fcup ao meu orientador, doutor josé antónio rodrigues ......fcup 3 agradecimentos ao meu...
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Agradecimentos
Ao meu orientador, Doutor José António Rodrigues, gostaria de agradecer todo o
apoio, disponibilidade e incentivo ao longo destes anos. Agradeço especialmente a
liberdade e autonomia que me foi dando e que me permitiu evoluir pessoal e
profissionalmente. Agradeço a oportunidade que sempre me deu de poder ser criativa.
Não esquecerei a forma como me orientou e a confiança que depositou em mim.
Ao Doutor Aquiles Araújo Barros gostaria sobretudo de agradecer por me ter
permitido fazer parte do grupo de Química Analítica e Qualidade Alimentar (QuAQuA).
Lembrar-me-ei sempre do seu dinamismo na gestão do grupo, mantendo-se sempre
firme nas suas convicções. Agradeço de forma muito especial o incentivo, a
disponibilidade e apoio em fases mais críticas, e a forma incansável como sempre o
fez.
Ao Doutor Paulo Almeida e ao Doutor Luís Guido agradeço toda a disponibilidade e
auxílio ao longo da minha estadia no QuAQuA e pela forma como me acolheram no
grupo.
A todos os colegas de laboratório no QuAQuA agradeço a ajuda e o bom ambiente
de trabalho proporcionado. Agradeço de forma particular àqueles com quem partilhei
mais tempo ao longo destes últimos anos e com quem trabalhei mais diretamente:
Manuela Moreira, Luís Gonçalves, Daniel Carvalho, Rui Ramos, Christiane Santos,
Eliana Tavares, Ana Sofia Silva, Ana Margarida Carvalho, Manuel Cruz, Patrick Pais,
Paulo Magalhães, João Pacheco, Ana Catarina Oliveira, Carolina Alves. Ao Manuel
Cruz e à Christiane Santos faço um agradecimento especial pela contribuição valiosa
para uma parte deste trabalho.
À Dra. Isabel Rocha agradeço toda a disponibilidade e ajuda no laboratório.
À Dra. Zélia Azevedo agradeço a enorme ajuda nos ensaios de espetrometria de
massa.
A todos os meus amigos, em especial à Manuela, ao Luís e ao Daniel com quem
tenho também o prazer de trabalhar. Agradeço-lhes os bons momentos passados
dentro e, sobretudo, fora do QuAQuA. À Manuela agradeço a amizade incondicional
ao longo destes anos e que também contribuíram de forma significativa para o meu
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Agradecimentos
crescimento pessoal. Qualquer outro agradecimento que lhe possa fazer será sempre
insuficiente. Ao Luís agradeço a amizade e a forma como me incentiva a ser cada vez
melhor. Agradeço as discussões (por vezes inflamadas) sobre assuntos diversos e
que, apesar das divergências, nos têm permitido crescer pessoal e profissionalmente.
À minha família, agradecendo de forma muito especial aos meus pais e irmão pela
enorme paciência, apoio e incentivo durante todos estes anos e, principalmente, nas
fases mais atribuladas.
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PUBLICAÇÕES DO AUTOR CONTENDO TRABALHO RELACIONADO COM ESTA
DISSERTAÇÃO
Manuel P. Cruz, Inês M. Valente, Luís M. Gonçalves, José A. Rodrigues and
Aquiles A. Barros, Analytical and Bioanalytical Chemistry (2012) 403 (4), 1031-1037.
Inês M. Valente, Christiane M. Santos, Luís M. Gonçalves, José A. Rodrigues and
Aquiles A. Barros, Analytical Methods (2012) 4, 2569-2573.
Inês M. Valente, Christiane M. Santos, Manuela M. Moreira, José A. Rodrigues,
Journal of Chromatography A (2013) 1271 (1), 27-32.
Inês M. Valente, Luís M. Gonçalves, José A. Rodrigues, Journal of
Chromatography A (2013) 1308, 58-62.
Christiane M. Santos, Inês M. Valente, Luís M. Gonçalves, José A. Rodrigues,
Analyst (2013) 138, 7233-7237.
Apoio financeiro da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) no âmbito do
PIDDAC através da bolsa de doutoramento com a referência SFRH/BD/69719/2010.
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Resumo
A perceção da qualidade das bebidas por parte dos consumidores depende
maioritariamente das suas características organoléticas e da manutenção no tempo
dessas características. Os defeitos organoléticos, designados por off-flavours, são
características sensoriais que não são habituais no aroma e sabor típicos desses
produtos. Os compostos químicos responsáveis por essas perceções sensoriais
podem surgir devido a contaminações durante o processo de fabrico, embalagem e
transporte e, mais habitualmente, por alterações químicas e/ou microbiológicas da
bebida durante o período de armazenamento. Neste último caso, os off-flavours
resultam, normalmente, de reações químicas entre diferentes componentes do
produto, de processos oxidativos, de reações induzidas pela luz ou por via enzimática.
Os off-flavours mais frequentemente identificados nas bebidas devem-se em
grande parte ao aparecimento de compostos que resultam de diversos processos
químicos e enzimáticos, entre os quais a oxidação lipídica, a reação de Maillard, a
degradação de aminoácidos e a atividade microbiológica. A maioria dessas espécies
químicas é volátil e pode ser detetada através da análise sensorial, dado que, em
geral, os seus limites de perceção sensorial são extremamente baixos (da ordem dos
ng L-1). Por outro lado, a determinação analítica desses compostos é também uma
importante ferramenta para a caracterização da qualidade do produto, complementar à
análise sensorial mas com a vantagem de permitir uma avaliação mais objetiva e, em
muitos casos, mais correta. Porém, a análise instrumental dos off-flavours representa
um grande desafio analítico na identificação e quantificação desses compostos, que só
com o recurso a técnicas analíticas de extração e deteção muito eficientes é possível
dar resposta.
A importância que a preparação da amostra tem na análise química e a constante
procura de metodologias de extração mais simples, sensíveis, de baixo custo e com
baixo consumo de solventes de baixa toxicidade motivou a realização deste trabalho.
Neste sentido, o trabalho descrito nesta tese envolve o desenvolvimento de
metodologias analíticas para a determinação de off-flavours em bebidas baseadas em
técnicas de extração cujas principais características se inserem no contexto da
Química Verde.
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Resumo
Neste trabalho foram utilizadas duas técnicas de extração principais para o
desenvolvimento de metodologias analíticas para a determinação de cetonas,
aldeídos, aminas e fenóis em amostras de vinho, cerveja e sumos de fruta. A análise
instrumental dos extratos foi realizada por cromatografia líquida (LC).
