sequenciamento e caracterizaÇÃo parcial do genoma
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
SEQUENCIAMENTO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DO
GENOMA DE CAGAITEIRA (Eugenia dysenterica DC.)
STELA BARROS RIBEIRO
Orientador: Prof. Alexandre Siqueira Guedes Coelho
Março – 2016
Ficha catalográfica elaborada automaticamente com os dados fornecidos pelo(a) autor(a), sob orientação do Sibi/UFG.
RIBEIRO, STELA BARROS SEQUENCIAMENTO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DO GENOMADE CAGAITEIRA (Eugenia dysenterica DC.) [manuscrito] / STELABARROS RIBEIRO. - 2016. LXXVI, 76 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. ALEXANDRE SIQUEIRA GUEDES COELHO;co-orientador MARIANA PIRES DE CAMPOS TELLES.Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Goiás, Escola deAgronomia (EA) , Programa de Pós-Graduação em Genética &Melhoramentos de Plantas , Goiânia, 2016. Bibliografia.
1. Cagaiteira. 2. Draft assembly. 3. Cerrado . I. SIQUEIRA GUEDESCOELHO, ALEXANDRE , orient. II. PIRES DE CAMPOS TELLES,MARIANA , co-orient. III. Título.
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E
DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o do-cumento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou down-load, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico: [X] Dissertação [ ] Tese 2. Identificação da Tese ou Dissertação Autor (a): Stela Barros Ribeiro E-mail: [email protected] Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [X]Sim [ ] Não Vínculo empregatício do autor Agência de fomento: Universidade Federal de Goiás Sigla: UFG País: Brasil UF: GO CNPJ: Título: Sequenciamento e caracterização parcial do genoma de cagaiteira (E. dysenterica
DC.) Palavras-chave: Cagaiteira, draft assembly, Cerrado. Título em outra língua: Sequencing and partial characterization of cagaiteira tree genome (E.
dysenterica DC) Palavras-chave em outra língua: Cagaiteira, draft assembly, Cerrado Área de concentração: Genética e Melhoramento de Plantas Data defesa: (11/03/2016) Programa de Pós-Graduação: Genética e Melhoramento de Plantas Orientador (a): Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho E-mail: [email protected]
*Necessita do CPF quando não constar no SisPG 3. Informações de acesso ao documento: Concorda com a liberação total do documento [X] SIM [ ] NÃO1
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1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de embargo.
STELA BARROS RIBEIRO
SEQUENCIAMENTO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DO GENOMA DE CAGAITEIRA (Eugenia dysenterica DC.)
Dissertação apresentada à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas da Universidade Federal de Goiás, como exigência para obtenção do título de Mestre em Genética e Melhoramento de Plantas.
Orientador: Prof. Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho
Coorientadora: Prof.ª Dr.ª Mariana Pires de Campos Telles
Goiânia, GO – Brasil
"Um pássaro pousado em uma árvore nunca tem medo que o galho se rompa, porque sua confiança
não está no galho e sim em suas próprias asas”.
Chico Xavier
À minha Mãe, meu Pai e Maninha, pessoas que trazem o sentido à minha vida, dedico.
AGRADECIMENTOS
Resolvi escrever de acordo com ordem cronológica dos acontecimentos, na
expectativa de não esquecer nenhum dos momentos vividos nesta fase, bem como não
esquecer nenhuma das pessoas envolvidas ...
Primeiramente agradeço à Keyla, que além de professora, tornou-se uma amiga,
que emprestou seu tempo e seus ouvidos para compartilhar comigo momentos bons e ruins,
me deu conselhos, e acima de tudo, foi a primeira pessoa a acreditar em mim quando me
apresentou ao LGGP (Laboratório de Genética e Genômica de Plantas).
Agradeço agora à todas as pessoas que me acompanharam no início de tudo, me
deram força e me ajudaram a superar minhas dificuldades de iniciante (Lud, Camilla e
Milena) e àqueles que mesmo estando longe neste momento (Arthur e Bianca), também
fizeram parte dessa etapa e tem lugar garantido nas minhas melhores lembranças.
Agradeço imensamente aos professores do PGMP, em especial, aos meus
orientadores Alexandre e Mariana. Ao professor Alexandre por todos os momentos em que
pude ter o privilégio de absorver um pouco de seu vasto conhecimento, por toda a paciência
e disposição em me ensinar e me tranquilizar nos momentos em que duvidei da minha
capacidade. À Professora Mariana, por ser para mim um exemplo de profissional e de pessoa
e por me dar a oportunidade de fazer parte de uma bela equipe (LGBio), fato que me ajudou
muito em diversos aspectos nesta última fase do mestrado.
Aos meus amigos de longa data e eternos (Vanuza, Mayane, Fabrício, Amanda,
Nayane, Mariana e Murilo) que estiveram ao meu lado, não só nesta, mas em várias fases da
minha vida, me proporcionando momentos de alegria, compreensão e companheirismo.
Aos amigos que ganhei de presente durante o mestrado, e que tem uma
importância indescritível no meu trabalho e na minha vida. Rhewter, Ivone, Clistiane e
Isabela, jamais esquecerei do quanto aprendi e evolui convivendo com vocês, quero leva-los
comigo, na vida e no coração para sempre.
A todas as pessoas que me marcaram de alguma forma, me fazendo rir, trocando
uma idéia sobre a vida e principalmente, me ensinando a lidar e amar as diferenças e
peculiaridades de cada um (Sabrina, Lanusse, Débora, Mariane, Régis, Suzy, Danilo, Karla,
Mayara, Ueric, Edivaldo e Giórgia).
À minha família: minha Mãezinha, meu velhinho e “Tify”, razões do maior
amor que carrego no peito...
Agradeço também aos membros da banca examinadora Thannya e Maria
Imaculada pela disposição e carinho em contribuir com a evolução deste trabalho.
À UFG pela estrutura e apoio, à CAPES pela concessão da bolsa de estudos e
ao GENPAC-02 e 03 CNPq/FAPEG/PRO-CENTRO-OESTE (563839/2010-4;
564145/2010-6 e 201110267000125) pelo apoio financeiro para a realização deste
trabalho.
E grandemente, agradeço ao meu pai do céu, que mesmo diante das minhas
fraquezas, revoltas e dúvidas, mostra todos os dias, de incontáveis formas, o quão grande
é o seu amor por mim.
SUMÁRIO
RESUMO.......................................................................................................................... . 8 ABSTRACT..................................................................................................................... .. 9 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 10 2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................ 13 2.1 ESTRUTURA GENÔMICA DE PLANTAS ..................................................... 13 2.1.1 Aspectos Gerais ................................................................................................. 13 2.1.2 Elementos Repetitivos ....................................................................................... 17 2.1.2.1 Repetições em Tandem ....................................................................................... 17 2.1.2.2 Elementos Transponíveis .................................................................................... 20 2.1.3 Aspectos Evolutivos .......................................................................................... 26 2.2 SEQUENCIAMENTO, MONTAGEM E ANOTAÇÃO DE GENOMAS DE
PLANTAS ........................................................................................................... 29 2.2.1 Aspectos Gerais ................................................................................................. 29 2.2.2 Tecnologias de Sequenciamento de Nova Geração ........................................ 30 2.2.3 Ferramentas Computacionais para Montagem e Anotação de Genomas ... 32 2.3 CARACTERÍSTICAS GERAIS DA CAGAITEIRA (Eugenia dysenterica DC.) .. 36 2.3.1 Aspectos Biológicos ........................................................................................... 36 2.3.2 Caraterização Físico-Química ......................................................................... 37 2.3.3 Caracterização Genética Baseada em Caracteres Quantitativos e Marcadores
Moleculares ........................................................................................................ 39 3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 43 3.1 EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO E SEQUENCIAMENTO ....................... 43 3.2 AVALIAÇÃO E CONTROLE DE QUALIDADE DAS SEQUÊNCIAS ......... 44 3.3 DRAFT ASSEMBLY DO GENOMA DE E. dysenterica .................................... 45 3.4 IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ELEMENTOS REPETITIVOS . 46 3.5 PREDIÇÃO E ANOTAÇÃO DE GENES ......................................................... 46 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................... 48 4.1 CONTROLE DE QUALIDADE DOS DADOS DE SEQUENCIAMENTO .... 48 4.2 ESTIMAÇÃO DO TAMANHO DOS FRAGMENTOS DE SEQUENCIAMENTO ... 52 4.3 AVALIAÇÃO DO DRAFT ASSEMBLY ............................................................ 53 4.4 CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA .................................................................. 55 4.4.1 Elementos Transponíveis .................................................................................. 55 4.4.2 Regiões Microssatélites ..................................................................................... 57 4.4.3 Genes e Transcritos ........................................................................................... 59 5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................... 66 6 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 67
RESUMO
RIBEIRO, S. B. Sequenciamento e caracterização parcial do genoma de cagaiteira (E. dysenterica DC.). 2016. 76 f. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas) – Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2016.1
Com o desenvolvimento das tecnologias de análise genômica, entre elas o sequenciamento de nova geração (NGS), a obtenção de uma grande quantidade de dados de sequenciamento de DNA é hoje uma realidade. Estes dados, associados às ferramentas computacionais desenvolvidas para sua análise, permitem o acesso às informações sobre genomas de diversos organismos, através da montagem de suas sequências parciais ou completas, bem como sua caracterização estrutural e funcional. A cagaiteira (E.dysenterica DC.) é uma das espécies nativas do Cerrado que possui potencial de utilização em sistemas de produção agrícola, devido ao potencial de utilização de seus frutos, folhas e casca além de possuir grande valor ecológico, por servir de alimento para a fauna nas suas regiões de ocorrência. Apesar dos avanços obtidos, pouco se sabe sobre a organização e estrutura genética desta espécie, visto que os trabalhos já realizados fazem o uso de um pequeno número de marcadores moleculares, aplicados a estudos sobre sistema cruzamento e efeitos de eventos microevolutivos nas populações. Foi realizada a montagem e a caracterização parcial o genoma de E.dysenterica com relação à quantidade, estrutura e função de genes e DNAs repetitivos, de forma a agregar informações àquelas já existentes. DNAs de cinco indivíduos de populações distintas foram sequenciados utilizando a plataforma Illumina MiSeq. O controle de qualidade das sequências genômicas obtidas foi feito utilizando o FastQc e o Trimmomatic. O draft assembly foi obtido utilizando o dipSpades e o controle de qualidade do assembly foi feito utilizando o blastn e o SamTools. A identificação e caracterização de regiões repetitivas foi feita com os programas RepeatMasker, RepeatModeler e QDD. Para a predição e anotação de genes foram utilizados os programas AUGUSTUS e o Blast2GO. Foi obtido um volume inicial de 8,64 Gb de sequências, distribuídos em 63.017.960 reads. Este valor diminuiu para após o controle de qualidade, restando 5,63 Gb, distribuídos em 59.415.168 reads. Mesmo com diminuição da quantidade de dados, foi observado o aumento das taxas de alinhamento entre o genoma de E.dysentera e E.grandis, espécie mais próxima à cagaiteira, cujo genoma já foi sequenciado. Após a retirada de DNAs organelares e contigs menores que 500 bases, foram obtidos 130.243 contigs, representando 56,7% (~250 Mb) do tamanho estimado para o genoma de E.dysenterica (~442 Mb). Cerca de 35,3% do assembly é composto por regiões repetitivas das quais 27,1% são elementos transponíveis, sendo a maioria pertencente à ordem LTR retrotransposons. Foram identificadas 55.491 regiões microssatélites das quais 46.701 são monocleotídeos e 8.403 são dinucleotídeos. O motivo de repetição T/A foi o mais frequente, seguido por A/T e GA/TC. Foram preditos 60.171 fragmentos gênicos e 228.510 transcritos. Observou-se uma densidade de 1 gene a cada 7,3 kb e uma média de 3,8 transcritos por gene. Diante dos resultados obtidos e a abordagem utilizada, este trabalho faz da cagaiteira a primeira espécie vegetal nativa do Cerrado cujo genoma foi amplamente amostrado e caracterizado utilizando dados NGS.
Palavras Chave: Cagaiteira, draft assembly, Cerrado
ABSTRACT
RIBEIRO, S. B. Sequencing and partial characterization of cagaiteira tree genome (E. dysenterica DC). 2016. 76 l. Dissertation (Master in Genetics and Plant Breeding) – Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2016.1
The development of genomic analysis technologies, mainly the next generation sequencing platforms (NGS), has enabled to obtain a large amount of DNA sequencing information. The association between NGS data and cutting edge computational tools affords access to whole genome information for different organisms, through whole genome assembly (or partial) and structural and functional characterization. The cagaiteira tree (E. dysenterica DC.) is one of the Cerrado native species with potential utilization in crop production systems, due to its products exploration: fruits, leaves and bark. Besides, it has ecological importance for food availability to local fauna. Despite the efforts made, little is known about the organization and genetic structure of the cagaiteira tree. The previous researches take into account a reduced number of molecular markers applied to mating systems studies and effects of micro evolutionary events in populations. In this study we obtained an assembly and a partial characterization of E. dysenterica genome, regarding number, structure and function of genes and repetitive DNA. We obtained DNA sequences for five individuals from different populations using Illumina MiSeq sequencing platform. The quality control was performed with FasQc and Trimmomatic. We assembled the reads using dipSPAdes and used blastn and Samtools to verify the assembly quality. We used Repeat Masker, Repeat Modeler and QDD to identify and characterize the repetitive DNA content. For gene prediction and annotation we used AUGUSTUS and Blast2GO. The raw DNA sequences amounted 8.64 Gb, distributed in 63,017,960 reads. After trimming for low quality, the amount decreased to 5.63 Gb, distributed in 59,415,168 reads. After filtering for organellar DNA and contigs smaller than 500 bp, we assembled 130,243 contigs, representing 56.7% (~250 Mb) of estimated E.dysenterica genome size (~442 Mb). About 35.3% of genome assembled comprised repetitive regions, of which 27.1% are transposable elements (most LTR retrotransposons). We identified 55,491 microsatellite regions, 46,701 mononucleotides and 8,403 dinucleotides. The T/A motif was the most common follow by A/T and GA/TC. We predicted 60,171 gene fragments and 228,510 transcripts. We observed a gene density of 1 gene per 7.3 Kb and an average of 3.8 transcripts per gene. This study makes the cagaiteira tree the first native plant species from Cerrado of which genome was widely sampled and characterized using NGS data.
