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Profa. Renata Faier Calegario
Profº Bruno Portela Brasileiro
Marcadores Moleculares
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁSETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO
AF 060- Biotecnologia Vegetal
Marcadores genéticos
• Marcador: função de identificar ou etiquetar;
• Marcadores genéticos: marcar alelos cuja expressão seja de difícil identificação;
• Selecionar o alelo de interesse de forma indireta, por meio do marcador;
Marcadores genéticos
• Deve ser herdável e de fácil avaliação;
• Deve estar intimamente ligado ao alelo que deseja-se selecionar;
• Estudos de divergência genética, teste de paternidade, seleção etc.
• Marcadores genéticos:– Morfológicos;
– Moleculares.
Marcadores moleculares
• Década de 70: engenharia genética (biologia molecular);
• Marcadores moleculares:
– Proteínas (produtos diretos dos alelos);
– DNA (seqüências de DNA situadas próximas aos genes que queremos marcar).
Características que permitem a distinção de indivíduos
geneticamente diferentes
Marcadores
(BORÉM, 1997).
INTRODUÇÃO
Morfológicas, Bioquímicas ou Moleculares
Marcadores Genéticos
Melhoramento Genética
mendeliana
Genética de
populações
Genética
molecular Organização do
genoma
Sequenciamento
Transferência
gênica
Aplicações: diversas áreas do conhecimento
Constituição genética de um organismo
=> o conjunto de genes
Fenótipo
Características visíveis de um indivíduo
Sofre influência:
• Genótipo
• Fatores ambientais
Genótipo
ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS
Diplóide: Constituído por duas cópias de cada cromossomo
ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS
DiplóideHaplóide
Alelo: Genes que ocupam o mesmo locus em cromossomos homólogos
Local ocupado pelo
gene no cromossomo
Haplóide: Constituído por uma cópia de cada cromossomo
Homozigotos: Célula diplóide com alelos idênticos de um gene
em ambos os cromossomos homólogos
Heterozigotos: Célula diplóide com alelos diferentes de um gene
em ambos os cromossomos homólogos
ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS
Gene Recessivo (a)
• Só manifesta o fenótipo
quando em homozigose (aa)
• Presente em dose dupla
(dois alelos iguais)
Gene Dominante (A)
• Manifesta o mesmo
fenótipo em homozigose
(AA) e heterozigose (Aa)
DOMINÂNCIA
A1A1 A1A2 A2A2
Mesmo padrão de bandas: Homozigose e Heterozigose
MARCADORES “ DOMINANTES”
=> exclusão de um dos alelos na expressão gênica do heterozigoto
2 alelos recessivos no mesmo
loco: Ausência de banda – só
amplifica locus com alelos
dominantes
A1= alelo dominante
Presença de bandas
A1A1 A1A2 A2A2
Padrão de bandas diferentes: Homozigose e Heterozigose
MARCADORES “ CO-DOMINANTES”
=> Expressão de ambos os alelos no heterozigoto
Genes no mesmo
locus
Monomorfismo e Polimorfismo
✓ Marcadores MorfológicosCaracterísticas fenotípicas do organismo
Ex. Nanismo, deficiência de clorofila, cor de pétala
✓ Marcadores BioquímicosPresença ou ausência de compostos
Ex. isoenzimas e proteínas
✓ Marcadores Moleculares Presença ou ausência de sequências de DNA
Ex. alteração em bases nitrogenadas - Várias técnicas
TIPOS DE MARCADORES
CONCEITO DE MARCADOR dominante e co-dominante
Dominante Co-Dominante
Tipos de Marcadores
✓Reprodutibilidade
✓Amplamente distribuído através do genoma
✓Poder de discriminação
✓Ausência de influências ambientais
✓Barato
✓Fácil de mensurar
CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DE UM MARCADOR
✓ Marcadores genéticos que exploram a variabilidade do DNA
✓ Características polimórficas herdáveis que refletem
diferenças na sequência de DNA ao nível de nucleotídeos
MARCADORES MOLECULARES
Polimorfismo detectado na sequência de DNA => Variabilidade
Qualquer fenótipo molecular proveniente de um gene
expresso ou de um segmento específico de DNA
APLICAÇÕES
✓ Diversidade genética de organismos
✓Proteção de cultivares - demonstrar que a cultivar é diferente de
qualquer outra variedade da mesma espécie
✓ Análise da pureza genética de semente
✓Mapeamento de genes e características (associação do marcador
com os genes de interesse)
✓Seleção de genitores
✓ Retrocruzamento assistido...