Uma das técnicas, a microextração por difusão gasosa (GDME), baseia-se na
extração de compostos voláteis de uma amostra líquida para um pequeno volume de
solução aceitadora líquida por difusão gasosa através de uma membrana porosa. Foi
realizado um estudo de caracterização do processo de extração com base na
avaliação de alguns parâmetros: natureza e características da membrana, modo de
extração, força iónica, temperatura, tempo, agitação da solução dadora, presença do
derivatizante na solução aceitadora e agitação desta solução. Os resultados obtidos
com soluções modelo de cetonas e aldeídos permitiram concluir que a seletividade da
extração depende essencialmente das características da membrana utilizada. A
eficiência da extração é afetada por todos os parâmetros estudados; no entanto está
sobretudo relacionada com a volatilidade dos analitos. Após a realização deste estudo
de caracterização, foram desenvolvidas metodologias para a determinação de alguns
compostos responsáveis por off-flavours (aminas, acetaldeído e compostos α-
dicarbonílicos) em vinhos e cervejas.
A segunda técnica de extração estudada neste trabalho foi a extração líquido-
líquido assistida por salting-out (SALLE). O processo consiste na separação de
solventes orgânicos miscíveis com a água (acetonitrilo, propanol, acetona, etc.) da
água por adição de um sal. A SALLE permite obter extratos diretamente compatíveis
com diversas técnicas instrumentais de análise, nomeadamente a cromatografia
líquida. Além disso, o baixo consumo de solventes e o uso de solventes de elevada
polaridade são duas características desta técnica que a tornam preferível à extração
líquido-líquido clássica. Neste trabalho foram inicialmente estudados alguns
parâmetros da SALLE (natureza e volume de solvente orgânico utilizado, natureza e
concentração do sal) em soluções modelo de compostos α-dicarbonílicos e em
amostras de cerveja. Posteriormente estes compostos foram quantificados em
amostras reais (vinho e cerveja).
A aplicação da SALLE em análise alimentar tem sido sobretudo utilizada na
metodologia QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe), criada
para a determinação de pesticidas em amostras sólidas. Esta metodologia envolve
duas etapas: (1) extração dos analitos através de uma SALLE e (2) limpeza do extrato
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Resumo
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orgânico obtido na etapa anterior por extração em fase sólida dispersiva (d-SPE).
Neste trabalho, foi desenvolvida uma metodologia baseada em QuEChERS para a
determinação de fenóis voláteis em bebidas (vinho, cerveja e sumos de fruta).
Palavras-chave
Bebidas, defeitos organoléticos, extração, extração líquido-líquido assistida por salting-
out (SALLE), microextração por difusão gasosa (GDME), off-flavours
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Abstract
Perception of beverages’ quality by consumers greatly depends on their
organoleptic characteristics and their maintenance over time. Organoleptic defects,
also known as off-flavours, are sensory characteristics that are not common in the
typical aroma and flavour of these products. The chemical compounds responsible for
these sensory perceptions may arise due to contamination during the production
process, packaging and transportation and, more usually, by chemical and/or
microbiological changes of the beverage during storage. In the latter, off-flavours are
normally a result of chemical reactions between different product components,
oxidative processes, light induced reactions or enzymatic reactions.
The more frequently off-flavours identified in beverages are due to the presence of
compounds formed by various chemical and enzymatic processes, including lipid
oxidation, Maillard reaction, amino acids’ degradation and microbial activity. Most of the
chemical species are volatile and can be detected by sensory analysis since that, in
general, their sensory perception limits are extremely low (of the order of ng L-1). On
the other hand, the analytical determination of these compounds is also an important
tool for the characterisation of the product’s quality, complementary to the sensory
analysis, with the advantage of allowing a more objective and, in many cases, more
accurate evaluation. However, off-flavours instrumental analysis is a major analytical
challenge for the identification and quantification of these compounds that is only
possible with the use of very efficient extraction and detection techniques.
The importance that the sample preparation has in analytical chemistry and the
constant search for simpler, more sensitive, low-cost and with low solvent consumption
with low toxicity motivated the realization of this work. In this sense, the work described
in this thesis involves the development of analytical methodologies for the
determination of off-flavours in beverages based on extraction techniques which main
characteristics fit into the Green Chemistry context.
In this work two extraction techniques were used to develop analytical
methodologies for the determination of ketones, aldehydes, amines and phenols in
wine, beer and fruit juice samples. The instrumental analysis of the extracts was
performed by liquid chromatography (LC).
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Abstract
One of the techniques, the gas-diffusion microextraction (GDME), is based on the
extraction of volatile compounds from a liquid sample to a small volume of an acceptor
liquid solution by gas-diffusion through a porous membrane. A study on the
characterization of the extraction process was conducted based on the evaluation of
several parameters: the nature and characteristics of the membrane, method of
extraction, ionic strength, temperature, time, stirring of the donor solution, the presence
of a derivatizing reagent in the acceptor solution and stirring of this solution. The results
obtained with model solutions of ketones and aldehydes showed that the selectivity of
the extraction depends essentially on the characteristics of the membrane. The
extraction efficiency is affected by all the parameters studied; however it is mainly
related to the analytes’ volatility. After this characterization study, methodologies for the
determination of some compounds responsible for off-flavours (amines, acetaldehyde
and α-dicarbonyl compounds) in wines and beers were developed.
The second studied extraction technique in this work was salting-out assisted liquid-
liquid extraction (SALLE). The process consists on the separation of water-miscible
organic solvents (acetonitrile, propanol, acetone, etc.) and water by addition of a salt.
SALLE allows the analyst to obtain extracts directly compatible with different
instrumental analytical techniques, including liquid chromatography. Furthermore, the
low solvent consumption and the use of high polarity solvents are two characteristics of
this technique that make it preferable to classical liquid-liquid extraction. In this work
some parameters of SALLE (type and volume of organic solvent, nature and
concentration of the salt) were initially studied in model solutions of α-dicarbonyl
compounds and beer samples. Subsequently these compounds were quantified in real
samples (wine and beer).
The application of SALLE in food analysis has been mainly used in the QuEChERS
(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) methodology, created for the
determination of pesticides in solid samples. This methodology involves two steps: (1)
extraction of analytes through SALLE and (2) clean-up of the organic extract obtained
in the previous step by dispersive solid-phase extraction (d-SPE). In this work a
methodology based on QuEChERS for the determination of volatile phenols in
beverages (wine, beer and fruit juices) was developed.
