métodos cromatográficos e espectrométricos usados … · 1 métodos cromatográficos e...

1

Métodos cromatográficos e espectrométricos usados em quimiotaxonomia, prospecção de metabólitos

bioativos e identificação rápida de fungos

Lucas M. de Abreu, DFP, UFLA

Setembro, 2011

V Simpósio Brasileiro de Microbiologia Aplicada

?

O

OH

O

O H

O H

O H

2

MetabMetabóólitos primlitos primáários e metabrios e metabóólitos secundlitos secundáários...rios...

substâncias com distribuição

generalizadasubstâncias com distribuição restrita

OH O

O

O

OO

O

O

O

O H

O

Dewick, 2001

3

MetabMetabóólitos secundlitos secundáários produzidos por fungos rios produzidos por fungos

100 mil espécies de fungos descritas

25 mil metabólitos secundários descritos (2005)

10 mil spp. investigadas quanto ao metabolismo secundário

funções

competição, proteção

toxinas, antibióticos

controle metabolismo (sob certas condições)

comunicação

nenhuma ?

diversidade - aproximadamente...

Bérdy, 2005; Dewick, 2001

4

usos - fármacos e seus precursores

O

N

O

OOH

S

N

H

H

O

O H

O

OSN

tiamulina - antibiótico de uso veterinário caspofungina - antifúngico

griseofulvina - antifúngico

penicilina G - antibiótico

MetabMetabóólitos secundlitos secundáários produzidos por fungos rios produzidos por fungos

Misiek & Hoffmeister, 2007

5

N

O

N

ON

O

N

ONH O

NH

ON

ONH

O

N

O

N

O

NH

O

OH

H

ciclosporina A - imunossupressor

ácido micofenólico - imunossupressor

lovastatina - inibidor da síntese do colesterol

ergotamina - vasoconstritor (enxaqueca)

usos - fármacos e seus precursores

MetabMetabóólitos secundlitos secundáários produzidos por fungos rios produzidos por fungos

Misiek & Hoffmeister, 2007

6

perigos - micotoxinas

aflatoxina B1

toxina T2

ocratoxina A

patulina

citrinina

fumonisina B1

MetabMetabóólitos secundlitos secundáários produzidos por fungos rios produzidos por fungos

Bennett & Klich, 2003

7

ProspecProspecçção quão quíímica de fungosmica de fungos

em geral desvinculada de um trabalho taxonômico

fontes de diversidade

solo (tradicional), plantas (endófitos e patógenos)

e ambiente marinho

escolha dos isolados aleatória ou baseada em resultados de bioensaios

frequente ocorrência de redundâncias

taxonômica e química

Larsen et al., 2005; Monaghan et al., 1995

8

Fungos toxigênicos Fungos toxigênicos

métodos analíticos para detecção de toxinas em alimentos e fungos

contaminantes

taxonomia é importante: conhecendo-se as espécies e seus metabólitos

tem-se idéia do risco associado

Penicillium roqueforti Frisvad & Samson, 2004

Maturação de queijos - sem riscos

Contaminação de forragens e grãos - toxina PR

Toxina PRToxina PR

Nielsen et al., 2005

9

EstratEstratéégiagia

obtenção de perfis de metabólitos produzidos

comparações entre perfis; uso de bancos de dados

caracterização parcial das substâncias presentes nos extratos

Prospecção química, análise toxicológica e quimiotaxonomia

Larsen et al., 2005; Smedsgaaard & Nielsen, 2005

avaliação dos metabólitos secundários produzidos por fungos cultivados em pequena escala

métodos analíticos - CLAE, CLAE-EM

RT, espectro UV, espectro de massas

10

Primeira etapa Primeira etapa -- obtenobtençção de extratosão de extratos

cultivo dos isolados em meio(s) apropriado(s)

Penicillium brasilianum

11

ObtenObtençção de extratosão de extratos

extração em micro-escala

Smedsgaard, 1997; Nielsen, 2009

12

Cromatografia lCromatografia lííquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos quida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE(CLAE--DAD, HPLC) DAD, HPLC)