Key words: Cagaiteira, draft assembly, Cerrado
1 INTRODUÇÃO
Populações naturais de plantas estão cada vez mais vulneráveis à erosão
genética, ocasionada por eventos como uso inadequado dos solos e mudanças climáticas.
Estes eventos podem funcionar como agentes seletivos de genótipos, contribuindo para a
diminuição dos tamanhos populacionais e consequente perda de variabilidade genética.
Além disso, essas populações sofrem com os efeitos da depressão por endogamia devido à
fragmentação de seus habitats naturais (Ribeiro & Rodrigues, 2006).
O conhecimento acerca da estrutura genômica e variabilidade genética das
espécies é o primeiro passo para desenvolvimento de programas de conservação. A partir
dessas informações, é possível se obter estimativas de parâmetros populacionais que servirão
como guia na escolha dos materiais a serem conservados e assim aumentar a variabilidade
existente para vários caracteres em bancos de germoplasma (Zonneveld et al., 2012).
Com o desenvolvimento das tecnologias de análise genômica, entre elas o
sequenciamento de nova geração (NGS – Next Generation Sequencing), a obtenção de uma
grande quantidade de dados de sequenciamento de DNA é hoje uma realidade. Estes dados,
associados às ferramentas computacionais desenvolvidas para sua análise, permitem o
acesso às informações sobre genomas de diversos organismos, através da montagem de suas
sequências parciais ou completas, bem como sua caracterização estrutural e funcional. Essas
informações permitem verificar o potencial de aplicação e as limitações destas tecnologias
em estudos de genética da conservação e de genética e genômica de populações (Allendorf
et al., 2010; Zonneveld et al., 2012).
O sequenciamento de diversos genomas de plantas tem possibilitado desde a
análise conjunta dos aspectos genéticos e fenotípicos em comparações intraespecíficas da
diversidade genética, até a comparação interespecífica dos níveis de expressão gênica, de
sua relação com fenótipos e com as funções de genes de interesse (Cooper et al., 2012). O
11
aumento do número de marcadores genéticos proporcionado por essas ferramentas tem
possibilitado a identificação de genes, de sequências repetitivas e de polimorfismos de uma
única base (SNPs - Single Nucleotide Polymorphism) nos genomas, que podem ser usados
para estudar de uma forma mais precisa os efeitos da seleção natural, da história
demográfica, do fluxo gênico e do parentesco nas populações de interesse (Carvalho & Silva,
2010; Davey et al., 2011; Ouborg et al., 2010).
O Cerrado compreende a segunda maior biodiversidade da América do Sul,
superado apenas pela Amazônia. Apesar de ser um bioma rico em espécies com potencial
econômico e ambiental, a maioria dessas espécies é utilizada de forma exclusivamente
extrativista e tem seu habitat natural substituído por monoculturas. Tais processos afetam a
estrutura genética e diminuem a ocorrência de populações naturais, evidenciando a
importância do desenvolvimento de programas de manejo e conservação dessa
biodiversidade (Gomes & Moura, 2010).
A cagaiteira é uma das espécies nativas do Cerrado que possui potencial de
utilização em sistemas de produção agrícola, principalmente devido ao potencial de
utilização de seus frutos, folhas e casca para obtenção de produtos alimentícios,
desenvolvimento de fármacos e ornamentação. A planta também possui grande valor
ecológico, por servir de alimento para a fauna nas suas regiões de ocorrência (Cardoso et al.,
2011; Martinotto et al., 2008).
Diversos estudos acerca da estrutura genética de populações naturais de
cagaiteira foram desenvolvidos nas últimas décadas, bem como sobre os efeitos de alguns
processos microevolutivos que atuam sobre essas populações. Esses estudos foram
realizados utilizando-se um pequeno número de marcadores moleculares, incluindo desde
isoenzimas até marcadores microssatélites, desenvolvidos exclusivamente para a espécie ou
transferidos de E. grandis, e trouxeram informações importantes para o desenvolvimento de
futuros programas de conservação e cultivo. Porém com a grande quantidade de informações
fornecidas pelas tecnologias de obtenção e na análise de dados, é possível obter ainda mais
informações acerca da composição e organização do genoma da espécie, estabelecendo uma
base para o campo da genômica populacional (Carvalho & Silva, 2010; Telles et al., 2001a;
2001b; Trindade & Chaves, 2005, Zucchi, 2004; Zucchi, 2005).
12
O constante desenvolvimento de tecnologias para geração e análise de dados
genômicos possibilitou a condução de estudos genômica para diversas espécies de plantas.
Para a família Myrtaceae, à qual pertence a cagaiteira, estes estudos ainda encontram-se
limitados a espécies do gênero Eucalyptus e Eugenia uniflora. Segundo Escudero (2014),
por apresentarem características como genomas relativamente pequenos e diploidia, as
espécies dessa família são fortes candidatas a modelos para estudo e compreensão de
diferentes processos biológicos que ocorrem em plantas (Da Costa et al., 2008). Quando
associadas às tecnologias e ferramentas de análise disponíveis, essas características podem
facilitar a obtenção de informações sobre genes e elementos reguladores, que por sua vez
podem ser utilizadas como referência para a compreensão da variação genômica em nível
populacional (Feuillet et al., 2011; Escudero, 2014).
Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo obter uma amostra do
genoma de E. dysenterica que permitisse caracterizá-lo com relação à quantidade, estrutura
e função de genes e DNAs repetitivos, de forma a agregar informações àquelas já existentes.
Pela abordagem utilizada, este trabalho faz da cagaiteira a primeira espécie vegetal nativa
do Cerrado cujo genoma foi amplamente amostrado e caracterizado utilizando dados NGS.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 ESTRUTURA GENÔMICA DE PLANTAS
2.1.1 Aspectos Gerais
A quantidade de sequências genômicas disponíveis têm crescido rapidamente
nas últimas décadas, possibilitando a caracterização de genomas de diversos organismos,
modelos e não-modelos. Este processo tem revelado detalhes específicos de cada espécie
que incluem a estrutura e o tamanho dos genomas, bem como seus padrões de duplicação e
número de genes, além da grande quantidade de elementos repetitivos, suas funções e efeitos
(Caicedo & Purugganan, 2005; Michael & Jackson, 2013).
Assim como nos demais organismos eucariotos, os genomas de plantas são
compostos basicamente por moléculas de DNA associadas a proteínas, as quais formam
unidades denominadas nucleossomos. Os nucleossomos por sua vez estão dispostos em
intervalos de ~200 pb, compactados em arranjos que formam a cromatina (Heslop-Harrison
& Schwarzacher, 2011; Michel & Jackson, 2013). A cromatina é organizada em
cromossomos, não sendo conhecido outro padrão de organização até o momento. Cada
cromossomo consiste em uma única molécula de DNA linear e ininterrupta de uma
extremidade à outra. Além das proteínas que se ligam ao DNA, nos cromossomos também
ocorrem proteínas associadas aos processos de expressão gênica, replicação e reparo
(Alberts et al., 2010; Heslop-Harrison & Schwarzacher, 2011).
Os cromossomos de plantas são divididos longitudinalmente em partes
delimitadas pela ocorrência de duas estruturas: o centrômero e o telômero. O centrômero
divide o cromossomo em dois braços e define a sua morfologia, além de permitir que uma
cópia de cada cromossomo duplicado seja levada às células filhas durante a divisão celular.
Contém sequências repetitivas, incluindo DNAs satélites em sua região central e elementos
transponíveis nas regiões flanqueadoras (Matsumoto et al., 2005). Os centrômeros não estão
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sujeitos à recombinação, o que provavelmente está relacionado com os padrões únicos de
evolução molecular observados nos genes que residem nessas regiões. Os telômeros são
sequências repetitivas, localizadas nas extremidades dos cromossomos e que permitem a sua
replicação eficiente. Essas estruturas também evitam, juntamente com suas regiões
adjacentes, que as extremidades dos cromossomos sejam confundidas com moléculas que
necessitem de reparo (Kellog & Bennetzen, 2004; Heslop-Harrison & Schwarzacher, 2011).
Comumente dois tipos de cromatina estão presentes em células vegetais: a
heterocromatina e a eucromatina. A heterocromatina concentra-se principalmente em
regiões do centrômero e telômero. O DNA heterocromático possui poucos genes e apresenta
elevado nível de compactação, o que torna essa região, do ponto de vista de expressão gênica,
pouco ativa. Apesar dessa condição, em Arabidopsis, por exemplo, foram identificados 47
genes expressos nessas regiões. A eucromatina consiste de regiões menos condensadas, que
constituem a maior parte dos cromossomos interfásicos. São regiões geralmente ricas em
genes, com níveis elevados de atividade de transcrição e recombinação na meiose (Alberts
et al., 2010; Hamilton et al., 2012).
Os cromossomos carregam genes. Genes são definidos como segmentos de DNA
que contêm as instruções para produção de determinadas proteínas, embora existam genes
cujos produtos finais sejam moléculas de RNA. Essas moléculas podem exercer diversas
funções estruturais e catalíticas nas células, como codificação de proteínas, splicing do pré-
mRNA e transporte de proteínas (Bennetzen et al., 2004; Michel & Jackson, 2013).
Além dos genes, os cromossomos de plantas contêm um excesso de DNA
repetitivo, organizado lado a lado ou de forma intercalante, que por muito tempo foi
considerado “DNA-lixo” por não ter função conhecida. Atualmente, sabe-se que parte dessas
sequências está envolvida na expressão gênica, além de apresentar outras funções que vêm
sendo estudadas (Alberts et al., 2010; Hua-Van et al., 2011).
A informação genética nas plantas pode ser encontrada tanto no núcleo das
células quanto em organelas (mitocôndrias e cloroplastos), sendo possível ainda encontrar
DNAs organelares inseridos de forma independente no DNA nuclear desses organismos. Na
análise do genoma de arroz, por exemplo, observou-se que 0,20-0,24% e 0,18-0,19% do
genoma nuclear é composto por inserções de DNA cloroplastidial e mitocondrial,
respectivamente (Matsumoto et al., 2005).
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Genomas de plantas são conservados em sua estrutura geral, porém variam
quanto ao tamanho e número de cromossomos, não se observando uma relação direta entre
esses dois aspectos. Isso pode ser demostrado pela comparação entre o genoma de arroz
(Oryza sativa) e cevada (Hordeum vulgare), em que o primeiro possui cerca de 389 Mb
distribuídos em 12 cromossomos, enquanto o genoma de cevada tem seus 5100 Mb
distribuídos em apenas sete cromossomos (Kellogg & Bennetzen, 2004; Michael & Jackson,
2013; Phytozome, 2015). Outro exemplo pode ser observado entre espécies da família
Myrtaceae (n=11), em que as estimativas feitas por citometria de fluxo revelam variações
entre gêneros e espécies, que vão desde 245 Mb, para Eugenia uniflora, até 545 Mb, em
Eucalyptus globulus. O projeto de sequenciamento do genoma de Eucalyptus grandis
revelou que seu genoma possui cerca de 640 Mb. Até o momento, o menor genoma
sequenciado é o da planta carnívora Utricularia gibba (82 Mb, n=16) e o maior é o de trigo,
um alopoliploide (Triticum aestivum, 17 Gb, n=3x=21) (Grattapaglia et al., 2012; Michael
& Jackson, 2013).
Os genes de plantas têm se apresentado bastante compactos e distribuídos mais
ou menos ao acaso, com variações substancias de densidade em posições diferentes dentro
de um mesmo cromossomo. Um exemplo dessa variação é a quantidade média de genes
identificados em Arabidopsis, aproximadamente 25 genes a cada 100 kb em regiões de
centrômeros e telômeros, podendo variar de 1 a 38 genes a cada 100 kb fora dessas regiões.
No genoma de arroz, a densidade é de 10,1 genes a cada 100 kb. Em pêssego, essa densidade
é de 12,2 genes a cada 100 kb (Brown, 2002; Matsumoto et al., 2005; Verde et al., 2013).
Durante a replicação, quando ocorrem erros que resultam em duplicações de
partes do genoma, ocorre a retenção de segmentos de DNA originais ou duplicados. Genes
duplicados dessa forma geralmente passam então a realizar funções especializadas dentro da
célula. Repetições deste processo, ao longo de milhares de anos, têm dado origem às famílias
gênicas. As famílias gênicas podem ter tamanhos variáveis entre espécies e desempenhar
funções importantes relacionadas à adaptação ou à especiação, tais como fatores de
transcrição, enzimas, transportadores ou transdutores moleculares (Alberts et al., 2010;
Lópes-Flores, 2012; Guo, 2013; Martinez, 2011).
Genes que se diferenciam gradualmente ao longo da evolução, cujas cópias
foram produzidas em eventos de especiação, e geralmente continuam exercendo a mesma
função em espécies diferentes, são chamados ortólogos. Aqueles que resultam de um evento
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de duplicação dentro de um único genoma, e que geralmente adquirem funções
especializadas, são chamados parálogos. Ambos, os genes ortólogos e os genes parálogos,
por apresentarem uma ancestralidade comum, são chamados de homólogos (Alberts et al.,
2010).
Genes são altamente conservados, permanecendo reconhecíveis em todas as
espécies. Novos genes sempre surgem a partir de sequências de DNA já existentes, podendo
ocorrer inovações a partir de mutações intragênicas, duplicações gênicas, embaralhamento
de segmentos e transferência horizontal. Evolutivamente, todos esses eventos deixam
evidências de seu acontecimento, através de traços característicos que podem ser detectados
na sequência de DNA (Alberts et al., 2010).
Alguns RNAs produzidos por genes, apesar de não codificarem proteínas
(ncRNAs - non-coding RNA), contêm em sua estrutura informações que possibilitam sua
atuação como componentes estruturais e enzimáticos para uma ampla gama de processos nas
células (Alberts et al., 2010; Cui & Cao, 2014; Dias Correia & Dias Correia, 2007). Os
pequenos RNAs nucleares (snRNA - small nuclear RNA), por exemplo, direcionam o
splicing do pré-RNA para formar moléculas de RNA mensageiro (mRNA). Os RNAs
ribossomais (rRNAs) são responsáveis pela formação da estrutura básica dos ribossomos,
além de catalisarem a síntese proteica. Moléculas de RNAs transportadores (tRNAs)
funcionam como adaptadores entre o mRNA e os aminoácidos. Sabe-se também que
moléculas de microRNAs (miRNAs) e pequenos RNAs de interferência (siRNAs - small
interfering RNA) atuam como reguladores-chave na expressão de genes eucarióticos (Cui &
Cao, 2014; Dias Correia & Dias Correia, 2007; Martienssen & Moazed, 2015).