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Abstract
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Keywords
Beverages, extraction, gas-diffusion microextraction (GDME), off-flavours, organoleptic
defects, salting-out assisted liquid-liquid extraction (SALLE)
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Índice
Agradecimentos ............................................................................................................ 3
Resumo ........................................................................................................................ 7
Abstract ...................................................................................................................... 11
Lista de abreviaturas................................................................................................... 29
Parte I - Introdução
1. Off-flavours em bebidas ....................................................................................... 35
1.1. Oxidação lipídica ........................................................................................... 36
1.2. Reação de Maillard ....................................................................................... 38
1.3. Degradação de aminoácidos ......................................................................... 39
1.4. Atividade microbiológica ................................................................................ 40
2. Técnicas de extração de off-flavours de bebidas ................................................. 41
2.1. Técnicas de extração em headspace ............................................................ 42
2.2. Técnicas de extração para fase líquida ......................................................... 44
2.2.1. Extração líquido-líquido clássica ............................................................ 44
2.2.2. Microextração em fase líquida ............................................................... 45
2.3. Técnicas de extração para fase sólida .......................................................... 49
2.3.1. Extração em fase sólida ........................................................................ 49
2.3.2. Microextração em fase sólida ................................................................ 51
2.3.3. Extração sortiva em barra de agitação................................................... 54
2.4. Técnicas de extração assistidas por membranas .......................................... 55
2.4.1. Extração líquido-líquido assistida por membrana ................................... 56
2.4.2. Difusão gasosa ...................................................................................... 58
2.4.3. Pervaporação ........................................................................................ 59
3. Enquadramento do trabalho................................................................................. 63
3.1. Compostos químicos estudados ................................................................... 63
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Índice
3.1.1. Compostos α-dicarbonílicos ................................................................... 63
3.1.2. Acetaldeído ........................................................................................... 64
3.1.3. Aminas biogénicas................................................................................. 67
3.1.4. Fenóis voláteis ....................................................................................... 69
3.2. Técnicas de extração utilizadas neste trabalho ............................................. 71
3.2.1. Microextração por difusão gasosa ......................................................... 71
3.2.2. Extração líquido-líquido assistida por salting-out ................................... 73
Parte II - Microextração por difusão gasosa
4. Introdução ............................................................................................................ 79
5. Execução experimental ........................................................................................ 81
5.1. Materiais e equipamentos ............................................................................. 81
5.2. Preparação de soluções ................................................................................ 83
5.3. Procedimentos experimentais ....................................................................... 84
5.3.1. Caracterização do processo de extração ............................................... 84
5.3.2. Determinação de aminas biogénicas alifáticas ...................................... 85
5.3.3. Determinação de acetaldeído livre e total em vinhos ............................. 86
5.3.4. Determinação de compostos α-dicarbonílicos em amostras alimentares88
6. Caracterização do processo de extração ............................................................. 91
6.1. Influência da natureza e características da membrana.................................. 91
6.2. Estudo do modo de extração: módulo imerso ou em headspace .................. 96
6.3. Influência da força iónica ............................................................................. 101
6.4. Influência da temperatura de extração ........................................................ 103
6.5. Influência do tempo de extração ................................................................. 104
6.6. Influência da agitação da solução dadora ................................................... 106
6.7. Influência do derivatizante na solução aceitadora ....................................... 107
6.8. Influência da agitação da solução aceitadora .............................................. 108
7. Determinação de aminas biogénicas alifáticas .................................................. 111
7.1. Otimização dos parâmetros da extração ..................................................... 111
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Índice
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7.2. Validação da metodologia ........................................................................... 114
7.3. Quantificação das aminas em vinho e cerveja ............................................ 116
8. Determinação de acetaldeído livre e total em vinhos ......................................... 117
8.1. Otimização das condições de extração ....................................................... 117
8.2. Estudo da influência do SO2 e do etanol ..................................................... 118
8.3. Validação da metodologia ........................................................................... 120
8.4. Quantificação do acetaldeído em vinhos ..................................................... 120
8.5. Identificação por HPLC–DAD–MS/MS dos compostos extraídos ................ 121
9. Determinação de compostos α-dicarbonílicos em amostras alimentares ........... 125
9.1. Otimização das condições de extração ....................................................... 125
9.2. Validação da metodologia ........................................................................... 126
9.3. Quantificação dos compostos α-dicarbonílicos nas amostras ..................... 126
10. Conclusões ........................................................................................................ 129
Parte III - Extração líquido-líquido assistida por salting-out
11. Introdução .......................................................................................................... 135
12. Execução experimental ...................................................................................... 137
12.1. Materiais e equipamentos ........................................................................... 137
12.2. Preparação de soluções .............................................................................. 138
12.3. Procedimentos experimentais ..................................................................... 140
12.3.1. Determinação de compostos α-dicarbonílicos para o estudo da SALLE
140
12.3.2. Determinação de compostos α-dicarbonílicos em amostras de bebidas
utilizando a SALLE ............................................................................................ 141
12.3.3. Determinação de fenóis voláteis através da metodologia QuEChERS 143
13. Estudo da extração líquido-líquido assistida por salting-out em misturas
acetonitrilo-água ....................................................................................................... 145
13.1. Estudo do efeito do solvente orgânico e dos sais na extração .................... 146
13.2. Estudo do efeito da concentração de sal na extração ................................. 147
13.3. Estudo do efeito do volume de acetonitrilo na extração............................... 149
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Índice
13.4. Aplicação do processo de extração à análise de bebidas ........................... 150
14. Determinação de compostos α-dicarbonílicos em bebidas utilizando a SALLE .. 153
14.1. Efeito do reagente derivatizante na extração .............................................. 153
14.2. Efeito da natureza do sal utilizado na extração ........................................... 154
14.3. Efeito do pH da amostra .............................................................................. 156
14.4. Validação da metodologia ........................................................................... 158
14.5. Determinação de compostos α-dicarbonílicos em vinho e cerveja .............. 160
15. Determinação de fenóis voláteis em bebidas através da aplicação da metodologia
QuEChERS .............................................................................................................. 163
15.1. Seleção do solvente extrator ....................................................................... 163
15.2. Seleção do sal a utilizar na extração dos fenóis voláteis ............................. 164
15.3. Seleção do adsorvente para a limpeza do extrato por d-SPE...................... 165
15.4. Validação da metodologia ........................................................................... 167
15.5. Quantificação dos fenóis nas amostras ....................................................... 168
16. Conclusões ........................................................................................................ 171
Parte IV - Propostas de trabalho futuro
Referências bibliográficas ......................................................................................... 181
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Índice de tabelas
Parte I - Introdução
Tabela 2.1 – Lista de compostos responsáveis por off-flavours em bebidas em que se
utilizou a LLE para a extração. .................................................................................... 45
Tabela 2.2 – Exemplos de aplicações de técnicas de LPME à extração de off-flavours
de bebidas .................................................................................................................. 46
Tabela 2.3 – Lista de aplicações da SPE na extração de off-flavours de bebidas para
análise por LC, GC e eletroforese capilar (CE). .......................................................... 51
Tabela 2.4 – Lista de aplicações de SPME em modo headspace e de imersão na
amostra para a determinação de alguns compostos responsáveis por off-flavours em
bebidas. ...................................................................................................................... 53
Tabela 2.5 – Lista de aplicações da PV para a determinação de off-flavours em
bebidas ....................................................................................................................... 62
Tabela 3.1 – Lista de metodologias analíticas para a determinação de compostos α-
dicarbonílicos em bebidas........................................................................................... 64
Parte II - Microextração por difusão gasosa
Tabela 5.1 - Características principais das membranas utilizadas no módulo de GDME.