Nielsen, 2009

RT = 9,5 minRT = 10,8 minRT = 5,5 minRT = 6,9 min

13

Fel 355

CLAECLAE--DADDAD

Alternariol

RT = 8,7 min RT = 11,5 min

14

CLAECLAE--DAD acoplada DAD acoplada àà espectrometria de massas (EM)espectrometria de massas (EM)

metabólitos separados por CLAE são analisados por EM

EM - íons são separados de acordo com sua razão massa / carga (m/z)

espectrômetro de massas

Nielsen & Smedsgaard, 2003

15

CLAECLAE--DADDAD--EMEM

espectrômetros de alta resolução - determinação de fórmulas moleculares

bancos de dados - identificação de metabólitos, desreplicação

Perfil de metabólitos secundários de Aspergillus fumigatus obtido por CLAE-EM. Adaptado de Frisvad et al., 2009

16

Uso de perfis de metabUso de perfis de metabóólitos na desreplicalitos na desreplicaçção e descoberta de substânciasão e descoberta de substâncias

Triagem inteligente

obtenção de perfis de metabólitos em pequena escala e definição de

quimiotipos

CLAE-DAD, CLAE-DAD-EM

seleção de representantes de cada quimiotipo e desreplicação

espectros de massa, bancos de dados

condução de bioensaios

extratos brutos ou (micro) fracionados

cultivo em grande escala, purificação e elucidação estrutural

metabólitos alvo

Larsen et al., 2005; Smedsgaard & Nielsen, 2005

17

novos análogos da mevastatina produzidos por Penicillium solitum

MevastatinaMevastatinaSolistatinaSolistatina Solistatinol

Espectros de absorção no UV dos metabólitos mevastatina, solistatina e solistatinol. Adaptado de Sørensen et al., 1999; Larsen et al., 2007

Triagem inteligente

18

Alantripinona

N

N

O

NH

O

NH

O

Alantripinona

N

N

O

NH

O

NH

O

descoberta de análogos de metabólitos conhecidos - programa X-hitting

avalia arquivos gerados por CLAE-DAD em busca de espectros de

absorção no UV semelhantes ao de uma substância alvo

Lapatina A

NH

N

N

O

NHN

O

H

O

Lapatina A

NH

N

N

O

NHN

O

H

O

Lapatina BLapatina B

Comparação entre os espectros de absorção no UV da alantripinona (azul) com aqueles da lapatina A (esquerda) e lapatina B (direita). Adaptado de Hansen et al., 2005

Triagem inteligente

19

Fracionamento de extratos por CLAE seguido de bioensaiosFracionamento de extratos por CLAE seguido de bioensaios

metabólitos eluídos são distribuídos em uma placa de microtitulação

o conteúdo dos poços é submetido a bioensaios (micro-escala)

os resultados de bioatividade são comparados com os cromatográficos

20

[M+H]+

[M+NH4]+

Fórmula molecular:

C29H35NO8

Escoparasina A Fenocalasina B

Microfracionamento Microfracionamento

metabólitos citotóxicos produzidos por Libertella sp.

21Perfil por CLAE, atividade antibacteriana e citotóxica do extrato do fungo Gliocladium sp. Adaptado de Lang et al., 2006

4-ceto-clonostaquidiol

O O

O

O

OOH

4-ceto-clonostaquidiol

O O

O

O

OOH

Microfracionamento Microfracionamento

metabólitos bioativos produzidos por Gliocladium sp.

22

objetivo

uso de metabólitos secundários como caracteres (marcadores) para

caracterização e identificação de fungos

hipótese

quimioconsistência - espécies diferentes produzem perfis de

metabólitos secundários distintos

Quimiotaxonomia Quimiotaxonomia

Frisvad et al. 2008

gêneros mais estudados

Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Alternaria,Trichoderma,

Stachybotrys, Xylaria, Hypoxylon

23Samson et al. 2004

abordagem descritiva - marcadores qu�micos para caracteriza��o de

esp�cies definidas; indica��o de poss�veis novos t�xons

P. roqueforti – produ��o de queijos; contamina��o de p�es, silagem e gr�os

Produz toxina PR, �cido micofen�lico, isofumigaclavina A e B, roquefortina C

P.carneum – contamina��o de carne, p�es, cerveja, queijos e silagem

P. paneum – contamina��o de

p�es, gr�os e silagem

Produz patulina, penitrem A, �cido micofen�lico, isofumigaclavina A e B, roquefortina C

