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FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS

Curso Prático

Profa. Ângela Líbia Cardoso

Responsável pela disciplina Microbiologia de Alimentos.

2017

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INDICE

1 Normas de Segurança no Laboratório de Microbiologia 03

2 Preparação do material para análise microbiológica de alimentos 05

3 Preparação da amostra para análise 10

4 Contagem de Bactérias aeróbias mesófilas/ psicrotróficas/ termófilas 11

5 ColiformesTotais, Termotolerantes e E.coli 12

5.1 Método dos tubos múltiplos 12

5.2 Método da membrana filtrante 17

6 Pesquisa de Salmonella sp 19

7 Preparo Meio de Cultura 23

8 Contagem de Bacillus cereus 29

9 Contagem de Staphylococcus aureus 32

10 Contagem de Clostrídios Sulfito-Redutores 36

11 Bibliografia 38

12 Anexos 40

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1 – NORMAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

As normas de segurança nos laboratórios de Microbiologia foram elaboradas com o objetivo de proteger a saúde de todos os colaboradores do laboratório e do público, assim como o meio ambiente, dos riscos associados à exposição acidental a micro-organismos e materiais biológicos experimentais.

Os acidentes em laboratório de Microbiologia, normalmente, ocorrem pela formação de aerossóis, por respingos, pipetagem incorretas, injeções, trabalhos com grandes quantidades e/ou concentrações elevadas de micro-organismos, laboratórios superlotados de pessoal e material, infestação por roedores e insetos, entrada de pessoas não autorizadas. Para evitar a maior parte destes riscos, devem ser tomados cuidados especiais, desde a concepção geral e instalação do laboratório.

As infecções por micro-organismos em laboratório de Microbiologia podem ocorrer através da pele, das vias digestivas e mucosas bucal, das vias respiratórias e mucosas nasais e dos olhos e ouvidos.

As regras enumeradas a seguir constituem a base das práticas seguras de laboratório. Em muitos laboratórios estas normas podem ser estabelecidas como regulamentos do trabalho. Serão apresentadas aqui as regras mais importantes, às quais podem ser acrescentadas outras regras, muitas delas específicas para cada laboratório onde se trabalha particularmente com determinado agente patológico.

1. Não comer, beber, fumar, guardar alimentos e

aplicar cosméticos no recinto de trabalho;

2. Não pipetar com a boca material infeccioso ou tóxico; proteger a ponta superior das pipetas com algodão antes da esterilização;

3. Manter o laboratório limpo e em ordem, devendo ser dele retirados quaisquer materiais que não tenham relação com o trabalho;

4. Descontaminar as superfícies de trabalho, pelo menos, uma vez por dia ou sempre que ocorrer derramamento de substâncias potencialmente perigosas;

5. Lavar as mãos apos haver manipulado materiais e animais infectados, e também ao deixar o laboratório;

6. Manter mãos longe da boca, nariz, olhos e rosto.

7. Deve ser evitado o uso de barba e os cabelos compridos devem estar sempre presos, quando se trabalha com micro-organismos perigosos;

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8. Todos os procedimentos devem ser efetuados de maneira a se evitar ao máximo, a formação de aerossóis;

9. Recobrir as superfícies das bancadas com papel

absorvente, sempre que exista a possibilidade de respingamento de material perigoso;

10. Realizar a manipulação das subculturas de micro-organismos infecciosos em capelas;

11. Descontaminar todos os líquidos e sólidos infectados antes de despreza-los ou então, reutiliza-los. Os materiais esterilizados em autoclaves ou incinerados fora do laboratório deverão ser acondicionados em recipientes fechados e impermeáveis;

12. Usar sempre avental ou uniforme enquanto estiver no laboratório; estas roupas não devem sair do recinto de trabalho e, devem ser desinfetadas por procedimentos adequados;

13. Sempre que necessário, proteger os olhos e o rosto de respingos ou impactos usando óculos de segurança, escudos faciais, máscaras ou qualquer outro dispositivo de segurança;

14. As bancadas do laboratório devem ter a superfície muito lisa, de maneira a serem facilmente limpas e desinfetadas;

15. Somente deverão ser autorizadas a entra no laboratório pessoas que tenham sido informadas sobre os possíveis riscos e satisfaçam os requisitos que se exigem para o acesso; durante o trabalho, as portas devem ser mantidas fechadas; somente terão acesso ao local animais e pessoas autorizadas; não se deve permitir a entrada de crianças no laboratório;

16. Não se deve permitir a entrada no laboratório, de animais que não tenham relação com os trabalhos que estão sendo efetuados;

17. Deve ser estabelecido (quando for o caso), um programa de luta contra os insetos e roedores;

18. As pipetas usadas devem ser imediatamente imersas em desinfetantes;

19. Em caso de respingos, cubra imediatamente a área com desinfetantes;

20. Nunca umedeça rótulos coma língua; use água ou rótulos autoadesivos;

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21. Em todos os trabalhos nos quais existem possibilidades de contacto direto acidental com resíduos biológicos devem ser usadas luvas. Estas luvas, antes de descartadas, devem ser esterilizadas em autoclaves;

22. Todos os derramamentos, acidentes e exposição reais ou potenciais por material infectado devem ser imediatamente notificados ao responsável pelo laboratório. Devem existir protocolos escritos destes episódios, onde são previstos avaliações, vigilância e tratamento médico apropriado;

23. Culturas líquidas de organismos altamente infecciosos requerem cuidados especiais, pois, qualquer movimento que agite a superfície do líquido produzirá aerossol; os liquidificadores dão origem a pesados aerossóis.