................................................................................................................................... 82
Tabela 5.2 – Características das colunas cromatográficas utilizadas nas separações
dos compostos extraídos por GDME. ......................................................................... 83
Tabela 5.3 – Designação, teor alcoólico e pH das amostras de vinho e cerveja
analisadas para a determinação de aminas alifáticas. ................................................ 86
Tabela 5.4 – Designação, teor alcoólico e pH das amostras de vinho analisadas para a
determinação de acetaldeído livre e total. ................................................................... 87
Tabela 5.5 – Condições utilizadas no detetor de MS para os estudos de identificação
dos compostos extraídos por GDME. ......................................................................... 88
Tabela 6.1 – Lista dos valores das constantes de Henry (KH) para as cetonas e
aldeídos estudados por ordem crescente de volatilidade. ........................................... 99
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Índice de tabelas
Tabela 7.1 – Limites de deteção (LD) e de quantificação (LQ), e repetibilidade da
metodologia desenvolvida para a quantificação de aminas alifáticas por GDME. ..... 115
Tabela 7.2 – Valores de concentração obtidos para as aminas biogénicas alifáticas por
GDME nas amostras de vinho e cerveja descritas na Tabela 5.3. ............................ 116
Tabela 8.1 – Compostos identificados por HPLC-DAD-MS/MS em extratos de
amostras de vinho. ................................................................................................... 122
Parte III - Extração líquido-líquido assistida por salting-out
Tabela 12.1 – Características das colunas cromatográficas utilizadas nas separações
cromatográficas dos compostos extraídos por SALLE. ............................................. 138
Tabela 12.2 – Designações e composições dos tubos comerciais e não comerciais de
d-SPE testados na limpeza do extrato em acetonitrilo. ............................................. 140
Tabela 12.3 – Designação, teor alcoólico e pH das amostras analisadas para a
determinação de compostos α-dicarbonílicos após extração por SALLE. ................. 143
Tabela 14.1 – Equações das curvas de calibração, coeficientes de determinação e
limites de deteção e quantificação dos compostos α-dicarbonílicos extraídos de
soluções padrão de acordo com o procedimento descrito na secção 12.3.2. ............ 158
Tabela 14.2 – Valores de repetibilidade e reprodutibilidade para os compostos α-
dicarbonílicos estudados obtidos a partir da análise de extratos de amostras de vinho
branco, vinho tinto e cerveja. .................................................................................... 160
Tabela 15.1 – Limites de deteção e de quantificação, repetibilidade, reprodutibilidade e
taxas de recuperação da metodologia desenvolvida para a determinação de fenóis
voláteis em bebidas. ................................................................................................. 167
Tabela 15.2 – Concentrações (mg L-1) obtidas para os fenóis voláteis quantificados nas
amostras de bebidas analisadas. .............................................................................. 168
Parte IV - Propostas de trabalho futuro
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Índice de figuras
Parte I - Introdução
Fig. 1.1 - Principais compostos químicos resultantes da oxidação lipídica de (A) ácidos
gordos saturados e (B, C e D) insaturados. ................................................................ 37
Fig. 1.2 – Esquema simplificado da reação de Maillard. Adaptado de Hodge [8]. ....... 39
Fig. 2.1 – Esquema de um módulo de extração por headspace. Adaptado de Pacheco
et al. [16] ..................................................................................................................... 44
Fig. 2.2 – Esquema da extração por DLLME. ............................................................. 47
Fig. 2.3 – Representação esquemática de SDME por imersão (A) e no headspace (B).
................................................................................................................................... 48
Fig. 2.4 – Imagens de microscopia eletrónica de varrimento de uma membrana HF: (a)
secção transversal, (b) superfície interior, (c) superfície exterior, (d) e (e) secções
transversais parciais com diferentes aumentos. Retirado de Sukitpaneenit et al. [46]. 49
Fig. 2.5 – Representação de um dispositivo de extração de SPME. Adaptado de Lord e
Pawliszyn [69]. ............................................................................................................ 52
Fig. 2.6 – Representação esquemática de (a) uma barra de agitação revestida com
PDMS para SBSE e (b) de um dispositivo para HSSE. Adaptada de Bicchi et al. [72].
................................................................................................................................... 55
Fig. 2.7 – Esquema de um sistema em fluxo usando SLME. Adaptado de Wang et al.
