ANÁLISE MICROBIOLÓGICA

A contaminação das águas por excretas de origem humana ou animal pode torná-las um veículo na transmissão de agentes de doenças infecciosas. Dessa forma, a vigilância da qualidade microbiológica da água é essencial, sendo requerida pelas legislações aplicadas nos mais diversos usos da água. Somente pessoas e animais infectados eliminam microorganismos patogênicos, que podem estar em concentrações extremamente baixas nas amostras de água e requerem métodos específicos de concentração.

Na rotina para monitoramento da água e atendimento das regulamentações de sua qualidade são realizadas as análises dos microrganismos indicadores de poluição fecal, os quais podem indicar o risco da presença de microrganismos enteropatogênicos.

A coleta de amostras de água para exame microbiológico apresenta técnica diferenciada em água bruta e tratada e deve ser realizada sempre antes da coleta de qualquer outro tipo de ensaio ou determinação de campo, a fim de se evitar o risco de contaminação do local de amostragem com frascos ou amostradores não estéreis.

O objetivo do exame microbiológico da água é fornecer subsídio a respeito da sua potabilidade, isto é, ausência de risco de ingestão de microorganismos patogênicos (causadores de doenças), geralmente provenientes da contaminação pelas fezes humanas e outros animais de sangue quente. Os microorganismos patogênicos incluem vírus, bactérias, protozoários e helmintos.

Em geral não se devem retirar amostras próximas às margens de rios, canais e no ponto de lançamento de despejos, exceto quando essas regiões são de interesse específico, pois a qualidade, em tais pontos, geralmente não é representativa de todo o corpo d’água. No caso da contribuição dos tributários (afluentes), é importante acompanhar a qualidade de suas águas, e como ela afeta o corpo principal, por meio da coleta de amostras em ponto próximo da sua desembocadura (foz) ou de acordo com o objetivo do trabalho.

COLETA DA AMOSTRA

Material necessário1. Frascos de coleta ou bolsa de coleta;2. Caixa térmica com gelo reciclável;3. Kit para dosagem de cloro residual livre;4. Formulário de Coleta (3 vias para cada ponto de coleta);5. Caneta esferográfica;6. Papel toalha;7. Luvas de procedimento;

Os frascos para análises microbiológicas devem ser submetidos à descontaminação em autoclave, à temperatura de 121ºC e à pressão de 1ATM, durante 30 minutos. Após a autoclavagem, deve-se proceder a lavagem dos frascos observando-se a seguinte seqüência: limpar a parte externa com uma esponja; adicionar uma gota de detergente líquido, não tóxico, no interior de cada frasco e escovar a parte interna com auxílio de uma escova; enxaguar 10 vezes com água corrente e, em seguida, mais 3 vezes com água destilada; após a lavagem deixar os frascos emborcados numa estufa a 80/100ºC durante 1 hora para secagem.

Após a secagem, o frasco deve ser preparado previamente no laboratório, estéril e conter:1. EDTA em quantidade necessária para complexar metais pesados que possam estar presentes na

amostra (por exemplo, cobre), e 2. tiossulfato de sódio, se houver a suspeita da presença de cloro livre, este frasco não deve ser

ambientado e a coleta deve ser pontual, ou seja, a amostra para ensaio microbiológico não deve ser composta.

NOTA: O prazo de validade de frascos esterilizados é de 60 dias. Se não forem utilizados neste período devem ser devolvidos para nova esterilização.

Procedimento de coleta1. Lavar as mãos e secá-las, se possível utilizar luvas de procedimento;2. Numerar os frascos e o formulário de coleta correspondente;3. Abrir a torneira, deixando a água escoar por cerca de 3 minutos ou o tempo suficiente para eliminar

a água estagnada na tubulação;4. Ajustar a abertura da torneira em fluxo baixo de água e coletar o volume necessário para os

ensaios: Para análise microbiológica (Deve ser sempre a primeira coleta realizada).

