minicurso técnicas de sequenciamento e suas aplicações
TRANSCRIPT
TÉCNICAS DE SEQUENCIAM
ENTO E APLICAÇÕES
Lucélia Silva BarrosoBacharel em Fisioterapia – FAP
Laboratório de Microbiologia – HC – UFMGMembro do LINC – INCT MM – FM - UFMG
Ana Paula Mendes SilvaBacharel em Ciências Biológicas – UFV
Mestre em Genética – USPDoutoranda em Medicina Molecular – UFMG
• Definir o que é sequenciamento;
• Quais as aplicações dessa técnica;
• Quais as Plataformas disponíveis;• Diferenças metodológicas,• Vantagens e desvantagens.
• Perspectivas futuras
Objetivos do Minicurso
DNA
mRNA
Proteínas
Variação Normal ou Patológica
DOGMA CENTRAL
Cromatina
mRNA ncRNA
Proteínas
Variação Normal ou PatológicaAmbiente
Variação em seqüência Variação estrutural Variação química na cromatina
Epigenômica
Genômica
Transcritômica
Proteômica
DOGMA CENTRAL
• Processo de determinação da ordem precisa de nucleotídeos na molécula de DNA, RNA e outras moléculas;
• Determina a ordem das bases nitrogenadas: Adenina, Guanina, Citosina, Timina e Uracila,
• Visa o entendimento do dogma central e a previsão das moléculas possivelmente formadas a partir de determinada sequência.
Sequenciamento de DNA
Objetivos para sequenciamento genômico
Exemplo
Sequenciamento de novo
Sequenciamento genômico
Sequenciamento de >1000 genomas de influenza
DNA de org. extinto Homo neanderthalenses
Metagenômica Intestino humano
Resequencia-mento
Genomas completos Indivíduos humanos
Regiões genômicas Detecção de rearranjos ou regiões associados à doenças
Mutações somáticas Em câncer
Transcriptoma mRNA Definir regulação da transcrição
Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)
RNAs não codificadores Identificar e quantificar microRNAs
Epigenética Padrão de Metilação Avaliar padrão de metilação em câncer
ESTUDO DE CASO 1
Esse casal de albinos poderia ter um filho com
melanina (normal)?
X1 X2
S1 S2 S3
PAI MÃE
ESTUDO DE CASO 2
Megaureter Família Modelo: Pai saudável, Mãe
saudável, filhos gêmeos monozigóticos (um saudável e um doente)
Hipótese -> Pequenas modificações no(s) gene(s) (SNPs) que possam caracterizar o fenótipo da doença.
Hipótese -> Pequenas modificações no(s) gene(s) (SNPs) que possam caracterizar o fenótipo da doença.
ESTUDO DE CASO 3
1985 Inglaterra Numa pequena cidade localizada entre
montanhas estava acontecendo uma série de estupros e assassinatos de mulheres
Qual análise inicial poderia ser feita?
- Coleta e análise do DNA do esperma - Comparação entre os DNAs dos espermas de
cada assassinato
• As autoridades locais simularam uma doação de sangue -> identificar o agressor.
Todos os habitantes doaram, e apenas um deles possuía o DNA igual ao do estuprador.
Estupro e assassinato
Amabis & Martho, 1995<==?
