seminário toxicidade final

TOXICIDADE

ANA LUÍSA M. MOROTTILUIS FELIPE COSTA SILVA

Florianópolis, 2012

Introdução

Recentemente, estudos eram realizados somente durante os ensaios clínicos.

Descarte de 20 – 30%.

Ensaios mais prematuros causariam: ↓ de custos; ↓ no tempo; ↑ da eficácia na obtenção de novos candidatos.

KERNS; DI, 2008,

Introdução

KERNS; DI, 2008,

Introdução

KERNS; DI, 2008,

Maximizar a Janela Terapêutica

Introdução

KERNS; DI, 2008,

Introdução

A toxicidade pode ser desencadeada por diferentes mecanismos:

KERNS; DI, 2008,

A toxicidade pode ser desencadeada por diferentes mecanismos:

Alvo terapêutico

A toxicidade pode ser desencadeada por diferentes mecanismos:

Alvo terapêutico; Não-alvo terapêutico; Metabólito reativo

A toxicidade pode ser desencadeada por diferentes mecanismos:

Alvo terapêutico; Não-alvo terapêutico

Introdução: Termos e Mecanismos

Toxicidade aguda

KERNS; DI, 2008,

Toxicidade crônica

Carcinogenicidade Citotoxicidade

Genotoxicidade Reação idiossincrática

Imunotoxicidade Toxicidade em orgãos

Fosfolipidose Toxicologia reprodutivaSegurança

farmacológicaTeratogenicidade

Toxicidade aguda Toxicidade crônica

Carcinogenicidade Citotoxicidade

Genotoxicidade Reação idiossincrática

Imunotoxicidade Toxicidade em orgãos

Fosfolipidose Toxicologia reprodutiva

Segurança farmacológica

Teratogenicidade

Mecanismo: Alvos Terapêuticos

Modulações nos alvos terapêuticos podem trazer efeitos indesejáveis ao tecido alvo ou ao organismo como um todo.

KERNS; DI, 2008,

Observada em estudos in vivo ou ensaios clínicos.

Mecanismo: Não-Alvos Terapêuticos

KERNS; DI, 2008,

Avaliação in vitro de ligação ou atividade em diversos alvos moleculares, ou estudo in vivo com monitoramento de diversas funções fisiológicas.

O composto pode inibir inesperadamente uma enzima ou receptor, causando toxicidade ou efeitos adversos.

Mecanismo: Metabólito Reativo

KERNS; DI, 2008,

Modificação estrutural em proteínas pode induzir à resposta imune Hepatotoxicidade

O metabólito, ou intermediário, pode ser um eletrólito, ligando covalentemente a nucleófilos endógenos como o DNA.

KERNS; DI, 2008,

Mecanismo

KERNS; DI, 2008,

Mecanismo

KERNS; DI, 2008,

Ferramentas Experimentais

KERNS; DI, 2008,

O metabólito, ou intermediário, pode ser um eletrólito, ligando covalentemente a nucleófilos endógenos como o DNA.

O metabólito, ou intermediário, pode ser um eletrólito, ligando covalentemente a nucleófilos endógenos como o DNA:

Genotoxicidade

O metabólito, ou intermediário, pode ser um eletrólito, ligando covalentemente a nucleófilos endógenos como o DNA:

Genotoxicidade; Toxicidade em órgão específicos

O metabólito, ou intermediário, pode ser um eletrólito, ligando covalentemente a nucleófilos endógenos como o DNA:

Genotoxicidade; Toxicidade em órgão específicos:

Cardiotoxicidade; Hepatotoxicidade; Hematotoxicidade; Fototoxicidade; Neurotoxicidade; Nefrotoxicidade.

O metabólito, ou intermediário, pode ser um eletrólito, ligando covalentemente a nucleófilos endógenos como o DNA:

Genotoxicidade; Toxicidade em órgão específicos:

Cardiotoxicidade; Hepatotoxicidade; Hematotoxicidade

Ferramentas Experimentais

KERNS; DI, 2008,

Crescente necessidade antecipar os ensaios toxicológicos.

Aprimorar as ferramentas existentes para melhores rendimentos e qualidade de análise.

Ensaios de ADME são muito mais sofisticados que os de toxicidade.

Cardiotoxicidade

WANG; URBAN; BOJANIC, 2007

Vários fármacos retirados do mercado afetavam uma única proteína não-alvo.

Canal iônico de K+, específico do coração (subunidade α)

Parcialmente responsável pela repolarização do potencial de ação.

Hepatotoxicidade

WANG; URBAN; BOJANIC, 2007; XU; HOFFMASTER, 2011

HepG2 (célula de hepatocarcinoma) Estudos gerais de potencial de citotoxicidade.

As células podem ser induzidas à expressão de CYP

Avaliação de necrose celular através dos níveis intracelulares de ATP.

Somente células saudáveis são capazes de produzir

Pode-se avaliar injúria mitocondrial.

HepG2 (célula de hepatocarcinoma) Estudos gerais de potencial de citotoxicidade.

↓ capacidade de metabolismo; Células em proliferação.