Técnicas de preservação e armazenamento de amostras Os frascos e as tampas devem ser de material resistentes às condições de esterilização e à ação

solvente da água e não devem liberar compostos tóxicos, como bactericidas ou bacteriostáticos durante a esterilização. Podem ser de vidro neutro, de vidro borossilicato ou plástico autoclavável, com boca larga (mais ou menos 4cm) para facilitar a coleta e a limpeza.

PROCEDIMENTOS DE COLETA DE AMOSTRAS PARA ENSAIO MICROBIOLÓGICO

Para coleta em residências lavar as mãos com água e sabão; limpar a torneira do usuário com um pedaço de algodão embebido em álcool, 70% e/ou hipoclorito

de sódio 100mg/L; abrir a torneira e deixar escorrer a água durante 1 ou 2 minutos; coletar a amostra de água; encher com pelo menos 3/4 de seu volume; tampar o frasco, identificá-lo, anotando endereço, hora, e nome do coletor, etc; marcar o frasco com o número da amostra, correspondente ao ponto de coleta; preencher a ficha de identificação da amostra de água; colocar o frasco da amostra na caixa de isopor com gelo; lacrar, identificar e enviar a caixa para o laboratório. O tempo de coleta e a realização do exame não devem exceder 24 horas. Nota: Além de residências as amostras podem ser coletadas em hospitais, escolas, torneiras

públicas e pontos considerados vulneráveis. No caso de utilização do hipoclorito de sódio para desinfecção da torneira, deve-se removê-lo completamente antes da coleta.

Para coleta em águas superficiais:

As amostras para análises microbiológicas devem, preferencialmente, ser recolhidas diretamente nos frascos esterilizados que serão enviadas para análise; ou em baldes esterilizados.

Remover a tampa do frasco, juntamente com o papel alumínio protetor, tomando cuidado para evitar a contaminação da amostra pelos dedos das luvas ou outro material;

Manter a tampa sobre o frasco no momento da coleta a uma distância de aproximadamente 10 centímetros, para evitar a contaminação da parte interna da tampa ou queda de qualquer material no interior do frasco;

Encher o frasco com a amostra até aproximadamente ¾ (três quartos) do seu volume, para possibilitar sua homogeneização durante o processo de ensaio no laboratório (Fig. 65);

Fechar imediatamente o frasco, fixando muito bem o papel alumínio protetor em volta da tampa; Identificar a amostra; Acondicionar e transportar a amostra em caixa térmica, sob refrigeração (Fig. 66).

A Portaria nº 2.914/2011 do Ministério da Saúde estabelece que para garantir sua potabilidade seja verificada, na água para consumo humano, a ausência de coliformes totais e Escherichia coli e determinada a contagem de bactérias heterotróficas.

Determina ainda que a contagem de bactérias heterotróficas deva ser realizada como um dos parâmetros para avaliar a integridade do sistema de distribuição (reservatório e rede), devendo ser feita em 20% das amostras mensais de coliformes totais nos sistemas de distribuição, recomendando que não deva exceder a 500 Unidades Formadoras de Colônias por 1 mililitro de amostra (500 UFC/mL).

Para a conformidade do padrão microbiológico de potabilidade é obrigatório a ausência de coliformes totais em 100 mL de amostra na saída do tratamento. No entanto, conforme Anexo I da Portaria MS nº 2.914/2011, admite-se a presença de coliformes totais em apenas 1 amostra mensal para sistemas ou soluções coletivas que abastecem menos de 20.000 habitantes e em 5% das amostras mensais em sistemas ou soluções coletivas que abastecem mais de 20.000 habitantes. Ressalta-se que em ambas as situações não são permitidas a presença de Escherichia coli na água para consumo humano.

Anexo I – Portaria 2914/2014

As bactérias do grupo coliforme são consideradas os principais indicadores de contaminação fecal. Todas as bactérias coliformes são gram-negativos, não esporulados, aeróbios ou anaeróbios e estão associadas com as fezes de animais de sangue quente e com o solo. Existem dois grandes gêneros do grupo coliforme: totais e fecais (ou termotolerantes).

