluções.

Lin Wild Yeast Medium (LWYN) – meio de cultivo para enumeração e

isolamento de leveduras selvagens do gênero Saccharomyces.

-extrato de malte...................................... 0,20 g

-extrato de levedura................................ 0,40 g

-peptona.................................................. 0,20 g

-glicose .................................................. 1,00 g

-fosfato de potássio bibásico................... 0,10 g

-cloreto de amônio .................................. 0,05 g

-ágar ....................................................... 2,00 g

-violeta cristal * ....................................... 0,6 mg

-mistura fucsina-sulfito ........................... 0,01 g

-ácido nalidíxico * ................................... 5,0 mg

-ampicilina * ........................................... 5,0 mg

-água destilada q.s.q. ............................ 100 mL

Os ingredientes assinalados com asterisco serão incorporados ao

meio na forma de soluções. A mistura fucsina-sulfito é composta de 1 parte, em

peso, de dextrina, 4 partes de fucsina básica e 25 partes de sulfito de sódio

anidro.

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Ágar Nutriente – meio de cultivo para isolamento e enumeração de

bactérias

-peptona…………………........................ 5 g

-extrato de carne..................................... 3 g

-cloreto de sódio...................................... 1 g

-ágar........................................................ 20 g

-água destilada q.s.q. ............................. 1000 mL

Todos os meios de cultura serão esterilizados em autoclave a 120ºC

por 20 minutos, a 1 atm.

Solução de azul de metileno-citrato de sódio

-azul de metileno...................................... 0,01 g

-citrato de sódio........................................ 2 g

-água destilada q.s.q. ............................. 100 mL

Dissolver o corante numa pequena porção de água, adicionar os

outros ingredientes e completar o volume.

Solução salina

-cloreto de sódio....................................... 8,5 g

-água destilada q.s.p................................ 1000 mL

Cristal violeta (Gram)

Solução A

-cristal violeta........................................... 2 g

-álcool a 95%........................................... 20 mL

Solução B

-oxalato de amônio..... ............................. 0,8g

-água destilada......................................... 80 mL

Misturar as soluções A e B.

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Lugol (Gram)

-iodo....... …………………........................ 1 g

-iodeto de potássio................................... 2g

-água destilada q.s.q. ............................. 300 mL

Dissolver o iodeto numa pequena porção de água, adicionar o iodo e

completar o volume.

Safranina (Gram)

-safranina em solução alcoólica a 2,5%. 10 mL

-água destilada q.s.q. ............................. 100 mL

7. Bibliografia

CECCATO-ANTONINI, S.R. Guia prático de microb iolog ia. Araras: UFSCar,

1996. 58 p. (Apostila)

CECCATO-ANTONINI, S.R., SILVA, D.F. Eficiência de meios diferenciais no

isolamento de cepas de leveduras de processos industriais de fermentação

alcoólica. STAB, Piracicaba, v.18, n.4, p.40-46, 2000.

PELCZAR, M., REID, R., CHAN, E.C.S. Microb iolog ia. São Paulo: McGraw-Hill,

1980. 566p. vol.1

RAVEN, P.H., JOHNSON, G.B. Biology. Dubuque: WCB, 1990. 1310p.

TORTORA, G.J. FUNKE, B.R., CASE, C.L. Microb iolog ia. Porto Alegre: Artmed, 2000. 827p.