HepaRG (seleção clonal da HepG2) e THLE

Hepatotoxicidade

XU; HOFFMASTER, 2011

HIAT (Ensaio de Tecnologia de Imagem do Hepatócito)

Indica fármaco hepatotóxicos; Baixo índice de falso-positivo.

Genotoxicidade

WAKMSLEY; ELDERM 2011

Dano ao DNA pode tomar proporções catastróficas. Dano oxidativo Modifica as bases

induzindo a erros de replicação e quebra da dupla hélice.

Ligação do xenobionte ao DNA

Metilação das bases A alquilação é rotineira, mas a metilação pode induzir à quebra da dupla hélice. Hidrólise Depurinização, depirimidinação, e deaminação.

Erro no reparo, mutação/dano.

Genotoxicidade

WAKMSLEY; ELDERM 2011

Estudo in vitro em células humanas e em bactérias Bactérias são menos complexas:

Não apresenta membrana que reveste o núcleo;

Menor empacotamento do DNA; Ùnico cromossomo circular. Alvos específicos podem não estar presentes

em todas as linhagens de células eucarióticas

Mutação gênica Dano cromossomal

Indução à expressão gênica

Genotoxicidade: Ensaio Cometa

RIBEIRO et al., 2007; WAKMSLEY; ELDERM 2011

Eletroforese do conteúdo nuclear de células

A cabeça contem grande quantidade enovelada de DNA. Calda contem porções onde houve pelo menos a quebra de uma das duas hélices do DNA.

Estudos in vitro

A dificuldade em predizer a toxicidade em humanos reside no mecanismo toxicológico único de cada NCE.

ASTASHKINA; MANN; GRAINGER, 2012

A toxicidade de fármacos in vivo é uma sequencia de eventos multifatoriais, dinâmico, e complexo. O processo que leva ao dano, como resultado da exposição farmacológica, pode variar significantemente, ou ser específica para cada órgão, e envolver interações entre células e fármaco, metabólitos e conjugados fármacos-proteína.

Fármaco Retirados do Mercado

ASTASHKINA; MANN; GRAINGER, 2012

Terfenadina

Fármaco antihistamínico retirado do mercado por causar toxicidade cardíaca

ASTASHKINA; MANN; GRAINGER, 2012; ZHOU, 2008

Inibição da CYP2J2 enzima reguladora do tonus vascular e de eventos anti-apoptóticos.

Modelos in vivo

Distribuição específica de CYP, distribuição do fármaco, taxa de reações de fase I, e via preferencial de fase II variam significativamente em roedores, coelhos, cães, e humanos.

DORATO; BUCKLEY, 2001

Ainda é o modelo que melhor possibilita verificação da interação entre mecanismos em órgãos diversos.

Conclusão

Modelos in vitro podem dar noção da capacidade toxicológica de NCE, mas existe necessidade de realização de diversos ensaios específicos. não eliminando a necessidade de ensaios in vivo. Existe grande variação entre espécies, o que, às vezes, dificulta a extrapolação dos dados in vivo para humanos, principalmente a respeito de dose tóxica. Apesar das desvantagens, a combinação destes ensaios é imprescindível para avaliação pré-clínica dos NCE’s.

hERG K+ Channels (IKr )

Bloqueio destes canais: Altera a repolarização ventricular, prolongando o intervalo QT.

Vulnerabilidade para o desenvolvimento de taquiarritmias do tipo torsades de pointes e morte súbita.

Canais de potássio formados por subunidades individuais codificadas pelo gene “Human ether- a- go- go- related gene” (hERG)Conduzem corrente responsável pela repolarização no fim do intervalo QT (fase 3)

hERG K+ Channels (IKr )

Apesar de terem sítios de ligação com formas características e caráter hidrofóbico, os canais hERG interagem com farmacos, das mais variadas estruturas.

Dentre estes fármacos, encontram-se antibacterianos, antifúngicos, antipsicóticos e antivirais.

Interações fármaco-fármaco: Podem aumentar os níveis plasmáticos de bloqueadores dos canais hERG.

Como regra geral:

Intervalo de segurança > 30 x hERG IC50 / Cmáx esperada do composto

Muitas organizações se direcionam, para a predição das propriedades ADMET já nos primeiros passos:

“Fail fast, fail cheap”

Modelos de 1a geração: Regra dos 5 de Lipinski

Modelos de 2a geração: Parâmetros farmacocinéticos

Modelos de 3a geração: Metabolismo de xenobióticos

Avaliação toxicidade de canais hERG

“Clamp de voltagem” - PADRÃO OURO “Patch Clamp” “Planar patch clamp” Ensaios com marcadores de fluorescência

http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-ph1008.html

Modelagem por Homologia Um modelo tridimensional da sequência proteína

é criado baseado em estruturas homólogas. Estruturas atômicas disponíveis: Canais de K+ de

bactérias KcsA (fechado) e MthK (aberto)

KvAP

Modelagem por Homologia

QSAR

Identificação e quantificação das propiedas físico-químicas de um fármaco e relação destas com atividade biológica.