MARCADORES MOLECULARES
• Não sofre influência do ambiente
• Neutros em relação a efeitos fenotípicos
• N° ilimitado de marcadores e de polimorfismo
• Identificação de genótipos em estágios iniciais da planta
• Acelera o processo de seleção e recombinação desejáveis
Vantagens
• Necessidade de técnicas e equipamentos mais complexos
Desvantagens
Enzima de restriçãoEnzima de restriçãoPCR
TermocicladorPCR
TermocicladorEletroforese
TÉCNICAS E FERRAMENTAS DE BIOMOL
Levou à descrição de várias classes de marcadores moleculares
EletroforesePCR
Enzimas de Restrição
DNA ligase
Técnicas para obtenção de padrão polimórfico de DNA
• Marcadores baseados em PCR
– PCR (Reação da polimerase em cadeia).
– RAPD
– ISSR
– Microssatélites
– Minissatélites
– AFLP, etc.
PCR - REPLICAÇÃO IN VITRO
Saiki, RK, Gelfand, DH, Stoffel, S, Scharf, SJ,
Higuchi, R, Horn, GT, Mullis, KB & Erlich, HA.
1988. Primer-direct enzymatic amplification of
DNA with a thermostable DNA polymerase.
Science. 239: 478-494.
•NOBEL
PCR - REPLICAÇÃO IN VITRO
•Promove a síntese específica de certos
segmentos do DNA genômico;
•Necessidade de síntese de primers;
•Cada molécula produz duas moléculas filhas
idênticas a cada ciclo (2n).
PCR
- Pequena quantidade de DNA genômico (10ng);
- Solução tampão contendo magnésio;
- Dois primers específicos;
- dATP, dTTP, dCTP, dGTP;
- DNA polimerase.
DNA Polimerase
• DNA polimerase comum (E. coli);
• Taq polimerase (bactérias termofílicas –Thermus aquaticus);
• Possibilidade de automação do processo;
• Surgimento de várias metodologias para detectar marcadores moleculares do DNA.
PCR - Termociclador
• 940 separação das fitas de DNA (desnaturação);
• 550 os primers pareiam aos sítios que flanqueiam a
região a ser amplificada;
• 720 a enzima DNA polimerase estende o primer, ou
seja, adiciona nucleotídeos ao terminal 3’-OH dos primers;
• Depois de 40 ciclos (1 a 4 h);
• Região amplificada pode ser visualizada em gel de eletroforese.