PLATAFORMAS
Genetic Analyser 3130
PCR
https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo
https://www.youtube.com/watch?v=kvQWKcMdyS4
Gene TBX3
Gene LDB3
MÉTODO SANGER
Prêmio Nobel 1980
Amplificação do fragmento alvo por PCR
Purificação do produto
Reação de Sequenciamento
Purificação do produto
MÉTODO DE SANGER
Obtenção da sequência do fragmento desejado
MÉTODO DE SANGER
PCR
Sequenciamento
MÉTODO SANGER
MÉTODO SANGER-MANUAL-
• DNA molde + dNTPs e
ddNTPs + DNApolimerase +
Primer
• Amplificação - PCR
• Eletroforese em gel de
acrilamida
• Os fragmentos migram
distâncias proporcionais ao
seu tamanho.http://www.ib.usp.br/microgene/index.php?pagina=atividades&idcategoria=4&categoria=Atividades%20on-line&tabela=atividades
Reads longos (~900bps)
- Baixo Rendimento - Alto Custo
MÉTODO SANGER-MANUAL-
MÉTODO SANGER-AUTOMÁTICO-
MÉTODO SANGER-AUTOMÁTICO-
http://www.ib.usp.br/microgene/index.php?pagina=atividades&idcategoria=4&categoria=Atividades%20on-line&tabela=atividades
Norm
aliz
ed F
luore
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Em
issi
on
(Exc
itati
on a
t 48
8 n
m)
Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
500 550 600 650 700
Wavelength (nm)
MÉTODO SANGER-AUTOMÁTICO-
MÉTODO SANGER-AUTOMÁTICO-
MÉTODO SANGER-AUTOMÁTICO-
MÉTODO SANGER-AUTOMÁTICO-
Genomas sequenciados (outubro/2014)Eucariotos: 21 completes, 1701 em progresso
Procariotos: 3227completo, 25252 em progresso
Virus: 4127 completes, 94 em progresso
Organellar: 5039 completos
195
NATURE Vol 464 1 April 2010
2001: Human Genome Project2.7G$, 11 years
2001: Celera100M$, 3 years
2007: 4541M$, 3 months
2008: ABI SOLiD60K$, 2 weeks
2009: Illumina, Helicos40-50K$
2010: 5K$, a few days?
2012: 1000$, <24 hrs?
Next Gen X Sanger
2ª Geração de Sequenciamento • 454 - Pirosequenciamento (Roche)
• •Genome Analyser - Seqüenciamento por término reversível (Illumina-Solexa)
• SOLiD - Seqüenciamento por ligação de sondas (Applied Biosystems - Life)
• Comercializada em 2004
Pirosequenciamento – 454/Roche
• Etapas:- Ligação de adaptadores
- PCR em emulsão
- Seqüenciamento
Pirosequenciamento – 454/Roche
*dNTP – só um deles
Pirosequenciamento – 454/Roche
Resultado
Pirosequenciamento – 454/Roche
HiSeq 2000Illumina (Solexa)
Produz acima de 600Gb por corrida em 13 dias. Custo de resequenciar um genoma humano: UNC-CH Genome Analysis Facilit - (30x cobertura) aproximadamente $6,000
MiSeq Sistema de
pequena capacidade,
Estudo metagenômico,
PE 2x250cycles in 27hours.
https://www.youtube.com/watch?v=l99aKKHcxC4
https://www.youtube.com/watch?v=1uZtCMY-yEw
• Data de comercialização = 2007
• Etapas:1)Ligação de adaptadores2)PCR em emulsão3)Seqüenciamento
Sequenciamento por ligação de sondas (SOLiD)
• SOLiD = Sequencing by Oligo Ligation and Detection
https://www.youtube.com/watch?v=nlvyF8bFDwM
Sequenciamento por ligação de sondas (SOLiD)
Ion Torrent (life technologies)Tamanho do read -
200-250bp (200cycles)
Não realiza leitura Paired End
Sequenciamento mais rápido do mercado.Recommendações: Amplicons
(produtos de PCR), Genomas de
tamanho pequeno a médio.
4ª Geração de Sequenciamento
Genoma humano em 1 dia
Custo de reagents por corrida - $1000
Taxa de erro em torno de 1.2%
RNAseq, ChIPseq Ion Proton Chip I –
10 Gb Ion Proton Chip II –
100 Gb
Ion Proton System (life technologies)
Plataform
a
Tamanho do
read
Tempo de
corrida
Gb/corrid
a
Vantagens
Desvantagens
SAGE 900 pb 1 – 2 dias
0.02 Read longo
Alta taxa de erro
454 500 pb 8 horas
0.04 Read longo
Alta taxa de erro
HiSeq
75-100 2 dias 600 Sequenciamento profundo/custo
Reads pequenos
MiSeq
75 1 dia 2 Sequenciamento profundo/custo
Reads pequenos
Solid 85 8 dias 150 Baixa taxa de erro
Reads pequenosCorrida longa
Ion Torrent
200 2 horas
100 Corrida rápida
Novo*
Ion Proton
200 2horas
100 Corrida rápida
Novo*
“ Só os que se arriscam a
ir longe demais são
capazes de descobrir o
quão longe se pode ir. ”
T. S.
Eliot