anÁlise da morfologia de incisivos fluorÓticos de … · não precisa ser homem, basta ser...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE RIBEIRÃO PRETO

ANÁLISE DA MORFOLOGIA DE INCISIVOS FLUORÓTICOS DE RATOS POR MEIO DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA E

MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO

REGINA APARECIDA SEGATTO SAIANI

Ribeirão Preto

2007

REGINA APARECIDA SEGATTO SAIANI

ANÁLISE DA MORFOLOGIA DE INCISIVOS FLUORÓTICOS DE RATOS POR MEIO DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA E

MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO

Orientadora: Profa. Dra. Raquel Fernanda Gerlach

Ribeirão Preto

2007

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre, pelo curso de Pós-Graduação em Odontologia - Área de Concentração: Odontopediatria.

Ficha Catalográfica

Saiani, Regina Aparecida Segatto. Análise da morfologia de incisivos fluoróticos de ratos por meio

de microscopia eletrônica de varredura e microscopia de polarização. Ribeirão Preto, 2007.

57p. il., 30cm. Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de

Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre - Área de Concentração: Odontopediatria.

Orientadora: Gerlach, Raquel Fernanda.

1. Esmalte, 2. Fluorose, 3. Microscopia Eletrônica de Varredura, 4. Microscopia de Polarização.

DEDICATÓRIA

“Se eu pudesse deixar algum presente a você deixaria o acesso ao sentimento de amor à vida dos seres humanos. A consciência de aprender tudo que nos foi ensinado pelo tempo afora,

lembraria dos erros que foram cometidos, como sinais para que não mais se repetissem. A

capacidade de escolher novos rumos deixaria para você se pudesse, o respeito àquilo que é

indispensável: além do pão, o trabalho, a ação. E quando tudo mais faltasse para você, eu deixaria

se pudesse, um segredo: o da busca no interior de si mesmo o respeito e a força para encontrar a

saída.”

(Mahatma Gandhi)

Aos meus filhosMatheus e Mariana

Por todo incentivo, confiança, amor e apoio em todos os

momentos de minha vida. Por acreditarem na concretização desse sonho e por me darem

todo o alicerce necessário.

Aos meus pais Osmar e Regina Saiani

AGRADECIMENTOS

AO MEU AMIGO ESPECIAL

PAULO ROBERTO DESIDÉRIO, pelo incentivo para a

concretização de mais este objetivo, pelas longas horas escutando

minhas lamúrias a respeito das dificuldades na realização deste

trabalho, por ter me ajudado nos momentos mais complicados de minha

vida em todo o período que estivemos juntos.

AOS MEUS IRMÃOS

ANDRÉA, ROGÉRIA, FABIANA, OSMAR e LUCIANO, por me

ajudarem a seguir em frente e participarem de minha vida incentivando-

me a conquistar meus objetivos.

Não precisa ser homem, basta ser humano, basta ter sentimento, basta ter coração. Precisa

saber falar e calar, sobretudo saber ouvir. Tem que gostar de poesia, de madrugada, de pássaro, de sol, da lua, do canto, dos ventos e das canções

da brisa. Deve ter amor, um grande amor por alguém, ou então sentir falta de não ter esse amor. Deve amar o próximo e

respeitar a dor que os passantes levam consigo.

Devem guardar segredo sem se sacrificar. Não é preciso que seja de primeira mão, nem é imprescindível que seja de

segunda mão. Pode já ter sido enganado, pois todos os amigos são enganados. Não é preciso

que seja puro, nem que seja todo impuro, mas não deve ser vulgar. Deve ter um ideal e medo

de perdê-lo e, no caso de assim não ser, deve sentir o grande vácuo que isso deixa. Tem que

ter ressonâncias humanas, seu principal objetivo deve ser o de amigo. Deve sentir pena das

pessoas tristes e compreender o imenso vazio dos solitários.Deve gostar de crianças e

lastimar as que não puderam nascer.

Procura-se um amigo para gostar dos meus gostos, que se comova, quando chamado de amigo.

Que saiba conversar de coisas simples, de orvalhos, de grandes chuvas e das recordações da

infância.Precisa-se de um amigo para não se enlouquecer, para contar o que se viu de belo e

triste durante o dia, dos anseios e das realizações, dos sonhos e da realidade. Deve gostar de

ruas desertas, de poças de água e de caminhos molhados, de beira de estrada, de mato depois

da chuva, de se deitar no capim. Precisa-se de um amigo que diga que vale a pena viver, não porque a vida

é bela, mas porque já se tem um amigo. Precisa-se de um amigo para se parar de chorar. Para

não se viver debruçado no passado em busca de memórias perdidas. Que nos bata nos ombros

sorrindo ou chorando, mas que nos chame de amigo, para ter-se a consciência de que ainda se

vive. (Vinícius de Morais)

AOS AMIGOS

Isabel Maria Porto, você foi minha “orientadora”, este trabalho

existe porque você colocou a mão. Não vou esquecer. Serei

eternamente grata.

Andréa Marccacini, que ajudou na elaboração dos cortes dos

dentes no experimento.

Carolina Torres, pela convivência, principalmente durante esses dois

anos, pelo incentivo e, principalmente, pela amizade.

Glauce Regina Costa de Almeida, por ter se mostrado tão

prestativa, amiga e companheira nos momentos mais difíceis da

conclusão deste trabalho.

Cristhiane Bagatin, pelas extensas conversas e por me fazer

continuar no caminho.

AOS AMIGOS DE PÓS-GRADUAÇÃO Thais Andreolli, Jaciara Miranda, Maria Stella Raffaini,

Iza Peixoto, Carolina Guerra, Cristiane Rocha, Iza

Peixoto, Patrícia Motta, Patrícia Monteiro, Soraia Cheier.

Agradeço pela convivência, pela amizade e pelas boas lembranças que

cada um de vocês deixaram em minha trajetória.

AOS PROFESSORES

À Profª Drª Léa Assed Bezerra da Silva pelas sugestões,

ensinamentos, pela presteza e disponibilidade a mim despendida. Por

ser exemplo de competência, equilíbrio e respeito.

Ao Profª Dr° Paulo Nelson Filho pela dedicação por seus alunos,

pelos ensinamentos dentro e fora da Odontologia, que me servirão de

estímulo por toda a vida.

À Profª Drª Maria Cristina Borsatto, pelos ensinamentos e

incentivo.

À Profª Alexandra Mussolino de Queiroz pelos ensinamentos e

pela convivência.

Ao Profª Dr° Frederico Barbosa de Sousa do Departamento de

Morfologia do Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal da

Paraíba, pela análise da birrefringência do esmalte.

Sem atalhos mergulhei pelos caminhos do saber.

Conheci a inquietude, o descontentamento,

mas também o fascínio irresistível do maravilhoso pequeno ante o grandioso, grande ante a pequenez do espírito

e a pretensa força dos poderosos, de tudo me procurei me aproximar,

tangido pela atração do desconhecido, do irrealizado. não haveria contudo atalho ou caminho,

não estivesse em mim a força, irresistível, do prazer de percorre-lo. (Leonardo da Vinci)

AOS FUNCIONÁRIOS A todos os funcionários da FORP que sempre me atenderam muito bem.

Obrigada pelo carinho e atenção...

Aos funcionários do Departamento de Clínica Infantil, Odontologia

Preventiva e Social da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo, Benedita Viana Rodrigues, Fátima

Rizoli, Vera Ribeiro do Nascimento, Marco Antônio dos Santos,

Rejane Gomes Cavalheiro Mazer e José Aparecido Neves do

Nascimento, pelo convívio e dedicação. Obrigada pela eficiência,

simpatia e empenho em ajudar.

Aos funcionários do Departamento de Morfologia, Estomatologia e

Fisiologia Adriana Lima, Célia Aparecida da Silva, Dimitrius

Leonardo Pitol, Nilce de Oliveira Wolga por terem sido tão

prestativos comigo em todos os momentos em que eu precisei.

Às funcionárias da Seção de Pós-Graduação da Faculdade de

Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Isabel

Cristina Galino Sola e Regiane Cristina Moi Sacilloto, pela atenção

sempre concedida e pela cordialidade.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS À minha orientadora Profª Drª Raquel Fernanda Gerlach, por seus

profundos conhecimentos, experiência e ensinamentos que muito

contribuíram para a minha formação. Por sua qualificada participação na

realização deste trabalho.

A todas as pessoas que, de algum modo, contribuíram para a

realização deste trabalho.

RESUMO

O flúor é considerado o maior mentor dos programas de controle da cárie dentária.