Produz patulina, botriodiplodina, roquefortina C

Quimiotaxonomia Quimiotaxonomia

24

taxonomia numérica - classificação multivariada de isolados com base em

perfis de metabólitos

matrizes binárias isolados X metabólitos (RI) - índices de similaridades667 681 688 689 696 697 699 702 703 707 712 718 721 733 740 744 745

CML871_Coffee_MG 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0CML1316_Coffee_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0CML1501_Mango_MG 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0CML1506_Mango_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0CML1527_Cacao_BA 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0CML1928_Phoradendron_MG0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0CML1930_Tapirira_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0CML1932_Tapirira_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0CML1933_Tapirira_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0CML1500_Mango_MG 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0CML1502_Mango_MG 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1CML1503_Mango_MG 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0CML1507_Mango_MG 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1CML1931_Tapirira_MG 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0CML1934_Phoradendron_MG0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0CML1936_Phoradendron_MG0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1CML1481_Mango_MG 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0CML1520_Cacao_AM 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0CML1529_Cacao_BA 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0CML1530_Cacao_BA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0CML1939_Phoradendron_MG0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0CML1929_Tapirira_MG 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

Quimiotaxonomia Quimiotaxonomia

25

taxonomia numérica

Overy et al. 2005

Quimiotaxonomia Quimiotaxonomia

26

quimiotipos e filogenia

Quimiotaxonomia Quimiotaxonomia

27

Penicillium polonicum

IdentificaIdentificaçção rão ráápida (e taxonomia) de fungospida (e taxonomia) de fungos

ESI - ionização de um grande número de metabólitos; de perfis de massa

Larsen et al., 2005

infusão direta do extrato bruto no espectrômetro de massas ( id-EM)

28

idid--EMEMId-EM Filogenia

Larsen et al., 2005

29

AnAnáálise de perfis de protelise de perfis de proteíínas por EMnas por EM

extratos brutos, micélio ou esporos analisados diretamente por EM

ionização de proteínas - MALDI

Glish & Vachet, 2009; Santos et al., 2009

30

AnAnáálise de perfis de protelise de perfis de proteíínas por EMnas por EM

analisador de massas por tempo de vôo - TOF

Glish & Vachet, 2009; Santos et al., 2009

31

AnAn��lise de perfis de protelise de perfis de prote��nas por EM nas por EM –– MALDIMALDI--TOFTOF

A. candidus

A. chevalieri

A. flavus

A. fumigatus

A. sydowii

A. terreus

A. ustus

A. versicolor

Hettick et al. 2008a

32

AnAn��lise de perfis de protelise de perfis de prote��nas por EM nas por EM –– MALDIMALDI--TOFTOF

A - A. candidus

B - A. chevalieri

C - A. flavus

D - A. fumigatus

E - A. nidulans

F - A. niger

G - A. parasiticus

H - A. repens

I - A. sydowii

J - A. terreus

K - A. ustus

L - A. versicolor

Hettick et al. 2008a

33

AnAn��lise de perfis de protelise de perfis de prote��nas por EM nas por EM –– MALDIMALDI--TOFTOF

P. aurantiogriseum

P. brevicompactum

P. citrinum

P. chrysogenum

P. purpurogenum

P. roqueforti

P. simplicissimum

P. variabile

Hettick et al. 2008b

34

AnAn��lise de perfis de protelise de perfis de prote��nas por EM nas por EM –– MALDIMALDI--TOFTOF

A - P. aurantiogriseum

B - P. brevicompactum

C - P. citrinum

D - P. chrysogenum

E - P. expansum

F - P. fellutanum

G - P. jensenii

H - P. melinii

I - P. purpurogenum

J - P. roqueforti

K - P. simplicissimum

L - P. variabile

Hettick et al. 2008b

35

contato:

lmabreu@gmail.com

FIM!