2 – PREPARO DO MATERIAL NECESSÁRIO PARA UMA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS

2.1 – Vidraria – Uso do calor seco – Estufa de esterilização

Todo material de laboratório vazio de vidro, metal ou plástico que entrará em contacto com o alimento deve ser esterilizado. A esterilização pode ser por calor seco ou por calor úmido:

Esterilização por calor seco: A esterilização por calor seco, em geral é realizada em estufa de

esterilização para esterilizar vidraria e material de metal e o óxido de etileno para esterilização de material plástico (normalmente comercializados já esterilizados, podendo ser usados uma só vez). Todo material de vidro ou metal a ser esterilizado em estufa, deve ser mantido a 170–180ºC durante uma hora. Os frascos de vidro (erlenmeyers, tubos de ensaio, balões, provetas, etc.) não rosqueáveis, devem ter sua boca protegida por um tampão constituído por gaze e algodão e recoberto por papel. As Placas de Petri devem ser embrulhadas em papel kraft antes de colocadas na estufa de esterilização, o mesmo acontecendo com pipetas (que devem ter chumaço de algodão hidrófobo na extremidade a ser colocada na boca), e demais utensílios (pinças, espátulas, facas, garfos, etc.). Decorrido o tempo de esterilização (1 a 2 horas) deixar a estufa esfriar por si: sua abertura ainda quente poderá danificar o material devido à brusca variação de temperatura.

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2.2 – Vidraria – Uso do calor úmido – Autoclave

A esterilização por calor úmido, em geral é realizada em autoclave para esterilizar vidraria e material de metal e o óxido de etileno para esterilização de material plástico (normalmente comercializados já esterilizados, podendo ser usados uma só vez). Todo material de vidro ou metal a ser esterilizado em autoclave, deve ser mantido a 121ºC durante 30 minutos.

Uso da autoclave

Princípio de funcionamento: obtenção de altas temperaturas por aquecimento de água em recipiente fechado, sob pressão. Técnica: colocar água no fundo da autoclave até cobrir totalmente a resistência, introduzir a cesta contendo o material a ser autoclavado, adaptar a tampa e fechar os parafusos, deixando a válvula de escape de vapor aberta. Ligar a autoclave no máximo de intensidade. A princípio, haverá expulsão do ar contido na autoclave. Quando a água começar a ferver haverá saída de um jato intermitente de ar misturado com vapor de água. Quando todo o ar for expulso, começará a sair, apenas, um jato continuo de vapor de água. Neste momento, fecha-se a válvula de escape de vapor e observa-se o aumento de pressão acusado pelo manômetro. Ao atingir a temperatura

desejada (121oC), regula-se o aquecimento de modo que o ponteiro do manômetro fique estável, mantendo-se neste nível pelo tempo desejado Decorrido este tempo, desliga-se a autoclave e espera-se que a pressão desça a zero e, então, abre-se à válvula de escape de vapor. Quando não há mais saída de vapor, abre-se a tampa e retira-se o material. Todo material deve ser identificado com data e nome do responsável.

Evite ficar próximo da autoclave quando esta estiver em funcionamento. Se não souber opera-la, nunca mexa nela sem a autorização e ajuda de um técnico.

2.3 – Meios de cultura – Esterilizar por calor úmido - autoclave

Todos os meios de cultura empregados numa análise microbiológica devem ser esterilizados.

Preparar os meios de cultura conforme instruções do fabricante. Dependendo do frasco usado, se forem não rosqueáveis, deve ser usado como tampa, um tampão constituído por gaze e algodão e recoberto por papel. Alguns meios de cultura especiais não podem autoclavados, devendo ser esterilizados por simples fervura ou em vapor fluente (autoclave aberta), ou ainda filtrados; nunca usar os meios de cultura na temperatura que saem da autoclave. Se necessário abaixar a temperatura em água corrente, e manter os meios em banho-maria a 45-50ºC até o instante do uso.

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2.4 – Outros reagentes

Outros reagentes como soluções tampões de diluição, água, solução de ácidos ou álcalis, etc., precisam estar estéreis se forem entrar em contacto com o alimento, podendo ser esterilizados na autoclave junto com os demais meios de cultura, ou então filtrados em filtros de esterilização.

Uso dos filtros de esterilização

Filtros tipo MilliporeR (de celulose) ou SeitzR (de amianto).

Colocar a membrana de esterilização no local adequado, e

esterilizar todo o conjunto (Kitassato, funil, membrana, copo) na autoclave a 120ºC durante 30 minutos.

Colocar o líquido a ser esterilizado no copo do filtro, ligar a extremidade do Kitassato à trompa d’água (ou bomba de vácuo) e proceder à filtração, que não deve demorar muito. Filtrado todo o líquido, transferi-lo assepticamente para um frasco previamente esterilizado.

Em um laboratório de microbiologia, precisa de uma variedade de

vidraria, que serão usados nas análises a serem realizadas:

1‐ Tubo de ensaio: Empregado para fazer reações em pequena escala,

principalmente em testes de reação em geral. Usado para guardar soluções

salinas, fazer diluição de materiais, entre outros. Ao utilizá‐lo, flambe a boca em

bico de bunsen e mantenha‐o em pé. 2 – Becker: É de uso geral em laboratório. Serve para fazer reações entre soluções, dissolver substâncias sólidas, efetuar reações de precipitação, aquecer líquidos, fazer soluções. Pode ser substituído por recipientes de vidro de boca larga, do tipo usado para guardar conservas.