Em cidades desenvolvidas o declínio da prevalência da cárie dental marcou o final

do século vinte. No entanto, um aumento na prevalência da fluorose dental também

tem se encontrado. A fluorose dental é um efeito adverso associado à ingestão

crônica de níveis relativamente baixos de flúor. Sabe-se esta desordem da

mineralização ocorre quando o flúor é ingerido durante a formação e

desenvolvimento dental, mas o mecanismo da fluorose dental é ainda obscuro.

Muitos estudos analisam a natureza das características histológicas e físicas

químicas do esmalte fluorótico, mas o que concerne a ultraestrutura do esmalte

fluorótico os achados são limitados. Assim neste estudo, as alterações

ultraestruturais de incisivos de ratos submetidos á altas doses de flúor, por 60 dias,

foram analisadas por microscópio eletrônico de varredura e microscópio de

polarização.

Palavras chaves: esmalte, fluorose, microscopia eletrônica de varredura,

microscopia de polarização.

ABSTRACT Fluoride is considered to be the mainstay of dental caries programme control. In

developed countries, a decline in the prevalence of caries marked the end of 20th

century. However, an increase in prevalence of dental fluorosis has also been

shown. Dental fluorosis the only established adverse effect associated with the

chronic ingestion of relatively low levels of fluoride. It is known that this disorder of

mineralization occurs only if the fluoride is ingested during the formation and

development of the teeth, but the under lying mechanism remains obscure. Many

studies were made to examine the histological characteristics and physico-chemical

nature of such enamel. However, the overall findings concerning the ultrastructure of

enamel in dental fluorosis still seem limited. In the present study, ultrastructural

changes in the incisor enamel were studies in rats given a high dose of fluoride for 60

days using scanning electron microscopy and polarization.

Key words: enamel, fluorosis, scanning electron microscopy, polarization

ÍNDICE

INTRODUÇÃO ........................................................................................1

MATERIAL e MÉTODO ........................................................................24

RESULTADOS......................................................................................28

DISCUSSÃO .........................................................................................38

CONCLUSÃO........................................................................................44

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA..........................................................46

ANEXOS................................................................................................56

INTRODUÇÃO

Regina Aparecida Segatto Saiani

2

O esmalte dental, tecido mais mineralizado de todo o corpo, é formado e

gradualmente torna-se maduro através de um processo muito longo e mais

complicado que a dentina. O desenvolvimento do esmalte é geralmente dividido em

três estágios consecutivos: 1) formação de um esmalte macio; 2) substituição de

uma matriz protéica compacta e hidratada no estágio transicional e 3) maturação,

transformação em tecido duro para a erupção dental. Alguns distúrbios ao longo

desses estágios de desenvolvimento causam defeitos na estrutura do esmalte e sua

composição (Sato et al., 1996).

Essas malformações do esmalte são classificadas em hipoplasias e

hipomineralizacões (Suckling et al., 1986). A hipoplasia ocorre por um distúrbio na

produção e secreção da matéria orgânica pelos ameloblastos no estágio de

secreção da matriz. Esse processo evidencia-se após a erupção, pois se trata de um

fenômeno morfologicamente detectável. No entanto, a hipomineralização do esmalte

é uma alteração da matriz por desordens nas funções dos ameloblastos no estágio

de maturação e não pode ser facilmente detectável por métodos histológicos simples

(Suga,1989). Por exemplo, o uso indiscriminado de flúor pode causar uma

hipomineralização do esmalte dentário.

O uso do flúor constituiu um dos marcos mais importantes da história da

Odontologia pela sua propriedade anti-cariogênica. Por isso vem sendo utilizado

como método eficaz na prevenção e controle da cárie dentária em diversas formas:

na fluoretação da água de abastecimentos públicos, adicionado ao sal de cozinha,

prescrito em gotas, em aplicações tópicas de gel, verniz ou soluções, em programas

comunitários de bochechos, nos dentifrícios, entre outros (Capella et al., 1989).

Porém são estudados e conhecidos seus efeitos colaterais quando sua ingestão

atinge níveis de toxicidade crônica ou aguda (Pires, 2001).


3

A fluorose dentária é um distúrbio no desenvolvimento do esmalte, que ocorre

quando há ingestão excessiva e/ou crônica de fluoreto durante seu período

formativo (Pires, 2001), especificamente na fase de maturação do esmalte (Aoba e

Fejerskov 2002). Do ponto de vista estrutural, a fluorose se caracteriza por um

esmalte superficial normalmente mineralizado sobreposto a uma camada

hipomineralizada (Fejerskov et al., 1974, 1975). Isto torna o esmalte fluorótico (grau

severo) altamente friável, o que leva a fraturas decorrentes da ação das forças

mastigatórias. Estas fraturas outrora eram consideradas erroneamente como

hipoplasias do esmalte causadas pelo excesso de flúor (Fejerskov et al., 1977, 1979;

Thylstrup e Fejerskov, 1979). Trabalhos relatam que a fluorose trata-se de uma

hipomineralização do esmalte (Smith et al., 1993; Fejerskov et al., 1994).

O aspecto clínico da fluorose varia conforme a severidade. O grau leve a

moderado se caracteriza clinicamente por manchas de cores brancas, opacas e sem

brilho, sendo também comum à presença de estrias no sentido transversal ao longo

eixo do dente, com pequenas proeminências superficiais (periquimáceas muito

acentuadas). O grau severo de fluorose apresenta-se como manchas de cor

castanha/marrom proveniente de pigmentações exógenas incorporadas aos defeitos

fluoróticos. Os dentes afetados apresentam, nos casos mais graves, grandes zonas

subsuperficiais de hipomineralização no esmalte, o que leva a perda de grande parte

do esmalte, de tal forma que o dente raramente apresenta sua morfologia normal no

momento do diagnóstico (Fejerskov et al., 1994). A severidade da fluorose depende

da dose, da duração da exposição, do estágio da atividade do ameloblasto, da idade

do indivíduo e da susceptibilidade individual. Os efeitos de formação do esmalte

dependem diretamente da dose a que o indivíduo é submetido (Cury, 2001).


4

É muito importante estudar a fluorose para prevenir que essa alteração

irreversível ocorra, visto que o flúor é amplamente utilizado. Só conhecendo detalhes

do(s) mecanismo(s) que leva(m) a fluorose é que conseguiremos os melhores

resultados em termos de prevenção da doença cárie com o menor grau possível de

fluorose nos pacientes ou na comunidade (Fejerskov et al., 1994).

As propriedades preventivas do flúor foram descobertas a partir de

investigações sobre o seu efeito tóxico no esmalte dentário em desenvolvimento,

resultante da sua ingestão. A constatação da fluorose dentária precedeu a adoção

da fluoretação da água de abastecimento público como medida benéfica à saúde

bucal. Mediante a observação de tais efeitos e o desejo de investigá-los,

desencadeou-se uma série de estudos, que resultaram na descoberta da fluoretação

da água de abastecimento público como medida de controle de cárie dentária

(Thylstrup, 1990).

O aumento das formas brandas e mais recentemente das formas mais graves

de fluorose não deve causar a eliminação do uso deste elemento em programas de

prevenção da cárie dentária, pois ele é uma das razões da redução da cárie

observada nas últimas três décadas (Pires, 2001).


5

História da Descoberta dos Efeitos Benéficos e Prejudiciais Do Flúor

Sobre o Esmalte Dental

Eager, um médico da marinha norte-americana, verificou, no ano 1901 em

Nápoles (Itália), modificações no esmalte dentário de moradores de uma região

geograficamente rica em vulcões, onde a água de consumo apresentava uma alta

concentração de húmus vulcânico. A população apresentava afecções endêmicas

que se caracterizavam por manchas escuras no esmalte dentário, descritas como

“Dente de Chiaie”. Por volta de 1911, Mckay, observou que era relativamente

freqüente a ocorrência de um determinado grau de opacidade no esmalte dentário

entre os moradores de Colorado Springs, nos Estados Unidos da América. Esta

alteração dentária era localmente denominada de "Mancha Amarronzada do

Colorado". Apesar de ser alta a prevalência da mancha nos dentes dos moradores,

ocorria apenas entre os nascidos ou aqueles que se mudaram para o local ainda

bebês (Burt; Fejerskov, 1996). Mckay e Black, em 1916, não conseguiram

estabelecer correlação entre a ocorrência das “Manchas de Colorado” com a idade,

sexo, raça, doenças infecciosas ou fatores socioeconômicos e nutricionais da

população local. Entretanto, estabeleceram uma relação direta entre o defeito

estrutural do esmalte e a presença de alguma substância na água de abastecimento

público. Ao ser constatado que a população residente na área urbana, abastecida

pela água de Colorado Springs, desde bebês, ou seja, desde o período de formação

dentária, apresentava o manchamento do esmalte e os moradores da área rural não,

estabeleceu-se à relação com a água. Outra constatação importante foi que as

crianças da área urbana apresentavam uma menor prevalência de cárie (Mckay;