Técnica da PCR
Consiste na síntese in vitro de fragmentos de DNA;
Reagentes e moléculas utilizadas:
- DNA a ser amplificado;
- Primers;
- DNTps;
- Taq DNA polimerase;
- Co-fatores necessários para a síntese;
Técnica da PCR
Termociclador;
Ciclos ( 40);
Eletroforese;
Luz U.V.;
TERMOCICLADOR
Polimerização de DNA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5’
5’3’
3’
Polimerização de DNA
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
|||||||
5’3’
ATGCTTC5’ 3’
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
TTT T
T T
T
T
T
T
T
G
G
GG
G
G
G
G
G
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
Polimerização de DNA
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
|||||||||
5’3’
ATGCTTC5’ 3’
A
A
A
A
AA
A
A
A
A
TTT T
T T
T
T
T
TT
G
G
GG
G
G
G
G
G
C
C
C
CC
C
C
C
C
C
C
Polimerização de DNA
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
||||||||||
5’3’
ATGCTTCTG5’ 3’
A
A
A
A
A A
A
A
A
A
TT
T
T
T T
T
T
T
T
T
G
G
GG
G
G
G
G
G
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
Polimerização de DNA
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
|||||||||||||||||
5’3’
ATGCTTCTGGCAGATCT5’ 3’
A
A
A
A
AA
A
A
A A
T TT
T
TT T
T
T
TT GG
GG G
G
G
G G
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
Polimerização de DNA
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
|||||||||||||||||
5’3’
ATGCTTCTGGCAGATCT5’ 3’
A
A
A
A
AA
AA
A
A
T
TT
T
TT
T
T
T
TT
G
G
GG
G G
G
G
G
C
C
C
CC
CC
C
C
C
C
Polimerização de DNA
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
||||||||||||||||||||||||
5’3’
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA5’ 3’
A
A
A
A
A
A
AA
A
A
TT
T
TT
T
TT
TT
T
G
GG
G
GG
G
GG
CCC
CC
C
C
CC
C
C
Polimerização de DNA
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
||||||||||||||||||||||||
5’3’
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT5’ 3’
A
A
A AA
A
AA
A
A
TT
T
T
TT
TT
T T
TG
GG
G
GG
G
GG
C
C
CC
C
C
C
C
C
C
C
Polimerização de DNA
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
||||||||||||||||||||||||||||||
5’3’
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG5’ 3’
A
A
AA
A
A
AA
A
AT
TT
TT
TT
T
TT
T
G
GG
G
GG
G
GG
C
CC
C
C
C
C
C
C
C
C
Polimerização de DNA
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
||||||||||||||||||||||||||||||
5’3’
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT5’ 3’
A
A
A
A
A
A
AA
A
A
T
TT
T
T
TT
T
T
TT
G
G
G
G
GG
G
GG
C
C CC
C
CC
CC
C
C
Polimerização de DNA
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
||||||||||||||||||||||||||||||
5’3’
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT5’ 3’
A A
A
A
AA
AA
A
A
TT
T
T
T
TT T
T
T T
G
G
G
G
G
G
G
G
G C CCCC
C C
CC
C
C
Polimerização de DNA
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5’3’
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT5’ 3’
A A
A
A
A
A AA
A
A
T
TT
T
T
T T
TT
T T
G
G
G
G
GG
G
GG
C CCC C
CC
C C
C
C
Polimerização de DNA
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5’3’
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT5’ 3’
AA
A
A
A
AAA
A
A
T
TT
T
T
TT
TT
TT
G
G
G
G
GG
G
GG
CC CCC
CC
CC
C
C
AFLP
Restrição e
Hibridização de
sequências DNA
PCR
PCR + restrição...
CLASSES DE MARCADORES MOLECULARES
RFLP
RAPD, Microssatélites
=> Varia de acordo com a técnica usada para identifica-lo
A partir 1980...
Marcadores isoenzimáticos
• Marcadores de proteína mais utilizados são representados pelas isoenzimas (esterase, fosfatase, peroxidase etc);
• Como são produtos diretos dos alelos, basta identificá-los para selecionarmos os indivíduos com o fenótipo desejado;
• Possuem reduzida variabilidade (polimorfismos);
Marcadores isoenzimáticos
• Os alelos responsáveis pelas proteínas facilmente identificáveis não ocorrem em número suficiente para marcar um grande número de alelos de interesse.
• Ex. Em cevada– Isoenzima esterase para selecionar plantas
resistentes ao vírus do mosaico amarelo.
• Vantagem: menores custos.
Restriction Fragment Length Polymorphism
Polimorfirmo no tamanho do fragmentos de restrição
✓ Utiliza o DNA genômico digerido com enzima de restrição
✓ Examina diferenças no tamanho dos fragmentos de DNA
✓ Polimorfismo: é resultado de mutação pontual, inserção, deleção
✓ Requer conhecimento sequência
RFLP
RFLP
Southern
Blot
Hibridização
Planta, fungo, organismos...