3‐ Erlenmeyer: Utilizado em aquecimento de líquidos e para dissolver

substâncias e proceder reações entre soluções. Serve ainda como recipiente para guardar meios de cultura e outras soluções.

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4‐ Estante para tubos de ensaio: Serve para guardar tubos de

ensaio,mantendo‐os em pé.

5‐ Placa de Petri: Em microbiologia, usado como recipiente para meios de

cultura. Possui tampa e deve ser guardado de cabeça para baixo, 6‐ Pipeta graduada: Utilizada para medir pequenos volumes. Mede

volumes variáveis com relativa precisão.

8 – Proveta: Serve para medir e transferir volumes de líquidos. Não

deve ser aquecida. É o instrumento usado para fazer medições. Use‐a

ao invés de beckers e erlenmeyers. 9‐ Bico de Bunsen: É a fonte de aquecimento mais utilizada em laboratório. CUIDADO: RISCO DE QUIMADURAS!

10‐ Swab: Usada na coleta de materiais biológicos. Pode ser substituída

por cotonete ou algum tipo de palito longo com algodão na ponta, tudo devidamente esterilizado.

11 ‐ Alça metálica (não ilustrada) : usada para fazer inoculações de

bactérias. Pode ser feita com um arame fino e firme, com uma extremidade circular e outra com um suporte que não esquente.

EQUIPAMENTOS:

Estufa: A temperatura utilizada deve ser de acordo com a exigência da temperatura ideal para o desenvolvimento cada micro-organismo. Esse equipamento mantém essa temperatura pelo tempo desejado, fazendo com que esse crescimento seja mais eficiente.

Contador de colônias: é um instrumento usado para contar as colónias de bactérias e outros micro-organismos que crescem sobre uma placa de ágar.

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Banhos Maria: são equipamentos para laboratórios aplicados em análises que necessitem de amostras aquecidas. Seja como preparação, ou como etapa do procedimento. Este aparelho para laboratório promove o aquecimento de amostras que não podem ser colocadas diretamente no fogo – sejam elas sólidas ou líquidas – de forma gradual e homogênea. Também é conhecido como Banho Termostático

3 – PREPARO DO ALIMENTO PARA ANÁLISE

3.1 – Alimentos sólidos

Pesar, assepticamente, 25g do alimento e homogeneizar com 225

mL de tampão diluente ou água peptonada. A homogeneização pode ser feita em homogeneizador próprio, esterilizado ou em liquidificador com o copo “esterilizado” pela lavagem com álcool 70% e posteriormente com água destilada estéril. Usar velocidade baixa para não aquecer a mistura. Transferir a diluição 101 assim obtida para um frasco estéril e proceder à diluição seriada decimal (1mL da diluição 10-1 adicionados à 9 mL de diluente, e assim por diante).

3.2 – Alimentos líquidos

Pipetar, assepticamente, 25 mL de alimento e transferir para um frasco contendo 225 mL de tampão diluente (ou água peptonada) e homogeneizar. Proceder à diluição seriada como descrito acima.

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4 – ENUMERAÇÃO DE BACTÉRIAS AERÓBIAS MESÓFILAS, PSICROTRÓFICAS E TERMÓFILAS E DE Bolores E Leveduras

4.1 – Material necessário

Meio de cultura: PLATE COUNT ÁGAR PCA E BDA, ROSA BENGALA; Estufas a 35ºC-37ºC e/ou a 55ºC e 20°C Geladeira a 5ºC-7ºC Banho-maria a 45ºC-50ºC Contador de colônias Vidraria estéril: placas de Petri, Pipetas, tubos de ensaios, Alças de vido, bastões de vidro etc..

4.2 – Metodologia

4.2.1 – Preparar a quantidade necessária do PLATE COUNT ÁGAR (PCA) e/ou Rosa Bengala, BDA acidificado, conforme instruções no frasco, calculando 12 a 15 mL para cada placa de Petri. Esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

4.2.2 – Proceder à homogeneização e diluição seriada do alimento.

4.2.3 – Procedimento

a) De cada diluição do alimento transferir 1 mL para placas de Petri

estéreis. Se possível, empregar duplicatas, para cada diluição de cada grupo de bactéria.

b) Adicionar cerca de 15 mL de PCA esfriado a 45ºC em cada placa semeada e homogeneizar girando suavemente as placas no sentido horário e anti-horário alternadamente.

c) Uma vez solidificado o ágar, inverter as placas e incuba-las a 35ºC- 37ºC durante 48 horas, para as bactérias aeróbias mesófilas; 55ºC durante 48 horas, para as bactérias aeróbias termófilas; 5ºC-7ºC durante 7-10 dias, para as bactérias aeróbias psicrotróficas e até 7 dias, para bolores e leveduras a 20°C ou em temperatura ambiente.

d) Decorrido o tempo de incubação, selecionar as placas contendo 25 a 250 colônias e contá-las com o auxílio de contador.

e) Calcular o número de bactérias aeróbias mesófilas/ psicrotróficas/ termófilas e/ou Bolores e Leveduras por grama de amostra.

4.3 – Resultados

Expressar os resultados em “Unidades Formadoras de

Colônias” por grama de alimento (UFC/g). Em caso de se obter apenas placas com número inferior a

25 ou superior a 250, expressar os resultados como: Contagem estimada: UFC/g.

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Esquema geral de análise para contagem total de micro-organismos aeróbios mesófilos em placas (Morton, 2001).