Black, 1916 apud Pereira, 2003; Black; Mckay, 1916 Apud Fejerskov; Ekstrant; Burt,


6

1996). Black e Mckay quando descreveram a ocorrência utilizaram o termo “mottled

enamel” (esmalte mosqueado) e associaram tal alteração ao tipo de água

consumida. Mais tarde, em 1928, Mckay sugeriu que a substância presente na água,

responsável pelo manchamento dos dentes, também seria capaz de reduzir a

experiência de cárie das crianças (Mckay, 1928 apud Burt; Fejerskov,1996). Em

1931, Petrey descobriu, acidentalmente, que a água utilizada em Bauxite, uma das

cidades americanas em que o esmalte mosqueado tornou-se endêmico, possuía

13,7 mg F-/L. Assim, foram sendo reunidos os dados sobre a presença de flúor na

água e foi se tornando claro que o grau de severidade das manchas dentárias era

proporcional à maior quantidade de flúor na água, e a afecção do esmalte

mosqueado passou a ser chamada de fluorose. Paralelamente a isto, também se

percebeu que a fluorose ocorria durante o período de mineralização dos dentes

(Mckay, 1928 apud Burt; Fejerskov, 1996).

Ao estudar a fluorose é importante procurar conhecer os mecanismos de ação

do flúor sobre o esmalte dental, obtendo-se o melhor resultado em termos de

prevenção da doença cárie com o menor grau possível de fluorose nos pacientes ou

na comunidade (Fejerskov et al., 1994).


7

Mecanismos de Ação do Flúor Sobre o Esmalte Dental

A. Odontogênese

O início do desenvolvimento odontogênico é caracterizado pela invaginação

do epitélio oral no tecido subjacente seguido de proliferação, gerando assim a

lâmina dentária. Nesta lâmina serão formados pontos específicos denominados

botões epiteliais. Os germes dentários passam pelas fases de botão, capuz,

campânula, coroa e raiz. Porém, a formação específica dos diversos tecidos que

constituirão o dente e suas estruturas de suporte inicia-se a partir da fase de

campânula. Desse modo, esses processos recebem denominações também

específicas. Assim sendo, dentinogênese, amelogênese, cementogênese e

osteogênese correspondem, respectivamente, à formação de dentina, esmalte,

cemento e osso (Katchburian e Arana, 2004).

A organização morfogenética do órgão do esmalte permite que se definam os

contornos da futura coroa e o local de deposição inicial da matriz do esmalte

(Termine et al., 1980). Apesar de cada dente se desenvolver como uma estrutura

independente e formar tipos dentários morfologicamente diferentes (incisivos,

caninos, pré-molares e molares), o processo de desenvolvimento dental,

denominado odontogênese, é basicamente o mesmo.

A interação entre o epitélio oral e a papila dentaria levam à formação de dos

ameloblastos e dos odontoblastos. A dentina é formada pelos odontoblastos e o

esmalte é formado pelos ameloblastos (Simmer et al., 2001).


8

B. Amelogênese

O processo de formação do esmalte dentário é denominado de amelogênese,

sendo compreendido basicamente de duas fases: (i) secreção, na qual células

presentes no tecido epitelial que reveste os dentes, os ameloblastos, secretam uma

matriz altamente protéica e hidratada e (ii) maturação, na qual há um grande influxo

de íons minerais, principalmente cálcio e fósforo, que vão se depositar na forma de

cristais de hidroxiapatita. O crescimento desses cristais em largura ocorre

concomitantemente à perda de água e proteínas (Smith, 1998).

Os ameloblastos pré-secretórios são células cuboidais que, a partir dos

primeiros sinais de desenvolvimento odontogênico, tornam-se secretoras e

morfologicamente colunares, com comprimento superior a 60 µm e diâmetro de 2 a 3

µm. Seus núcleos e mitocôndrias polarizam-se no sentido proximal, enquanto a

porção distal dessas células assume um aspecto cônico, constituindo o Processo de

Tomes (Finchan e Simmer, 1997), o único sítio celular a interagir com a superfície do

esmalte, formado por meio da secreção de matriz orgânica, de sua remoção e de

sua substituição por pequenos cristais minerais (Reith, 1970; Sasaki et al., 1997).

A composição da matriz do esmalte é basicamente protéica, contendo

carboidratos e lipídios. Deve-se salientar que as proteínas dessa matriz não são de

natureza colágena, característica esta que distingue da matriz dos outros tecidos

mineralizados e que expressa claramente a origem não conjuntiva do esmalte. São

reconhecidos dois grupos de proteínas na matriz do esmalte recém-secretado: as

amelogeninas, mais abundantes (aproximadamente 90% do total das proteínas do

esmalte), hidrofóbicas e ricas em prolina, e as enamelinas, que são fosfoproteínas

glicosiladas acídicas. Nos últimos anos foram identificados mais tipos de proteínas,

sendo agora considerados, portanto, também dois grandes grupos: as amelogeninas


9

e as não - amelogeninas. Neste segundo grupo incluem-se fosfoproteínas

glicosiladas acídicas – enamelina e tufelina – e glicoproteínas sulfatadas –

ameloblastina e suas frações, amelina e bainhalina (Katchburian e Arana, 2004).

O arranjo tridimensional do principal grupo de proteínas do esmalte, composto

pelas amelogeninas, forma agregados de estruturas quaternárias quase esféricas

denominadas nanosferas, cada uma com aproximadamente 20nm (Moradian-Oldak,

2001; Aichmayer et al., 2005). Essas nanosferas, semelhantes a um “colar de

pérolas” em torno dos cristalitos, assumem a função de andaime, direcionando o

crescimento cristalino e modulando sua arquitetura (Finchan et al., 1995). Tais

eventos ocorrem pela atuação inibitória das proteínas nas superfícies dos cristais de

apatita, possibilitando uma uniformidade em tamanho e morfologia, impedindo a

invasão de um cristal sobre a superfície do outro com sua conseqüente fratura

(Robinson et al., 1982, 1998).

Durante a secreção há o alongamento de cada cristalito, um processo

atribuído as amelogeninas em função da sua afinidade de ligação à superfície

mineral do esmalte e a sua presença em maior quantidade em relação as

enamelinasdo esmalte. No período de maturação, a remoção ordenada das

proteínas do esmalte, permite o crescimento do cristal em largura (Robinson et al.,

1982, 1998).

O esmalte em formação desenvolve uma porção prismática e outra

interprismática. Esses dois tipos de estruturas são praticamente idênticos, a não ser

pela angulação de seus cristais. Enquanto o esmalte prismático dispõe-se

paralelamente ao longo eixo dos ameloblastos, o interprismático encontra-se a

aproximadamente 65 graus em relação ao primeiro. Entre essas estruturas há uma

camada delgada de matriz, sem cristais, conhecida como bainha do prisma ou


10

espaço de bainha do prisma. Na amelogênese, o espaço referido pode ser

observado desde a junção amelodentinária até a superfície do esmalte (Katchburian

e Arana, 2004).

Após a deposição de uma fina camada superficial de esmalte aprismático, os

ameloblastos reduzem sua altura, diminuindo suas organelas relacionadas com a

síntese e secreção, através de mecanismos de autofagia. Na fase de maturação, os

ameloblastos apresentam-se como células cilíndricas baixas, apresentando em sua

extremidade distal um aspecto liso ou rugoso, semelhante, neste último caso, à

borda estriada das células clásticas. Enquanto os ameloblastos de borda lisa estão

envolvidos na remoção da matéria orgânica e água, os ameloblastos de borda

rugosa participam no rápido influxo de íons cálcio e fosfato para a matriz, permitindo

o crescimento dos cristais de hidroxiapatita (Simmer e Fincham, 1995).

O resultado de interferências nesse e em outros eventos ocorridos durante a

amelogênese, se manifesta por meio dos distúrbios de desenvolvimento do esmalte,

entre os quais se destaca a fluorose.