Bactérias do grupo coliformeConceitos:• Coliformes totais (bactérias do grupo coliforme) - bacilos gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, não formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de desenvolver na presença de sais biliares ou agentes tensoativos que fermentam a lactose com produção de ácido, gás e aldeído a 35,0 ± 0,5ºC em 24-48 horas, e que podem apresentar atividade da enzima ß - galactosidase. A maioria das bactérias do grupo coliforme pertence aos gêneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter, embora vários outros gêneros e espécies pertençam ao grupo.

Coliformes fecais ou termotolerantes

Os coliformes fecais são também conhecidos como “termotolerantes” por suportarem uma temperatura superior à 40°C, convivem em simbiose com humanos, bois, gatos, porcos e outros animais de sangue quente. São excretados em grande quantidade nas fezes e quando estão no trato digestivo. Neste grupo está presente a bactéria gram-negativa Escherichia coli, e ao se ingerir alimentos por ela contaminados, os resultados desagradáveis (como gastrenterite, por exemplo) podem ser brandos ou desastrosos, dependendo do grau de contaminação. Os coliformes fecais, por serem termotolerantes, não se multiplicam fora dos intestinos dos animais de sangue quente. As bactérias coliformes termotolerantes reproduzem-se ativamente a 44,5 - 45,5ºC e são capazes de fermentar a lactose com produção de gás em 24 horas.

Escherichia coli - bactéria do grupo coliforme que fermentaa lactose e manitol, com produção de ácido e gás a 44,5 ± 0,2ºC em 24 horas, produz indol a partir do triptofano, oxidase negativa, não hidroliza a ureia e apresenta atividadedas enzimas ß galactosidase e ß glucoronidase, sendo considerado o mais específico indicador de contaminação fecal recente e de eventual presença de organismos patogênicos.

EstreptococosA pesquisa de estreptococos, o mais característico é o Streptococcus faecalis, pode servir para confirmar a origem fecal da contaminação em casos duvidosos. Os estreptococos fecais podem aparecer nas fezes em número variado, geralmente inferior ao número de E.coli, e na água morrem e desaparecem em proporção semelhante à de E.coli, e mais rapidamente que outros membros do grupo coliforme. Portanto, se numa amostra de água se encontram bactérias coliformes, mas não E.coli, a presença de estreptococos fecais

confirma a origem fecal da contaminação. Os estreptococos fecais são aplicados nos estudos de correlação com coliformes fecais em levantamentos sanitários e investigações sobre poluição de cursos d’água, para verificar se a poluição é de origem animal ou humana. Sabe-se que: Estreptococos fecais/coliformes fecais < 0,7 indica poluição de origem animal Coliformes fecais/estreptococos fecais > 0,4 indica poluição de origem humana

EXAMES

Antes de iniciar os exames:1. Desinfetar a bancada do laboratório usando uma solução de álcool etílico a 70% ou outro

desinfetante que não deixe resíduo;2. Todas as amostras a serem examinadas devem ser homogeneizadas pelo menos 25 vezes;3. Não esquecer de flambar a boca dos tubos de ensaio contendo meios de cultura, antes de usá-

los;4. O tiossulfato de sódio a 10% colocado nos frascos de coleta é para neutralizar a ação do cloro;5. As placas de Petri devem ser colocadas na posição invertida para evitar a condensação de água

na superfície do ágar;6. Fazer a contagem padrão de bactérias heterotróficas, sempre em duplicata.

