transformação de plantas seleção de tecido vegetal competente para propagação ou regeneração...

Transformação de Plantas

• Seleção de tecido vegetal competente para propagação ou regeneração

• Método de transferência de gene• Identificação de células transformadas por seleção• Regeneração de plantas de células transformadas• Plantas transgênicas analisadas para confirmar

presença do transgene - herança e estabilidade• Plantas transgênicas avaliadas para performance

Transferindo genes para plantas

• O processo de introdução de genes em plantas chama-se transformação genética

• O gene sendo transferido para a planta é chamado de transgene

• Plantas com modifiçações genética são denominadas de transformadas ou transgênicas

• Denominação geral = Organismos Geneticamente Modificados (OGM)

Transferindo DNA para células de plantas

Célula Vegetal

núcleo

parede celular membranacitoplasmática

transgene

1. DNA pode ser transferido por meio biológico (Agrobacterium) ou físico (bombardeamento)

2. DNA deve cruzar várias barreiras

3. DNA deve se integrar ao cromossomo no núcleo da célula

4. Cada célula transformada é única

5. Número de células transformadas é mínimo

citoplasma

Cronologia da Transformação de Plantas

1907 Identificação de Agrobacterium tumefaciens como agente causal de galhas

1974 Descoberta de elemento extra-cromossomial ligado à indução de galhas

1975 Aquisição de habilidade oncogênica por transferência de plasmídeo1977 Transferência e manutenção de T-DNA em células de plantas1980 Uso de plasmídeo Ti para introdução de genes em plantas1981 Transmissão Mendeliana de genes introduzidos por Ti1983 Construção de genes marcadores quiméricos

Engenharia de vetor Ti para introdução de genes sem oncogênese1984 Regeneração de plantas resistentes à kanamicina com herança

Mendeliana1985 Estabelecimento de transformação e regeneração por disco foliar1987 Transformação através de bombardeamento com micropartículas

Transformação de Plantas• 1. Agrobacterium tumefaciens como vetor

– método de escolha– limitação de hospedeiro

• 2. Bombardeamento com micropartículas– usado em Monocotiledôneas e Legumes– versatilidade de tecido alvo

• 3. Protoplastos– célula vegetal sem parede celular– totipotência - similar a bactéria– permeabilização reversa membrana

• PEG• Eletroporação

Agrobacterium tumefaciens

• Bactéria de solo Gram-negativa, tipo bacilo• Causa galha da coroa (“crown gall”): videira, maçã,

etc• Afeta mais dicotiledôneas e pouco monocotiledôneas• Família Rhizobiaceae• Outras espécies:

– Agrobacterium rhizogenes -raiz em cabeleira (“hairy root)

– Agrobacterium rubi - hospedeiros limitados

– Agrobacterium radiobacter - não tumorogênica (sem Ti)

Agrobacterium

• Biovar: características fisiológicas, químicas e nutricionais

• Biovar I: A. tumefaciens, A. radiobacter e poucas

A. rhizogenes

• Biovar II: maioria A. rhizogenes e A. rubi

• Biovar III: A. viti (A. tumefaciens)

Agrobacterium

• Infecção natural - ferimentos• Quimiotactismo - fenóis, açúcares, amino ácidos• Formação de tumores• Expressão de genes da bactéria transferidos e

integrados de forma estável ao genoma vegetal• Capacidade tumorogênica - plasmídeo Ti =

– Ti = Tumor Inducing - 150 a 250 kpb• Regiões do plasmídeo Ti importantes:

– região T-DNA - Transfer DNA– região vir - genes de virulência

Agrobacterium

Região T-DNA• Tamanho: de 12 a 24 kb• Limitada por seqüências repetidas diretas

imperfeitas– bordas direita (RB) e esquerda (LB) - delimitam T-DNA

• Contém genes de síntese de reguladores de crescimento (hormônios vegetais) e de opinas

• Transferem genes para direcionar metabolismo para manutenção da Agrobacterium

Agrobacterium

Região T-DNA

Síntese de reguladores de crescimento• Auxina

– genes iaaM (tms1): triptofano 2-monooxigenase – gene iaaH (tms2): indol-3-acetamida

• Citocinina– gene tmr: isopentenil transferase

• adição de cadeia isopentenil a 5’-AMP• adição de OH = transzeatina

iaaM (tms1)iaaH (tms2)

ipt (tmr)

AgrobacteriumRegião T-DNASíntese de opinas• compostos únicos e incomuns• fonte de C e N para Agrobacterium• favorece transferência conjugativa de Ti • condensação de açúcares ou ácido orgânico + amino ácido

– arginina + piruvato = octopina– arginina + a-ketoglutaraldeído = nopalina– glutamato bicíclico = agropina

Catálise de opinas– no Ti, mas fora região T-DNA– específico para a cepa indutora do tumor

Agrobacterium

Região vir• genes responsáveis pela síntese de enzimas da

transferência e integração do T-DNA – transporte do ssT-DNA-membranas e paredes– proteção contra nucleases

• região de 35-40 Kb• 8 operons: virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG e virH• 25 genes• virA, virF e virG - monocistrônicos• outros –policistrônicos• animação

AgrobacteriumRegião vir• sistema regulador positivo: virA e virG• regulam os outros genes vir