[95]. ............................................................................................................................ 57
Fig. 2.8 – Esquema de diferentes configurações de membranas em forma de saco
utilizadas para SLME. Adaptado de Schellin e Popp [94]. ........................................... 57
Fig. 2.9 – Representação esquemática da HF-LPME em sistemas de (A) duas e (B)
três fases. Adaptado de Psillakis e Kalogerakis [97]. .................................................. 58
Fig. 2.10 – Esquema do processo de extração por HF-LGLME. Adaptado de
Farajzadeh e Assadi [107]. ......................................................................................... 59
Fig. 2.11 – Esquema de um módulo de PV convencional. Adaptado de Luque de
Castro e Gámiz-Gracia [113]. ..................................................................................... 60
Fig. 3.1- Esquema representativo da reação química entre a OFDA e os compostos α-
dicarbonílicos. ............................................................................................................. 64
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Índice de figuras
Fig. 3.2 – Equações químicas que representam a formação de adutos entre o HSO3- e
compostos carbonílicos [156]. ..................................................................................... 66
Fig. 3.3 – Equação química que representa a reação do DNPH com aldeídos. .......... 67
Fig. 3.4 – Estruturas químicas de algumas aminas biogénicas. .................................. 67
Fig. 3.5 – Esquema que representa a reação química entre o PITC e as aminas. ...... 69
Fig. 3.6 – Mecanismo da formação enzimática de vinilfenóis e etilfenóis por
Brettanomyces (adaptado de [157]). ........................................................................... 70
Fig. 3.7 – Imagens obtidas por microscopia eletrónica de varrimento de células de
levedura Brettanomyces [178]. ................................................................................... 70
Fig. 3.8 – Representação esquemática do módulo de GDME. .................................... 72
Fig. 3.9 – Esquema do procedimento experimental de GDME e representação do
processo de extração quando na solução aceitadora existe um reagente derivatizante
β a reagir com o analito α, originando γ. ..................................................................... 72
Parte II - Microextração por difusão gasosa
Fig. 5.1 – Esquema do procedimento experimental utilizado para a determinação de
aminas alifáticas. ........................................................................................................ 85
Fig. 6.1 - Cromatograma obtido na separação cromatográfica de uma solução padrão
com uma concentração de 1 mg L-1 de cada um dos compostos α-dicarbonílicos. As
extrações foram realizadas a 55 ºC durante 10 min e as condições cromatográficas
foram as descritas na secção 5.3.1. ............................................................................ 92
Fig. 6.2 – Cromatograma obtido na separação cromatográfica de uma solução padrão
com uma concentração de 2 mg L-1. As extrações foram realizadas a 55 ºC durante 10
min e as condições cromatográficas foram as descritas na secção 5.3.1. .................. 92
Fig. 6.3 – Soma das áreas dos picos cromatográficos de cetonas e aldeídos extraídos
a partir de misturas aquosas destes compostos utilizando diferentes membranas
hidrofóbicas (Tabela 5.1). As extrações foram realizadas com soluções padrão
contendo 1 mg L-1 de cada composto dicarbonílico e 5 mg L-1 de cada aldeído e
acetoína, a 55 ºC durante 10 min. ............................................................................... 93
Fig. 6.4 – Áreas dos picos cromatográficos do formaldeído, metilglioxal e acetoína
obtidos a partir da extração de soluções aquosas utilizando diferentes membranas
hidrofóbicas (Tabela 5.1). As extrações foram realizadas com soluções padrão
FCUP
Índice de figuras
23
contendo 1 mg L-1 de metilglioxal e 5 mg L-1 de formaldeído e acetoína, a 55 ºC
durante 10 min. ........................................................................................................... 94
Fig. 6.5 – Áreas dos picos cromatográficos do acetaldeído e diacetilo obtidos a partir
da extração de soluções aquosas utilizando diferentes membranas hidrofóbicas
(Tabela 5.1). As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 5 mg L-1
de acetaldeído e 1 mg L-1 de diacetilo, a 55 ºC durante 10 min. ................................. 94
Fig. 6.6 – Esquema dos modos de extração por GDME estudados: (A) com o módulo
imerso na solução dadora e (B) com o módulo no headspace da solução dadora. ..... 97
Fig. 6.7 – Áreas dos picos cromatográficos dos compostos cuja eficiência da extração
é superior quando se realiza a extração com o módulo de GDME imerso na solução
dadora. As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1 mg L-1 de
metilglioxal e diacetilo e 2 mg L-1 de acetoína, formaldeído e furfural, a 55 ºC durante
10 min e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1). ......................................... 98
Fig. 6.8 - Áreas dos picos cromatográficos dos compostos cuja eficiência da extração é
superior quando se realiza a extração com o módulo de GDME no headspace da
solução dadora. As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1 mg L-
1 de pentano-2,3-diona e hexano-2,3-diona e 2 mg L-1 de cada um dos restantes
compostos, a 55 ºC durante 10 min e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1).
................................................................................................................................... 98
Fig. 6.9 – Áreas dos picos cromatográficos do formaldeído e do decanal para a
extração por GDME destes compostos com diferentes concentrações de NaCl na
solução dadora. As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 2 mg L-
1 de formaldeído e decanal, a 55 ºC durante 10 min e utilizando as membranas
SureVent (Tabela 5.1). .............................................................................................. 102
Fig. 6.10 - Áreas dos picos cromatográficos do metilglioxal para a extração por GDME
com diferentes concentrações de NaCl na solução dadora. As extrações foram
realizadas com soluções padrão contendo 1 mg L-1 metilglioxal, a 55 ºC durante 10
min e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1). ............................................ 102
Fig. 6.11 – Áreas dos picos cromatográficos do metilglioxal, diacetilo, pentano-2,3-
diona e hexano-2,3-diona realizando a extração por GDME a temperaturas diferentes
(entre 25 e 65 ºC). As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1 mg
L-1 de cada analito, durante 10 min e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1)
................................................................................................................................. 103
24 FCUP
Índice de figuras
Fig. 6.12 – Variação das áreas dos picos cromatográficos dos compostos
dicarbonílicos (metilglioxal, diacetilo, pentano-2,3-diona e hexano-2,3-diona) com o
tempo de extração. As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1
mg L-1 de cada analito, a 55 ºC e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1). . 104
Fig. 6.13 – Área do pico cromatográfico do diacetilo em função do tempo de extração
com e sem agitação da solução aceitadora. As extrações foram realizadas com
soluções padrão contendo 1 mg L-1 de diacetilo, a 25 ºC e utilizando as membranas
Mitex (Tabela 5.1). .................................................................................................... 107
Fig. 6.14 – Área do pico cromatográfico do diacetilo em função do tempo de extração
com agitação da solução dadora, a presença e ausência de derivatizante na solução
aceitadora. As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1 mg L-1 de
diacetilo, a 25 ºC e utilizando as membranas Mitex (Tabela 5.1). ............................. 108
Fig. 6.15 - Área do pico cromatográfico do diacetilo em função do tempo de extração
com e sem agitação da solução aceitadora (não contendo o reagente derivatizante).