5 – ENUMERAÇÃO DE COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES e de Escherichia coli

5.1 – Método dos tubos múltiplos

5.1.1 – Material necessário:

Meios de cultura: Caldo Lauril Sulfato Triptose

Caldo Bile Lactose Verde Brilhante Caldo EC Agar Levine

Caldo Indol (Caldo MR-VP Agar Citrato de Simmons)

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Reagentes: Reagente de Kovács ( ) Reagentes VM ( ) Reagentes VP Banho-maria a 44,5ºC + 0,1ºC Estufa a 35ºC

5.1.2 – Metodologia

5.1.2.1 – Preparo do alimento para análise

Efetuar a homogeneização e a diluição seriada do alimento.

Preparar, no mínimo, 3 diluições decimais subseqüentes.

5.1.2.2 – Procedimento

a) De cada diluição do alimento, transferir 1mL para 3 tubos contendo o meio Lauril Sulfato Triptose (LST). Homogeneizar por agitação cuidadosa.

b) Incubar a 35ºC durante 48 horas.

c) Decorrido o tempo de incubação separar os tubos positivos, ou seja, turvos e com gás no interior do tubo de Durham, e dispensar os demais. Prosseguir como em 5.1.3 para pesquisa de Coliformes Totais e como em 5.1.4 para pesquisa de Coliformes Termotolerantes e E.coli.

5.1.3 – Pesquisa de Coliformes Totais

a) Transferir uma alçada (com o auxilio de alça de metal) de cada tubo positivo de LST para outro contendo Caldo Bile Verde Brilhante (BLVB).

b) Incubar a 35ºC durante 48 horas.

c) Selecionar os tubos positivos(turvos e com gás no interior dos tubos de Durham).

d) Utilizar a tabela NMP para calcular o “Número Mais Provável” (NMP) de totais por grama de alimento.

5.1.4 – Pesquisa de Coliformes Termotolerantes e E. coli

a) Transferir uma alçada de cada tubo positivo de caldo LST para outro tubo contendo caldo EC.

b) Incubar a 44,5ºC durante 24 horas.

c) Selecionar os tubos positivos (turvos e com gás no interior dos tubos de Durham).

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d) Utilizar a tabela NMP para calcular o “Número Mais Provável” de Coliformes Termotolerantes por grama de alimento.

e) Selecionar um dos tubos positivos de caldo EC e semeá-lo, por estrias, de modo a obter colônias isoladas, em Ágar Levine.

f) Incubar a 35ºC durante 24 horas.

g) Observar o surgimento de colônias típicas de E.coli, isto é, de coloração negra, com brilho metálico esverdeado (este brilho pode estar ausente ou pouco visível). Fazer a confirmação bioquímica das colônias suspeitas, através da série IMViC (prova do indol, do vermelho de metila, de Voges-Proskauer, e do citrato):

Prova do Indol: Inocular uma alçada da colônia suspeita no caldo indol. Incubar a 35ºC durante 24 horas. Adicionar 0,3 mL do reativo de Kovács e observar a coloração da fase alcoólica.

Prova + : fase alcoólica de cor púrpura Prova - : fase alcoólica de cor amarela

Prova do VP: Inocular uma alçada de colônia suspeita no caldo MR-VP, incubar a 35ºC durante 48 horas. Adicionar a 1,0 mL de cultura 0,6 mL do reagente “a” e 0,2 mL do reagente “b” e agitar vigorosamente o tubo. Se necessário, aquecer.

Prova + : coloração vermelha Prova - : coloração amarela

Prova do VM: Inocular uma alçada de colônia suspeita no caldo MR-VP e incubar a 35ºC durante 5 dias. Adicionar algumas gotas do reagente VM, e observar a coloração do meio.

Prova + : coloração vermelha Prova - : coloração amarela Prova de citrato: Inocular levemente o agar citrato com a colônia suspeita e incubar a 35ºC por até 5 dias. Observar a mudança de coloração do meio verde para azul.

Prova + : meio azul Prova - : meio verde

h) Resultados positivos para as provas do indol e do VM, e negativo para

as provas do VP e citrato confirma presença de E.coli.

5.1.5 – Resultados

Expressar os resultados das contagens de T otais e Termo em “Número Mais Provável por grama de alimento”. Indicar presença ou ausência de E.coli.

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Esquema de análise de coliformes totais, termotolerantes e E, coli em alimentos pelo método do NMP (Kornacki & Johnson, 2001).

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TABELA NMP – SÉRIE 3 TUBOS

10-1 10-2 10-3 10-1

10-2

10-3

(0,1g) (0,01g) (0,001g) (0,1g) (0,01g) (0,001g)