Assim, pode-se estabelecer uma relação que permite a determinação de propriedades que desempenham um papel inportante na farmacocinética ou no mecanismo de ação.

QSAR 1o farmacóforo sugerido por Ekins et al:

15moléculas de literaturas 4 grupamentos hidrofóficos; 1 grupamento de

caráter ionizável positivo.

Predição de IC50 de 22 fármacos, a maioria antipsicóticos, conhecidos por inibir hERG.

Expansão para 66 moléculas:

R²=0,90

R²=0,83

R²=0,86

Adição de mais 25 moléculas da literatura diminuiu o índice de confiabilidade,

obtendo um valor de correlação R²=0,67.

QSAR Cavalli et al,

Farmacóforo a partir de 31 moléculas da literatura conhecidas como por prolongarem o intervalo QT

3 grupamentos aromáticos ligados a uma amina terciária

Predição de IC50 6 fármacos da literatura

R²=0,952

R²=0,744

QSAR Pearsten et al,

Modelo baseado em dados de um “patch clamp” in house de 28 compostos, 18 deles eram análogos do Sertindol:

QSAR Keseru,

55 compostos da literatura para criar um modelo de QSAR baseado em 5 descritores: CLog P Refração molar calculada Área de superfície negativa Polarizabilidade Hidrofobicidade

Modelo testado com 13 compostos para validação

R²= 0,94

R²= 0,56

Métodos de Classificação

Distribuição dos fármacos em classes ou categorias baseadas em alguma observação funcional.

Compostos foram separados em ativos e inativos em relação ao bloqueio de hERG:

Métodos de Classificação Roche et al:

Modelo com 244 compostos: diversas técnicas de classificação. A técnica mais precisa para a classificação foi baseada numa rede neural artificial.

Para a validação, 95 compostos (57 com valores IC50 obtidos in house e 38 com valores da literatura) foram avaliados. 93% dos compostos inativos e 71% dos ativos foram classificados corretamente.

Buyck et al, Experimentos in house, avaliando caracteristicas fisico-

químicas. Fatores sugestivos de inibidores de hERG: Clog P≥3,7;

110≤CRM* <176 e pKa máx ≥ 7,3.

*Refração molar calculada

Métodos de Classificação Aronov e Goldman,

“3 pontos” para verificação de farmacóforos bloqueadores de hERG.

Considerações Estruturais

1) A afinidade dos canais hERG decrescem significativamente com agente bloqueadores quando há ligantes polares e de baixo peso molecular. Possivelmente relacionado ao caráter lipofílico dos canais hERG e pela largura de seus poros.

Considerações Estruturais

2) Grupamentos básicos solúveis ou nitrogênio positivamente carregado aumenta a afinidade do bloqueador pelos canais hERG.

3) Flexibilidade da molécula inibidora ajuda os ligantes a encontrarem uma conformação compatível para os diversos ligantes dos canais hERG.

4) O arranjo dos ligantes em meta ou para parecem menos ativos como bloqueadores hERG. A colocação do grupo solubilizante, se presente, pode ter um forte impacto sobre os canais hERG.

Referências ASTASHKINA, A.; MANN, B.; GRAINGER, D. W. A critical evaluation of in vitro cell

culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics, v. 134, p. 82-106, 2012.

DORATO, M. A.; BUCKLEY, L. A. Toxicology testing in drug discovery and development. Current Protocols in Toxicology, San Diego: John Wiley & Sons, Inc. 2001.

KERNS, E. H.; DI, L. Drug-like properties: Concepts, structure design and methods: from ADME to toxicity optimization. 1. ed. San Diego: Academic Press. 2008, 549 p.

RIBEIRO, M. L.; PRIOLLI, D. G.; MIRANDA, D. D. C.; PAIVA, D. A.; PEDRAZZOLI JÚNIOR, J.; MARTINEZ, C. A. R. Avaliação do dano oxidativo ao DNA de células normais e neoplásicas da mucosa cólica de doentes com câncer colorretal. Revista Brasileira de Coloproctologia, v. 27, p. 391-402, 2007.

XU, J. J.; HOFFMASTER, K. Genetic Toxicity: in vitro approaches for medicinal chemists. In:TSAIOUN, K.; KATES, S. A. ADMET for medicinal chemists: a practical guide. 1. ed. New Jersey: John Wiley & Son, Inc. 2011. 524 p.

Referências WALMSLEY, R. M.; ELDER, D. Hepatic Toxicity. In:TSAIOUN, K.; KATES, S.

A. ADMET for medicinal chemists: a practical guide. 1. ed. New Jersey: John Wiley & Son, Inc. 2011. 524 p.

WANG, J.; URBAN, L.; BOJANIC, D. Maximising use of in vitro ADMET tools to predict in vivo bioavailability and safety. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology, v. 3, p. 641-665, 2007.

ZHOU, S. F. Drug behave as substrates, inhibitors and inducers of human cytochrome P450 2ª4. Current Drug Metabolism, v. 9, p. 310-322, 2008.