C. Flúor

O flúor é o elemento mais eletronegativo do grupo dos halógenos, tendo

assim, uma grande capacidade de reagir com outros elementos químicos, formando

compostos orgânicos e inorgânicos. Vários aspectos diferem o flúor dos demais

elementos do grupo, incluindo (i) o fato de se combinar reversivelmente com íons de

hidrogênio para formar um ácido fraco, o HF, (ii) de ser um potente inibidor de várias

enzimas (iii) de ter uma velocidade de eliminação dos organismos muitas vezes mais

rápida que a dos demais halógenos, (iv) afinidade por tecidos calcificados (v)

capacidade de estimular a formação de tecido ósseo e (vi) a sua grande capacidade


11

de inibir e também de reverter o processo de formação de lesão de cárie. Grande

parte das propriedades do flúor pode ser explicada com base na capacidade de

difusão do HF (Featherstone et al., 1990 Featherstone, 1999).

O esmalte e a dentina são compostos minerais à base de apatita (sais

contendo cálcio e fosfato), extremamente dinâmicos tanto no período de

desenvolvimento dentário, quanto após a sua erupção (Cury, 2001). Este fato

justifica porque durante muito tempo permaneceu a teoria de que as propriedades

cariostáticas do flúor fossem decorrentes da sua incorporação ao esmalte.

Acreditava-se que através do uso sistêmico do flúor ocorreria uma melhora na

estrutura cristalina dos dentes, tornando-os mais resistentes à cárie, uma vez que

incorporado ao dente formaria fluorapatita (FA), pela reação abaixo descrita:

10 Ca +2 + 6HPO4-2 + 2 H2O ↔ Ca10(PO4)6(OH)2 + 8 H+

A fluorapatita sendo menos solúvel que a hidroxiapatita (HA), não só

explicaria a menor ocorrência de cárie quando da ingestão de água fluoretada, como

também, justificaria o uso de flúor sistêmico (Cury, 2001). No entanto, alguns

estudos demonstraram que quando o flúor é ingerido durante a formação dos

dentes, ocorre a incorporação de uma quantidade de flúor correspondente a no

máximo 10% de substituição de hidroxila por flúor na apatita. Esta concentração de

flúor não torna o esmalte mais resistente aos ácidos produzidos pelas bactérias.

Para aumentar a resistência do esmalte seriam necessários 30.000 ppm F- ou cerca

de 60% de substituição (Ogaard et al., 1988, Ogaard et al., 1991; Ten Cate, 1997;

Featherstone, 1999; Limeback, 1999). Desta forma, o flúor incorporado na estrutura

do esmalte tem um efeito inexpressivo ou mesmo inexistente (Limeback, 1999;

Featherstone, 1999), sendo o íon flúor livre na saliva que interfere no processo de

des-remineralização mais importante na atividade cariostática.


12

Os resultados positivos obtidos mediante o uso do flúor, no controle da cárie

dentária, são indiscutíveis e reconhecidos cientificamente. No entanto, a ingestão

excessiva deste composto no período de formação dos dentes pode levar à fluorose

dentária. A partir da década de 80 ocorreu um declínio na prevalência e incidência

de cárie e, simultaneamente, um aumento na prevalência de fluorose dentária

(Thylstrup e Fejerskov, 1978; Fejerskov et al., 1981; Burt, 1992; Whitford, 1996).

A quantidade de ingestão diária de flúor, normalmente aceita como ideal para

o controle da cárie e segura para a prevenção de fluorose, é de 0,05 a 0,07 mgF-/kg

massa corporal (Burt, 1992), embora ainda sejam necessários mais estudos para se

determinar precisamente esta dose.

Mesmo havendo consenso da relação existente entre o uso do flúor e a

redução de cárie dentária e o reconhecimento da sua ação terapêutica, é preciso

entender que o flúor é uma substância tóxica e, como tal, pode causar efeitos

colaterais quando altas doses são ingeridas agudamente, ou mesmo, baixas doses

cronicamente. Estes efeitos podem desencadear desde distúrbios gástricos

reversíveis, redução temporária da capacidade urinária, fluorose dentária ou

esquelética, até mesmo a morte, uma vez que estão diretamente relacionados à

dose, tempo de ingestão e idade (Thylstrup e Fejerskov, 1978; Fejerskovet al., 1981;

Burt, 1992; Whitford, 1996).

A concentração de flúor no sangue de um indivíduo em jejum e que consome

água fluoretada, gira em torno de 19.10-3 mgF-/L. Em regiões com altas

concentrações de flúor na água de abastecimento, são observadas importantes

variações na concentração plasmática de flúor dos moradores. Em uma

concentração de até 1,2 mgF-/L as flutuações não são muito evidentes

(Ekstrand,1996). A concentração de flúor no plasma e nos fluidos intersticiais deve


13

ser similar e varia entre 1.10-2 a 5.10-2 mgF-/L, embora outros valores intermediários

já tenham sido relatados (Whitford, 1990).

Devido à grande importância terapêutica e toxicológica do flúor iônico, é

importante avaliar se o flúor presente no plasma encontra-se na forma iônica ou

ligada a outras moléculas. A concentração de flúor iônico no plasma aumenta com a

idade, o que se deve provavelmente ao aumento na reabsorção da estrutura óssea e

à diminuição da capacidade do esqueleto em remover o flúor do sangue que

ocorrem com a idade (Whitford, 1990).

O flúor se distribui rapidamente pelo organismo após a sua ingestão. Os

níveis plasmáticos geralmente começam a apresentar sinais de aumento 10 minutos

após a ingestão, o pico máximo é atingido entre 20 a 60 minutos, e então, retornam

para os níveis de pré-ingestão depois de 3 a 11 horas, dependendo da dose

(Whitford, 1996). Uma vez estabelecido que o gradiente de pH entre os meios intra e

extracelulares pode ser aumentado ou diminuído pela alteração do pH extracelular, é

possível promover a entrada ou saída de flúor nas células. Esta é a base para a

sugestão de que a alcalinização dos fluidos corporais seja um bom coadjuvante no

tratamento de toxicidade aguda pelo flúor (Whitford al., 1979).

D. Fluorose Dental

A fluorose dentária é caracterizada pelo aumento de porosidade na

subsuperfície do esmalte, fazendo com que o esmalte pareça opaco, embora a

camada superficial (de cerca de 30µm em humanos) esteja íntegra e normalmente

mineralizada. O mecanismo pelo qual este evento ocorre durante a amelogênese

ainda não foi esclarecido (Fejerskov et al., 1994).


14

Tendo um caráter dose-dependente, o aspecto clínico da fluorose pode variar

desde linhas brancas finas até um esmalte opaco e de aspecto calcáreo, que pode

se fraturar após a erupção e/ou se pigmentar (Fejerskov et al., 1994). A

concentração de flúor no esmalte é mais alta nas camadas externas ficando na faixa

de 3.000-5.000 ppm quando o esmalte é formado em uma área fluoretada. Com uma

baixa ingestão de flúor durante a mineralização, a concentração fica na faixa de

1.000 a 2.000 ppm. Dentro dos 10-20 µm mais externos do esmalte, a concentração

de flúor cai para cerca de 50 ppm nas áreas não fluoretadas (Thylstrup e Fejerskov,

1978).

Quando o volume dos poros atinge 10 a 15%, a superfície externa pode se

romper, formando cavidades inicialmente menores, mas que podem confluir

impulsionadas por forças físicas intrabucais, como mastigação ou atrito. A aparência

hipoplásica do esmalte é, portanto, falsa, pois não houve perturbação no estágio

secretório do esmalte, mas, sim, desgaste pós-eruptivo da camada superficial.

(Thylstrup e Fejerskov, 1978; Yanagisawa et al, 1989; Giambro et al, 1995).

O padrão progressivo de formação do esmalte em germes de molares de

cabras e ovelhas foi estudado por Suga (1982), que utilizou microradiografias para

comparar seus resultados com os de estudos prévios em outros mamíferos.

Observou que, entre os fatores que atuam sobre o processo de mineralização estão

a composição química e física da matriz orgânica e o movimento de íons e

substâncias orgânicas por meio de células do órgão do esmalte e dos túbulos

dentinários. Possivelmente, os ameloblastos ao serem atingidos por compostos tais

como o fluoreto de sódio, e desorganizados durante o final do estágio de secreção e

o inicio da maturação, originariam a perda da continuidade da mineralização na área

subjacente. As alterações na forma e no gradiente de mineralização ocorridas nos


15

espécimes estudados ocorriam, entre outros fatores, por diferenças na composição

química de cada camada depositada.