COLIFORMES TOTAISMÉTODO DOS TUBOS MÚLTIPLOS (TM)

Execução do teste

Teste presuntivo1. Tomar uma bateria contendo 15 tubos de ensaio distribuídos de 5 em 5;2. Nos primeiros 5 tubos, (os que contêm caldo lactosado de concentração dupla) inocular, com

pipeta esterilizada, 10 mL da amostra de água a ser examinada, em cada tubo. (Diluição 1:1);3. Nos 10 tubos restantes (os que contêm caldo lactosado de concentração simples), inocular nos 5

primeiros 1 mL da amostra (Diluição 1:10) e nos 5 últimos tubos, 4. Inocular 0,1 mL da amostra, em cada tubo. (Diluição 1:100);5. Misturar;6. Incubar a 35 ± 0,5ºC durante 24/48 horas;7. Se no final de 24/48 horas, houver a formação de gás dentro do tubo de Durhan, significa que o

teste presuntivo foi Positivo. Neste caso, fazer o teste confirmativo. Se não houver a formação de gás durante o período de incubação, o exame termina nessa fase e o resultado do teste é considerado negativo.Observação: No lugar do caldo lactosado pode ser usado o caldo Lauril Triptose.

Teste confirmativo1. Tomar o número de tubos do teste presuntivo que deram Positivos (formação de gás) nas 3 diluições 1:1; 1:10 e 1:100;2. Tomar igual número de tubos contendo o meio de cultura verde brilhante Bile a 2%;3. Com a alça de platina, previamente flambada e fria, retirar de cada tubo positivo uma porção de

amostra e inocular no tubo correspondente contendo o meio verde brilhante. Esse procedimento chama-se repicagem;

4. Identificar os tubos;5. Incubar durante 24/48 horas a 35 ± 0,5ºC;6. Se no final do período de 24/48 horas houver a formação de gás dentro do tubo de Durhan o

teste é considerado positivo. Caso não haja formação de gás, o teste é considerado negativo.

Expressão dos resultados1. Resultados são expressos em NMP (Número Mais Provável) /100 mL de amostra.2. Para se determinar o NMP, verifica-se a combinação formada pelo número de tubos positivos que apresentaram as diluições 1:1; 1:10 e 1:100 no Teste Confirmativo.

Exemplo:a) nos 5 tubos da diluição 1:1, obtiveram-se 3 tubos positivos;b) nos 5 tubos da diluição 1:10, obtiveram-se 2 tubos positivos;c) nos 5 tubos da diluição 1:100, obteve-se 1 tubo positivo;d) formou-se, portanto, a combinação 3-2-1;e) determina-se o NMP consultando a Tabela 1.

Se não quiser trabalhar com 15 tubos para determinar o NMP. Fazer apenas 5 tubos na diluição 1:1 (10 mL do meio de cultura + 10 mL da amostra) e calcular o NMP. Consultando a tabela 2.

COLIFORMES TERMOTOLERANTESMÉTODO DOS TUBOS MÚLTIPLOS (TM)

Execução do ensaio1. Tomar todos os tubos do Teste Presuntivo que deram Positivos (Formação de gás) e todos os tubos

negativos em que houve crescimento após 48 horas, nas 3 diluições (1:1; 1:10 e 1:100);2. Transferir, com alça de platina flambada e fria, uma porção para os tubos de ensaio contendo o

meio EC;3. Misturar e deixar todos os tubos em banho de água durante 30 minutos;4. Incubar em banho-maria a 44,5 ± 0,2ºC durante 24 ± 2 horas;5. Se no final de 24 horas ou menos houver a formação de gás, está indicada a presença de coliformes

termotolerantes;6. Calcular o NMP consultando a tabela 1.

NOTA: Esse ensaio deve ser realizado simultaneamente ao Teste Confirmativo para Coliformes Totais.

OBSERVAÇÃO: Fazer esse exame toda vez que forem realizados testes confirmativos para coliformes totais.