Os genes podem ser classificados de acordo com suas funções ou com base nas
estruturas das proteínas codificadas por eles, através da análise dos domínios que formam
essas proteínas. O método de classificação baseado na estrutura das proteínas pode ser
aplicado mesmo a genes cujas funções não são conhecidas, abrangendo o conjunto total de
genes constituintes de determinado genoma. O método de classificação baseado em funções
utiliza o princípio segundo o qual todos os organismos eucariotos possuem o mesmo
conjunto básico de genes, mas as espécies mais complexas têm um maior número de genes
em cada categoria. Este método apresenta a desvantagem de deixar de fora uma parte do
conjunto total de genes, em casos onde suas funções ainda não foram identificadas (Brown,
2002).
17
2.1.2 Elementos Repetitivos
O termo “elementos repetitivos” refere-se a fragmentos de DNA que estão
presentes em múltiplas cópias, podendo representar grande parte do genoma de algumas
espécies. Em uva, cerca de 41% do genoma é formado por elementos repetitivos, proporção
mais elevada do que a encontrada no genoma de arroz (~35%), que tem um tamanho inferior.
Em milho, os elementos repetitivos representam mais de 80% do genoma (Jaillon et al.,
2007; Mehrotra & Goyal, 2014; Schnable et al., 2009).
Os DNAs repetitivos podem ser divididos em dois grandes grupos que
compreendem aqueles organizados em matrizes de repetições em tandem (DNAs satélites,
minissatélites e microssatélites) e repetições intercaladas (elementos transponíveis). As
repetições em tandem representam matrizes de fragmentos de DNA imediatamente
adjacentes uns aos outros na orientação de 5’ ⟶ 3’. Já as repetições intercaladas são
fragmentos de DNA de tamanho superior a 20 kb, inseridos mais ou menos ao acaso no DNA
hospedeiro (Jurka et al., 2007; Lerat 2010; Lópes-Flores & Garrido-Ramos, 2012).
2.1.2.1 Repetições em Tandem
As sequências de DNA repetidas em tandem, podem ser classificadas em três
grupos, de acordo com o comprimento da unidade de repetição e o tamanho da matriz. O
primeiro grupo consiste em repetições compostas por motivos de até seis pb e um tamanho
de matriz que pode variar de 10-100 unidades, conhecidos como microssatélites ou
repetições simples repetidas (SSR - Simple Sequence Repeats) (Lópes-Flores & Garrido-
Ramos, 2012; Mehrotra & Goyal, 2014).
Os microssatélites são sequências comuns em genomas de eucariotos e
procariotos e que apresentam altos níveis de polimorfismo alélico. O polimorfismo e a
variabilidade dessas regiões as tornaram amplamente utilizados no desenvolvimento de
marcadores moleculares. Esses marcadores têm sido aplicados a estudos de mapeamento
genético, genética de populações e biologia da conservação para diversos organismos (Amos
et al., 2008; Bhargava & Fuentes, 2010).
Essas repetições são classificadas de acordo com o motivo de repetição em
mono, di, tri, tetra, penta e hexanucleotídeos. A classificação também é feita, de acordo com
o tipo de repetição, em perfeitos ou imperfeitos, interrompidos ou compostos.
18
Microssatélites perfeitos são sequências formadas apenas pelas bases que constituem os
motivos repetidos, já nos imperfeitos há um par de bases que não corresponde ao motivo
repetido. Em um microssatélite interrompido existe uma pequena sequência dentro da
repetição que não coincide com a sequência do motivo, enquanto os microssatélites
compostos são formados por pelo menos dois motivos de repetição distintos adjacentes
(Bhargava & Fuentes, 2010; Oliveira et al., 2006).
Em genomas de plantas, os microssatélites de mononucleotídeos predominam
sobre os formados pelos demais tipos de repetições, sendo o motivo A/T descrito como o
mais frequente nesses organismos. Os de dinucleotídeos vêm em seguida, sendo os motivos
GA/TC e AT/AT os mais frequentes. Já os de trinucleotídeos são menos frequentes nos
genomas de uma maneira geral, ocorrendo com maior frequência em regiões codificantes
(Bhargava & Fuentes, 2010, Lópes & Flores & Garrido-Ramos 2012; Myburg et al., 2014).
Dentre os principais critérios utilizados na seleção de locos microssatélites para
serem utilizados como marcadores moleculares estão: o tipo de repetição (di, tri, tetra, penta
ou hexanucleotídeos), o número de repetições, o número de alelos por loco e a magnitude da
heterozigosidade (Buschiazzo & Gemmell, 2006). Segundo Lourenço (2004),
microssatélites de mononucleotídeos não têm praticamente utilidade. Nestes casos a
identificação dos alelos é bastante trabalhosa e muito sujeita a erros. Marcadores baseados
neste tipo de polimorfismo estão sujeitos a um efeito denominado stutter, caracterizado pelo
surgimento de “sombras” de bandas com uma repetição a mais ou a menos do que o alelo
verdadeiro (Myburg et al., 2014; Lourenço, 2004).
Os microssatélites são encontrados com frequências altamente variáveis em
diferentes espécies, tanto em regiões codificantes quanto não codificantes (Amos et al.,
2008; Buschiazzo & Gemmell, 2006). Zhao et al. (2013) sugerem que não há uma relação
significativa entre o tamanho dos genomas de plantas e a densidade de microssatélites.
Morgante et al. (2002) avaliaram a frequência de microssatélites em cinco espécies de
plantas (Arabidopsis, soja, milho, arroz e trigo) e observaram que as frequências de
microssatélites são significativamente diferentes entre as plantas estudadas. Nas espécies
que possuem genomas maiores, como milho e trigo, as quantidades de microssatélites
identificados foram menores. Tal hipótese foi corroborada ainda pela frequência observada
de 0,85% de microssatélites no genoma de Arabidopsis (125 Mb), comparada aos 0,37%
observados no genoma de milho (2300 Mb).
19
Os principais mecanismos de mutação em microssatélites são o deslizamento de
cadeia durante a replicação (strand-slippage) e recombinação desigual (Figura 1). Ambos os
processos implicam no pareamento incorreto dos filamentos de DNA, acarretando ganho ou
perda de unidades de repetição. Modelos alternativos estão sendo utilizados para explicar a
evolução destes elementos. Esses modelos compartilham a pressuposição de que cada loco
pode variar independente do comprimento, ao longo do tempo (Ellegren, 2004; Lópes-Flores
& Garrido-Ramos, 2012).
Figura 1. Mecanismos de mutação de regiões microssatélites. a) Erros durante a recombinação
intracromossomal podem produzir alelos curtos com números reduzidos de unidades de repetição. Alternativamente, o crossing-over desigual pode ampliar ou diminuir o tamanho dos alelos. b) O deslizamento de cadeia pode acarretar erros de pareamento entre os nucleotídeos durante a replicação do DNA, resultando em diminuição ou aumento de unidades de repetição. Fonte: Gemayel et al. (2010).
As taxas de mutação de regiões microssatélites podem variar entre locos, alelos
e espécies e dependem de características como o número de unidades repetidas, o
comprimento da repetição e o motivo repetido. Devido à maior probabilidade de
deslizamento, regiões com maior número de repetições tendem a ser mais mutáveis
(Bhargava & Fuentes, 2010). A mutabilidade de microssatélites depende também da
constituição genômica das sequências que flanqueiam essas regiões.
Os minissatélites constituem o segundo grupo de repetições em tandem e são
formados por sequências com mais de 9 pb de comprimento e um tamanho da matriz de 0,5-
20
30 kb. A maioria dos minissatélites é rica em GC, com uma forte assimetria em suas cadeias.
O polimorfismo dessas regiões resulta de variações no número de repetições e da capacidade
que algumas dessas matrizes têm em hibridizar com dezenas de outras regiões semelhantes
no genoma. Os minissatélites foram os primeiros marcadores moleculares altamente
polimórficos e multialélicos utilizados em estudos de ligação e nos estágios iniciais de
mapeamento do genoma humano (Vergnaut & Denoeud, 2000; Oliveira et al., 2015).
Minissatélites ocorrem não só em DNA nuclear mas também no genoma de
cloroplastos e mitocôndrias, como observado em arroz e em espécies do gênero Brassica.
Podem ser encontrados em aglomerados nas regiões pericentroméricas dos cromossomos e
geralmente constituem regiões hipervariáveis e não codantes (Lópes-Flores & Garrido-
Ramos, 2012; Mehrotra & Goyal, 2014; Oliveira et al., 2015).
O terceiro grupo de repetições em tandem envolve as sequências de DNAs
satélites (satDNA), que consistem de repetições curtas não codificantes. Estes elementos
podem representar cerca de 30% do DNA de algumas plantas e são os principais
componentes da heterocromatina, encontrada nos cromossomos (Ambrozová et al., 2011;
Mehrotra & Goyal, 2014; Garrido-Ramos, 2015). Famílias de DNA satélite podem surgir
por mecanismos moleculares como crossing-over desigual, amplificação por círculo rolante,
deslizamento durante a replicação e por mutação. Elas se diferenciam de acordo com a
localização, sequência de nucleotídeos, complexidade das sequências, abundância e
comprimento das unidades de repetição. Segundo Garrido-Ramos (2015), funções
biológicas têm sido sugeridas para as diferentes famílias de DNA satélite, além de outras
funções como organização, emparelhamento e segregação dos cromossomos (Pezer et al.,
2012; Plohl et al., 2012, 2014; Rao et al., 2010).
2.1.2.2 Elementos Transponíveis
Os elementos transponíveis (TEs - Transposable Elements) são fragmentos de
DNA que têm a capacidade de se mover e de se inserir em novas posições do genoma, muitas
vezes fazendo cópias de si mesmos durante esse processo. Quando ativos, devido à sua
mobilidade e capacidade de auto replicação, esses elementos tornaram-se componentes
abundantes e responsáveis por boa parte da diversidade genômica observada (Barron et al.,
2014; Feschotte et al., 2002; Lópes-Flores & Garrido-Ramos, 2012).
21
Os TEs foram primeiramente descritos por Barbara McClintock, nos anos de
1940, em estudos sobre quebras cromossômicas em milho. Na época, esses elementos foram
chamados de “elementos controladores”, por estarem relacionados a alterações na expressão
de genes que estivessem próximos ou nos próprios locais de inserção dos mesmos. Em
plantas, a primeira clonagem desses elementos foi feita no início dos anos de 1980. Com o
sequenciamento de diversos genomas, foi possível identificar a presença de TEs em
praticamente todos os eucariotos analisados até agora (Bennetzen & Wang, 2014; Wicker et
al., 2007).
Os TEs exibem uma grande diversidade, podendo constituir cerca de 80% do
DNA genômico total de espécies como o milho. Inicialmente, os TEs podem ser divididos
em dois grupos, o primeiro grupo envolve elementos de replicação autônoma, capazes de
codificar um conjunto completo de enzimas características de sua família, sendo auto
suficientes em termos de transposição. Os elementos autônomos são então capazes de se
mover e acumular cópias de si mesmos em novas posições do genoma. Estes elementos já
foram vistos como egoístas desde que Hickey (1982) descobriu sua capacidade de se
espalhar nas populações, mesmo causando mutações prejudiciais (Hurst & Werren, 2001,
Jurka et al., 2007).
Elementos não-autônomos formam o segundo grupo e envolvem aqueles que se
transpõem por meio de empréstimos da maquinaria de proteínas, codificadas por seus
parentes autônomos. Os não-autônomos carecem de alguns (ou todos) os domínios
encontrados em elementos autônomos. Normalmente, contém uma região de codificação
altamente degenerada, ou mesmo a falta de capacidade de codificação (Jurka et al., 2007;
Wicker et al., 2007).
Finnegan (1989) foi o primeiro a propor um sistema de classificação para os TEs,
distinguindo estes elementos de acordo com seus mecanismos de transposição. Além da
divisão em classes, os TEs podem ainda ser agrupados em subclasses e ordens, com base
nas suas relações estruturais, e em superfamílias e famílias, de acordo com a similaridade de
sequências (Barrón et al., 2014).
Segundo Wicker et al. (2007) o nível taxonômico ordem é utilizado para marcar
grandes diferenças nos mecanismos de inserção e consequentemente, na organização geral
do elemento. As superfamílias, dentro de ordens, distinguem-se a partir da estrutura das
22
proteínas codificadas ou dos domínios de codificação, além da presença e tamanho do sítio
alvo de duplicação (TSD - Target Site Duplication) que consiste de uma pequena repetição
em ambos os flancos de inserção de um TE. As superfamílias são subdivididas em famílias,
as quais são definidas pela conservação da sequência de DNA. A similaridade entre as
proteínas codificadas é geralmente elevada entre as diferentes famílias que pertencem à
mesma superfamília. Por outro lado, a conservação da sequência de DNA é mínima e restrita
a partes altamente conservadas das regiões codificantes (Wicker et al., 2007).
Os elementos transponíveis da classe I, também chamados de retrotransposons,
utilizam um RNA intermediário cujo transcrito é utilizado como molde para um novo DNA,
produzido através da atividade de uma transcritase reversa (RT - Reverse Transcriptase).
Em seguida esse novo DNA é inserido no genoma hospedeiro através de uma enzima
integrase ou endonuclease (Figura 2). Cada ciclo de replicação completo produz uma nova
cópia, fazendo com que os retrotransposons sejam muitas vezes os principais contribuintes
para a fração repetitiva em grandes genomas (Bennetzen & Wang, 2014; Hurst & Werren,
2001).
Figura 2. Elemento transponível pertencente à classe I (retrotransposons). O mecanismo de
transposição desses elementos baseia-se na atividade de uma transcritase reversa que utiliza o produto de um RNA intermediário para gerar uma cópia do fragmento de DNA original. Fonte: Lisch et al. (2013).
23
Os retrotransposons podem ser divididos em cinco ordens: retrotransposons
LTR, LINEs, DIRs-like, Penelopes (PLEs) e SINEs. O comprimento desses elementos pode
variar de algumas centenas até 25 Kb (Jurka et al., 2007; Wicker et al., 2007). Os membros
da ordem DIRS (Dictyostelium Intermediate Repeat Sequence) têm sido detectados em
diversas espécies, que vão de algas verdes até animais e fungos. Já os elementos da ordem
PLE foram encontrados pela primeira vez em Drosophila virilis e já foram detectados em
mais de 50 espécies de animais, fungos e plantas (Lopes-Flores, 2012; Wicker et al., 2007).