A desorganização do processo de maturação induzida por alterações

citológicas nos ameloblastos, como resultado da interferência de fatores externos, foi

avaliada por Suga et al (1987). Neste estudo, microradiografias e cortes para

microscopia óptica de dentes de ratos foram usadas, apresentando distúrbios de

desenvolvimento causados pela administração de fluoreto de sódio e estrôncio na

água de consumo. O fluoreto de sódio foi acrescido à água nas concentrações de

100, 200 e 300ppm, durante 40 dias. Cinco horas antes do sacrifício dos grupos, os

animais receberam injeção de tetracloreto de tetraciclina a 6mg/100mg de peso do

animal. A droga foi injetada para demarcar as áreas de mineralização normal. Foram

realizadas ainda, análises dos elementos Ca, P, Mg, Fe, além do Sr e do F. Notou-

se que, na hipomineralização causada pelo fluoretode sódio e pelo estrôncio, o ferro

penetrou profundamente no esmalte, algumas vezes alcançando a junção

amelodentinária, presumivelmente devido à alta porosidade da matriz.

Estudos pretendem esclarecer os mecanismos de ação do flúor durante o

desenvolvimento do dente, para responder como e quando ocorre a

hipomineralização. Estes questionamentos esbarram nas dificuldades de se

reproduzir in vitro as condições humanas, uma vez que a maioria dos estudos é

realizada em animais por questões éticas (Evans e Darvell, 1995). Transferir o

resultado dos estudos in vitro para o homem sem considerar os demais fatores que

interferem na fluorose pode levar a conclusões erradas.

Fejerskov et al. (1979) produziram fluorose, em incisivos de ratos, ao

acrescentar em água de consumo diário 100ppm de fluoreto de sódio. Notaram

ainda que, a concentração referida não foi suficiente para produzir um esmalte


16

hipoplásico. Concluíram que, no modelo de estudo utilizado, o grau de

comprometimento do esmalte seria dependente da dose de flúor administrada. O

autor considerou que, as diferenças evolutivas entre os humanos e os pequenos

roedores seriam superadas pela similaridade das características básicas

encontradas em seus dentes permitindo, portanto, a comparação entre eles.

Para que as lesões produzidas em animais pudessem mimetizar as humanas,

as doses de flúor ingeridas deveriam ser proporcionalmente similares. Desse modo,

estimou-se que 100ppm de fluoreto de sódio na água de consumo diário, produziria

em ratos uma concentração de flúor entre 12 e 13 mgF-/kg de massa corporal

(Fejerskov et al., 1979).

Kruger (1970) induziu fluorose dentária em ratos, por meio de injeções

intraperitonais de fluoreto de sódio nas concentrações de 7, 3 e 0,1mg F-/kg. A partir

da análise das alterações na ultraestrutura dos ameloblasto, considerou a dose de

0,1mg F-/kg de massa corporal, a dose limítrofe na promoção de fluorose no modelo

experimental utilizado, sendo esta quantidade consideravelmente mais alta que os

0,04mg F-/kg capazes de causar fluorose em humanos. A dose mínima utilizada no

experimento foi capaz de causar alterações compatíveis com a fluorose dentária,

porém não provocou alterações ultraestruturais no ameloblastos.

Em 1972, o mesmo autor, acreditando que a síntese e secreção de proteínas

poderiam sofrer modificações perante compostos fluoretados, injetou em ratos 3,

0,05 e 0,01 mg F-/kg e estudou a incorporação de serina à matriz do esmalte. O

fosfato de serina, conforme o autor, foi identificado na matriz do esmalte bovino e,

teoricamente, teria influência no crescimento dos cristais de apatita. Na análise dos

seus resultados notou que, após uma hora houve diminuição na entrada de serina

na matriz, quando a dose foi de 3 mg F-/kg e que, as duas outras doses foram


17

insuficientes para alterar a incorporação do aminoácido. Sugeriu que os eventos

bioquímicos observados poderiam estar envolvidos na diminuição da síntese e

secreção protéica, necessária para produção da matriz extracelular.

A diminuição do conteúdo protéico do esmalte, secretado em dentes com

fluorose, foi um dos aspectos estudados por DenBesten e Crenshaw (1984). Ao

compararem quantitativamente a matriz do estágio secretor nos dentes com e sem

fluorose, não observaram diferenças entre os grupos, quanto à quantidade de

proteínas. O efeito da ingestão crônica de doses altas de flúor sobre a maturação do

esmalte também foi testado nesse mesmo experimento. Usaram ratos como modelo

experimental oferecendo-lhes, na água de consumo, fluoreto em concentrações de

75, 100 e 150ppm. Após cinco semanas, compararam os grupos com base nos

componentes protéicos e na presença de flúor. Os resultados indicaram que, a partir

de 75ppm houve aumento na concentração de flúor e retenção das proteínas de

matriz, levando-os a sugerir uma provável interferência no desenvolvimento pré-

eruptivo do esmalte dos espécimes estudados. Em 1985, utilizaram uma

metodologia similar e notaram que, no início da maturação, a ingestão crônica de

75ppm de flúor era suficiente para alterar a modulação dos ameloblastos, um outro

fator que poderia contribuir para a retenção das proteínas.

Em 1986, DenBesten avaliou novamente os efeitos do flúor em cada um dos

estágios de formação do esmalte, usando a cromatografia e a eletroforese em

espécimes obtidos de ratos, submetidos a doses de 10, 25, 50 e 100ppm de fluoreto

de sódio. Com a eletroforese observaram que, em todas as isoformas estudadas

houve um atraso na clivagem enzimática durante a maturação, mesmo tendo sido

quase todas removidas ao final desse período, atribuindo ao flúor um efeito direto na


18

atividade enzimática e conseqüentemente no atraso da remoção das proteínas do

esmalte.

A falta de remoção das proteínas do esmalte pode ser considerada como a

responsável pela diminuição na quantidade e no índice de nucleação dos cristais de

apatita do esmalte. Essa hipótese foi demonstrada por Aoba et al. (1987), que

observaram in vitro o potencial de inibição de crescimento cristalino exercido pelas

proteínas do esmalte. Uma interferência na degradação dessas proteínas poderia

estar associada à permanência prolongada das mesmas e, conseqüentemente, a

deficiência de mineralização. Os dentes afetados pela fluorose mostram esse padrão

de alteração (Robinson et al., 1998).

O início do estágio de maturação parece apresentar uma susceptibilidade

maior aos efeitos negativos do flúor, que poderia gerar inibição da proteólise na

matriz, resultando no acúmulo de material orgânico. Os achados de Lyaruu et al.

(1987), indicaram que a matriz sintetizada e secretada na presença de 10 mg F-/ml

de água destilada, em cultura de germes dentários de hamsters, mantém sua

capacidade de sustentar o crescimento cristalino quando o flúor é removido da

cultura. Mesmo não se conhecendo com exatidão a função das amelogeninas na

mineralizaçãodo esmalte, acredita-se que as mesmas controlam a orientação do

crescimento dos cristais em comprimento. A administração do flúor, in vitro, durante

a fase de secreção da amelogênese inibe tal crescimento, indicando que o flúor

rompe temporariamente o controle das amelogeninas sobre a mineralização.

Acreditando que o influxo de íons flúor poderia interferir indiretamente na

atuação das proteases sobre as proteínas do esmalte, principalmente as

amelogeninas, Overall e Limeback (1988) sugeriram que a serina denominada

ameloginase seria ativada por uma metaloproteinase e que, para tal ativação o íon


19

Ca++ era necessário. O flúor por sua vez poderia interferir na atuação dos íons

cálcio sobre enzimas, resultando em um distúrbio funcional por parte das mesmas e

na retenção das amelogeninas.

DenBesten et al. (1992), estudando as interações bioquímicas ocorridas na

estrutura do esmalte, buscaram determinar a possível capacidade de ligação do flúor

às proteínas da matriz. Para tanto utilizaram 26 ratos, com água contendo zero e

100ppm de fluoreto de sódio durante seis semanas. Após a realização de seu

experimento, constataram a existência de ligação iônica entre flúor e as proteínas da

matriz do esmalte na fase de mineralização. Observaram ainda uma interação entre

o cálcio e o flúor durante a fase secretora e sugeriram que o composto formado

poderia afetar a remoção das proteínas e, conseqüentemente, a maturação do

esmalte.

A demonstração morfológica da alteração na maturação do esmalte por

atraso na remoção da matriz protéica foi abordada por Zhou et al. (1996) através de

avaliações morfométricas e auto-radiográficas, em incisivos de ratos expostos de

forma crônica a doses de 75 e 100ppm de fluoreto de sódio no período de seis

semanas. Ao mensurarem o comprimento da matriz na região pós-secretora,

observaram que seu comprimento era maior nos grupos com fluorose em relação ao

controle, o que seria uma confirmação morfológica do atraso da degradação e

reabsorção das proteínas da matriz, causando hipomineralização.