VirA: expresso constitutivamente– proteína de membrana interna - histidina kinase– reconhece compostos fenólicos sob pH 5-5,8– auto-fosforilação e fosforilação de VirGVirG - fosforilado se torna ativo– ativa sua própria transcrição– ativa transcrição outros genes vir– seqüência de 12 pb - vir box

AgrobacteriumRegião vir• virC e virD - geração e processamento do T-DNA• reconhecem borda direita do T-DNA

– virD1:- relaxamento da fita dupla (topoisomerase)– virD2:- corte da fita simples (endonuclease) e formação de

complexo-T com o ssT-DNA e direcionamento– virC1 e virC2: complementam atividade de virD1 e virD2

• virB e virE - formação de elementos estruturais de movimento do T-DNA– virE2: proteína do tipo “single strand binding ptn) protegendo T-

DNA de degradação por nucleases e direcionamento– virB1 a virB11: formação de tubo de conjugação– virH (ou pinF): responsável desintoxicação (tipo citocromo)

Agrobacterium

Região vir• mutações em virA, virB, virD e virG : eliminam

formação de tumores

• mutações de virC , virE, virF e virH: restringem gama de hospedeiro

animação

Agrobacterium

• Região vir é suficiente para transferir qualquer T-DNA - reconhece bordas

• Gene indutores de tumores podem ser retirados e substituídos no T-DNA

Geração de Linhagens

deAgrobacterium

Desarmadas

Remoção de oncogenes

Sistema de vetores de

Agrobacteriumpara transformação

A. Co-integrado

B. Binário

Plasmídeo Binário

CruzamentoTriparental

Agrobacteriume Escherichiacom auxíliopRK2013

helper

Agrobacterium

• Genoma seqüenciado C58: 5.674.062 bases

• cromossoma circular:– 2.841.490 pb (59,4% G+C) - 2789 ptn

• cromossoma linear:– 2.075.560 pb (59,3% G+C) - 1882 ptn

• plasmídeo pAtC58:– 542.779 pb (57,3% G+C) - 550 ptn

• plasmídeo pTiC58:– 214.233 pb (56,7% G+C) - 198 ptn

Bombardeamento com Micropartículas

micropartículas cobertas com DNA construído, acelerados por explosão,

introduzidos em células vegetais

Vantagens:1. transformação de Monocot e Legumes2. simplificação nas construções3. co-transformação com várias

construções4. ausência de falsos positivos5. protocolos de transformação

simplificados

Transformação por Bombardeamento

Transformação por Bombardeamento

Métodos Alternativos

1. Fibra “Silicon Carbide”- fibras penetram parede celular com DNA aderido- cristais únicos 0,6 x 10 a 80 mm- suspensões celulares - milho, aveia e tabaco- simples e flexível - domínio público

2. Eletroporação de tecidos intactos- expressão transiente em pólen de tabaco, base de folha de cereais, embriões de caupi- transformação estável em sementes- padronização de equipamento - capacitor

3. Eletroforese - embrião de cevada e orquídeas

4. Microinjeção - rotina para célula animais- utiliza micromanipulador- uso de protoplasto - vacúolo- oneroso, complexo e demorado

Transformação de Plantas• Introdução de genes heterólogos• Alteração da expressão gênica

– superexpressão• promotor constitutivo ou induzível

– gene anti-senso ou senso - silenciamento

• Aplicações– Melhoramento genético– Plantas como biorreatores– Estudo de função

Tipos de genes

1. Genes estruturais codificam enzimas

2. Genes regulatórioscodificam proteínas que controlam genes estruturais

(fatores de transcrição)-> definem

QUANDO, QUANTO e ONDE

Promotor

Gene Estrutural

Região Codificadora de Proteína

Regulatório

RR

R

Enzima

Gene Estrutural

Estratégias de Modificação de Rotas

Metabólicas

INTRODUÇÃO DE GENE• codificando enzima não existente ou

não funcional ou pouco eficiente• gene sentido oposto - ANTISENSO

– GENE -> ENEG• gene com controle alterado (promotor)

Reação em Rotas Metabólicas

A B C DX y u

E

z

Gene em Senso e Antisenso

Promotor

GGCAAGCT ENEG

Senso

Promotor

GENE AGCTTGCC

Antisenso

Rota Metabólica de Biossíntese

A B C DX y u

E

z

Reação Normal

Produtos D e E feitos

Rota Metabólica de Biossíntese

Introdução de novo gene

A B C DX y u

E

z

Introdução de gene w codificando enzima W

Produtos D e W feitos

WW

transformação

Reação em Rotas MetabólicasAntisenso

A B C DX y u

E

z

Introdução de gene y anti-senso inibindo Y

Produtos D e E não são feitos

transformação

Reação em Rotas Metabólicas:

Ex. resistência à herbicidaX

Y

Z

Amino Ácidos

EPSPS

Enzima fundamental

para sintetizar um grupo de amino ácidos

•Roundup inibe EPSPS• Carência de Aminoácidos• Planta morre

Soja RoundupReady

X

Y

Z

Amino Ácidos

EPSPS

CP4-EPSPS

Forma da enzima que NÃO

é inhibida por Roundup

“Bypass” MetabólicoAdicionando gene

codificando EPSPS que permite as plantas fazer

amino ácidos após aplicação de Roundup