Os retrotransposons LTR diferenciam-se das demais ordens por possuírem uma
estrutura com capacidade de codificação chamada repetição terminal longa (LTR - Long
Terminal Repeat) em suas duas extremidades (Figura 3). Os retrotransposons LTR são os
elementos transponíveis encontrados com maior frequência em plantas, representando cerca
de 35% das repetições do genoma de arroz, 55% do genoma de sorgo e 75% do genoma de
milho. Tais achados sugerem que há uma correlação positiva entre o tamanho dos genomas
e a quantidade de retrotransposons LTR. Em plantas, os elementos LTR mais comumente
encontrados são pertencentes às superfamílias Copia e Gypsy (Lerat, 2010).
Os retrotransposons da ordem LINE (Long Interspersed Elements) são
elementos autônomos, ou seja, possuem toda a maquinaria necessária para sua transposição.
Esses elementos não possuem sequências LTR, porém podem exibir uma cauda poli-A em
sua extremidade 3’. Os elementos da família SINE (Short Interspersed Elements), também
desprovidos de sequências LTR, são elementos não autônomos, ou seja, dependem de
proteínas codificadas pelos LINEs para sua transposição (Figura 3) (Lopes-Flores, 2012;
Wicker et al., 2007).
24
Figura 3. a) Representação da estrutura dos retrotransposons LTR. b) Estrutura de elementos que
não possuem regiões LTR (LINEs e SINEs). Fonte: Jurka et al. (2007).
Os elementos transponíveis da classe II, também conhecidos como transposons
de DNA utilizam uma transposase para excisar um DNA e inseri-lo em outros locais (Figura
4), processo também conhecido como recorta-e-cola (cut-and-paste) (Bennetzen & Wang,
2014). A classe II contém duas subclasses, que se distinguem pelo número de cadeias de
DNA que são cortadas durante a transposição. A subclasse I compreende os elementos da
ordem TIR (Terminal Inverted Repeats) (Figura 4), caracterizados por suas repetições
terminais invertidas de comprimento variável. As nove superfamílias conhecidas
distinguem-se pelas sequências TIR e pelo tamanho da região TSD (Figura 4). Em plantas
os elementos TIRs mais comuns são os Ac-Ds, primeiros elementos transponíveis descritos,
identificados primeiramente em milho (Wicker et al., 2007).
Os helitrons compreendem a subclasse II dos transposons de DNA e se
diferenciam dos demais quanto ao mecanismo de transposição que ocorre por meio de
círculo rolante (Figura 4) (Bennetzen & Wang, 2014). De modo geral os Helitrons não
parecem reconhecer TSDs. Apesar disso, no genoma do milho, em que foram melhor
caracterizados, apresentam certa especificidade de inserção por estarem sempre próximos
uns aos outros e dispostos na mesma orientação (Yang & Bennetzen 2009).
Os TEs podem apresentar diversos efeitos, de acordo com sua estrutura e local em que
estejam inseridos. A presença de TEs em regiões gênicas pode causar alterações na
expressão desses genes. Isso foi observado em milho, onde a inserção de elementos
transponíveis no gene b1 resultou na mudança da expressão desse gene nos grãos, alterando
sua cor. Da mesma forma, em laranja, a inserção de um retrotransposon no gene que confere
a cor da polpa foi responsável pelo mutante Ruby, dando origem à variedade de frutos com
25
polpa avermelhada, conhecida como Blood Orange (Figura 5) (Lisch et al., 2013). TEs
também podem aumentar a expressão de genes, alterando drasticamente o fenótipo de
algumas plantas. Esse fato tem sido observado durante o processo de domesticação do milho.
Figura 4. Transposons de DNA representando a subclasse I, que compreende os elementos da
ordem TIR e a subclasse II, que compreende os Helitrons. Fonte: Jurka et al. (2007).
Figura 5. Alterações na cor da polpa de laranjas, ocasionadas pela inserção de um retrotrasposon.
Fonte: Lisch (2013).
26
Dentre os cinco locos que separam o milho comercial do seu ancestral selvagem, teosinte, o
loco tb1 codifica um fator que reprime a ramificação, logo a super-expressão desse gene em
milho, resultou numa drástica diminuição na quantidade de ramos quando comparado aos
seus genitores selvagens, e isso se deve à atividade do retrotransposon Hopscotch, situado
na região de codificação do gene (Lisch et al., 2013).
Mesmo diante de alguns exemplos de vantagens adaptativas ocasionadas pela
inserção de TEs, esses elementos estão de modo geral associados a efeitos deletérios. As
plantas dedicam recursos consideráveis para o controle da atividade desses elementos, o que
geralmente é conseguido por silenciamento epigenético. Os mecanismos epigenéticos são a
primeira linha de defesa contra a proliferação descontrolada de TEs e incluem a metilação
do DNA, a remodelação da cromatina e os siRNAs (Lee & Kim, 2014; Lisch, 2013).
Apesar dos elementos transponíveis terem sido considerados por muito tempo
como DNA-lixo ou egoísta, a seleção contra suas consequências negativas, bem como as
estratégias específicas utilizadas por estes elementos e por seus hospedeiros para amenizar
essas consequências garantem que a maioria das mudanças sobreviventes causadas por TEs
sejam seletivamente neutras ou apenas levemente prejudiciais (Lisch, 2013).
2.1.3 Aspectos Evolutivos
Dentre as descobertas realizadas na análise da grande quantidade de informação
obtida pelo sequenciamento de genomas, as descobertas da existência de sequências de DNA
conservadas e de genes homólogos são de longe as maiores. Como resultado, a análise de
similaridade entre sequências se tornou uma ferramenta poderosa por permitir a detecção de
sinais de eventos evolutivos passados. Duplicações de genes, segmentos cromossômicos ou
de genomas inteiros, fontes primárias de novidades evolutivas, incluindo novas funções e
padrões de expressão gênica, são eventos detectáveis pelas modernas técnicas de análise
genômica comparativa (Alberts et al., 2010; Vanneste et al., 2014a).
O sequenciamento de genomas tem demostrado que eventos de duplicação em
pequena e grande escala ocorreram em muitas etapas da evolução, especialmente em
linhagens de plantas, onde há evidências de duplicações recorrentes de genomas inteiros
(WGDs - Whole Genome Duplications) (Figura 6). Muitos desses eventos parecem estar
associados a períodos com maiores níveis de estresse ambiental, algo que pode ser observado
27
nas linhagens evolutivas de espécies de plantas poliploides e paleopoliploides formadas há
cerca de 66 Ma, a partir do evento de extinção ocorrido no período Cretáceo-Paleogeno
(Vanneste et al., 2014b).
As primeiras análises de sequências de plantas evidenciaram eventos de
duplicação do genoma em espécies que eram anteriormente consideradas diploides. Estes
eventos tiveram consequências importantes na evolução desses organismos. Na medida em
que mais espécies de plantas foram analisadas, tornou-se claro que muitos genomas de
plantas tinham sofrido poliploidização (completa ou parcial) e outros rearranjos
cromossômicos (Bancroft, 2001; Cui et al.,2006; Jaillon et al., 2007).
Figura 6. Eventos de duplicação de genomas em plantas. As barras horizontais representam
eventos de WGD observados com maior frequência a partir do Cretáceo (barras vermelhas). A barra tracejada indica um possível WGD na base das plantas monocotiledôneas, porém sua colocação filogenética exata ainda permanece pouco clara. Fonte: Vanneste et al. (2014b).
A poliploidização é uma força preponderante na evolução das plantas e causa
efeitos profundos que vão desde alterações moleculares a alterações ecológicas. Os genomas
das plantas modernas abrigam provas de várias rodadas desses eventos, muitas vezes
28
seguidos de silenciamento e eliminação de genes. As angiospermas em particular têm sido
alvo de estudos relacionados à frequência de poliploidização em seus genomas. Estima-se
que cerca de 30-50% dessas espécies são poliploides (Adams et al., 2005, Cui et al., 2006;
Soltis et al., 2014).
A análise do genoma de Arabidopsis revelou que 60% desse genoma está contido
em grandes segmentos que foram duplicados, embora menos da metade dos genes nesses
segmentos tenham sido conservados. Em Populus, há evidências de ocorrência de um evento
de WGD datado de 8-13 Ma, em que cerca de 8000 pares de genes duplicados nesse evento
sobreviveram no genoma. Um evento mais antigo de duplicação (~100-120 Ma) coincide
com o período em que ocorreu a divergência entre Populus e Arabidopsis (Fawcett et al.,
2009; Tuskan et al., 2006).
As análises genômicas realizadas em Eucalyptus grandis revelaram que a
história evolutiva do genoma da espécie é marcada por um evento de paleotetraploidização
de uma linhagem específica, sobreposto ao evento de paleohexaploidização anteriormente
compartilhado por todas as plantas eudicotiledôneas. Estima-se que este evento tenha
ocorrido há ~110 milhões de anos atrás (Myburg et al., 2014; Vanneste et al., 2014a).
Os eventos de duplicação de genes e genomas muitas vezes resultam em
alterações fenotípicas que contribuem para a domesticação e sucesso das espécies. Em
tomate, por exemplo, há evidência de um evento de triplicação do genoma compartilhado
com batata que resultou na produção de frutos carnosos, característica importante para a
distribuição das sementes, por atrair dispersores vertebrados. O evento foi responsável pelo
surgimento de famílias gênicas, relacionadas ao amadurecimento e pigmentação dos frutos
(Sato et al., 2012).
Pode-se observar que a maioria dos eventos identificados na evolução de
genomas de plantas, até agora, ocorreram em um curto intervalo de tempo. As WGDs
parecem tem ocorrido no período que corresponde ao evento de extinção do Cretáceo-
Paleogeno, o que sugere que as espécies poliploides atuais estabeleceram-se e proliferaram
devido às suas vantagens evolutivas quando comparadas aos seus genitores diploides. Essas
vantagens surgiram a partir de eventos cataclísmicos ou de grande turbulência ambiental
(Fawcett et al., 2009).
29
2.2 SEQUENCIAMENTO, MONTAGEM E ANOTAÇÃO DE GENOMAS DE PLANTAS
2.2.1 Aspectos Gerais
Diversas razões contribuem para o grande interesse dos pesquisadores no
sequenciamento de genomas de plantas. Esses organismos formam a base da cadeia
alimentar, servindo como fonte de alimento para os demais seres vivos. A importância
ecológica das plantas envolve espécies que são responsáveis pela manutenção do equilíbrio
dos ciclos de carbono, proteção dos solos contra erosões e por constituírem uma promissora
fonte de energia renovável. As plantas dão origem a produtos utilizados na medicina e
servem como organismos-modelo para estudos de sistemas biológicos, tais como função dos
elementos transponíveis e epigenética. Mesmo diante de todas estas razões, poucos genomas
de plantas foram sequenciados, levando-se em consideração a quantidade de espécies
existentes (Schatz et al., 2012).
O primeiro genoma de planta a ser sequenciado foi o de Arabidopsis thaliana,
seguida por Oryza sativa, Carica papaya e Zea mays, todos utilizando o método de
sequenciamento automático com eletroforese por capilares. O aumento na quantidade de
genomas de plantas sequenciados, principalmente a partir do ano de 2011 no qual 12
sequências de genomas foram publicadas, está relacionado ao constante desenvolvimento de
tecnologias de obtenção e análise de dados. Essas novas tecnologias permitem maior
rendimento, com menor tempo e custo por gigabase, quando comparadas aos métodos
anteriores (Michael & Jackson, 2013; Schatz et al., 2012).
O acesso a informações genômicas obtidas a partir desses dados tem
possibilitado a anotação de novos genes, bem como o desenvolvimento de estudos de
genômica comparativa e de marcadores moleculares, com ampla aplicação em áreas como o
melhoramento de plantas. Apesar dos notáveis avanços, a montagem e anotação de genomas
de plantas ainda exige esforços consideráveis. A presença de características típicas destes
organismos, como genomas extensos, ploidias elevadas, altas taxas de heterozigosidade e de
elementos repetitivos, são fatores complicadores. Uma outra dificuldade na montagem de
genomas de plantas é a presença de grande quantidade sequências de DNA plastidial nos
dados de sequenciamento, dificultando a montagem do genoma nuclear (Pellicer et al., 2010;
Schatz et al., 2012).
30
Uma boa montagem de genoma requer a combinação adequada entre cobertura
(ou profundidade) de sequenciamento e reads com comprimento e qualidade adequados. O
não atendimento a alguma destas condições poderá resultar em um assembly fragmentado.
Para contornar o problema de reads curtos produzidos pelos métodos NGS, alguns estudos
contam com a união de reads de diferentes tamanhos e geradas por diferentes plataformas,
buscando balancear as vantagens e desvantagens de cada uma delas (Ekblom & Wolf, 2014;
Koren et al., 2012; Schatz et al., 2012).
2.2.2 Tecnologias de Sequenciamento de Nova Geração
A década de 90 marcou o início da transição da genética para a genômica, com
o desenvolvimento de métodos de sequenciamento automatizados que baseavam-se no
método de sequenciamento dideoxi ou sequenciamento de Sanger. Com o aumento do poder
das ferramentas computacionais, o rendimento desse método de sequenciamento aumentou
ainda mais, possibilitando o sequenciamento do genoma de organismos com pouca ou
nenhuma informação prévia disponível (Hamilton & Buell, 2012; Mardis, 2008).
O lançamento em 2005 da plataforma 454, desenvolvida pela 454 Life Sciences,
depois adquirida pela Roche, disponibilizou à comunidade científica um método de alto
rendimento, baseado em sequenciamento por síntese, conhecido como pirossequenciamento
(Roche, 2015; Margulies et al., 2005; Shendure & Ji, 2008). Este método utiliza a técnica de
PCR em emulsão e o sequenciamento de fato ocorre em uma flow cell, onde a adição de um
nucleotídeo à cadeia de DNA resulta na liberação de um pirofosfato. Genomas já publicados
como os de uva (Vitis vinifera) e morango (Fragaria vesca) utilizaram esta plataforma para
obtenção de parte de seus dados (Jaillon et al., 2007; Schatz et al., 2010; Shulaev et al.,
2011).