Explicar o atraso da degradação da matriz do esmalte tem sido um dos

aspectos mais estudados em relação à patogenia da fluorose dentária. Uma das

respostas para esse processo está na possível ação direta do flúor sobre a atividade

das enzimas proteolíticas, destinadas a clivar as proteínas do esmalte. Assim

Gerlach et al., 2000, comprovaram, utilizando colorimetria e zimografia da matriz de


20

esmalte de ratos, não haver efeito direto do flúor livre sobre as proteinases.

Conforme os autores, seus resultados permitiram a exclusão dessa hipótese para o

desenvolvimento da fluorose, sendo consideradas mais viáveis as trocas energéticas

na superfície dos cristais frente ao flúor.

Zhang et al. (2006), investigaram a atuação do flúor na síntese e secreção da

metaloproteinase-20 (MMP-20), a proteinase responsável pela hidrólise inicial da

amelogenina durante o estágio secretório da formação do esmalte. Os resultados

sugeriram que o flúor pode alterar a expressão da MMP-20 pelos ameloblasto,

resultando em um distúrbio no balanço entre a MMP-20 e seu substrato que pode

contribuir para a retenção da amelogenina na formação do esmalte fluorótico.

Lyaruu et al., em 2006, confirmaram em hamster a hipótese de que a

alteração na formação do esmalte dental na presença de alta quantidade de flúor é

dependente do grau de desenvolvimento do ameloblasto e que a hipomineralização

do esmalte distribuída pelas superfícies do esmalte fluorótico são causadas pela

perda tardia dos estágios secretórios e transicionais dos ameloblastos. Os grupos de

ameloblastos transicionais foram mais sensíveis seguidos por alguns do estágio

secretório. Estes dados sugerem que um aumento do flúor induz morte celular no

estágio transicional dos ameloblastos acompanhados de lesão cística, as quais

podem explicar a formação de buracos (fossas) vistas clinicamente na superfície

dental.

Como vimos existem várias hipóteses de como o flúor age na amelogênese e

são amplos os estudos que procuram desvendar o efeito que este provoca no

esmalte dental.

Estudos em animais experimentais e também em diferentes espécies de

mamíferos indicam que os estágios secretório e pós secretório da formação do


21

esmalte podem ser afetados pelo aumento da exposição ao flúor (Aoba e Fejerskov

2002; Tataruch e Kierdorf, 2003), mas que a causa da hipomineralização

subsuperficial da fluorose dental hoje é amplamente atribuída por distúrbios

induzidos pelo flúor na maturação do esmalte (Aoba e Fejerskov, 2002).

Investigações do desenvolvimento dental em humanos têm sido realizadas

para se determinar sinais moleculares importantes no processo da fluorose (Bartlett

et al., 2005). Mas muitos estudos também têm acontecido em ratos, pois estes

roedores possuem incisivos de erupção contínua, podendo-se encontrar todas as

fases do desenvolvimento do esmalte no mesmo dente. Assim sendo, esses animais

são submetidos a altas doses de flúor por um período prolongado (em média 02

meses) desenvolvendo fluorose em seus incisivos. Isto ocorre porque o esmalte é

susceptível a fluorose durante seu desenvolvimento. A fluorose é mais severa nos

dentes permanentes do que nos decíduos porque, no útero, a placenta bloqueia o

acesso do flúor ao feto onde a primeira dentição está em desenvolvimento (Whitford,

1996). Então, um desenvolvimento dental, semelhante à erupção contínua dos

incisivos de ratos, é necessário ao estudo da fluorose (Bartlett et al., 2005).

Há poucos achados morfológicos sobre a fluorose dental, e a maioria é em

humanos ou macacos; em ratos não há trabalhos com o esmalte fluorótico maduro.

Como o modelo do incisivo de rato é muito usado para estudar amelogênese na

presença de flúor, é importante ter mais informações morfológicas do esmalte

fluorótico mineralizado em incisivos de ratos.


22

Achados Morfológicos de Incisivos de ratos

Kruger (1971) observou molares de ratos que receberam 7mg F-/kg, 2 vezes

ao dia, do 4º ao 19º dia após o nascimento. Os dentes foram cortados em secções

sagitais no sentido mésio-distal, polidos manualmente e em seguida passaram por

ataque ácido com ácido acético 2%. Quando levados ao microscópio eletrônico de

varredura, foram observadas bandas claras e escuras. As bandas escuras eram

ligeiramente elevadas da superfície e mais resistentes ao ataque ácido e ao

polimento. As bandas claras eram mais brilhantes e não foram resistentes ao ataque

ácido. Ele concluiu que provavelmente as áreas claras eram menos mineralizadas

que as áreas escuras.

Shinoga e Ogura (1977) administraram 100 ppm de flúor na água de beber

dos ratos. Os espécimes estudados foram obtidos da parte incisal dos incisivos.

Estes foram divididos em três grupos e então examinados no microscópio eletrônico

de varredura. No grupo 1 os espécimes sofreram ataque ácido; no grupo 2 os

espécimes sofreram ataque ácido e foram incinerados a temperaturas baixas; no

grupo 3 os espécimes foram fraturados. No esmalte formado durante altas

exposições ao flúor encontraram marcas de hipomineralização, isto é, a densidade

do cristal no núcleo do prisma e na região interprismática era mais baixa do que

aquele dos animais controle. As substâncias orgânicas pareceram aumentar nessas

regiões. Estas mudanças eram proeminentes na camada externa e média do

esmalte. Tais mudanças parecem indicar uma inibição da maturação do esmalte,

isto é, da deposição mineral e/ou retirada da matriz orgânica.

Ishida et al. (1979), identificaram bandas incrementais hipo e

hipermineralizadas no esmalte de dentes de ratos tratados com injeção subcutânea


23

de fluoreto de sódio. Os dentes foram analisados em microradiografias e

microscopia eletrônica de varredura. A espessura dos cristais de esmalte na faixa

hipermineralizada era maior entre aquelas que estavam no mesmo estágio de

desenvolvimento vista nos animais controle. Encontrou-se também um aumento

gradual na espessura do cristal da superfície para a junção amelodentinária. Este

fenômeno de hipermineralização pode ser devido a uma aceleração do crescimento

do cristal na presença do íon fluoreto.

Para colaborar com os estudos, o nosso propósito neste trabalho é analisar

as características morfológicas do esmalte dentário de incisivos de ratos fluoróticos e

compará-los com o esmalte normal, usando a microscopia eletrônica de varredura e

microscopia de luz polarizada.


24

Material e Método


25

Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA)

do Campus de Ribeirão Preto – USP, protocolo n° 01.1364.53.4.

Foram usados 14 ratos (7 controles e 7 experimentais) Wistar de 100 g. Aos

ratos experimentais foi administrado por dois meses 100 ppm de flúor dissolvidos em

água destilada e os ratos controles foram tratados por dois meses somente com

água destilada. Ambos os grupos tiveram água e comida ad libitum.

Após este período estes ratos foram sacrificados, três mandíbulas

experimentais e três controles foram usados na microscopia comum. No restante

dos animais foram extraídos os incisivos superiores e inferiores.

Foram feitas fotos dos incisivos extraídos de alguns animais controle e

fluorotico.

Microscopia Eletrônica de Varredura

Cinco incisivos inferiores experimentais e cinco incisivos inferiores controle

foram fixados com glutaraldeído 2,5 % em tampão fosfato pH 7,4 por 48 horas. Após

isso, foi realizado ataque ácido na face labial com ácido clorídrico 6N por 15

segundos cada. Estes mesmos dentes foram então desidratados em grau crescente

de acetona, secados em estufa a 37oC overnight. A cobertura foi feita com ouro,

sendo em seguida analisados e fotografados no microscópio eletrônico de varredura

(Jeol JSM – 5600LV, Tóquio, Japão).

Outros cinco incisivos inferiores experimentais e cinco incisivos inferiores

controles foram lixados e polidos até uma espessura de 0,5µm, em seguida

passaram pela tripsina 0,25% por 30 minutos. Após foi realizado 3 banhos de água

destilada e a cada banho os dentes passaram por cuba ultrasônica por 5 minutos. A

seguir foi realizado ataque ácido com ácido fosfórico 37% por 15 segundos cada.


26

Em seguida, fixados em glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato pH 7,4 por 48 horas.

Então foram desidratados em ordem crescente de acetona, colocados em estufa a

37oC overnight, foi removido de unidade em dessecador de ponto crítico,

metalização com ouro, sendo em seguida analisados e fotografados no microscópio

eletrônico de varredura.