0 0 0 < 3.0 2 0 0 9.1

0 0 1 3.0 2 0 1 14.0

0 0 2 6.0 2 0 2 20.0

0 0 3 9.0 2 0 3 26.0

0 1 0 3.0 2 1 0 15.0

0 1 1 6.1 2 1 1 20.0

0 1 2 9.2 2 1 2 27.0

0 1 3 12.0 2 1 3 34.0

0 2 0 6.2 2 2 0 21.0

0 2 1 9.3 2 2 1 28.0

0 2 2 12.0 2 2 2 35.0

0 2 3 16.0 2 2 3 42.0

0 3 0 9.4 2 3 0 29.0

0 3 1 13.0 2 3 1 36.0

0 3 2 16.0 2 3 2 44.0

0 3 3 19.0 2 3 3 53.0

1 0 0 3.6 3 0 0 23.0

1 0 1 7.2 3 0 1 39.0

1 0 2 11.0 3 0 2 64.0

1 0 3 15.0 3 0 3 95.0

1 1 0 7.3 3 1 0 43.0

1 1 1 11.0 3 1 1 75.0

1 1 2 15.0 3 1 2 120.0

1 1 3 19.0 3 1 3 160.0

1 2 0 11.0 3 2 0 93.0

1 2 1 15.0 3 2 1 150.0

1 2 2 20.0 3 2 2 210.0

1 2 3 24.0 3 2 3 290.0

1 3 0 16.0 3 3 0 240.0

1 3 1 20.0 3 3 1 460.0

1 3 2 24.0 3 3 2 1,100.0

1 3 3 29.0 3 3 3 >2,400.0

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5.2.1 – Material necessário

Bomba de vácuo Porta Filtro Placas de Petri de 5cm de diâmetro Kitassato ou sistema manifold Pinça de bordas chatas Membranas Filtrantes Cartão absorvente Mangueira de silicone flexível Estufa incubadora a 35ºC Banho-maria a 44,5ºC

Meios de cultura:

- Tampão diluente (meio 14.56) - Meio m-Endo - Meio m-FC

5.2.2 – Metodologia

5.2.2.1 – Preparo do alimento para análise

Homogeneizar a amostra. Pipetar 25mL da amostra para

erlenmeyer contendo 225mL de tampão diluente. Homogeneizar. Pipetar 10mL da solução anterior para um frasco contendo 90mL de tampão diluente. Homogeneizar. Repetir essa operação até atingir a diluição desejada.

5.2.2.2 – Procedimento

Esterilizar o porta-filtro por autoclavação a 121ºC por 15 minutos.

Caso o porta-filtro seja de aço-inox ou de vidro pode ser esterilizado por exposição à luz ultravioleta por 5 minutos (distância da fonte de UV de 15cm).

Conectar o kitassato (na saída lateral) à bomba de vácuo com auxilio da mangueira.

Acoplar o porta-filtro ao kitassato ou ao sistema manifold. Retirar a membrana filtrante do envelope com auxílio da pinça

previamente flambada. Colocar a membrana com o quadriculado voltado para cima, sobre a base do porta-filtro.

Pipetar 10 mL da diluição desejada. Ligar a bomba de vácuo. Assim que todo o líquido for filtrado,

desligar. Adicionar tampão diluente ou água estéril para lavar as paredes

internas do porta-filtro (20 mL aproximadamente). Agitar o porta-filtro e filtrar novamente.

Retirar, com a pinça previamente flambada, a membrana e colocar na placa sobre o cartão absorvente embebido com 2 mL de meio de cultura

5.2 – Método da Membrana Filtrante

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colocando com quadriculado voltado para cima. Para contagem de otais, usar o meio m-Endo e para Coliformes Termotolerantes, o meio m-FC.

Fechar a placa e cuidar para não deixar ar retido entre a membrana e o cartão com meio de cultura.

Incubar a placa de Petri invertida. Para os Coliformes Totais incubar em estufa a 35ºC por 24h± 2

horas. Caso a estufa seja muito grande, colocar um recipiente raso com água para umidificar o ambiente, evitando, assim, o ressecamento do meio de cultura das placas.

Para Coliformes Termotolerantes, colocar as placas em um frasco de vidro com tampa e incubar esse frasco em banho-maria a 44,5ºC, por 24± 4 horas.

Interpretação dos resultados:

- Totais: Contar todas as colônias com cor verde ou vermelha com brilho metálico característico. Resultado = número de UFC x fator de correção da diluição. Expressar os resultados em UFC/mL de Coliformes Totais.

- Coliformes Termotolerantes: Contar todas as colônias azul Royal forte. Resultado = número de UFC x fator de correção da diluição. Expressar os resultados em UFC/mL de Coliformes Termotolerantes.

Pesquisa de Escherichia coli:

As colônias de coloração azul nas placas de m-Endo são suspeitas de E.coli. Para a confirmação, utilizar os testes bioquímicos do item 6.

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6 – PESQUISA DE Salmonella

6.1 – Material necessário

Meios de cultura: Caldo de lactose Caldo Selenito e Cistina Caldo Tetrationato Agar Sulfito de Bismuto (SB) Ágar SS, Agar Hektoen-Enteric (HE) Ágar XLD Meio TSI e LIA Agar Citrato de Simmons

Estufa a 35ºC Contador de colônias Vidraria estéril: placas de Petri / Pipetas de 1mL

6.2 – Metodologia

6.2.1 – Pré-enriquecimento

Homogeneizar 25g ou 25 mL do alimento com 225mL de Caldo de

Lactose. Incubar a 35-37ºC, por 24 horas.

6.2.2 – Enriquecimento

Transferir 1mL do Caldo de lactose para um tubo contendo 10mL de Caldo Tetrationato e 0,1mL para um tubo contendo 10mL de Selenito cistina. Incubar o primeiro a 43ºC em banho Maria e o segundo a 35-37ºC por 24 horas.

6.2.3 – Semeadura em ágar seletivo

Semear uma alçada de cada cultura do enriquecimento em placas

de Ágar Sulfito de Bismuto (SB), Ágar Hektoen-Enteric (HE) e Ágar XLD, de modo a obter colônias isoladas. Incubar a 35-37ºC por 24 horas.

6.2.4 – Identificação de colônias suspeitas

Agar SB: as colônias podem ser de cor marrom, cinza ou preta; algumas se apresentam com brilho metálico.

Agar HE: colônias verde-azuladas a azuis com ou sem centro negro.

Muitas culturas de Salmonella podem produzir colônias totalmente negras. Agar XLD: colônias dacor do meio com o centro escuro.