Posteriormente, um método de sequenciamento por síntese de elevado
rendimento foi desenvolvido pela Solexa, mais tarde adquirida pela Ilumina (Illumina,
2015a). As plataformas de sequenciamento Illumina diferem do método 454 em vários
aspectos, entre eles o tipo de amplificação utilizada, que nesse caso é a técnica de PCR em
ponte. Nessa plataforma os conjuntos de fragmentos de DNA são sintetizados diretamente
na flow cell e os amplicons servem como molde para o sequenciamento (Mardis, 2008;
Shendure & Ji, 2008).
31
O fluxo de trabalho dos sequenciadores Illumina pode ser dividido em quatro
etapas: a preparação de bibliotecas, a geração de clusters, o sequenciamento e a análise dos
dados gerados. Durante a preparação das bibliotecas, são obtidos fragmentos de ácidos
nucleicos com adaptadores ligados a ambos os extremos desses fragmentos para posterior
geração de clusters e sequenciamento. O processo de geração de clusters tem como principal
objetivo a obtenção de DNA suficiente para ser detectado durante o sequenciamento que
ocorre na célula de fluxo (flow cell) (Illumina, 2015a; Shendure & Ji, 2008).
A flow cell é formada por um par de lâminas de vidro com um canal no seu
interior. O canal está alinhado a adaptadores de oligonucleótidos complementares aos
fragmentos de DNA. Em sua superfície existem dois oligonucleótidos complementares a
cada um dos adaptadores adicionados aos fragmentos de DNA. A amostra passa através da
superfície da flow cell e hibridiza com os seus oligonucleótidos complementares (Illumina,
2015a).
Uma vez que a amostra tenha hibridizado com a superfície da flow cell, uma
cópia da cadeia original é realizada pela adição de DNA polimerase e dNTPs. Após a síntese
da nova cadeia, o passo seguinte consiste em remover a cadeia original após uma rápida
desnaturação. A cadeia removida então se liga novamente a superfície da flow cell. A cadeia
gira e hibridiza novamente a um oligonucleotídeo que se encontra ligada à flow cell, em
seguida são adicionados a polimerase e os dNPTs gerando uma nova extensão, que forma
uma ‘ponte’ de cadeia dupla. Esta cadeia é novamente desnaturada, onde cada uma das fitas
liga-se a novos oligonucleotídeos continuando o processo conhecido por PCR em ponte
(Hamilton et al., 2012; Illumina, 2015a).
Ao fim do processo de agrupamento teremos clusters dos fragmentos de DNA
originais, cada um contendo um fragmento amplificado diferente da amostra original. Após
a clusterização, são geradas imagens dos clusters por meio de combinações de filtro e LED
específicas para cada um dos quatro didesoxinucleotídeos marcados através de
fluorescência. Após a geração da imagem de um bloco da flow cell, esta é movida para expor
o próximo bloco, repetido-se o processo para cada ciclo de sequenciamento. Depois da
análise das imagens, o programa realiza uma análise primária dos dados, que inclui a
chamada de bases, filtragem e pontuação de qualidade (Illumina, 2015a, Mardis, 2008).
32
Atualmente a plataforma Illumina é a mais utilizada, produzindo reads com
comprimentos que variam de 25 a 600 bases em uma velocidade maior e custos mais baixos
do que o sequenciamento de Sanger. Dado o comprimento reduzido dos reads obtidos por
essa tecnologia, seu uso na montagem de genomas demanda a utilização de coberturas
maiores. O aumento da cobertura de sequenciamento, ao compensar esta redução, permite a
obtenção de conjuntos de dados de alta qualidade, com taxas de erro pequenas (~10-16),
considerando que cada nucleotídeo tenha sido confirmado pelo menos oito vezes por reads
idênticos (cobertura mínima de 8x). Elevadas coberturas de sequenciamento também são
necessárias para obtenção de dados de genotipagem de locos polimórficos em genomas
diploides ou poliploides (Schatz et al., 2012; Sims et al., 2014).
A superação dos desafios existentes na montagem de genomas complexos
depende de avanços nas tecnologias de sequenciamento no que diz respeito a melhorias no
rendimento, custo, comprimento de reads e precisão. Novas tecnologias têm sido
desenvolvidas para suprir essas demandas. Estas tecnologias, denominadas de terceira
geração, vem sendo desenvolvidas pelas empresas Pacific Biosciences (PacBio) e Oxford
Nanopore. Estas novas plataformas permitem a obtenção de reads bem mais longos (até
50kb), que poderão ser utilizados para otimizar o sequenciamento de genomas complexos,
heterozigóticos e ricos em DNA repetitivo (Naito et al., 2015; Schatz et al., 2012).
2.2.3 Ferramentas Computacionais para Montagem e Anotação de Genomas
Dentre os fatores que devem ser considerados na escolha dos algoritmos de
montagem de genomas incluem-se: a quantidade de dados disponíveis (comprimento dos
reads e cobertura de sequenciamento); a qualidade dos dados (taxas de erro); e a estrutura
do genoma (tamanho, conteúdo GC, heterozigosidade, número e tamanho de regiões
repetitivas). Diversos softwares já foram desenvolvidos para realizar montagens de genomas
a partir de sequências curtas, como as geradas pelas tecnologias NGS. Alguns destes
softwares, como o Velvet e Spades, utilizam algoritmos baseados em grafos de Bruijn,
abordagem em que os reads são fragmentados em k-meros que por sua vez tornam-se nós
em um grafo (Li et al., 2010; Sanfonova & Pevzner, 2015; Zerbino & Birney 2008; Zerbino
et al., 2009). Nesses algoritmos, os k-meros tomam o lugar das sequências-semente
utilizadas pelas ferramentas de montagem de genomas baseadas no algoritmo overlap-
33
layout-consensus, conforme mostrado na Figura 7 (Compeau & Tesler, 2011; Schatz et al.,
2010).
A escolha da abordagem ideal para montagem de um determinado genoma passa
pela comparação de vários métodos de montagem diferentes, para que o mais adequado para
os dados em questão possa ser identificado (Ekblom & Wolf, 2014). Antes da montagem, o
controle de qualidade dos dados de sequenciamento deve ser realizado. Os dados de baixa
qualidade, as duplicações resultantes de PCR, bem como as sequências de iniciadores,
devem ser retiradas pois podem atrapalhar o processo de montagem. O processo de
montagem consiste na união dos reads em contigs, estruturas que são unidas para formar
longos trechos de sequência conhecidos como scaffolds. Em uma última etapa, os scaffolds
são reunidos em grupos de ligação ou em cromossomos, de forma a representar da melhor
maneira possível a estrutura do genoma. Esta etapa é geralmente realizada através do
alinhamento dos reads a mapas obtidos por outras estratégias de análise genética. As
montagens de sequências genômicas obtidas sem a utilização de uma sequência de referência
prévia são conhecidas como montagens de novo (Ekblom & Wolf, 2014; Martins, 2013).
Uma variedade de estatísticas que refletem diferentes aspectos da integridade e
continuidade da montagem estão disponíveis, sendo N50 a mais utilizada. Para a obtenção
desta métrica, os contigs devem ser ordenados por tamanho (do maior para o menor) e a
partir do contig mais longo, os comprimentos devem ser somados até que se obtenha o valor
que corresponde à metade do comprimento de todos os contigs montados. Este valor
corresponde ao N50. No entanto, o N50 e suas variações têm de ser interpretados com
cautela, pois limitam-se a indicar a contiguidade e não contêm informação sobre a precisão
de montagem. Outras informações utilizadas para avaliar a qualidade da montagem são o
tamanho médio de intervalos (gaps) em scaffolds e o número médio de gaps por scaffold
(Earl et al., 2011; Yandell & Ence, 2012).
34
Figura 7. Diferença entre grafos de sobreposição (overlap) e grafos de Bruijn para a montagem
de genomas. Sequências de dez reads de 8 pb (A) são representadas como nós no grafo de sobreposição (B), onde as setas pontilhadas indicam sobreposição de até 5 pb. As sobreposições mais longas são indicadas pelas setas. Nos grafos de Brujin (C), um nó é criado para cada um dos k-meros de todos os reads. Nesse exemplo o tamanho do k-mero é 3 e as linhas são traçadas entre todos os k-meros sucessivos. A sobreposição ocorre por k–1 bases. Em ambas as abordagens, as regiões repetitivas causam bifurcações nos grafos. Fonte: Schatz et al. (2010).
Após concluída a montagem, deve ser feita a anotação das informações obtidas
como genes e outros elementos de interesse. O processo de anotação pode ser
conceitualmente dividido em duas fases. Na fase computacional, várias evidências de
genomas ou transcritomas de outras espécies são usadas em paralelo para criar previsões de
genes e transcritos iniciais. Já na segunda etapa, que consiste na anotação em si, as
informações anteriormente obtidas são reunidas seguindo as regras determinadas pelo
pipeline de anotação adotado (Yandell & Ence 2012; Ekblom & Wolf, 2014).
Antes de predição de genes, é de grande importância identificar e mascarar
sequências repetitivas, incluindo regiões de baixa complexidade e elementos transponíveis.
Sugere-se que se crie um banco de dados de elementos repetitivos específico para cada
espécie, visto que essas regiões são pouco conservadas. Esta etapa deve ser feita com o
intuito de evitar erros na predição de genes, além de ajudar na caracterização das repetições,
que atualmente estão sendo estudadas para verificar seus efeitos e funções nos genomas.
Atualmente estão disponíveis diversas ferramentas que fazem busca e mascaram repetições
de uma forma geral, como o RepeatMasker e o RepeatModeler, além de ferramentas que
35
buscam por repetições específicas, como MGEScan non-LTR e Helitron finder (Du et al.,
2008; Ekblom & Wolf, 2014; Smit et al., 2015a; Rho & Tang 2009).
Os termos predição e anotação de genes são geralmente tratados como sinônimos
apesar de não serem (Figura 8). A diferença entre as duas etapas é que a predição de genes
busca identificar estruturas como sequências codantes (CDS - Coding DNA Sequences) e
características genômicas específicas do organismo, tais como as frequências de códons de
iniciação e parada, e as distribuições de comprimento de éxons-íntrons, para distinguir os
genes de regiões intergênicas e para determinar suas estruturas. Geralmente os preditores
não relatam as regiões não traduzidas (UTR - UnTranslated Regions). A fase de anotação de
genes por outro lado inclui informações acerca da localização de regiões UTR, bem como
das isoformas dos genes, através de evidências associadas aos dados preditos (Yandell &
Ence, 2012). As ferramentas computacionais de predição Augustus, GenomeScan e MakerP
são as mais utilizadas para plantas e são também chamadas de preditores ab initio, por
utilizarem modelos matemáticos ao invés de elementos como ESTs e proteínas para
identificar estruturas gênicas.
Figura 8. A) Predição de genes. B) Inclusão de evidências (ESTs, mRNA). C) Alinhamento dos
genes preditos às sequências de proteínas já anotadas, buscando novas evidências. D) Anotação do gene, que resultou de um consenso entre todas as evidências, que também sugerem formas de splicing alternativo. Adaptado de Yandell & Ence (2012).
A fase final de identificação e caracterização de genes consiste em anotar
informações biologicamente relevantes como variações estruturais e informações
funcionais, para isso, utilizam-se os termos de ontologia de genes (GO - Gene Ontology). O
GO foi desenvolvido no final dos anos 1990, caracterizando o primeiro esforço significativo
A
B
C
D
36
para se desenvolver um vocabulário unificado que descrevesse os atributos dos produtos
gênicos (Cooper et al., 2012; Gene Ontology Consortium 2012).
2.3 CARACTERÍSTICAS GERAIS DA CAGAITEIRA (Eugenia dysenterica DC.)
2.3.1 Aspectos Biológicos
A cagaiteira é uma árvore frutífera nativa do Brasil, que ocupa áreas de Cerrado
nos estados de Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Piauí, Goiás, Minas Gerais, São Paulo,
Tocantins, Bahia e Distrito Federal, ocorrendo preferencialmente em formações de cerradão
e cerrado stricto sensu, em solos profundos e bem drenados. A distribuição espacial da
cagaiteira se dá em agregados, com subpopulações geograficamente descontínuas, mesmo
em áreas preservadas (Camilo et al., 2013; Chaves & Telles, 2006).
A espécie pertence à família Myrtaceae, que compreende plantas dicotiledôneas
lenhosas, contém mais de 5.650 espécies organizadas em cerca de 150 gêneros dos quais
vários possuem relevância econômica, entre eles Eucalyptus, Corymbia, Psidium e Eugenia.
A família Myrtaceae é representada no Cerrado por 14 gêneros e 211 espécies, sendo
considerada uma das dez famílias mais representativas desse bioma, contribuindo com cerca
de 51% da sua riqueza florística (Chaves & Telles, 2006; Marinotto et al., 2008; Grattapaglia
et al., 2012).
As cagaiteiras possuem porte médio com alturas que podem variar entre 4 e 10
metros, com copa alongada e densa. Possuem troncos tortuosos cujo diâmetro varia entre 20
e 40 cm, com casca suberosa e fendada (Figura 9). As folhas são dispostas de maneira oposta,
com formas ovalares e glabras; são aromáticas e caducam no período de floração. As flores
da cagaiteira são hermafroditas, completas e autocompatíveis, apresentando um padrão de
floração denominado por Proença & Gibbs (1994) de Big Bang, em que ocorre uma
sincronização do florescimento em um curto período de tempo (Almeida Júnior et al., 2014;
Camilo et al., 2013).
Nos galhos, as flores da cagaiteira são organizadas de forma solitária ou em
trios, com pétalas de coloração branca (Figura 9). As abelhas das espécies Bombus atratus e
B. morios são as principais responsáveis pela polinização (Silva et al., 2001; Telles et al.,
2001a; Chaves & Telles, 2006). O florescimento das cagaiteiras ocorre entre agosto e
37
setembro, período no qual também surgem novas brotações ricas em pigmentação
avermelhada (Figura 9).
A frutificação ocorre logo depois, entre os meses de setembro e outubro e a
maturação dos frutos ocorre de maneira relativamente rápida, coincidindo com o início do
período chuvoso (Camilo et al., 2013). Os frutos da cagaiteira possuem formato globoso, cor
amarelo-clara, casca fina e brilhante com sabor levemente ácido (Figura 9). O comprimento
dos frutos varia de 3 a 4 cm com diâmetro entre 3 a 5 cm (Chaves & Telles, 2006; Martinotto
et al., 2008).