Microscopia de Polarização

Dez incisivos superiores de cada grupo foram fixados em paraformaldeído

4%por 48 horas, desidratados em graus crescentes de álcool, infiltrados na resina

Technovit, cortados no equipamento EXAKT, desgastados até a espessura de

40µm. Após foi feita a fotomicrografia dos cortes em microscópio de luz polarizada

(Leica modelo DMLP).

Foram usados incisivos superiores, deixando apenas à parte mais incisal do

dente (à parte com pigmentação castanha). Esta região foi dividida em três partes:

incisal (coroa clinica), meio e apical (parte mais próxima do esmalte menos

mineralizado).

Outros três incisivos superiores do grupo experimental e três incisivos

superiores do grupo controle foram fixados com Karnowsky. Estes dentes foram

desgastados em lixa d’água até a espessura de 100um e foram analisados em

MEIO

INCISAL APICAL


27

microscopia de polarização, com a colaboração do Professor Frederico Barbosa de

Sousa do Departamento de Morfologia do Centro de Ciências da Saúde, da

Universidade Federal da Paraíba, para a análise da birrefringência do esmalte.

Para esta análise foram usados dentes com 100 micrômetros de espessura,

cortados no centro da face vestibular. Estes dentes foram imersos por 48h em

solução de Thoulet com índice de refração 1,62 (preparados com água destilada,

iodeto de potássio e iodeto de mercúrio). As camadas analisadas foram (da

superfície para o limite amelo-dentinário): camada superficial aprismática - 1,

camada prismática superficial (1/3 mais externo) - 2 e camada prismática profunda

(2/3 mais internos) - 3. Essas camadas têm comportamento de birrefringência

diferentes, por isso foram analisadas separadamente e foram analisadas as partes

incisais dos dentes. As análises foram feitas em microscópio de luz polarizada Carl

Zeiss Jena, com compensador de Senarmont e filtro 546 nm. O índice de refração

da solução foi ajustado em um refratômetro de Abbe; a espessura foi medida em

medidor de espessura externa tipo relógio comparador.


28

RESULTADOS


29

A administração de 100 ppm de flúor por 60 dias para ratos produziu um padrão de

bandas e escuras e claras como podemos ver na figura 1.

O dente cujos ratos não foram submetido à dieta com flúor tem outro padrão

com podemos observar na figura 2.

Figura 1. Padrão de bandas claras e escuras de ratos submetidos à dieta com flúor.

Figura 2. Dentes sem bandas, não foram submetidos à dieta com flúor.


30

O mesmo padrão de bandas também encontra-se na Microscopia eletrônica

de varredura quando analisamos estes dentes pela face labial como podemos

observar na figura 3.

Figura 3. Face labial tratada com ácido clorídrico 6N - MEV. Padrão de bandas

claras (*) e escuras (**).

***


31

Quando estes dentes são desgastados até uma espessura de 50 µm e

analisados pela proximal no microscópio eletrônico de varredura este padrão não

aparece, o que vemos é um esmalte com prismas desorganizados (camada

aprismática) seguidos de prismas organizados tanto no grupo experimental quanto

no grupo controle como podemos observar na figura 4.


32

Quando os dentes são infiltrados na resina Technovit, cortados no

equipamento EXAKT, desgastados até a espessura de 40µm e observados em

microscopia de luz polarizada, as bandas mostram um padrão interessante. Na luz

normal as bandas escuras são castanhas e na luz polarizada são amareladas.

GRUPO FLUOROSE INCISAL GRUPO CONTROLE INCISAL

Fig. 4 – Dentes desgastados na proximal e vistos por microscopia eletrônica de varredura em um aumento de 500 x e 1000x a 10Kv, notar a semelhança tanto do controle quanto do experimental.

Fig. 5 A. Luz normal – observar o padrão de bandas – as castanhas são as escuras; 5B na luz polarizada são as amarelas.

AB

Fig. 6 A. Luz normal – observar o padrão normal do esmalte; 6B na luz polarizada a cor amarela desaparece.

A B


33

GRUPO FLUOROSE MÉDIO GRUPO CONTROLE MÈDIO GRUPO FLUOROSE APICAL

Fig. 7 A. Luz comum– observar o padrão de bandas – as castanhas são as escuras; 7B na luz polarizada são as amarelas.

A B

Fig. 8 A. Luz comum– observar o padrão normal do esmalte; 8B na luz polarizada a cor amarela desaparece.

A B

AB

Fig. 9 A. Luz comum – observar o padrão de bandas – as castanhas são as escuras; 9B na luz polarizada são as amarelas.


34

GRUPO CONTROLE APICAL ANÀLISE DA BIRREFRINGÊNCIA DO ESMALTE

Para esta análise, considerou-se cada camada separadamente.

Aparentemente, elas podem ser afetadas separadamente ou em conjunto. É o que

vemos na figura 11 A e B

DEFINIÇÃO DAS CAMADAS

CAMADA APRISMÁTICA

CAMADA PRISMÁTICAPROFUNDA (2/3)

CAMADA PRISMÁTICASUPERFICIAL (1/3)

A B

Fig. 10 A. Luz comum – observar o padrão normal do esmalte; 10B na luz polarizada a cor amarela desaparece.

A

B


35

Na figura 11A o retângulo nos mostra as bandas escuras e claras vistas em

luz comum e que estão representadas na figura 11B abaixo, definindo as camadas e

numerando-as em camada aprismática – camada 1, camada prismática superficial

(1/3) – camada 2, camada prismática profunda (2/3) – camada 3.

1 2-0,0002

-0,0003

-0,0004

-0,0005

-0,0006

-0,0007

-0,0008

-0,0009

-0,0010

-0,0011

Birr

efrin

gênc

ia

Bandas

Dente experimental 1 camada 1 camada 2 camada 3

Birrefringência do esmalte

0

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

0,001

0,0012

Camada1

Camada2

Camada3

Regiões do esmalte

Birr

efrin

gênc

ia n

egat

iva

Média BEMédia BCMédia Controle

Fig. 12 – o gráfico mostra como foram feitas as análises para chegar aos valores de média da birrefringência de bandas claras e bandas escuras nas diferentes camadas do esmalte (camadas 1, 2, 3) – dos dentes fluoróticos e controle.

Fig. 13 O gráfico mostra as médias (n=3) dos valores de birrefringência negativa nas 3 camadas de esmalte estudadas em dentes controle e fluoróticos, sendo que nesses últimos foi analisada a banda escura (DB) e a banda clara (LB).


36

Camada 1

Banda escura Banda clara Controle0.0

2.5

5.0

7.5Banda escuraBanda claraControle

Bir

refr

ingê

ncia

neg

ativ

ax

10-4

Camada 2

Banda escura Banda clara Controle0

5

10

15Banda escuraBanda claraControle

Bir

refr

ingê

ncia

neg

ativ

ax

10-4

Camada 3

Banda escura Banda clara Controle0.0

2.5

5.0

7.5Banda escuraBanda claraControle

Bir

refr

ingê

ncia

neg

ativ

ax

10-4


37

Na figura 14 os três gráficos mostram uma comparação entre as médias das

bandas claras e escuras dos dentes fluoróticos (n=3) nas três camadas e do controle

nas três camadas, a análise estatísta (ANOVA) não demonstrou nenhuma diferença

significante.

Banda clara

Camada 1 Camada 2 Camada 30.00000

0.00025

0.00050

0.00075

0.00100Camada 1Camada 2Camada 3

Camadas do esmalte

Bir

refr

ingê

ncia

neg

ativ

a

Banda escura

Camada 1 Camada 2 Camada 30.0000

0.0005

0.0010

0.0015Camada 1Camada 2Camada 3

Camadas do esmalte

Bir

refr

ingê

ncia

neg

ativ

a

Na figura 15 observamos uma comparação entre a média das bandas claras

e escuras nas diferentes camadas (1, 2, 3) e a análise estatística (ANOVA), revelou

uma diferença estatística (p< 0,05) entre a banda clara da camada 1 em relação a

camada 2 e da banda escura da camada 1 para a camada 2.

*P< 0,05

*P< 0,05

*

*


38

DISCUSSÃO


39

A fluorose dentária constitui-se em um distúrbio do desenvolvimento com

etiologia definida e patogenia controversa. Ao procurar entender porque o excesso

de flúor modifica o esmalte com graus variáveis de severidade, foram estabelecidas

linhas de pesquisa ao longo dos anos a fim de buscar no mecanismo da

biomineralização e em todas as suas particularidades, as respostas para o processo

de desenvolvimento da fluorose (Oliveira 1988; Tanabe et al., 1988; Suga, 1989;

Smith et al., 1993).

