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Taq DNA Polimerase

(recombinante)

Cat. No. 0300.0004.0100 100 unidades

Cat. No. 0300.0004.0500 500 unidades

Tampão de Reação sem MgCL2

incluindo 5X GC-rich Solution (para amplificação

de regiões de DNA ricas em bases GC)

ARMAZENAR A - 20oC.

Produto estável por 10 dias a 37oC.

Transportar a temperatura ambiente.

Descrição

Taq DNA Polimerase é uma enzima termoestável isolada

da bactéria termofílica Thermus aquaticus e expressa em

bactérias Escherichia coli. Esta enzima recombinante é

constituída por uma cadeia polipeptídica com o peso

molecular de aproximadamente 94 kDa apresentando as

atividades de 5’→3’ DNA polimerase e 5´→3´ exonuclease.

Não possui atividade 3'→5' exonuclease (proofreading).

A forma recombinante da enzima Taq DNA Polimerase é

ideal para uso em reações de PCR para amplificação de

fragmentos de DNA até 5 kb.

Produto composto por um frasco com solução líquida

contendo 500 unidades (5.000 U/mL correspondente a

5 U/µL) da enzima recombinante Taq DNA polimerase,

dois frascos com 10X Tampão de Reação sem MgCl2 e um

frasco contendo 50 mM MgCl2. Prazo de validade de,

no mínimo, 12 meses após a entrega. Cada produto

contém número de lote, data de fabricação, validade,

composição e procedência.

Componentes do Produto

Cat. No. 0300.0004.0100 100 unidades

AMOSTRA

500 µL 10X Tampão de Reação de PCR

TAMPA AZUL

500 µL 50 mM MgCl2 TAMPA

TRANSPARENTE

200 µL 5X GC-rich Solution TAMPA

AMARELA

20 µL Taq DNA

Polimerase 5U/µL TAMPA

VERMELHA

Cat. No. 0300.0004.0500 500 unidades

2 x 1,25 mL 10X Tampão de Reação de PCR

TAMPA AZUL

1000 µL 50 mM MgCl2 TAMPA

TRANSPARENTE

1000 µL 5X GC-rich Solution TAMPA

AMARELA

100 µL Taq DNA

Polimerase 5U/µL TAMPA

VERMELHA

Composição do 10X Tampão de Reação de PCR:

100 mM Tris-HCl (pH 8,8 a 25°C), 500 mM KCl, 0.8% (v/v)

Nonidet P40

Instruções para Uso

1. Descongelar e misturar vigorosamente os reagentes

10X Tampão de Reação de PCR, 50 mM MgCl2 e 5X GC-rich

Solution (opcional).

2. Para realizar várias reações de PCR e minimizar a

possibilidade de erros de pipetagem, preparar uma

mistura de amplificação (Mastermix) adicionando Água

para Biologia Molecular, 10X Tampão de Reação, MgCl2,

dNTPs, primers e Taq DNA Polimerase.

Devido à perda de volume durante a pipetagem da

Mastermix, calcular o número de reações adicionando

uma reação extra para cada 10 reações de PCR.

Por exemplo: para 20 reações de PCR, adicionar 2 reações

extras.

Após a preparação, distribuir a Mastermix nos microtubos

individuais de PCR e a seguir, adicionar o DNA alvo ou

controle negativo.

A tabela a seguir apresenta as quantidades para uma

reação de PCR padrão de volume final de 50 µL.

As quantidades de Água para Biologia Molecular e DNA

Alvo ou controle negativo podem ser ajustadas para

completarem o volume final de 50 µL da reação de PCR:

Taq DNA Polimerase

(recombinante)

Tampão de Reação sem MgCL2

Componente da Reação de PCR

Volume Concentração

Final

Água para Biologia Molecular

até 50 µL

5X GC-rich Solution (opcional)*

12 µL 1,2X

10X Tampão de Reação de PCR

5 µL 1X

50 mM MgCl2** 1,5 µL 1,5 mM

10 mM dNTP Mix 1 µL 0,2 mM

10 µM Primer Forward 2,5 µL 0,5 µM

10 µM Primer Reverse 2,5 µL 0,5 µM

Taq DNA Polimerase 5U/µL***

0,25 µL 1,25 U

DNA alvo ou controle negativo

variável 10 pg a 500 ng

*5X GC-rich Solution é uma solução contendo 5M de

betaine. A betaine é um dos mais efetivos aditivos para a

reação de PCR indicados para regiões de DNA ricas em

bases GC que apresentam um alto grau de estruturas

secundárias.

A betaine também aumenta a processividade da Taq DNA

Polimerase reduzindo pausas na polimerização causadas

pela presença de estruturas secundárias que podem

induzir a dissociação da polimerase do alvo de DNA.

O uso de betaine em reações de PCR pode ser facilmente

avaliado da seguinte forma:

1a Reação de PCR: adicionar 12 µL de Água

2a Reação de PCR: adicionar 12 µL de 5X GC-rich Solution

Adicionar os demais componentes da reação de PCR e

completar o volume para 50 µL.

** A concentração final de 1,5 mM de MgCl2 funciona para

a maioria dos alvos de DNA. Porém, caso seja necessário

padronizar a reação de PCR, adicionar um volume da

solução 50 mM MgCl2 para concentrações finais de MgCl2

variando entre 1 mM e 4 mM.

Para a amplificação de regiões de DNA ricas em bases GC,

recomendamos o uso de 1,2X GC-rich Solution e 4 mM

MgCl2.

*** Para alvos longos (fragmentos de DNA > 3 kb), utilizar

2,5 U de Taq DNA Polimerase.

3. Realizar a reação de PCR conforme as seguintes

condições de ciclagem térmica:

Temp Tempo Ciclos

Denaturação Inicial

95oC 3 minutos

Desnaturação 95oC 30 segundos

25 a 40 ciclos

Pareamento 55oC* 30 segundos

Extensão 72oC 1 min/kb

Extensão Final 72oC 10 minutos

* Depende do Tm dos primers. Geralmente, Tm - 5 oC.

4. Analisar 10 µL da reação de PCR em eletroforese em gel

de agarose.

Neste caso, utilizar a reação de PCR imediatamente em

aplicações de Biologia Molecular ou armazenar a - 20oC.

Controle de Qualidade (Certificado de Análise)

Cada lote da enzima Taq DNA Polimerase é

extensivamente purificado para garantir um grau de

pureza próximo de 100% analisado pela técnica de

eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

A análise funcional da enzima é realizada em reações de

PCR (95oC por 3 minutos, 35 ciclos de 95oC por

30 segundos, 55oC por 15 segundos e 72oC por 60

segundos) para a amplificação de um fragmento de 2 kb

do gene de beta-globina humano partir de 50 ng de DNA

genômico humano utilizando os seguintes primers:

2kb_Forward (5’ TCT TGG CAG AGT GTA TGT GTC 3’)

2kb_ Reverse (5’ TAA CCG ATG AGA TCA ACT GGA A 3’)

Nota: Os primers para a Reação de PCR podem ser

desenhados utilizando o software Primer-BLAST

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

Taq DNA Polimerase (Tampão de Reação sem MgCL2)

Rev.2

Produto para uso em pesquisas científicas

Fabricado no Brasil por:

DNA Express Biotecnologia LTDA

CNPJ 12.958.000/0001-88

Rua João Batista Nogueira 500 Módulo 29

Vila Nova Cumbica, Guarulhos, SP

SAC (11) 2303 7133 / 2303 743

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