Segundo Andrade et al. (2003) as sementes da cagaiteira apresentam
comportamento recalcitrante, onde altas taxas de germinação ocorrem a temperaturas que
variam de 15 a 30º C e a viabilidade é perdida quando as sementes são expostas a taxas de
umidade inferiores a 22%. A principal forma de dispersão de sementes é zoocórica, realizada
por animais como macacos e morcegos que se alimentam dos frutos e os transportam para
diferentes pontos (Chaves & Telles, 2006). De acordo com Telles et al. (2003) e Zucchi et
al. (2002), a cagaiteira apresenta sistema de cruzamento misto, com predomínio de alogamia,
apresentando taxa de fecundação cruzada estimada de 83,5% e 100,0%, em estudos com uso
de marcadores isoenzimáticos e microssatélites, respectivamente.
A espécie destaca-se entre as diversas plantas nativas dos cerrados brasileiros
que apresentam potencial de utilização em sistemas tradicionais de produção agrícola, pelo
consumo de seus frutos in natura ou processados sob a forma de doces, geleias, licores,
sucos e sorvetes. A planta também possui valor ornamental devido à sua beleza, realçada
principalmente na época de florescimento (Cardoso et al., 2011; Martinotto et al., 2008).
2.3.2 Caraterização Físico-Química
Cardoso et al. (2011) analisaram características físicas e químicas de frutos de
cagaiteira coletados no estado de Minas Gerais e observaram a presença de proteínas (0,63
g/100 g), lipídeos (0,57 g/100 g) e carotenoides (0,77 mg/100 g) em sua composição, além
de uma considerável quantidade de vitamina C (34,11 mg/100 g). O estudo demostrou que
o consumo de 100 g dos frutos da cagaiteira por dia contribui significativamente para
fornecer as necessidades diárias de vitaminas A, C e folatos em seres humanos.
38
Figura 9. A cagaiteira. A) indivíduo adulto. B) Fruto da cagaiteira maduro (cagaita). C) Flores.
D) Folhas jovens. Fotos: Rhewter Nunes (2014).
Estas propriedades também foram estudadas por Silva et al. (2015), que
realizaram esta mesma caracterização, desta vez com frutos provenientes do estado de Goiás.
Estes autores observaram que cerca de 90% dos frutos são compostos por água que
juntamente com os açúcares, constituem os componentes majoritários da polpa e da casca
(20,47%) das cagaitas. Já nas sementes, proteínas e lipídios são os nutrientes predominantes
(4,42 e 0,49%, respectivamente).
Quanto à composição química, a cagaiteira constitui-se de elementos como
cálcio, ferro e carboidratos. Análises realizadas com óleos essenciais obtidos a partir de
folhas de cagaiteira demonstraram a presença de uma grande quantidade de compostos
fenólicos, como os flavonoides, que além de conferir proteção às plantas contra herbivoria,
39
possuem propriedades antibacterianas e antifúngicas (Duarte et al., 2009; 2010; Silva, 2013;
Vilela et al., 2012).
Após realizar uma extensiva revisão sobre as propriedades químicas da espécie,
Silva et al. (2015) concluíram que a cagaiteira possui amplo potencial para desenvolvimento
de medicamentos fitoterápicos. Estes autores destacam, porém, que ainda existe a
necessidade de pesquisas afim de preencher lacunas no que diz respeito à sua eficácia e
segurança, para posterior desenvolvimento desses produtos.
2.3.3 Caracterização Genética Baseada em Caracteres Quantitativos e Marcadores Moleculares
Estudos acerca da variabilidade, estrutura genética e sistema de cruzamento de
populações naturais de E. dysenterica vêm sendo desenvolvidos nas últimas décadas,
permitindo grandes avanços no conhecimento genético e de alguns dos processos
microevolutivos que atuam sobre essas populações. Os estudos desenvolvidos contam com
análises de caracteres quantitativos e um pequeno número de marcadores moleculares que
incluem isoenzimas, marcadores RAPD e microssatélites, além de marcadores SNPs que
ainda se encontram em fase de teste (Telles et al., 2001a; 2001b; Trindade & Chaves, 2005;
Zucchi, 2004; Zucchi, 2005; Nunes, 2015, comunicação pessoal).
Telles et al. (2001a), através de marcadores isoenzimáticos, analisaram o padrão
de autocorrelação espacial da variação genética em subpopulações naturais de Eugenia
dysenterica e verificaram quais processos microevolutivos estariam atuando na
diferenciação genética dessas subpopulações. Para isso, foram utilizados seis sistemas
enzimáticos (SKDH, 6-PGD, α-EST, MDH, PGI e PGM), com oito locos polimórficos. A
partir deste estudo, foi possível sugerir que os padrões espaciais de divergência genética
entre as subpopulações estudadas poderiam ser explicados por processos estocásticos como
o isolamento por distância, onde as populações podem divergir sob um processo estocástico
simples (deriva genética), contrabalançado por fluxo gênico em curtas distâncias.
A diversidade genética e estrutura populacional da espécie também foram
estudadas a partir dos mesmos indivíduos do estudo citado anteriormente por Telles et al.
(2003). Neste caso também foram utilizados dados isoenzimáticos (seis sistemas
enzimáticos com oito locos polimórficos) para estimar vários parâmetros populacionais,
40
entre eles o índice de fixação intrapopulacional (f) que permite inferir o nível de endogamia
e o sistema reprodutivo predominantes na espécie; o grau de diferenciação interpopulacional
e os padrões espaciais associados à divergência genética, informações importantes para o
desenvolvimento de programas de conservação in situ e ex situ.
Após os estudos de caracterização genética da espécie utilizando marcadores
isoenzimáticos, Trindade & Chaves (2005) utilizaram caracteres morfológicos e marcadores
moleculares para analisar a estrutura genética de subpopulações amostradas da região
nordeste do estado de Goiás. Das treze subpopulações amostradas, três foram analisadas com
marcadores RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) a partir de seis primers que
apresentaram maior padrão de polimorfismo, assim como verificado no trabalho realizado
por Zucchi et al. (2005), onde a mesma série de primers foi utilizada na comparação de
populações provenientes da região sudeste de Goiás.
Zucchi et al. (2004) estudaram a estrutura genética e o fluxo gênico em
subpopulações de E. dysenterica, sugerindo que os marcadores SSR seriam mais sensíveis
para cálculos de estimativas populacionais que os marcadores isoenzimáticos e RAPD,
utilizados em estudos anteriores com a mesma espécie. Para a condução do estudo foram
testados 356 pares de primers, previamente desenvolvidos por Brondani et al. (1998) para
Eucalyptus spp., dos quais dez pares foram transferidos para E. dysenterica.
Os resultados mostraram o potencial de transferibilidade de locos SSR de
Eucalyptus spp. para espécies de gêneros diferentes da família Myrtaceae. Também foi
possível se observar o comprometimento da estrutura metapopulacional da espécie, pelos
indícios de que as populações estudadas sofreram deriva genética devido à ação humana. As
informações obtidas devem ser levadas em consideração na elaboração de programas de
conservação e pré-melhoramento de E. dysenterica.
Telles et al. (2013) relataram o desenvolvimento e caracterização de locos
microssatélites para a espécie e demonstram a sua aptidão para estudos posteriores de
estrutura genética populacional e fluxo gênico. A partir desse estudo nove iniciadores foram
desenhados, dos quais cinco renderam produto de amplificação. Estes cinco primers foram
testados em 97 indivíduos amostrados de três diferentes regiões. Todos os locos
apresentaram polimorfismo, com número de alelos por loco variando de 3 a 11 e
heterozigosidades esperada variando de 0,309 a 0,884. O desenvolvimento de marcadores
41
moleculares específicos para a espécie é importante para esclarecer os mecanismos
evolutivos da variabilidade genética de E. dysenterica.
Aguiar et al. (2009) ressaltam a importância do conhecimento da variabilidade
genética existente nas populações naturais de espécies frutíferas para o desenvolvimento de
uma gestão adequada dos ecossistemas e de variedades mais adaptadas para cultivo. Estes
autores estimaram parâmetros genéticos de caracteres quantitativos (altura da planta,
diâmetro do caule e suas respectivas taxas de crescimento) em 110 progênies derivadas de
dez subpopulações naturais de E. dysenterica. Os resultados mostraram que a maior parte da
variação genética se encontra dentro de subpopulações.
Junior et al. (2014), também utilizando caracteres quantitativos, realizaram a
caracterização da coleção de germoplasma de E. dysenterica da Universidade Federal de
Goiás. Foram avaliados na primeira etapa os caracteres altura da planta, altura da primeira
bifurcação, circunferência do caule a 10 cm do solo e projeção média da copa. Na segunda
etapa foram coletados dados métricos das folhas (comprimento e largura do limbo, formato
e comprimento do pecíolo). A partir da análise desses dados foi possível observar que as
subpopulações representadas não estão estruturadas para os caracteres avaliados, não
apresentando consequentemente, diferenciação fenotípica nos caracteres das árvores. Com
relação aos caracteres das folhas, foi observada estruturação, resultando em diferenciação
fenotípica das folhas entre as árvores.
Novaes (2014) também utilizou caracteres quatitativos, além de marcadores
microssatélites com o objetivo de analisar e comparar a proporção da variação genética
quantitativa e molecular entre subpopulações naturais de Eugenia dysenterica DC. Foi
possível observar altos níveis de variação fenotípica e genotípica tanto entre as
subpopulações quanto entre famílias dentro de subpopulações, com a maior proporção
verificada entre famílias. As estimativas de herdabilidade foram de 0,23 e 0,27 para taxa de
crescimento e número de folhas e maior que 0,34 para os outros caracteres, que indicam bom
potencial de seleção para caracteres avaliados, cuja seleção de progênies com rápido
desenvolvimento inicial é importante para a produção comercial de mudas.
Barbosa et al. (2015) obtiveram novas estimativas de diversidade genética a
partir de marcadores microssatélites em regiões neutras e não neutras do genoma de
E.dysenterica. As análises revelaram um gradiente noroeste-sudeste contínuo na
42
diferenciação da população, e não dois grupos distintos de populações como sugerido em
estudos anteriores e que um simples processo de diferenciação estocástica não explica os
padrões observados.
Rodrigues et al. (2016) avaliaram o sistema reprodutivo e fluxo gênico mediado
por pólen em uma geração de Eugenia dysenterica da coleção de germoplasma da
Universidade Federal de Goiás, utilizando marcadores microssatélites. Eles observaram uma
elevada taxa de diversidade genética que não diferiu significativamente entre os adultos
(H e = 0,777) e progênies (H e = 0,617). Os resultados do trabalho também mostraram
que E. dysenterica se reproduz por alogamia na coleção de germoplasma (t m = 0,957). De
acordo com os autores, os resultados mostraram que a coleção de germoplasma analisada
tem um elevado potencial para iniciar um programa de criação de E. dysenterica, com uma
alta taxa de cruzamento e uma elevada diversidade genética, proporcionando um
contribuindo de forma significativa para a conservação ex-situ desta espécie.
Diversas informações genéticas e fenotípicas sobre a cagaiteira já foram obtidas,
porém o seu uso decorrente unicamente do extrativismo e a falta de conhecimento que
possibilite o seu cultivo em grande escala, ainda revelam que há muito a ser feito para se
complementar as informações existentes, possibilitando o desenvolvimento de estratégias
efetivas de conservação e domesticação desta espécie. O advento de tecnologias de
sequenciamento e as ferramentas de análise de dados em grande escala apresentam uma
possibilidade para a obtenção dessas informações.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO E SEQUENCIAMENTO
Foram obtidas amostras de tecido foliar a partir de cinco indivíduos provenientes
da coleção de germoplasma mantida na Universidade Federal de Goiás, de modo que cada
indivíduo representasse uma subpopulação de E. dysenterica. O DNA genômico foi extraído
utilizando-se o protocolo CTAB 2% desenvolvido por Doyle & Doyle (1987). A avaliação
do DNA quanto à concentração e qualidade foi feita por meio de eletroforese horizontal em
gel de agarose 1% e no equipamento Qubit® Fluorometer Quantitation (Life Technologies,
2014).
As bibliotecas de fragmentos de DNA genômico para sequenciamento foram
construídas utilizando-se o kit Nextera® DNA Sample Preparation Kit 2x 300
Illumina, 2015b). Este kit elimina a necessidade de fragmentação mecânica do DNA, além
de permitir uma diminuição do tempo de manuseio das amostras. O sistema Nextera inclui
transposases que têm a função de fragmentar o DNA e inserir adaptadores de 19 pb nas
extremidades dos fragmentos, de forma simultânea.
Os fragmentos obtidos foram amplificados em uma reação de PCR com ciclos
limitados (15 ciclos). Nesta etapa foram adicionados os barcodes para identificação das
amostras, além de adaptadores comuns (P5 e P7), necessários para geração dos clusters de
sequenciamento. As bibliotecas produzidas foram então submetidas à plataforma de
sequenciamento Illumina MiSeq no modo paired-end, em que ocorre o sequenciamento dos
fragmentos a partir de ambas as extremidades (Illumina, 2015a).
Foram produzidos dois lanes de sequenciamento. No primeiro, o DNA genômico
de apenas um indivíduo foi sequenciado. No segundo, o DNA genômico de outros quatro
indivíduos foram sequenciados em multiplex, utilizando barcodes. Ao fim do processo,
44
foram obtidos dados de sequenciamento de cinco bibliotecas, correspondentes aos cinco
indivíduos amostrados.
3.2 AVALIAÇÃO E CONTROLE DE QUALIDADE DAS SEQUÊNCIAS
Para a visualização dos dados de sequenciamento, foi utilizado o programa
FastQC. Para a eliminação de sequências de baixa qualidade foi utilizado o programa
Trimmomatic (Andrews, 2010; Bolger et al., 2014). A partir dos módulos Per Base Sequence
Quality, Per Base Sequence Content e Adapter Content, fornecidos pelo FastQC, foi possível
identificar a presença de adaptadores de sequenciamento e bases de má qualidade
principalmente na região terminal 3’ das sequências.
Os adaptadores foram removidos utilizando-se a opção ILLUMINACLIP do
programa Trimmomatic. Posteriormente, buscou-se eliminar regiões que apresentassem
distorções em seu conteúdo nucleotídico (per base sequence content). Para isso foram
utilizadas as opções HEADCROP e CROP do Trimmomatic que permitem o descarte de
bases a partir de posições especificadas na linha de comando. Também foram eliminadas as
bases das extremidades 5’ e 3’, cujos valores de qualidade phred foram inferiores a 15
(opções LEADING e TRAILING). O valor de qualidade phred também foi utilizado para
eliminar bases sempre que o valor médio dentro de um intervalo de quatro bases fosse
inferior a 15 (opção SLIDINGWINDOW). Foram selecionadas apenas sequências com
comprimento de pelo 20 bases (opção MINLEN).