Na fluorose dentária, a amelogênese sofre a interferência de compostos

fluoretados ou mesmo de íons flúor lábeis (Gerlach et al., 2000) que, a princípio

hipoteticamente, poderiam interferir na diferenciação ou função das células

produtoras da matriz (Holland e Hongslo, 1979; Bronckers et al., 1984), poderiam

alterar a interação das proteínas com a superfície dos cristalitos formados (Tanabe

et al., 1988;) ou ainda, poderiam inibir a função das enzimas proteolíticas

designadas a degradar a matriz no momento propício (Fukae et al., 1998; Gerlach et

al., 2000).

A fundamentação destas três hipóteses relativas à patogenia da fluorose

dentária tem uma característica comum, concorda-se que a porção proteica da

matriz fica retida após o início da fase de maturação do esmalte, momento em que

deveriam ser removidas paulatinamente até serem quase totalmente endocitadas

pelos mesmos ameloblastos que a produziram (DenBesten et al., 1985; Lyaruu,

1987).

O esmalte fluorótico têm como característica, em dentes humanos, um

aumento na porosidade do tecido que em graus mais severos está presente uma

camada externa mineralizada seguida de uma subsuperfície menos mineraliada

(Fejerskov et al., 1979).


40

As hipomineraliações caracterizam-se por distúrbios em que, o esmalte não

se apresenta inteiramente mineralizado mesmo mantendo sua espessura padrão.

Ocorrem desajustes funcionais, principalmente no período que corresponde à

maturação do esmalte, alterando suas características finas. Macroscopicamente, a

hipomineralização pode não ser tão detectável como usualmente ocorre com as

hipoplasias (Suga et al., 1989).

Os ratos de linhagem Wistar, que representam o modelo experimental

adotado nesse trabalho, possuem dentição monofiodonte e cada quadrante de seus

maxilares apresenta três molares e um incisivo, sendo esse último caracterizado por

seu crescimento, mineralização e irrompimento contínuos. Em um rato adulto, existe

a possibilidade de se observar marcas metabólicas registradas na estrutura

incremental do esmalte. A histogênese dos incisivos de ratos permite o estudo de

todos os momentos da formação dos dentes em um só, o que se torna interessante

por haver desse modo menos variáveis a serem superadas (Schour e Massler,

1949).

A dose experimental escolhida de 100ppm representa a dose considerada

tóxica (10ppm) para o desenvolvimento do esmalte fluorótico (Richards, 1990; Smith,

1993).

Muitos estudos de fluorose examinam as características histológicas e a

natureza físico-química do esmalte (Fejerskov et al., 1974, 1975; Shinoda, 1975). No

entanto o que concerne a ultraestrutura do esmalte fluorótico, os estudos são

escassos (Kruger, 1971: Fejerskov et al., 1974).

A microscopia eletrônica de varredura é um valioso auxílio para o estudo do

desenvolvimento do esmalte, juntamente com as técnicas histológicas e


41

ultraestruturais, pois todas as superfícies do esmalte podem ser visualizadas e

verificadas tridimensionalmente (Kardos et al., 1989).

Macroscopicamente os nossos dentes fluoróticos exibiram um padrão de

bandas que se alternavam em claras e escuras. Estes dentes analisados no

microscópio eletrônico de varredura, a face labial exibiu o mesmo padrão de bandas

claras e escuras. As bandas escuras são menos atacadas pelo ácido que as bandas

claras o que corrobora com os trabalhos de Kruger (1971), que identificou o mesmo

padrão de bandas. Este autor conclui que as zonas claras quando analisadas no

MEV, são mais brilhantes e são menos resistentes ao ataque ácido comparadas as

bandas escuras, assim as zonas claras deveriam ser menos mineralizadas que as

zonas escuras.

Nos nossos cortes longitudinais analisando-se as faces proximais não

verificamos nenhuma alteração nos prismas do esmalte em contraste com trabalhos

de Fejerskov et al (1974) e Shinoda e Ogura (1978) que concluíram que há mais

matéria orgânica em torno no centro dos prismas do dente fluorótico e maior espaço

interprismático, sendo o esmalte mais externo mais susceptível ao efeito do flúor.

A polarização é um fenômeno que ocorre quando a luz passa através de

certas substâncias, tais como cristais, ou estruturas orientadas como o colágeno dos

tecidos, que fazem com que a luz seja dividida, de modo que emergem dois raios

luminosos derivados de um só. Essas substâncias têm dois índices de refração, ou

seja, são birrefringentes. Denomina-se birrefringência a diferença entre esses dois

índices: oe nnn −=∆ , dependendo dos valores relativos entre os dois índices, a

birrefringência de um meio pode ser positiva ou negativa. A microscopia de luz

polarizada é utilizada para avaliar alterações em lesões de esmalte, uma vez que


42

permite reconhecer mudanças definidas, em várias partes do tecido adamantino

(Fejerskov, 1979).

É uma técnica usada para analisar o conteúdo mineral do esmalte dental. A

birrefringência observada no esmalte é a soma da birrefringência intrínseca

(relacionado à fase mineral e com sinal negativo) e da birrefringência de forma

(relacionada com a fase não mineral e com sinal positivo) (Sousa et al., 2006).

Quanto mais negativa a birrefringência, maior o volume mineral da camada

(Thenus et al., 1993).

Nos nossos resultados quando olhamos os dentes fluoróticos com luz

comum observamos que as bandas escuras são marrons acastanhadas e quando

examinamos na luz polarizada estas se tornam amareladas. No estudo da

birrefringência do esmalte as bandas escuras parecem ser mais mineralizadas que

as bandas claras e a camada aprismática (1), onde se encontra o defeito parece ser

menos mineralizada que a camada do meio (2) e esta mais mineralizada que a

camada mais profunda do esmalte (3). Estes resultados parecem ser parecidos com

Ishida (1979) que encontraram bandas incrementais hipo e hipermineraliadas em

microradiografias de dentes fluoróticos. No entanto os dentes controle parecem ter

as mesmas características quando falamos em camadas do esmalte.

Os resultados de nosso trabalho, embora não conclusivos, indicam que a

birrefringência do esmalte pode ser útil para a análise e compreensão da fluorose já

que, nesta condição, o esmalte se caracteriza por ser menos mineralizado. Pelos

dados apresentados, os valores da birrefringência parecem indicar quais as

camadas de esmalte são menos ou mais mineralizadas.

Apesar do nosso n ser pequeno (n=3) podemos observar que houve uma

diferença estatisticamente (p< 0,05) significante quando as 3 regiões distintas foram


43

comparadas, sendo que a camada 1 (esmalte superficial) foi estatisticamente

diferente da camada 2 tanto nas bandas claras quanto nas bandas escuras dos

dentes fluoróticos. A ausência de diferença nas demais comparações não deve ser

considerada, em vista da necessidade de um número maior de amostras.

Devido à grande dificuldade técnica de manipular amostras de esmalte de

rato, esse nosso trabalho pode ser visto como uma caracterização inicial muito

importante, e a primeira a utilizar a microscopia de luz polarizada para

caracterização do esmalte de rato. Dele se conclui que vale a pena aumentar o

número de amostras a analisar, o que pode vir a demonstrar diferenças

estatisticamente significantes nas bandas claras e escuras em relação aos valores

da média do grupo controle na região superficial. O que definitivamente contribuirá

para a caracterização da fluorose no modelo tão estudado, que é a fluorose em ratos

Wistar.


44

CONCLUSÃO


45

1. A morfologia dos dentes fluoróticos vistos pela labial no microscópio

eletrônico de varredura, mostrou um padrão de bandas claras e

escuras inexistente nos dentes controle. As bandas escuras são mais

elevadas e mais resistentes ao ataque ácido do que as bandas claras.

Este padrão desaparece nos cortes longitudinais onde a morfologia

dos dentes fluoróticos e controles não revelaram diferença.

2. A análise de amostras de esmalte de rato fluorótico permitiu comparar

a birrefringência em diferentes regiões deste esmalte, bem como

comparar suas características às do controle. Esse método foi utilizado

nesse trabalho e evidenciou grande confiabilidade e pequena diferença

inter-amostras.

3. O uso da microscopia de luz polarizada em cortes de esmalte flurótico

é um método ainda não descrito com perspectivas de adicionar

infomações novas e importantes sobre a ultraestrutura do esmalte

fluorótico.


46

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ANEXOS


57

anÁlise da morfologia de incisivos fluorÓticos de … · não precisa ser homem, basta ser...

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