As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1 mg L-1 de diacetilo, a
25 ºC e utilizando as membranas Mitex (Tabela 5.1). ............................................... 109
Fig. 6.16 – Área do pico cromatográfico do diacetilo em função do tempo de extração
com e sem agitação da solução aceitadora (contendo o reagente derivatizante). As
extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1 mg L-1 de diacetilo, a 25
ºC e utilizando as membranas Mitex (Tabela 5.1). .................................................... 109
Fig. 7.1 – Áreas dos picos cromatográficos das aminas biogénicas alifáticas utilizando
diferentes concentrações de NaOH na solução dadora. As extrações foram realizadas
utilizando soluções padrão de 0,5 mg L-1 de cada analito, a 40 ºC, durante 10 min. . 112
Fig. 7.2 - Áreas dos picos cromatográficos das aminas biogénicas alifáticas utilizando
diferentes temperaturas de extração. As extrações foram realizadas utilizando
soluções padrão de 0,5 mg L-1 de cada analito, durante 15 min. .............................. 113
Fig. 7.3 - Representação gráfica das áreas dos picos cromatográficos das aminas
biogénicas alifáticas utilizando diferentes tempos de extração. As extrações foram
realizadas utilizando soluções padrão de 0,5 mg L-1 de cada analito, a 40 ºC. ......... 114
Fig. 7.4 – Cromatograma obtido para um extrato de uma amostra de cerveja preta de
acordo com as condições referidas na secção 5.3.2. ................................................ 115
Fig. 8.1 – Variação da área do pico cromatográfico do acetaldeído com (A) o tempo (a
uma temperatura de 50 ºC) e (B) a temperatura de extração (durante 15 min). As
extrações foram realizadas utilizando uma amostra de vinho tinto. ........................... 117
FCUP
Índice de figuras
25
Fig. 8.2 – Variação do sinal analítico do acetaldeído com a concentração de SO2 para
o estudo do efeito da concentração de SO2 no teor de acetaldeído extraído. As
extrações foram realizadas sobre uma amostra de vinho tinto, a 50 ºC durante 15 min.
................................................................................................................................. 119
Fig. 8.3 – Concentração de acetaldeído livre e total (barras) e da percentagem de
acetaldeído ligado (pontos) obtidas nas amostras de vinho descritas na Tabela 5.4. As
extrações foram realizadas de acordo com o procedimento descrito na secção 5.3.3.
................................................................................................................................. 121
Fig. 8.4 - Cromatograma de um extrato de uma amostra de vinho utilizando as
condições descritas na secção 5.3.3; os picos numerados representam os compostos
identificados e que se encontram listados na Tabela 8.1. ......................................... 122
Fig. 9.1 – Áreas dos picos cromatográficos do metilglioxal, diacetilo e pentano-2,3-
diona obtidos a partir da extração de uma solução padrão (contendo 1 mg L-1 de cada
analito) utilizando as membranas de SureVent e Mitex; as extrações foram realizadas
em triplicado a 55 ºC durante 10 min. ....................................................................... 125
Fig. 9.2 – Concentrações de metilglioxal, diacetilo e pentano-2,3-diona obtidas nas
amostras analisadas e descritas na secção 5.3.4. .................................................... 127
Parte III - Extração líquido-líquido assistida por salting-out
Fig. 12.1 – Esquema simplificado do procedimento de extração por SALLE para o
estudo da técnica em misturas acetonitrilo-água. ..................................................... 141
Fig. 12.2 – Esquema do procedimento experimental para a determinação de
compostos α-dicarbonílicos utilizando SALLE. .......................................................... 142
Fig. 12.3 – Esquema do procedimento de preparação da amostra para a determinação
de fenóis voláteis por HPLC-UV-FLD. ....................................................................... 144
Fig. 13.1 – Cromatograma obtido a partir da extração de uma solução padrão
contendo 5 mg L-1 de cada um dos compostos analisados utilizando as condições de
extração e de separação cromatográfica descritas na secção 12.3.1. ...................... 145
Fig. 13.2 – Representação gráfica da fração extraída média em função da razão de
fases (R) obtidos para a extração dos derivados dos compostos α-dicarbonílicos de
soluções de acetonitrilo-água (1:1, v/v) usando diferentes sais com concentração na
mistura de 1 mol L-1. As extrações foram realizadas utilizando soluções padrão 5 mg L-
1 de cada analito. ...................................................................................................... 147
26 FCUP
Índice de figuras
Fig. 13.3 – Fração extraída dos compostos α-dicarbonílicos em função da
concentração de sal na mistura acetonitrilo-água para os três sais testados (MgSO4, o
Na2CO3 e o NaCl). As extrações foram realizadas utilizando soluções padrão 5 mg L-1
de cada analito. ........................................................................................................ 148
Fig. 13.4 – Representações gráficas da variação do volume de fase orgânica recolhida
(A) e da fração extraída do derivado de glioxal (B) em função do volume de acetonitrilo
adicionado para a extração usando os três sais estudados (MgSO4, o Na2CO3 e NaCl).