Após o controle de qualidade, foram gerados quatro arquivos para cada
biblioteca, em que dois deles reuniram os reads que após a filtragem permaneceram em pares
(paired-ends) e os outros dois reuniram os reads em que somente um dos elementos do par
permaneceu após o filtro (single reads). O programa Bowtie2 foi utilizado para realizar um
alinhamento entre os reads de E. dysenterica (antes e depois de passarem pela filtragem)
com sequências genômicas de Eucalyptus grandis, espécie mais próxima, cujo genoma já
foi sequenciado. Esta etapa teve como objetivo verificar os efeitos do controle de qualidade
no alinhamento das sequências (Langmead & Salzberg, 2012).
O produto do alinhamento feito entre os reads filtrados e o genoma de
Eucalyptus grandis foi utilizado na obtenção de estimativas do tamanho dos fragmentos
45
sequenciados e que permaneceram após o controle de qualidade, com o intuito de obter
estimativas que foram utilizadas na etapa de montagem.
3.3 DRAFT ASSEMBLY DO GENOMA DE E. dysenterica
Dada a inexistência de uma sequência de referência para o genoma de E.
dysenterica, a estratégia de montagem de novo foi utilizada. Essa estratégia possibilita a
montagem de genomas pela formação de contigs e scaffolds. O programa dipSPAdes versão
1.0 foi utilizado para obtenção de um draft assembly de novo para E. dysenterica. Esse
programa faz uso de um algoritmo baseado em grafos de Bruijn para realizar a montagem
(Safonova et al., 2015).
Buscando melhorar a qualidade do assembly obtido, os contigs compostos por
menos de 500 bases foram retirados utilizando script em Pyton (Nunes, 2015a, comunicação
pessoal). A ferramenta blastn foi utilizada para identificar sequências que apresentaram altos
níveis de similaridade com sequências conhecidas de DNA organelar (cloroplastidial e
mitocondrial). As sequências assim identificadas foram retiradas do assembly final.
A estimação das estatísticas descritivas do assembly foi feita com o script
assemblathon.sh (Earl et al., 2011), com o qual foram obtidas informações relativas à
proporção estimada do tamanho do genoma de E. dysenterica representada pelo assembly, o
número de contigs formados, o tamanho médio dos contigs, o comprimento do maior e do
menor contig e o valor N50 (Martins, 2013; Souza, 2014).
A cobertura de sequenciamento dos contigs obtidos foi estimada afim de se
verificar a sua homogeneidade e confiança. Esta estimativa foi feita através do alinhamento
dos reads de E. dysenterica ao assembly obtido, utilizando-se o software Bowtie2
(Langmead & Salzberg, 2012). A partir deste alinhamento, foram obtidos cinco arquivos no
formato SAM, que foram posteriormente ordenados e reunidos em um único arquivo no
formato BAM, utilizando as ferramentas do programa SamTools (Li et al., 2009). O arquivo
BAM foi então utilizado para se estimar a profundidade de sequenciamento pelo uso da
ferramenta BedTools (Quinlan & Hall, 2010).
46
3.4 IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ELEMENTOS REPETITIVOS
Para a identificação e caracterização de elementos transponíveis (TEs) foi
utilizado o programa RepeatMasker (Smit, 2015a). Inicialmente foi realizada uma consulta
ao banco de dados de plantas eudicotiledôneas do NCBI, para identificar repetições comuns
entre E. dysenterica e outras espécies de plantas cujos genomas já foram anotados.
Posteriormente, também com o RepeatMasker, foi realizada uma nova busca, desta vez por
elementos exclusivos, baseando-se em um banco de dados de repetições de E. dysenterica
construído pelo RepeatModeler, que consiste de um pacote de identificação e modelagem de
novo de famílias de repetições, composto de dois programas (RECON e RepeatScout) que
empregam métodos computacionais complementares para identificar os limites do elemento
de repetição e as relações familiares a partir de dados de sequenciamento de nova geração
(Smit, 2015b).
Para a caracterização dos elementos não classificados, foi utilizada a ferramenta
blastx, com o intuito de verificar a presença de genes ou domínios conservados dentro desses
elementos, além da busca por ORFs (Open Reading Frames), realizada pela utilização da
ferramenta ORFFinder (NCBI, 2015). A caracterização das regiões microssatélites foi
realizada utilizando-se o programa QDD (Meglécz et al., 2014). Esta análise envolve quatro
passos e possibilita não só a identificação de regiões microssatélites, como também a busca
por possíveis contaminações, o desenho de primers e a comparação destes com sequências
de elementos transponíveis conhecidos, buscando-se eliminar regiões que se encontrem
neste contexto.
3.5 PREDIÇÃO E ANOTAÇÃO DE GENES
A predição de genes foi realizada com o programa AUGUSTUS, a partir do
assembly com as repetições mascaradas. O AUGUSTUS forneceu um arquivo no formato
GFF3 contendo informações como posição dos genes, de éxons, íntrons e de transcritos para
cada gene (Stanke et al., 2006). A partir do script getAnnoFasta.pl fornecido pelo próprio
programa, foi possível obter um arquivo FASTA contendo apenas as sequências de proteínas
que foram alinhadas contra o banco de dados de plantas embriófitas com o blastp.
47
O arquivo de saída fornecido pelo blastp foi utilizado para anotação funcional
dos genes identificados, etapa realizada com o programa Blast2GO (Conesa & Gots, 2008).
A ferramenta blastp foi utilizada para verificar quantos dos transcritos preditos para E.
dysenterica seriam recuperados no transcriptoma de E. grandis.
48
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 CONTROLE DE QUALIDADE DOS DADOS DE SEQUENCIAMENTO
Foram sequenciadas 8,64 Gb, distribuídas em 63.017.960 de reads do tipo
paired-ends. No controle de qualidade, o volume total de sequências foi reduzido a 5,63 Gb,
distribuídas em 59.415.168 reads. A visualização das sequências permitiu a observação do
impacto da retirada das sequências de baixa qualidade (trimagem). As bases que restaram
apresentam-se de boa qualidade, com valores de phred acima de 30 (Figura 10). Com relação
às frequências de bases sequenciadas (Figura 11), observou-se a diminuição das
discrepâncias que antes existiam no início e no final das sequências. Como esperado, a
retirada de adaptadores contaminantes e das bases de má qualidade tornou a distribuição
mais homogênea para todas as posições dos reads.
Originalmente os dados de sequenciamento foram constituídos em sua maioria
por sequências de 250 pb, com menor ocorrência de reads menores (20-240 pb). Como pode
ser visto na Figura 12, após o controle de qualidade ocorreu o aumento da frequência de
reads mais curtos, com comprimentos entre 20 e 180 pb, com reads maiores (190-250 pb)
ocorrendo em menor frequência. É importante salientar que apesar do aumento da
quantidade de reads curtos, estes são de boa qualidade, e que as bases eliminadas consistiram
de sequências de má qualidade e de fragmentos de adaptadores que, se não retirados,
poderiam prejudicar as análises posteriores.
Apesar da diminuição do volume de dados ocasionada pelo controle de
qualidade, foi possível verificar o aumento das taxas de alinhamento entre os reads das cinco
bibliotecas de E. dysenterica e o genoma de Eucalyptus grandis (Tabela 1). Este resultado
corrobora o que foi observado por Del Fabbro et al. (2013), que ao compararem nove
ferramentas de trimagem, observaram o aumento das taxas de alinhamento dos reads a um
genoma de referência, mesmo com a diminuição do volume de sequências.
49
Tabela 1. Número de reads que formam as bibliotecas antes e após o controle de qualidade. Observa-se o aumento das taxas de alinhamento dos reads de E. dysenterica brutos e filtrados com o genoma de Eucalyptus grandis, mesmo com a diminuição do volume de dados de sequenciamento.
Biblioteca Nº total de reads
% de alinhamento
Nº de reads alinhados
Brutos Filtrados Brutos Filtrados Brutos Filtrados
Edy1 27.208.448 24.089.756 10,3 11,3 2.797.970 2.471.213
Edy2 11.017.486 10.888.645 13,2 14,2 1.453.388 1.543.252
Edy3 10.226.114 10.067.174 13,3 14,3 1.363.728 1.429.918
Edy4 7.174.024 7.047.220 14,3 15,4 1.023.554 1.078.507
Edy5 7.391.888 7.322.373 14,6 16,1 1.076.607 1.176.931
Total 63.017.960 59.415.168 13,8 15,0 7.715.247 7.699.821
50
A
A
B
Figura 10. V
isualização da qualidade das bases de uma biblioteca de E. dysenterica antes (A
) e após (B) o controle de qualidade. O eixo x indica a posição
das bases nos reads e o eixo y indica os valores de qualidade phred.
51
A
B
Figura 11. D
istribuição do conteúdo de bases em um
a biblioteca de E. dysenterica (biblioteca Edy1) antes (A) e após (B) o controle de qualidade. O
eixo x indica a posição das bases nos reads e o eixo y indica as proporções de conteúdo por base.
52
52
Figura 12. Distribuição de frequência dos reads de acordo com seus tamanhos (pb) antes (A) e depois (B) da eliminação de sequências de adaptadores e bases com qualidade phred inferior a 15.
4.2 ESTIMAÇÃO DO TAMANHO DOS FRAGMENTOS DE SEQUENCIAMENTO
As estimativas de tamanho dos fragmentos que formam as bibliotecas paired-
end e single-reads foram utilizadas como informação complementar acerca da qualidade dos
dados sequenciados e posteriormente utilizadas para a obtenção do draft assembly. Os
valores estimados dos fragmentos foram obtidos a partir do alinhamento das bibliotecas de
DNA de E. dysenterica ao genoma de E. grandis e foram distribuídos de acordo com sua
frequência (Figura 13). Observa-se que para as cinco bibliotecas, a maioria dos fragmentos
obtidos possuem tamanho médio de 200 bases, o que pode ser justificado pelo kit utilizado
53
utilizado para construir as bibliotecas e pelo próprio método de sequenciamento, que assim
como as demais plataformas NGS, gera fragmentos pequenos.
4.3 AVALIAÇÃO DO DRAFT ASSEMBLY
Após obtido o assembly, afim de melhorar sua qualidade e aumentar a precisão
de análises posteriores como a predição de genes, os contigs que continham menos de 500
bases foram eliminados. Além disso, a partir da análise com a ferramenta blastn, as
sequências que obtiveram hit com e-value de 1e-16, similaridade e cobertura da query de
pelo menos 80% com DNAs organelares também foram retiradas do assembly, o que
diminuiu em cerca de 37% a amostragem inicialmente obtida (Tabela 2).
Figura 13. Distribuição dos fragmentos de DNA de E. dysenterica sequenciados, de acordo com
seus tamanhos. O eixo x indica os tamanhos dos fragmentos (pb) e o eixo y indica as frequências.
Ainda com o intuito aumentar a confiança no assembly, estimou-se a cobertura
de sequenciamento dos contigs que o compõem. Foi possível observar que a para a maioria
desses contigs, a cobertura média de sequenciamento é de 10x, ou seja, cada base foi
confirmada em média 10 vezes durante o sequenciamento, o que contribui para uma melhor
acurácia na determinação das sequências de DNA que formam esses contigs. Esse resultado
54
sugere uma menor ocorrência de erros durante o a obtenção da sequência de referência
(Martins, 2013; Sims et al., 2014).
A partir da razão entre a quantidade total de bases das cinco bibliotecas e a
cobertura média de sequenciamento observada, foi obtida uma estimativa de tamanho de 442
Mb para o genoma de E. dysenterica DC., valor utilizado como referência para calcular
algumas métricas de qualidade bem como a quantidade do genoma representado pelo
assembly (Tabela 3). Considerando plantas da família Myrtaceae, observa-se uma variação
de tamanho de genomas entre gêneros e entre espécies. No gênero Eucalyptus, por exemplo,
os genomas variam de 498 Mb em E. globulus, 625 Mb em E. urophylla e 640 Mb em
Eucalyptus grandis. Já no gênero Corymbia, o tamanho estimado do genoma é de 370 Mb
para a espécie Corymbia citriodora, e em Psidium, 247 Mb foi estimado para a espécie
Psidium guajava (da Costa et al., 2008, Grattapaglia et al., 2012; Praça et al., 2009).
Para o gênero Eugenia, as estimativas variam de 238 Mb em Eugenia crenata,
245 Mb em E. uniflora e 311 Mb em E. multicostata) (da Costa et al., 2008, Grattapaglia et
al., 2012; Praça et al., 2009). A partir dessas informações, pode-se dizer que a estimativa de
tamanho obtida para o genoma de E. dysenterica DC. está dentro dos valores médios
observados para plantas da família Myrtaceae.
O assembly obtido conseguiu representar 56,7% (~250 Mb) do valor estimado
para o genoma de E. dysenterica DC. Foram obtidos 130.243 contigs, dos quais 81.826 com
mais de 1 kb e 861 com mais de 10 kb. Os contigs formados têm tamanho médio de 1.92 kb,
sendo o maior contig composto por 58.42 kb. O N50 obtido com a montagem foi de 2.658
pb (Tabela 2).
Tabela 2. Informações utilizadas para avaliar a qualidade de um draft assembly obtido para E. dysenterica.
Métrica Valor obtido
Nº inicial de contigs 206.293 Nº de contigs após retirada de DNA organelar e contigs < 500 130.243 Contigs > 1 kb 81.826 Contigs > 10 kb 861 Tamanho médio dos contigs (pb) 1.924 Maior contig (pb) 58.428 Menor contig (pb) 500 N50 (pb) 2.658 Quantidade do genoma representada pelo assembly (%) 56,7
55
4.4 CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA
4.4.1 Elementos Transponíveis
Observou-se que 35,3% do assembly (~ 88 Mb) é composto por regiões
repetitivas, sendo que os elementos transponíveis (TEs) representam a maior parte dessas
repetições (27,1%). A fração do genoma de E. dysenterica representada por TEs foi superior
à proporção identificada em Arabidopsis (18,5%) e inferior ao que foi identificado em uva
(44,5%) e eucalipto (50,1%) (Jaillon et al., 2007; Kaul et al., 2000; Myburg et al., 2014).
