minicurso técnicas de sequenciamento e suas aplicações

TÉCNICAS DE SEQUENCIAM

ENTO E APLICAÇÕES

Lucélia Silva BarrosoBacharel em Fisioterapia – FAP

Laboratório de Microbiologia – HC – UFMGMembro do LINC – INCT MM – FM - UFMG

ljesus@ufmg.br

Ana Paula Mendes SilvaBacharel em Ciências Biológicas – UFV

Mestre em Genética – USPDoutoranda em Medicina Molecular – UFMG

apmendes@ufmg.br

• Definir o que é sequenciamento;

• Quais as aplicações dessa técnica;

• Quais as Plataformas disponíveis;• Diferenças metodológicas,• Vantagens e desvantagens.

• Perspectivas futuras

Objetivos do Minicurso

DNA

mRNA

Proteínas

Variação Normal ou Patológica

DOGMA CENTRAL

Cromatina

mRNA ncRNA

Proteínas

Variação Normal ou PatológicaAmbiente

Variação em seqüência Variação estrutural Variação química na cromatina

Epigenômica

Genômica

Transcritômica

Proteômica

DOGMA CENTRAL

• Processo de determinação da ordem precisa de nucleotídeos na molécula de DNA, RNA e outras moléculas;

• Determina a ordem das bases nitrogenadas: Adenina, Guanina, Citosina, Timina e Uracila,

• Visa o entendimento do dogma central e a previsão das moléculas possivelmente formadas a partir de determinada sequência.

Sequenciamento de DNA

Objetivos para sequenciamento genômico

Exemplo

Sequenciamento de novo

Sequenciamento genômico

Sequenciamento de >1000 genomas de influenza

DNA de org. extinto Homo neanderthalenses

Metagenômica Intestino humano

Resequencia-mento

Genomas completos Indivíduos humanos

Regiões genômicas Detecção de rearranjos ou regiões associados à doenças

Mutações somáticas Em câncer

Transcriptoma mRNA Definir regulação da transcrição

Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)

RNAs não codificadores Identificar e quantificar microRNAs

Epigenética Padrão de Metilação Avaliar padrão de metilação em câncer

ESTUDO DE CASO 1

Esse casal de albinos poderia ter um filho com

melanina (normal)?

X1 X2

S1 S2 S3

PAI MÃE

ESTUDO DE CASO 2

Megaureter Família Modelo: Pai saudável, Mãe

saudável, filhos gêmeos monozigóticos (um saudável e um doente)

Hipótese -> Pequenas modificações no(s) gene(s) (SNPs) que possam caracterizar o fenótipo da doença.

Hipótese -> Pequenas modificações no(s) gene(s) (SNPs) que possam caracterizar o fenótipo da doença.

ESTUDO DE CASO 3

1985 Inglaterra Numa pequena cidade localizada entre

montanhas estava acontecendo uma série de estupros e assassinatos de mulheres

Qual análise inicial poderia ser feita?

- Coleta e análise do DNA do esperma - Comparação entre os DNAs dos espermas de

cada assassinato

• As autoridades locais simularam uma doação de sangue -> identificar o agressor.

Todos os habitantes doaram, e apenas um deles possuía o DNA igual ao do estuprador.

Estupro e assassinato

Amabis & Martho, 1995<==?

PLATAFORMAS

Genetic Analyser 3130

PCR

https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo

https://www.youtube.com/watch?v=kvQWKcMdyS4

Gene TBX3

Gene LDB3

MÉTODO SANGER

Prêmio Nobel 1980

Amplificação do fragmento alvo por PCR

Purificação do produto

Reação de Sequenciamento

Purificação do produto

MÉTODO DE SANGER

Obtenção da sequência do fragmento desejado

MÉTODO DE SANGER

PCR

Sequenciamento

MÉTODO SANGER

MÉTODO SANGER-MANUAL-

• DNA molde + dNTPs e

ddNTPs + DNApolimerase +

Primer

• Amplificação - PCR

• Eletroforese em gel de

acrilamida

• Os fragmentos migram

distâncias proporcionais ao

seu tamanho.http://www.ib.usp.br/microgene/index.php?pagina=atividades&idcategoria=4&categoria=Atividades%20on-line&tabela=atividades