6.2.5 – Identificação bioquímica

Será utilizado o TSI e o LIA e Citrato de Simmons.

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Tocar no centro da colônia suspeita com uma agulha de platina e semear: o tubo TSI em toda a superfície e por picada até o fundo do tubo; o tubo LIA por picada até o fundo e o tubo de citrato em toda a superfície. Incubar os 3 tubos a 37ºC durante 24 horas.

O meio TSI permite observar:

1) produção de gás: desenvolvimento de bolhas. 2) Produção de H2S: enegrecimento do meio. 3) Produção de ácido: a base do meio fica amarela.

O meio LIA permite observar:

1) Produção de lisina descarboxilase: o meio fica todo roxo.

O meio citrato de Simmons permite observar utilização de citrato por mudança de cor do meio para azul.

O meio EPM e MILI são mais usados para Salmonella e permite

segundo a Tabela abaixo:

Obs: Não serão utilizados os meios EPM e MILI, será utilizado a

sorologia para identificação de Salmonella. Os resultados destes testes para Salmonella são:

Salmonella sp

S. typhi

S. paratyphi A

Produção de gás

+

-

V

EPM Produção de H2S Produção de uréase

+ -

+f -

- -

Produção de LTD - - -

MILI

Motilidade

+

+

+ Indol - - - Lisina + + -

Citrato

+

-

-

V= variável +f = positivo fraco

6.2.6 – Identificação sorológica

Deverá ser feita após a identificação bioquímica, utilizando-se inicialmente soro polivalente somático (contém anticorpos contra os antígenos somáticos das Salmonellas dos grupos A, B, C1, C2, D, E1, E2, E3, E4 e contra o antígeno Vi e posteriormente soro polivalente anti-Salmonella flagelar (contém anticorpos contra antígenos flagelares a, b, c, d, i, 1, 2, 5) (Probac do Brasil Produtos

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bacteriológicos Ltda.). A metodologia para a identificação sorológica é a de aglutinação em lâmina.

6.3 – Resultados

Expressar os resultados como “ausência” ou “presença” de Salmonella sp em 25g ou 25mL de alimento.

Esquema da análise de Salmonella sp pelo método BAM/FDA (2006).

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Continuação do esquema da análise de Salmonella sp pelo método BAM/FDA (2006).

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7 – MEIOS DE CULTURA

7.1 – Agar Citrato de Simmons

Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 2mL por tubo de ensaio antes de autoclavar.

7.2 – Agar EMB Levine

Preparar conforme instruções no frasco.

7.3 – Ágar LIA

Preparar conforme instruções no frasco. 7.4 – Ágar Plate Count

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Preparar conforme instruções no frasco.

7.5 – Ágar Púrpura de Bromocresol

Autoclavar.

Preparar 4 frascos de ágar, conforme instruções no frasco. Preparar soluções a 20% de cada 1 dos carboidratos (dextrose,xilose,

ramnose e manitol) e esterilizar por filtração. Adicionar a cada um dos frascos de meio-base um dos carboidratos, de

modo a obter a concentração final de 1%. Distribuir em placas estéreis.

7.7 – Água Peptonada a 0,1%

peptonada 10g NaCl 10g Água destilada 1000 mL Misturar os ingredientes, ajustar o PH para 8,6, distribuir em

frascos e autoclavar a 121ºC por 10 min. 7.8 – Caldo EC

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Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 10 mL por tubo,

introduzindo um tubinho de Durham em cada tubo, antes de autoclavar.

7.9 – Caldo Lauril Sulfato

Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 10 mL por tubo,

introduzindo um tubinho de Durham em cada tubo, antes de autoclavar.

7.10 – Caldo Bile Lactose Verde Brilhante

Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 10mL por tubo, introduzindo um tubinho de Durham em cada tubo, antes de autoclavar.

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7.11 - Caldo Selenito e Cistina

Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 10 mL por tubo.

7.12 – Caldo Tetrationato

Preparar conforme instruções no frasco. Distribuir 10 mL por tubo

de ensaio. Não autoclavar. No instante do uso, adicionar 0,1 mL de uma solução de verde brilhante 1:1000 e 0,2 mL da seguinte solução de lugol:

Iodo 6g Iodeto de potássio 5g Água destilada 20 mL

7.13 – meio EPM

a) Solução A

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Triptona 10g Extrato de carne 2g Cloreto de sódio 5g Fosfato de sódio dibásico 2g L-triptofano 1g Ágar 11g Água destilada 1 Litro

Dissolver os ingredientes, exceto o ágar, acertar o PH para 7,0.

Adicionar o ágar e autoclavar a 121ºC durante 15 minutos.

b) Solução B

Citrato de ferro amoniacal 2g Tiossulfato de sódio 2g Glicose 10g Uréia 40g Água destilada 85mL

Dissolver os ingredientes e aquecer em banho-maria a 65ºC com

agitação constante, durante 1 hora.

c) Solução C

Azul de bromotimol 1,5g Hidróxido de sódio 0,05N 48mL Etanol 50mLÁgua destilada 2mL Estocar protegida da luz

d) Preparo final do meio

Solução A 100 mL Solução B 17,5 mL Solução C 2,0 mL

Após resfriar a solução A a 65ºC adicionar a solução B e a

solução C. Distribuir 5mL em tubos de ensaio 12 x 120mm, previamente esterilizados e deixar solidificar em posição inclinada.