Foram identificados 312.127 TEs, dos quais 34.904 são comuns a outras espécies
e 277.223 foram identificados com base no banco de dados de repetições criado
exclusivamente para E. dysenterica. Como já observado em genomas de plantas, os
elementos LTR retrotransposons constituem a ordem mais frequente, abrangendo 26% dos
TEs identificados, dentre eles, os elementos Ty1-copia constituem a família mais abundante,
resultado observado também no genoma de pêssego. Já os transposons de DNA aparecem
com uma frequência de 11%, sendo que a maioria deles não foi colocado dentro de famílias
(Figura 14) (Myburg et al., 2014; Schnable et al., 2012; Verde et al., 2013).
Dentre os TEs identificados, 60% não foram agrupados em classes e destes, os
oito elementos que ocorreram de forma mais abundante foram analisados quanto a sua
estrutura e possíveis funções biológicas. A busca por genes que codificam para proteínas
dentro destes elementos feita com o blastx não identificou domínios conservados entre esses
elementos e outras espécies cujas informações encontram-se disponíveis no banco de dados
do NCBI.
Por outro lado, a busca por ORFs com a ferramenta ORFFinder, revelou que
apenas a sequência referente ao elemento mais abundante não possui tais estruturas,
sugerindo que esta possa se tratar de uma sequência não funcional do genoma (Tabela 6).
Por outro lado, a presença de ORFs nos demais elementos analisados, sugere que estas
regiões possuem potencial para codificação de genes, podendo constituir genes unicamente
pertencentes a E. dysenterica.
56
Figura 14. Frequência de elementos transponíveis identificados no genoma de E. dysenterica, de
acordo com as classes.
Tabela 3. Elementos transponíveis não classificados e que ocorreram de forma abundante no genoma de E. dysenterica.
ID do elemento Frequência absoluta Blastx ORF Finder
rnd-2_family-33 14.320 - -
rnd-2_family-117 7.470 - 2
rnd-2_family-30 6.786 - 5
rnd-2_family-222 3.942 - 1
rnd-2_family-112 3.805 - 4
rnd-2_family-27 3.661 - 1
rnd-2_family-138 3.223 - 2
rnd-4_family-191 3.041 - 1
Além dos elementos transponíveis, o RepeatMasker também identificou outras
repetições, entre elas repetições em tandem (satélites, microssatélites), DNAs de baixa
complexidade e pequenos RNAs, descritos na tabela a seguir:
57
Tabela 4. Outros grupos de elementos repetitivos identificados no genoma de E. dysenterica. Tipo de repetição Frequência
absoluta
Pequenos RNAs 1.794
DNAs Satélites 147
Repetições Simples 79.371
Baixa complexidade 18.990
TOTAL 100.302
4.4.2 Regiões Microssatélites
Foram identificadas 55.491 regiões microssatélites, das quais a maioria consiste
de mononucleotídeos (Tabela 7). A maioria das regiões contém entre dez e doze
nucleotídeos, sendo a maior região composta por 77 nucleotídeos. Foram classificadas como
microssatélites, apenas as regiões que continham pelo menos dez repetições para cada tipo
de motivo, desde mono até hexanucleotídeos. Este critério de classificação pode ser usado
como justificativa para o valor maior de regiões identificadas pelo RepeatMasker. A
divergência de valores também pode ser justificada pelo fato de que a análise feita com o
RepeatMasker não separa os microssatélites de outras repetições simples, podendo
encontrar-se incluídas na contagem minissatélites e DNAs satélites.
Tabela 5. Quantidade de regiões microssatélites identificadas no genoma de E. dysenterica de acordo com o tipo de motivo de repetição.
Tipo de motivo Frequência absoluta
Mononucleotídeos 46.701
Dinucleotídeos 8.403
Trinucleotídeos 337
Tetranucleotídeos 46
Pentanucleotídeos 2
TOTAL 55.491
O motivo de repetição T/A foi o mais frequente (44%), seguido de A/T (43%)
do dinucleotídeo GA/TC (7%). Motivos compostos por pelo menos três nucleotídeos
ocorreram com frequências inferiores a 1 % na amostragem analisada (Figura 15).
58
Figura 15. Frequência dos motivos de repetição de regiões microssatélites identificadas no genoma
de E. dysenterica.
Foram construídos 119.326 pares de primers para as regiões identificadas, dos
quais 25.803 foram eliminados por apresentarem similaridade com elementos transponíveis
conhecidos, a partir do banco de dados consultado. A eliminação dessas regiões foi feita com
a intenção de reduzir a ocorrência de alelos nulos e consequentemente de erros de
genotipagem. O alelismo nulo em regiões microssatélites é causado por mutações na região
de hibridização dos iniciadores, evitando a amplificação dos alelos afetados (Carlsson, 2008;
Pompanon, et al, 2008). Outra situação que pode gerar alelismo nulo é a amplificação de
alelos que variam de tamanho, onde alelos curtos muitas vezes amplificam de forma mais
eficiente do que aqueles com maiores dimensões, de modo que apenas o menor dos dois
alelos é detectado em um indivíduo heterozigoto (Dakin & Avise, 2004).
Erros de genotipagem causados por alelismo nulo podem ter efeitos sobre
estimativas como tamanho populacional, onde a obtenção de informações imprecisas pode
causar tomada de decisões incorretas sobre as populações estudadas (Pompanon, et al.,
2008). Além desses, mais 1.895 primers também foram eliminados por apresentarem
similaridade com outras repetições conhecidas, com o intuito de selecionar apenas primers
que estejam em regiões livres de possíveis contaminações, reunindo assim um total de
27.628 primers eliminados.
59
A partir dos 91.628 primers restantes, foram adotados critérios sugeridos pelo
próprio QDD, para seleção dos melhores primers, incluem além das regiões livres de
elementos transponíveis, a escolha de um primer por contig, com pelo menos 30 pb de
comprimento e desenhados a partir de microssatélites puros. Os primers desenhados para
regiões ricas em AT também foram descartados com o intuito de evitar a formação de
estruturas como os hairpins que podem afetar o anelamento do primer e consequentemente
a amplificação. A partir desses critérios, foi selecionada uma bateria de 6.953 primers, que
poderão ser testados quanto à sua aplicabilidade como marcadores moleculares,
complementando informações genéticas já existentes, obtidas com trabalhos que utilizaram
microssatélites e outros marcadores (Telles et al., 2001 a, b; Trindade et al, 2005; Zucchi et
al., 2004, 2005). O esquema de seleção de pode ser observado na figura a seguir.
Figura 16. Esquema de seleção de primers microssatélites desenvolvidos a partir de um draft
assembly de E. dysenterica.
4.4.3 Genes e Transcritos
Foram preditos 60.171 fragmentos gênicos putativos, com tamanho médio de 1.7
kb. A maioria dos fragmentos (84, 61%) contém até 3 kb de tamanho, sendo o maior deles
constituído por 20.5 kb e o menor constituído por 37 bases (Figura 17). O valor médio de
tamanho observado para os fragmentos gênicos preditos em E. dysenterica é inferior aos
descrito para Arabidopsis (2.4 kb) e arroz (4.5 kb), porém estes valores incluem regiões
60
UTR, informação não contida na predição de genes feita para E. dysenterica (Kaul et al.,
2000; Matsumoto et al., 2005).
A quantidade de fragmentos gênicos preditos em E. dysenterica é superior aos
valores descritos para espécies como Eucalipto (~36.376), Populus (~45.000) uva (~30.334)
e Arabidopsis (~25.000). Segundo Danton et al. (2014), isso pode ser justificado pela
fragmentação do assembly, descrito pelos pesquisadores como a principal causa da
superestimação da quantidade de genes (Kaul et al., 2000; Miburg et al., 2014; Tuskan et al.,
2006).
A variação observada no número de genes pode representar tanto a diversidade
genética resultante da evolução das famílias de genes, quanto a inferência feita a partir de
sequenciamento e montagem de artefatos. Isso ocorre porque a clivagem e separação de
genes em vários contigs dificulta a capacidade de preditores em identifica-los corretamente.
A obtenção e inclusão de informações complementares como ESTs e RNA-seq poderiam
funcionar como forma de melhorar a precisão da predição inicial (Danton et al., 2014).
Figura 17. Distribuição de frequência dos fragmentos gênicos preditos, de acordo com seus
tamanhos (pb).
De acordo com a estimativa de tamanho obtida para o genoma de E. dysenterica
neste trabalho (442 Mb), observa-se a ocorrência de 1 gene a cada 7.3 kb, mostrando uma
densidade de genes maior que a observada em espécies como eucalipto (1 gene a cada 17
kb), uva (1 gene a cada 16 kb) e Populus (1 gene a cada 10 kb) e proporcional à quantidade
de fragmentos gênicos preditos. Considerando-se os 130.243 contigs que constituem o
assembly analisado, tem-se uma média de 2.16 fragmentos gênicos por contig (Figura 18),
61
sendo que 80% dos contigs possuem apenas um fragmento de gene putativo. Este resultado
nos leva a supor que ~ 40% do genoma de E. dysenterica é composta por genes.
Figura 18. Frequência de ocorrência de fragmentos gênicos de acordo com o número de contigs
que compõe o draft assembly de E. dysenterica.
A partir dos fragmentos gênicos preditos, foram observados um total de 228.510
transcritos, com média de 3.8 transcritos por gene, onde cerca de 37% dos genes possuem
apenas um transcrito (Figura 19). A média de tamanho observada para estas estruturas foi de
2.7 kb, sendo que 50% deles são compostos por até 2.2 kb (Figura 20).
Figura 19. Distribuição de frequência de transcritos por fragmento gênico.
62
Figura 20. Distribuição dos transcritos preditos, de acordo com seus tamanhos (pb).
Também foi possível observar um total de 1.325.790 éxons, com uma média de
214 bases de tamanho, sendo 91,16% deles compostos por até 500 bases. Considerando-se
a quantidade de transcritos observados, tem-se em média 5.8 éxons para cada transcrito.
Foram observados um total de 1.160.721, íntrons com tamanho médio de 270 bases, sendo
que a 97 % dos íntrons observados possuem entre 500 e 1.000 bases. Os íntrons compostos
por mais de 1 kb ocorreram em uma frequência pequena, porém, chama a atenção a
informação de que o maior íntron identificado é composto por 4.8 kb, o que pode ser causado
pela presença de elementos transponíveis, evento observado em quase todos os íntrons
maiores que 1 kb, durante os estudos em genoma de arroz (Matsumoto et al., 2005).
63
Figura 21. Distribuição dos introns preditos, de acordo com seus tamanhos (pb).
Com o intuito de aumentar a confiança na predição, os transcritos de E. grandis
foram alinhados ao um banco de dados criados para o assembly de E. dysenterica, através
da ferramenta blastn. O resultado mostrou que 86,7% dos transcritos de E. grandis estão no
genoma de E. dysenterica, sugerindo que esses transcritos são referentes a genes homólogos
entre as espécies.
A anotação com o uso do Blast2go categorizou os 228.510 transcritos preditos
em três domínios (Figuras 22, 23 e 24): Componente Celular (CC), Função molecular (FM)
e Processo Biológico (PB). Categorias GO pertencentes ao domínio CC estão envolvidas
com partes da célula e do seu meio extracelular. As atividades elementais de um produto
gênico a nível molecular são agrupadas no domínio FM. Finalmente, o domínio PB agrupa
categorias GO de eventos moleculares com início e fim bem definidos relativos ao
funcionamento das células, tecidos e órgãos e organismos.
Considerando a anotação GO para CC, pode-se verificar que a maior parte dos
transcritos foram anotados como pertencentes às categorias ontológicas relacionadas com a
estrutura da célula (GO: The Cell 30.946 transcritos). Estas classes incluem todos os
componentes intracelulares excetuando os componentes da membrana plasmática. Seguindo
a ordem decrescente da anotação para CC, a segunda anotação mais frequente se deu para o
termo GO Organelle (21.413 transcritos) seguida por Membrane proteins (GO: Membrane
= 17.811).
64
Cellular Process e Single Organism Process foram as anotações GO mais
frequentes para PB (42.202 e 35.954, respectivamente), processos relacionados às classes
GO Reproduction, Imune System Process, Growth foram anotados em menor escala (567,
455, 978, respectivamente). Já para o domínio FM apresentou predominância de anotações
para as classes GO Catalytic Activity e Binding (47.472 e 36.723, respectivamente).
Figura 22. Classificação GO obtida para o domínio Componente Celular, na análise dos 228.510
transcritos com o uso do programa Blast2go.
65
Figura 23. Classificação GO obtida para o domínio Processo Biológico, na análise dos 228.510
transcritos com o uso do programa Blast2go.
Figura 24. Classificação GO obtida para o domínio Função Molecular, na análise dos 228.510
transcritos com o uso do programa Blast2go.
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
i. A abordagem utilizada neste trabalho mostrou-se eficiente para a amostragem e
caracterização do genoma de E. dysenterica. A montagem obtida apresenta-se
fragmentada em uma grande quantidade de contigs, porém, ainda assim foi possível
recuperar 56,7 % do tamanho estimado para o genoma da espécie. Dessa forma,
recomenda-se para trabalhos futuros o uso de um maior conjunto de sequências
genômicas, além do sequenciamento de diferentes tipos de bibliotecas (mate-pair,
PacBio, etc) com o objetivo de aumentar a contiguidade nas sequências montadas;
ii. As etapas de controle de qualidade das sequências e do assembly mostraram efeitos
positivos, constituindo um importante passo para melhorar a qualidade dos dados e
consequentemente dos resultados;
iii. O genoma de cagaiteira, apresenta uma grande quantidade de elementos repetitivos
(~35% do assembly), o que corrobora as informações descritas na literatura para
genomas de plantas;
iv. Os elementos transponíveis constituem a maior parte das repetições identificadas,
sendo que a maioria desses elementos (60%) não foram classificados neste estudo e
constituem matéria prima para estudos posteriores acerca da estrutura e função desses
elementos no genoma de E. dysenterica;
v. As ferramentas computacionais utilizadas permitiram a identificação grande
quantidade de regiões microssatélites (55.491) bem como a obtenção de primers que
não estão em contexto de elementos transponíveis, o que pode otimizar sua
amplificação. As regiões microssatélites identificadas podem utilizados como
marcadores moleculares, permitindo a obtenção de informações genéticas ainda
desconhecidas;
vi. Este trabalho constitui o primeiro rascunho de genoma de uma espécie nativa do
Cerrado e o segundo para a família Myrtaceae. Sendo assim, os resultados obtidos
sugerem que o genoma de cagaiteira é um candidato a
ser futuramente uma sequência modelo para essa família.
6 REFERÊNCIAS
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