Reads longos (~900bps)

- Baixo Rendimento - Alto Custo

MÉTODO SANGER-MANUAL-

MÉTODO SANGER-AUTOMÁTICO-

MÉTODO SANGER-AUTOMÁTICO-

http://www.ib.usp.br/microgene/index.php?pagina=atividades&idcategoria=4&categoria=Atividades%20on-line&tabela=atividades

Norm

aliz

ed F

luore

scence

Em

issi

on

(Exc

itati

on a

t 48

8 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

MÉTODO SANGER-AUTOMÁTICO-

MÉTODO SANGER-AUTOMÁTICO-

MÉTODO SANGER-AUTOMÁTICO-

MÉTODO SANGER-AUTOMÁTICO-

Genomas sequenciados (outubro/2014)Eucariotos: 21 completes, 1701 em progresso

Procariotos: 3227completo, 25252 em progresso

Virus: 4127 completes, 94 em progresso

Organellar: 5039 completos

195

NATURE Vol 464 1 April 2010

2001: Human Genome Project2.7G$, 11 years

2001: Celera100M$, 3 years

2007: 4541M$, 3 months

2008: ABI SOLiD60K$, 2 weeks

2009: Illumina, Helicos40-50K$

2010: 5K$, a few days?

2012: 1000$, <24 hrs?

Next Gen X Sanger

2ª Geração de Sequenciamento • 454 - Pirosequenciamento (Roche)

• •Genome Analyser - Seqüenciamento por término reversível (Illumina-Solexa)

• SOLiD - Seqüenciamento por ligação de sondas (Applied Biosystems - Life)

• Comercializada em 2004

Pirosequenciamento – 454/Roche

• Etapas:- Ligação de adaptadores

- PCR em emulsão

- Seqüenciamento

Pirosequenciamento – 454/Roche

*dNTP – só um deles

Pirosequenciamento – 454/Roche

Resultado

Pirosequenciamento – 454/Roche

HiSeq 2000Illumina (Solexa)

Produz acima de 600Gb por corrida em 13 dias. Custo de resequenciar um genoma humano: UNC-CH Genome Analysis Facilit - (30x cobertura) aproximadamente $6,000

MiSeq Sistema de

pequena capacidade,

Estudo metagenômico,

PE 2x250cycles in 27hours.

https://www.youtube.com/watch?v=l99aKKHcxC4

https://www.youtube.com/watch?v=1uZtCMY-yEw

• Data de comercialização = 2007

• Etapas:1)Ligação de adaptadores2)PCR em emulsão3)Seqüenciamento

Sequenciamento por ligação de sondas (SOLiD)

• SOLiD = Sequencing by Oligo Ligation and Detection

https://www.youtube.com/watch?v=nlvyF8bFDwM

Sequenciamento por ligação de sondas (SOLiD)

Ion Torrent (life technologies)Tamanho do read -

200-250bp (200cycles)

Não realiza leitura Paired End

Sequenciamento mais rápido do mercado.Recommendações: Amplicons

(produtos de PCR), Genomas de

tamanho pequeno a médio.

4ª Geração de Sequenciamento

Genoma humano em 1 dia

Custo de reagents por corrida - $1000

Taxa de erro em torno de 1.2%

RNAseq, ChIPseq Ion Proton Chip I –

10 Gb Ion Proton Chip II –

100 Gb

Ion Proton System (life technologies)

Plataform

a

Tamanho do

read

Tempo de

corrida

Gb/corrid

a

Vantagens

Desvantagens

SAGE 900 pb 1 – 2 dias

0.02 Read longo

Alta taxa de erro

454 500 pb 8 horas

0.04 Read longo

Alta taxa de erro

HiSeq

75-100 2 dias 600 Sequenciamento profundo/custo

Reads pequenos

MiSeq

75 1 dia 2 Sequenciamento profundo/custo

Reads pequenos

Solid 85 8 dias 150 Baixa taxa de erro

Reads pequenosCorrida longa

Ion Torrent

200 2 horas

100 Corrida rápida

Novo*

Ion Proton

200 2horas

100 Corrida rápida

Novo*

“ Só os que se arriscam a

ir longe demais são

capazes de descobrir o

quão longe se pode ir. ”

T. S.

Eliot