COLIFORMES TOTAISMÉTODO DA MEMBRANA FILTRANTE (MF)

Execução do ensaio 1. Com a pinça, colocar cuidadosamente na placa de Petri um cartão absorvente;2. Com pipeta esterilizada colocar 1,8 mL do meio de cultura no cartão absorvente e tampar a placa;3. Colocar a membrana filtrante no porta-filtro, com a pinça previamente flambada e fria;4. Agitar o frasco contendo a amostra, pelo menos 25 vezes;5. Destampar e flambar a boca do frasco;6. Verter, cuidadosamente, 100 mL de amostra no porta-filtro, evitando que a água respingue sobre as

bordas superiores;7. Ligar a bomba de vácuo (seringa) e fazer a sucção;8. Depois de filtrada a amostra, lavar 3 vezes as paredes do funil com água de diluição estéril com

porções de 20 mL aplicando vácuo;9. Após a lavagem e filtração, aliviar o vácuo e remover o funil do suporte;10.Com a pinça flambada e fria, remover o filtro do suporte e colocá-lo na placa de Petri, antes

preparada, com o lado quadriculado para cima;11. Tampar a placa de Petri e incubá-la invertida a 35ºC durante 24 ± 2 horas;12. Após o período de incubação, examinar o filtro fazendo a contagem das colônias.

Leitura dos resultadosAs colônias indicativas de coliformes totais típicas têm uma cor rosa a vermelho escuro, com brilho metálico.O brilho pode aparecer no centro ou na periferia da colônia. As não coliformes aparecem com coloração vermelho-clara ou escura sem o brilho metálico característico.

OBSERVAÇÃO: Às vezes, quando o disco está muito úmido e a fonte de luz é muito intensa, as colônias de não coliformes podem aparecer com um brilho falso, causando erros. Isso poderá ser contornado usando-se fonte de luz mais difusa ou secando o filtro antes de ser examinado.

Preparo do meio de cultura

TÉCNICA1. Pesar 4,8 gramas do meio desidratado;2. Transferir para o Erlenmeyer;3. Adicionar aos poucos 100 mL de água destilada contendo 2 ml de álcool etílico a 95%;4. Aquecer em banho-maria ou no bico de Bunsen até o início da fervura (não deixar ferver);5. Deixar esfriar;6. Distribuir 1,8 mL em cada placa.

OBSERVAÇÕES: Preparar somente a quantidade necessária para uso. Esse meio pode ser adquirido em ampolas de 2 mL, porém o custo é muito elevado. É mais econômico prepará-lo no laboratório. Em substituição ao meio m Endo Broth MF poderá ser utilizado o meio sólido (LES Endo agar).

COLIFORMES TERMOTOLERANTESMÉTODO DA MEMBRANA FILTRANTE (MF)

Execução do ensaio1. Com a pinça, colocar cuidadosamente na placa de Petri um cartão absorvente;2. Com pipeta esterilizada colocar 2,0 mL do meio de cultura no cartão absorvente e tampar a placa;3. Colocar a membrana filtrante no porta-filtro, com a pinça previamente flambada e fria;4. Agitar o frasco contendo a amostra, pelo menos 25 vezes;5. Destampar e flambar a boca do frasco;6. Verter, cuidadosamente, 100 mL de amostra no porta-filtro, evitando que a água respingue sobre as

bordas superiores;7. Ligar a bomba de vácuo (seringa) e fazer a sucção;8. Depois de filtrada a amostra, lavar 3 vezes as paredes do funil com água de diluição estéril com

porções de 20 mL aplicando vácuo;9. Após a lavagem e filtração, aliviar o vácuo e remover o funil do suporte;10.Com a pinça flambada e fria, remover o filtro do suporte e colocá-lo dentro da placa de Petri, com o

lado quadriculado para cima;11.Tampar a placa de Petri e incubá-la invertida a 44,5 ± 0,2ºC durante 24 ± 2 horas;12.Encerrado o período de incubação, examinar o filtro fazendo a contagem das colônias;13.As colônias indicativas de coliformes termotolerantes aparecem de cor azul. As não coliformes

aparecem com coloração clara ou rósea.

