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Primer DesignPrimer Design

A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA.

•O molde é um DNA dupla fita. •Um par de primers é adicionado, cada um com a sequencia coincidente com o final de uma das extremidades a serem amplificadas. •A Taq termoestavel e os dNTPs são adicionados a reação. •No primeiro ciclo, o aquecimento a 95°C abre a dupla fita de DNA e o subsequencte resfriamento a 60°C permite que os primers hibridizem com a sequencia complementar no DNA alvo. •A polimerase extende cada primer a partir da porção 3’ pela polimeração dos dNTPs, gerando novas fitas sintetizadas.

A reação de PCR produz uma quantidade de DNA que dobra a cada ciclo de sintese.

Modified from: Molecular Biology of the Cell, 3rd edn. 1994 by Bruce Alberts, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and James D. Watson.

Regras gerais para o desenho dos primersParametros Otimização 1. Sequencia de nucleotídeos única

A sequencia 3’ é crítica para o anelamento

2. G/C na porção 3' 1-2 G/C (S) nucleotideos 3. Não auto-complementaridade

< 3 bases contínuas

4. Não dimerização (complementaridade com outro primer)

< 3 bases contínuas

5. Distribuição de bases randômicas e composição

45-55% G+C

6. Tamanho do primer 18-25 bases 7. Equivalencia de Tm 8. Tamanho e composição do amplificado

100-600 bases

This table is modified from that of A. Sharrocks (1994) in “PCR Technology. Current Innovations” (eds. H.G. Griffin and A. M. Griffin) CRC Press, Boca Raton.

Sequencia única de nucleotídeos do Sequencia única de nucleotídeos do molde de DNAmolde de DNA

• Importante para especificidade de amplificação

…GTATCGTTAAAACAGCTAGGGCTAGGAC…

C

G G A TCAATTTTGTCGATCCCGATC

Grampo de G/C na porção 3'Grampo de G/C na porção 3'

•A porção 3‘ do primer deve ser G ou C para aumentar o correto anelamento do primer

•G-C possui pontes de hidrogenio mais fortes que A-T

Lembre-se que a porção 3’ frequentemente determina o anelamento. Se voce tem um primer em que pelo menos 5-10 nt complementam exatamente com a porção 3’, o anelamento provavelmente funcionará.

Sem auto-complementaridadeSem auto-complementaridade

O auto-pareamento diminui a habilidade do primer se anelar com o molde.

Como regra geral, não use primers com mais de 3 bases no inicio que se complementam com as bases da porção 3’.

Não dimerizaçãoNão dimerizaçãoOs pares de primers podem alinhar entre si. Se este alinhamento inclui pelo menos uma das porções 3’ a polimeras irá extender apenas a porção entre os dois resultando na formação de um dímero:

5’ GTTCAAATGGCATCGTAGGGATGCAT 3‘ | | | | | | | 3’ ACCGTAGTACTGCCG 5’

Distribuição randomica de bases e Distribuição randomica de bases e composiçãocomposição

•Se o conteúdo de G+C% dos dois primers for muito diferente eles terão diferentes Tms e não anelarão a mesma temperatura.•Se todos os nucleotídeos da porção 5’ do primer forem G ou C etodos os da porção 3’ forem A ou T, mesmo que a proporção esteja correta, a porção 3’ não se anelará na temperatura predita.

Tamanho do primerTamanho do primer

•O tamanho do primer deve ser longo o bastante para garantir que uma única sequencia seja amplificada e não tão longo para afetar a Tm e o anelamento.

•Os melhores tamanhos variam de 14 a 30 nucleotídeos.

Equivalencia de TEquivalencia de Tmm

• A Tm aproximada pode ser calculada pela fórmula:

Tm = 4(G + C) + 2(A + T)oC.

A temperatura de alinhamento depende diretamente do tamanho e da composição dos primers. Um primeira tentativa pode ser feita com a reação a 5°C abaixo da Tm estimada para os primers•A principal consequencia de se utilizar uma Tm muito baixa é a possibilidade do primer anela com qualquer sequencia do DNA , perdendo a especificidade

Tamanho do amplificadoTamanho do amplificado

•O máximo rendimento é obtido em uma reaçao de PCR quando o tamanho do produto é entre 100-600 nt.

•Diferentes polimerases possuem diferentes graus de processividade e diferentes tamanhos ótimos.

Ferramentas para desenho:Ferramentas para desenho:

• Primer 3

• GeneRunner

• NCBI

Primer3Primer3

• http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm

• Escolhe normalmente os 3 melhores pares de primers para a seqüência proposta

• É bastante exigente.

GeneRunnerGeneRunner• Excelente para conferir os oligos obtidos com o Primer3

• Pouco exigente quanto aos seus próprios critérios

NCBINCBI

• Importante para conferir se a seqüência escolhida não amplifica nenhum outro gene do organismo escolhido ou o mesmo gene em possíveis contaminantes.