As extrações foram realizadas utilizando soluções padrão 5 mg L-1 de cada analito
com uma concentração constante de sal na mistura de 0,5 mol L-1. ......................... 149
Fig. 13.5 – Fração extraída média de compostos α-dicarbonílicos em soluções padrão
(5 mg L-1) e em amostras de cerveja sem e com álcool dopadas com os cinco
compostos α-dicarbonílicos (5 mg L-1), utilizando diferentes sais para a extração com
acetonitrilo com uma concentração na mistura de 1 mol L-1. ..................................... 151
Fig. 13.6 – Razão de fases (A) e fração extraída média dos compostos α-dicarbonílicos
(B) em função da concentração de NaCl utilizada para a extração de compostos α-
dicarbonílicos de soluções padrão (5 mg L-1) e de amostras de cerveja sem e com
álcool dopadas com os cinco compostos α-dicarbonílicos (5 mg L-1). ....................... 151
Fig. 14.1 – Esquemas dos procedimentos experimentais (A, B e C) realizados para o
estudo do efeito do reagente derivatizante na extração usando uma solução padrão de
α-dicarbonilos (0,5 mg L-1). ....................................................................................... 153
Fig. 14.2 – Áreas dos picos cromatográficos dos quatro compostos estudados
realizando os três procedimentos representados na Fig. 14.1. As extrações foram
realizadas com uma solução padrão contendo 0,5 mg L-1 de cada analito e utilizando
NaCl com uma concentração na mistura de 0,5 mol L-1. ........................................... 154
Fig. 14.3 – Áreas dos picos cromatográficos dos analitos para extrações SALLE
realizadas com NaCl, Na2CO3 e CH3COONa com concentrações na mistura de 0,5 mol
L-1. Foram utilizadas soluções padrão de compostos α-dicarbonílicos contendo 0,5 mg
L-1 de cada um dos analitos. ..................................................................................... 155
Fig. 14.4 – Áreas dos picos cromatográficos dos analitos para extrações SALLE
realizadas com NaCl, Na2CO3 e CH3COONa (numa concentração de 0,5 mol L-1 na
mistura) utilizando amostras de vinho branco, vinho tinto e cerveja dopadas com os
compostos α-dicarbonílicos em estudo (0,25 mg L-1). ............................................... 156
Fig. 14.5 – Concentrações dos compostos α-dicarbonílicos obtidas para diferentes
valores de pH da amostra de vinho tinto. .................................................................. 157
FCUP
Índice de figuras
27
Fig. 14.6 – Cromatogramas obtidos a partir da extração de amostras de vinho tinto
(vinho tinto 2, Tabela 12.3) com diferentes adições de soluções padrão de compostos
α-dicarbonílicos, As condições utilizadas para a separação cromatográfica encontram-
se na secção 12.3.2. ................................................................................................. 159
Fig. 14.7 – Valores de concentração do glioxal, metilglioxal, diacetilo e pentano-2,3-
diona obtidos para as amostras de vinho e de cerveja analisadas (Tabela 12.3). (ND,
não detetado; NQ, não quantificado; a, não determinado). ........................................ 161
Fig. 15.1 – Áreas dos picos cromatográficos registados para os fenóis estudados
utilizando diferentes sais ou misturas de sais (secção 12.2) para a extração dos
compostos de uma amostra de vinho tinto dopada com 0,5 mg L-1 de cada fenol (a
etapa de d-SPE foi realizado com o tubo PSA). ........................................................ 164
Fig. 15.2 - Áreas dos picos cromatográficos registados para os fenóis estudados
utilizando NaCl com e sem MgSO4 para a extração dos compostos de uma amostra de
vinho tinto dopada com 0,5 mg L-1 de cada fenol (d-SPE foi realizado com o tubo PSA).
................................................................................................................................. 165
Fig. 15.3 - Áreas dos picos cromatográficos registados para os fenóis estudados
utilizando diferentes sorventes (Tabela 12.2) para a etapa de d-SPE em extratos
obtidos da extração de uma amostra de vinho tinto dopada com 0,5 mg L-1 de cada
fenol usando 2 g NaCl. ............................................................................................. 166
Fig. 15.4 – Cromatogramas obtidos a partir da análise de uma amostra de vinho tinto
dopada com 0,5 mg L-1 de cada fenol (a vermelho) e de um extrato da mesma amostra
utilizando 2 g NaCl para o SALLE e o tubo PSA para o d-SPE (a azul). ................... 166
Fig. 15.5 – Concentrações de 4-etilfenol e 4-etilguaiacol determinadas nas amostras
de vinho, cerveja, néctares e sumos de fruta ao longo do tempo de armazenamento a
4 ºC. ......................................................................................................................... 170
Parte IV - Propostas de trabalho futuro
FCUP
29
Lista de abreviaturas
CE Eletroforese capilar (do inglês, capillary electrophoresis)
DAD Detetor espetrofotométrico com rede de díodos (do inglês, diode-array detector)
DLLME Microextração líquido-líquido dispersiva (do inglês, dispersive liquid-liquid microextraction)
DNPH Dinitrofenilidrazina
DNS-Cl Cloreto de dansilo
d-SPE Extração em fase sólida dispersiva (do inglês, dispersive solid-phase extraction)
ESI Ionização por electrospray (do inglês, electrospray ionization)
GC Cromatografia gasosa (do inglês, gas chromatography)
GD Difusão gasosa (do inglês, gas-diffusion)
GDME Microextração por difusão gasosa (do inglês, gas-diffusion microextraction)
HF Fibra oca (do inglês, hollow fiber)
FIA Análise por injeção em fluxo (do inglês, flow-injection analysis)
FID Detetor de ionização de chama (do inglês, flame ionization detector)
FLD Detetor de fluorescência (do inglês, fluorescence detector)
HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência (do inglês, high performance liquid chromatography)
HSSE Extração sortiva em headspace (do inglês, headspace sorptive extraction)
LC Cromatografia líquida (do inglês, liquid chromatography)
LD Limite de deteção
LGLME Microextração líquido-gás-líquido (do inglês, liquid-gas-liquid microextraction)
LLE Extração líquido-líquido (do inglês, liquid-liquid extraction)
LLME Microextração líquido-líquido (do inglês, liquid-liquid microextraction)
LPME Microextração em fase líquida (do inglês, liquid phase microextraction)
LQ Limite de quantificação
MS Espetrometria de massa (do inglês, mass spectrometry)
NPD Deteção de azoto/fósforo (do inglês, nitrogen phosphorous detector)
30 FCUP
Lista de abreviaturas
OFDA o-fenilenodiamina
OPA o-ftalaldeído (do inglês, o-phthalaldehyde)
PDMS Polidimetilsiloxano
PFBHA o-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzil)hidroxilamina
PFPH Pentafluorofenilidrazina
PITC Isotiocianato de fenilo (do inglês, phenyl isothiocyanate)
PTC Feniltioureia (do inglês, phenylthiourea)
PTFE Politetrafluoroetileno
PV Pervaporação
PVDF Fluoreto de polivinilideno (do inglês, polyvinylidene difluoride)
QuEChERS Acrónimo de Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe
SALLE Extração líquido-líquido assistida por salting-out (do inglês, salting-out assisted liquid-liquid
extraction)
SDME Microextração em gota suspensa (do inglês, single drop microextraction)
SBSE Extração sortiva em barra de agitação (do inglês, stir bar sorptive extraction)
SLME Extração líquido-líquido suportada em membrana (do inglês, supported liquid membrane
extraction)
SPE Extração em fase sólida (do inglês, solid-phase extraction)
SPME Microextração em fase sólida (do inglês, solid-phase microextraction)
tR Tempo de retenção
USAEME Microextração por emulsificação assistida por ultrassons (do inglês, ultrasound-assisted
emulsification-microextraction)
Parte I
Introdução
FCUP
35
1. Off-flavours em bebidas
A perceção da falta de qualidade de bebidas e alimentos frescos, processados ou
embalados leva a que todos os anos a indústria alimentar receba inúmeras queixas de
consumidores. Na maioria dos casos estas ocorrências são pontuais mas, por vezes, o
problema pode envolver a perda da produção de um lote ou de várias embalagens de
um produto. Essas características indesejáveis podem ocorrer devido a uma
contaminação de uma fonte externa (por exemplo, ar, água, material de embalagem)
sendo denominada taint, ou pode ser originada pela degradação de alguns
componentes do produto (por oxidação lipídica, escurecimento não enzimático, ação
enzimática, atuação de microrganismos, etc.) sendo, neste caso, denominada off-
flavour. Pode ainda ser considerada uma terceira causa para o aparecimento de
características indesejáveis, cujo diagnóstico é mais difícil, e que corresponde à
alteração do sabor/aroma devido à perda do aroma/sabor característico (por
evaporação ou reação de componentes do alimento ao longo do tempo) [1]. Apesar
dos termos taint e off-flavour serem utilizados diversas vezes indistintamente, no
contexto deste trabalho o termo off-flavour será utilizado para designar um aroma ou
sabor indesejável que resulta da degradação química ou microbiológica de
componentes do produto.