1 . DNA tratado com enzimas de restrição = Gera fragmentos pequenos
2. Separação dos fragmentos: Eletroforese (gel agarose)
3. Transferência DNA para a membrana e Hibridização com sonda
4. Visualização dos fragmentos na membrana
▪ sondas marcadas (32P) ou Fluorescência
5. Análise dos resultados
▪ presença/ausência de bandas
▪ diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas
A escolha de sonda/enzima de restrição = direcionada
RFLP - METODOLOGIA
Southern blot
ANÁLISE DOS RESULTADOS
RFLP: Identificação de Fitoplasma em Tomate
Fonte: Mello et al., 2007.
Fragmentos que hibridizarem com a
sonda
+ + + + + +T T T T T T
+ Grupo 16 SrIII
118
194234
271 281
603
872 1078 1353
pb
310
Homozigotos p/ os alelos A1: 3, 5, 6, 7, 8, 9
Homozigotos p/ os alelos A2: 1, 2,4
Eletroforese do DNA cortado
com enzima de restrição
Gel revelado com EtBr => UV
Visualização de arraste contínuo
de fragmentos de DNA
Brássica: diferentes padrões de bandas em F2 = diferença genética
=> representam um loco RFLP = pode ser usado como marcador genético
✓ Trabalhoso
✓ Caro
✓ Uso de sondas radioativas
RFLP
✓ Reprodutibilidade
✓ Marcadores co-dominantes
✓ Simples
Vantagens
Desvantagens
Random Amplification of Polymorphic DNA
Fragmentos de DNA amplificados por PCR
✓ Método mais rápido para detecção de polimorfismos
✓ DNA genômico amplificado por PCR
✓ Uso de um único primer aleatório (8-10 bases): função de R e F
✓ Não requer conhecimento da sequência
✓ Marcador dominante
RAPD
1 . DNA é amplificado via PCR com primer aleatório
=> Gera fragmentos pequenos
2. Separação dos fragmentos por eletroforese
5. Análise dos resultados
▪ presença/ausência de bandas
▪ diferenças em padrão de bandas reflete diferenças
genéticas
RAPD - METODOLOGIARAPD - METODOLOGIA
A
A B
B
RAPD - METODOLOGIA
DNA
✓ Primer se anela em vários pontos do DNA (desconhecidos)
✓ Quando se anela em direções opostas = Amplificação
✓ Anelamento em pequenas distâncias
PRIMERS ALEATÓRIOS
Vários Fragmentos
Co-1 = gene que confere resistência à raça 65 de C. lindemuthianum
RAPD - Feijoeiro
marcador
ligado à Co-1
Resistentes à
raça 65
Fonte: Moura, 2005
550 pb
1000 pb
1200 pb
• Rápido e simples - não envolve hibridização
• Baixo custo
• Sem uso de radioisótopos
• Não precisa conhecimento prévio da sequência de DNA
Fonte: IPGRI
RAPD
Vantagens
Desvantagens
• Marcador dominante
• Problemas de reprodutibilidade: produtos amplificados não são
conhecidos
• Problemas de interpretação: co-migração
- mesma banda: mesmo fragmento? Pode ser outro!
- uma banda: um fragmento? Pode ser dois!
• Pequenas sequências com 1 a 4 nucleotídeos, repetidas em
tandem (em sequência) presentes no genoma eucarioto
Mononucleotídeos TGCATTGAAAAAAAAAAAAAAACTGGATC
Dinucleotídeos TGCATTGTATATATATATATATACTGGATC
Trinucleotídeos TGCATTGTGATGATGATGATGACTGGATC
Tetranucleotídeos TGCATTGTGACTGACTGACTGACCTGGATC
MICROSSATÉLITES
• Amplificadas por PCR
• Marcador Co-dominante
• Classe de marcador com maior grau de polimorfismo
• Requer conhecimento prévio da sequência
Sinonímias
• SSR (Simple Sequence Repeats);
• STMS (Sequence Tagged Microsatellites);
• SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);
Onde são encontrados ???
• Mamíferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma)
• Plantas: (AT)n
• Mitocôndrias
• Cloroplastos
MICROSSATÉLITES
MICROSSATÉLITES: METODOLOGIA
1 . Digestão DNA – Enzimas de Restrição
2. Seleção dos Fragmentos (tamanho) e clonagem em vetor
3. Transformação da bactéria e seleção das colônias por
hibridização (sondas marcadas com sequências repetidas)
4. Sequenciamento dos clones
5. Desenho dos primers
M
homozigotoheterozigoto
M
homozigotoheterozigoto
Marcador Co-dominante
MICROSSATÉLITES
Gel de poliacrilamida
=> Perceber diferenças de nucleotídeos
CACACA
GTGTGT
CACACA
GTGTGT
(CA)3
(CA)3
Amostra 1 Amostra 3Amostra 2
DETECÇÃO DE LOCUS SSR
Simple Sequence Repeats = Microssatélites
Homozigoto Heterozigoto Homozigoto
MICROSSATÉLITES
cada “ilha” microssatélite
constitui um locus,
multialélico
Cada fragmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo
diferente do mesmo locus
Marcador multialélico
Alelos diferentes da mesma repetição (mesmo locus)
MICROSSATÉLITES
Marcador Molecular com maior conteúdo de informação
de polimorfismo
MICROSSATÉLITES
Vantagens
• Reprodutibilidade
• Requer pequena quantidade de DNA
• Baixo custo
• Grande poder de resolução
• Alto nível polimorfismo – útil para germoplasmas aparentados e de
baixa variabilidade
Desvantagens
• Necessidade de serem desenvolvidos para cada espécie (primers
aleatórios)
• Trabalhoso
• Porém: uma vez desenvolvido é fácil
• Caro
Atributos
Isoenzimas
Proteínas
de sementes
RFLPs
RAPDs
Microssatélites
AFLPs
Nível de
Polimorfismo
baixo alto baixo-alto baixo-alto muito alto muito alto
Estabilidade
ambiental
moderada alta alta alta alta alta
Número de locos moderado (<50) baixo (<10) alto alto alto alto
Expressão genética co-dominate co-dominante co-dominante dominante co-dominante dominante
Número de alelos por
loco
2-5 multialélico multialélico 2 multialélico 2
Distribuição no
genoma
regiões de cópia
única
regiões de cópia
única
várias ao acaso ao acaso ao acaso
Acessibilidade
tecnológica
muito alta muito alta média muito alta muito baixa média
Aplicabilidade no
melhoramento
rápido,
baixo custo
rápido,
baixo custo
lento,
custo médio
rápido, baixo
custo
lento, custo alto rápido, custo
baixo
Identificação de
genótipos
baixa baixa alta muito alta muito alta muito alta
Avaliação de
germoplasma
média baixa alta alta alta muito alta
Mapeamento
genético
baixa muito baixa alta alta muito alta alta
Mapeamento de
regiões específicas
baixa inadequado média muito alta média muito alta
Mapeamento
comparativo
baixa inadequado muito alta baixa alta baixa
Genética de
Autógamas
baixa baixa média alta muito alta muito alta
Genética de
Alógamas
média baixa média alta muito alta muito alta
Análise Filogenética média baixa muito alta média alta média
Adaptado de Gepts (1993) e Ferreira & Grattapaglia (1995).
Marcadores de DNA
• Exemplo: Espécie humana– Estimativa: 2.900.000.000 pares de
nucleotídeos;• Em cada 100 nucleotídeos um deve ser diferente
(polimórfico);
• Espera-se 30.000.000 de pares de nucleotídeos diferentes quando se comparam dois indivíduos tomados ao acaso na população.