7.14 – meio MiLi

extrato de levedura 3g peptona 10g

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triptona 10g L-lisina 10g Glicose 1g Ágar 2g Solução de bromocresol 0,2% 25 mL Água destilada 1 litro

Dissolver os ingredientes, exceto ágar. Ajustar o pH para 6.5,

adicionar o ágar e aquecer para dissolução completa. Distribuir 4 mL em tubos 12 x 120 mm e autoclavar a 121ºC durante 15 minutos. Deixar solidificar na posição vertical.

Solução de bromocressol púrpura 0,2% Cromocresol púrpura 0,2% NaOH 0,05N 74,0 mL Etanol 13 mL Água destilada 13 mL

Estocar protegido da luz.

Obs.: Os meios EPM e MiLi podem ser adquiridos prontos no comércio (Probac do Brasil Produtos bacteriológicos Ltda.)

7.153 – Reagentes de Kovacs

p. dimetil amino benzaldeido 5g álcool etílico 300 mL água 200 mL

Dissolver o aldeído no álcool e adicionar o ácido.

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8 - ENUMERAÇÃO de Bacillus cereus

8.1 – Material necessário

Meio de cultura: Agar Manitol Gema de Ovo Polimixina (MYP)

Agar nutriente (NA) Caldo-Glicose-vermelho de fenol Caldo nitrato Teste de VP Teste de decomposição da tirosina

Diluente: Água salina peptonada Reagentes: Reagentes para teste de VP (solução alcoólica 5% de alfa-

naftol, Solução aquosa de KOH 40%, Creatitina em cristais

Reagentes para caldo nitrato (Solução 0,8% de ácido sulfanílico, Solução 0,5% de alfa-naftol em ácido acético, Pó de zinco livre de nitrato ou nitrito)

Estufa incubadora regulada a 35oC 8.2 – Procedimento

O esquema geral de análise para contagem de B. creus encontra-se

descrito na figura 8.1. Inoculação: Selecionar três diluições adequadas da amostra, inocular

0,1mL de cada diluição em placas de MYP, previamente preparadas e secadas. Espalhar o inóculo com alças de Drigaslski, até que todo o líquido seja absorvido pelo meio de cultura. Recomenda-se que na contagem de bactérias esporogênicas, seja utilizada uma alça estéril diferente para cada diluição, porque a flambagem em álcool não elimina os esporos e como conseqüência interferindo nos resultados. Havendo suspeita de contagem inferiores a 100 UFC/g, inocular 1,0 mL da primeira diluição da amostra distribuindo o volume por 4 placas de MYP, três com 0,3 mL e uma com 0,1 mL

Incubação: Aguardar que as placas sequem completamente e incubar

invertidas a 30oC por 24 horas.

Contagem das colônias presuntivas: Selecionar as placas com 10 a 100 colônias, contendo não mais que 30 colônias típicas (esféricas, com bordas perfeitas, planas, secas e cerosas, rodeadas por um halo de precipitação, toda a região do meio ao redor das colônias apresenta uma coloração rósea). Caso a coloração rósea não seja evidente com 24 horas de incubação, recomenda-se reincubar as placas por 24 horas adicionais.

Confirmação das colônias: Selecionar pelo menos 5 colônias típicas bem isoladas, inocular em tubos de NA inclinado e incubar a 30oC/24 horas . As culturas obtidas devem ser inoculadas nos meios-testes (Anexos)

Cálculo dos resultados: Calcular o número de UFC/g ou mL em

função0 do número de colônias típicas, dilução inoculada e percentagem de colônias confirmadas. Por exemplo: Diluição 10-1, plaqueamento em superfície,

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6 colônias típicas, 6 submetidas à confirmação, 3 confirmadas (50%). UFC/g ou mL= 6x10x10x0,5= 3,0x102

Esquema de análise para contagem de B. cereus por plaqueamento direto (Bennet & Belay, 2001).

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Esquema de análise para contagem de B. cereus pelo método do NMP (Bennet & Belay, 2001).

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09 – ENUMERAÇÃO DE Staphylococcus aureus

9.1 – Material necessário

Meio de cultura: BAIRD-PARKER ÁGAR

Caldo BHI Ágar DNA – azul de toluidina

Plasma de coelho Estufa a 35°C Contador de colônias Vidraria estéril: placas de Petri

Pipetas de 2mL Alças de Drigalski

9.2 – Metodologia

10.2.1 – Preparo do alimento para análise

Efetuar a homogeneização e a diluição seriada do alimento.

9.2.2 – Procedimento

a) Transferir 0,1 mL de cada diluição do alimento para a superfície do meio de Baird-Parker. Espalhar com a alça de Drigalski.

b) Após completa secagem da superfície do ágar, inverter as placas e incubá- las a 35°C durente 48 horas.

c) Decorrido o tempo de incubação, selecionar as colônias suspeitas, de coloração negra com 2 halos circundantes e efetuar os testes bioquímicos de confirmação.

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Representa-se o esquema geral de análise para detecção de Staphylococcus aureus

em alimentos.

9.2.3 – Identificação bioquímica 9.2.3.1 – Staphy-test (Probac do Brasil Prod. Bacteriológicos Ltda.)

a) Inocular as colônias suspeitas em TSA (ágar inclinado) e incubar a 35°C por 18-24 horas.

b) Depositar 1 gota de reativo R e 1 gota de reativo C em uma lâmina de vidro.c) Suspender, com o auxílio de palito de madeira, um pouco do crescimento em TSA na gota R, homogeizando bem. Idem na gota C.

d) Imprimir movimentos de rotação da lâmina e observar aglutinação na gota R e ausência de aglutinação na gota C, em 5 segundos.