Esterilização do conjunto de filtração no campo1. Umedecer cuidadosamente o anel de asbesto situado na base do suporte, com meia tampa de álcool

metílico (tampa do frasco de álcool);2. Atear fogo; 3. Colocar a cuba de aço por cima do funil quase o tampando;4. Após aquecer a cuba até o suportável pela mão, tampar o suporte;5. Esperar 15 minutos, aproximadamente e então remover a cuba e lavar o funil com água de diluição

estéril a fim de remover qualquer resíduo tóxico.

OBSERVAÇÕES: A combustão incompleta do metanol provoca a formação de aldeído fórmico que é o agente esterilizante. O suporte do filtro deve estar estéril no início de cada série de filtração e essa série não deve ultrapassar mais de 30 amostras. A cada série de filtração efetuar o exame de 100 mL da água de diluição para controle da esterilidade do porta-filtro. Os meios de cultura preparados para uso com membrana filtrante valem por 96 horas quando guardados em refrigerador com temperatura entre 2 a 10ºC. O conjunto de filtração também pode ser esterilizado em autoclave.

COLIFORMES TOTAIS E ESCHERICHIA COLI

Teste de presença/ausência

MÉTODO DO SUBSTRATO CROMOGÊNICO

A opção da metodologia para a realização dos exames bacteriológicos da água recai naquele procedimento que melhor se adequar às condições do laboratório, devendo-se, no entanto, adotar como padrão as metodologias, frequências e interpretação de resultados estabelecidas e recomendadas pela legislação em vigor. Os métodos de Tubos Múltiplos (TM) e Membrana Filtrante (MF) ainda são largamente utilizados, entretanto a opção pelo método de Substrato Cromogênico-Fluorogênico Definido é comumente adotado pela facilidade de manuseio, bem como por ter relativo custo/benefício já comprovado.

O método é baseado nas atividades enzimáticas específicas dos coliformes (ß galactosidade) e E. coli (ß glucoronida-se). Os meios de cultura contêm nutrientes indicadores (substrato cromogênico) que, hidrolisados pelas enzimas específicas dos coliformes e/ou E. coli, provocam uma mudança de cor no meio. Após o período de incubação, se a cor amarela é observada, coliformes totais estão presentes.

Se a fluorescência azul é observada sob luz ultravioleta (UV) 365 nm, E. coli está presente.Além da maior precisão, esse método tem como vantagem o tempo de resposta, já que a

determinação simultânea de coliformes (totais) e E. coli é efetuada após incubação das amostras a 35ºC por 24 horas, não havendo necessidade de ensaios confirmativos.

Execução do ensaio1. Coletar a amostra (100mL) em um frasco estéril ou saco de coleta contendo tiossulfato de sódio a

10% para água tratada;2. No próprio frasco ou saco adicionar o conteúdo de 1 (um) frasconete contendo o substrato

cromogênico;3. Fechar o frasco ou o saco e agitar levemente, não precisa dissolver totalmente, essa dissolução

ocorrerá de forma natural;4. Incubar a 35,0 ± 0,5ºC durante 24 horas.

Interpretação e expressão dos resultadosDecorridas 24 horas de incubação, retirar da estufa o material e observar visualmente o frasco ou

saco. Se apresentar coloração amarelada, o resultado é presença de Coliformes Totais na amostra.Com o auxílio de uma lâmpada ultravioleta 365 nm, observar se existe fluorescência azul nas amostras que desenvolveram coloração amarelada aproximando a lâmpada ao frasco. Se a amostra apresentar coloração amarelada e fluorescência com a luz UV-365 nm significa que há presença de Escherichia coli na amostra

examinada. Caso a amostra permaneça transparente, o resultado é negativo, tanto para Coliformes Totais como para E. coli. Expressar o resultado como: Presença ou Ausência de Coliformes Totais ou Escherichia coli.

NOTA: A fluorescência azul ocorre somente na presença da luz ultravioleta, ao tirar o frasco da frente da luz ele volta a ficar amarelo.

Após a realização de todas as coletas e exames os materiais devem ser esterilizados: frascos de coleta de amostra, pipetas, placas de Petri de vidro, frascos e tubos com água de diluição e meios de cultura.