Distâncias e Dissimilaridades
DISSIMILARIDADE utiliza dadosbinários para o cálculo, ou seja,marcadores dominantes. É o complementoda similaridade (Dis= 1- Sim), é um índicede divergência.
DISTÂNCIA utiliza freqüências alélicaspara seu cálculo, ou seja, marcadorescodominantes. Utilizam-se de conceitosgenéticos e/ou geométricos.
Medidas de Dissimilaridades
Objetivo: representar o grau de divergência
entre diferentes populações ou indivíduos.
Os marcadores são interpretados como
dados binários (1 e 0) presença ou
ausência da banda.
Principais índices:
- Jaccard
- Simple Matching (Coincidência simples)
- Dice (Sorensen ou Nei-Li)
Distâncias genéticas
• Marcadores codominantes (RFLP, SSR, isoenzimas) discriminam o genótipo heterozigoto do homozigoto e se prestam ao cálculo das frequências alélicas.
• Distância genética de Nei, Rogers e Reynolds
• TFPGA, GDA, NTSYS, ARLEQUIM...
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Medidas de Similaridades
Medidas de Similaridades
Medidas de Dissimilaridades
Matriz de Similaridade
Distância genética de Nei
Calculando a distância
Arquivo marcador codominante
Distância Nei: Loco 1
Distância Nei: Locos 1, 2 e 3
Análise de Agrupamento
Construção de dendrogramas;
Análise de Agrupamento
UPGMA (Unweighted Pair Grouping
Method with Aritimetical Means) – entre
populações e entre indivíduos/populações.
Correlação cofenética
A análise de correlação tem como objetivo determinar o grau de relacionamentoentre duas variáveis, isto é, a covariabilidade entre elas.
n
i
i
n
i
i
i
n
i
i
xy
YYXX
YYXX
YVXV
YXCovR
1
2
1
2
1,
Algumas observações importantes devem ser feitas em relação ao coeficiente decorrelação:
- O coeficiente de correlação é adimensional.
1110 2 xyrer
- Um coeficiente de igual a zero não implica falta de relação entre duas variáveis,apenas reflete a ausência de relação linear entre essas variáveis.
X2
X1
X1
X2 X2
X1 X1
X2X2
X1
Considerando que os resultados dos agrupamentos sofrem acúmulo de erro a cadaciclo de inclusão de um indivíduo, isto se reflete na construção do dendrograma,conduzindo a interpretações distorcidas dos resultados obtidos.
Em que:
Cij = valor de similaridade entre os indivíduos, obtidos a partir da matriz cofenética; e
Sij = valor de similaridade entre os indivíduos, obtidos a partir da matriz desimilaridade.
019.1618.1212.419.1039.13
033.1906.1750.744.6
029.1604.1219.13
053.1274.15
023.3
0
F
E
D
C
B
A
FEDCBA
D
063.2660.1712.463.2663.26
063.2663.26216.8216.8
060.1763.2663.26
063.2663.26
023.3
0
F
E
D
C
B
A
FEDCBA
D
Matriz dissimilaridade
Matriz cofenética
Rolph (1992) considera a partir do coeficiente de correlação cofenético:
Muito bom: r 0,9;
Bom: 0,8 r < 0,9;
Ruim: 0,7 r < 0,8; e
Péssimo: r 0,7.
Há que se ressaltar que um baixo coeficiente de correlação cofenético nãosignifica que o dendrogama não tem utilidade; apenas indica que algumadistorção deve ter ocorrido.
BIBLIOGRAFIA
1. Aluízio Borém e Eveline Teixeira Caixeta - Marcadores Moleculares
Viçosa, MG, 2006
2. Fábio Gelape Faleiro - Marcadores Genético-Moleculares aplicados
a programas de conservação e uso de recursos genéticos. EMBRAPA
Cerrados, Planaltina , DF, 2007.
3.http://geneticavirtual.webnode.com.br/genetica-virtual-home/topicos-
extras/marcadores-moleculares/
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