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9.2.3.2 – Reação da coagulase a) Inocular as colônias suspeitas em caldo BHI e inocular a 35°C durante 24 horas.

b) Misturar 0,1mL desta cultura com 0,3mL de plasma de coelho.

c) Incubar a 35°C, observando a formação de coágulo. Após 6 horas, a ausência de coágulo indica teste negativo.

9.2.3.3 – Reação de termonuclease

Pipetar, de modo a espalhar, 3mL de ágar DNA – azul de toluidina sobre

uma lâmina de microscopia. Após solidificar, cortar o ágar usando um tubo capilar esterilizado, de modo a obter orifícios de 2mm de diâmetro. Remover o ágar dos orifícios por aspiração.

Utilizando pipetas Pasteur ou tubos capilares, adicionar a cada orifício, aproximadamente 10µl da cultura em caldo usado para o teste da coagulase, previamente aquecida durante 15 minutos em banho-maria em ebulição.

Incubar a lâmina em câmara úmida por 4 horas a 35-37°C. Reação positiva: aparecimento de um halo cor de rosa brilhante,

estendendo-se pelo menos, 1mm além das bordas do orifício.

9.3 – Resultados

Calcular o número de S. aureus por grama de alimento, considerando somente as colônias que foram positivas nos testes bioquímicos. Expressar os resultados em Unidades Formadoras de Colônias por grama (UFC/g).

Considerando o número de colônias que foram positivas nos testes bioquímicos e o número total de colônias características. Por exemplo: se o número de colônias características foi igual a 25, e 5 colônias foram bioquimicamente testada, sendo que 3 foram positivas para S. aureus, o número de colônias de S. aureus na amostra será igual a:

5 testadas ------------------------------- 3 positivas 25 ----------------------------------------- X X = 15 Então o número de colônias de S. aureus será igual a 15 x o inverso da diluição x inverso do volume plaqueado.

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Staphylococcus coagulase positiva

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10- ENUMERAÇÃO DE Clostrídios Sulfito-Redutores

10.1 – Material necessário Agar Triptose Sulfito Cicloserina (TSC) com e sem gema de ovo e sem. Tubos de Caldo de Infusão Cérebro Coração (BHI) Peróxido de Hidrogênio 3% Sistema de geração de anaerobiose Estufa incubadora regulada a 46 oC Estufa regulada a 35oC- 37oC Tubos de meio Tioglicolato Tubos de meio de Lactose Gelatina Tubos de meio de Leite Ferro Tubos com Ágar Nitrato Motilidade Tubos de Meio de Fermentação para C. perfrigens Solução 0,04% de Azul de Bromotimol Antitoxina alfa de C./ perfrigens

10.2 – Procedimento Preparação das amostras – Diluições

Para contagem de Clostrídios Sulfito-Redutores:

Inoculação Selecionar 3 diluições adequadas da amostra e inocular em placas de Agar Triptose Sulfito Cicloserina (TSC), plaqueamento em superfície ou em profundidade. Aguardar que as placas sequem e cobrir a superfície com uma sobrecamada de TCS. Aguardar completa solidificação e incubar a 46oC por 18 horas/24 horas, em atmosfera anaeróbia*.

GasPak Anaerobic System (BBL 70304)

Gas Generating Kit (Oxoid BR 38

Anaerocult A (Merck 13829) A contagem das colônias presuntivas: Selecionar placas com 20 a 200 colônias e contar apenas as colônias pretas típicas de clostrídios sulfito-redutores.

CUIDADO: Ägar TSC permite crescimento e produção de C.botulinum

Trabalhar sempre com o material sobre bandeja, não diretamente a bancada, NUNCA pipetar culturas com a boca, desinfetar todas as superfícies com solução de NAOH 1N e esterilizar todo o material de descarte a 121oC por 30 minutos.

Confirmação: Selecionar várias colônias típicas e transferi-las para tubos de ensaio contendo BHI previamente desaerado. Para isso, submeter os tubos à fervura em banho, por 15 minutos com as tampas frouxas e resfriar imediatamente em banho de gelo. Incubar os tubos inoculados a 35oC/24 h. Fazer um Gram e o teste da catalase. Teste da catalase: Adicionar ao tubo de BHI, 1,0mL de peróxido de hidrogênio 3% (formação de bolhas, teste positivo ao contrário, teste negativo. (Os clostrídios sulfito-redutores são bastonetes Gram positivo catalase –)

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Cálculo dos resultados:Calcular o número de UFC/g ou mL em função do número de colônias típicas, diluição inoculada e percentagem de colônias

confirmadas. Exemplo: Plaqueamento em profundidade , diluição 102, 25 colônias típicas, 10 submetidas à confirmação, 8 confirmadas (80%). UFC/g ou

mL = 25x102x.8= 2,0x103 UFC/mL ou g

Esquema de análise para contagem de C. perfringens por plaqueamento direto (Labbe 2001)

.

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Esquema de análise para contagem de clostrídios sulfito-redutores (ANVISA, 2001).

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11 – BIBLIOGRAFIA

American Public Health Association – Standard methods for the examination of dairy products. Ed. R.T. Marshall, 16th ed., Washington, D.C.

American Public Helth Association – Compendium of methods for the

microbiological examination of foods. Ed. Vanderzant, C.& Splittstoesser, D.F. 3rd. Ed., New York, 2001.

Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual 8th. Ed. Food and Drug Administration, Washington, D.C., 2005.

American Public Health Association – Compendium of the Methods for

the Microbiological Examination of Foods. Marvin L. Speck, ed., 2001.

American Public Health Association – Standard Methods for the

Examination of Water and Wastewater. 16th ed., 2005.