Os compostos químicos responsáveis pelo aparecimento de off-flavours em
bebidas estão, geralmente, presentes em concentrações abaixo dos microgramas por
litro. No entanto, mesmo assim, representam um sério problema de qualidade do
produto devido aos seus baixos limites de perceção sensorial1.
Neste capítulo faz-se uma descrição crítica das principais fontes responsáveis por
off-flavours em bebidas: (1) a oxidação lipídica, (2) a reação de Maillard, (3) a
degradação de aminoácidos e (4) a atividade microbiológica.
1 Concentração mínima do composto à qual é detetado na análise sensorial.
36 FCUP
Off-flavours em bebidas
1.1. Oxidação lipídica
A degradação de lípidos é uma das principias vias de formação de off-flavours e
pode ocorrer por oxidação ou por ação enzimática. Em geral a oxidação lipídica ocorre
por reação do oxigénio com ácidos gordos saturados e insaturados através de reações
com radicais livres, podendo ou não ser iniciada por ação da luz. Dessas reações
resulta uma mistura de compostos voláteis, geralmente aldeídos, cetonas, ácidos
carboxílicos, álcoois, hidrocarbonetos, lactonas e ésteres. Os principais compostos
formados a partir da oxidação de lípidos saturados e insaturados encontram-se na Fig.
1.1. Os aldeídos e as cetonas insaturados são os produtos da oxidação lipídica que
mais contribuem para os off-flavours, essencialmente devido aos seus baixos limites
de perceção olfativa [1]. A oxidação de lípidos pode também ocorrer por ação
enzimática originando compostos semelhantes aos produzidos por via química.
A oxidação lipídica é influenciada por diversos fatores. O número e tipo de ligações
duplas dos ácidos gordos são um dos principais fatores que determinam a velocidade
do processo oxidativo. Por exemplo, na série de ácidos gordos compreendendo os
ácidos araquidónico, linolénico, linoleico e oleico, o primeiro (que tem quatro ligações
duplas) é mais rapidamente oxidado que os restantes (que têm três, duas e uma
ligação dupla, respetivamente). A presença de iões metálicos em quantidades
vestigiais, sobretudo os iões cobre, ferro e cobalto, influenciam de forma significativa o
processo oxidativo. Estes iões metálicos atuam diminuindo o período de indução e na
decomposição dos radicais livres, aumentando a velocidade da reação. Estes iões
metálicos podem existir na forma livre ou fazendo parte da estrutura de enzimas. A
velocidade da oxidação aumenta com o aumento da temperatura; no entanto, quando
a oxidação é catalisada por enzimas, a reação é geralmente mais rápida entre 30 e 45
ºC e diminui quando a enzima é desnaturada. Além disso, essas reações enzimáticas
ocorrem com ácidos gordos específicos e são dependentes do pH [1, 2]. Para além
dos iões metálicos, da temperatura e do pH, a luz também influencia a oxidação
lipídica pelo facto de induzir uma série de reações que caracterizam este processo.
FCUP
Off-flavours em bebidas
37
Fig. 1.1 - Principais compostos químicos resultantes da oxidação lipídica de (A) ácidos gordos saturados e (B, C e D)
insaturados.
A oxidação lipídica é favorecida em alimentos com baixo teor em água e uma
elevada quantidade de ácidos gordos polinsaturados. No entanto, dado que uma
grande parte dos alimentos e bebidas contêm lípidos, em quase todos esses produtos
pode ocorrer este processo.
Os aromas “herbáceos” são atribuídos a álcoois e aldeídos produzidos por
oxidação enzimática de ácidos gordos insaturados. Os principais são o hexanal, o
38 FCUP
Off-flavours em bebidas
trans-octen-2-al e o trans-2-nonenal [3, 4]. O trans-2-nonenal é o aldeído característico
do aroma a “ranço, cartão” resultante do processo de oxidação lipídica durante o
envelhecimento da cerveja [5]. A extensa investigação sobre este aldeído permitiu
caracterizar as suas vias de formação como sendo devidas à oxidação lipídica dos
ácidos linoleico e linolénico [4]. Aliás, uma grande parte dos estudos sobre o
envelhecimento da cerveja centra-se na oxidação de ácidos gordos insaturados [6].
1.2. Reação de Maillard
A reação de Maillard é responsável pela produção de diversos aromas e sabores
característicos de certas bebidas mas também está na origem do aparecimento de off-
flavours, sobretudo durante o período de armazenamento. É definida, genericamente,
como a interação entre aminoácidos, péptidos ou proteínas com açúcares redutores
num complexo processo de reações químicas. A reação de Maillard é responsável
pela formação dos aromas a torrado e a caramelo, bem como pelo aparecimento da
cor castanha em alimentos e bebidas. Por este motivo é também designada por
processo de escurecimento não enzimático.
A reação de Maillard decorre em diversas etapas (Fig. 1.2). Inicialmente um grupo
carbonilo do açúcar redutor (na forma de aldose) reage com o grupo amina do
aminoácido, péptido ou proteína para formar uma base de Schiff. A base de Schiff é
estabilizada através de um rearranjo (rearranjo de Amadori), formando um composto
de Amadori (1-amino-1-desoxicetose). A formação destes compostos é favorecida por
temperaturas elevadas. No entanto, quando as condições de temperatura e pH não
promovem esse rearranjo, os compostos de Amadori podem sofrer reações de
enolização formando 3-desoxidicarbonilos. Estas espécies são bastante reativas e
originam compostos furânicos (tais o furfural e o 5-hidroximetilfurfural) e α-dicarbonilos
(tais como glioxal, metilglioxal e diacetilo). As etapas finais da reação de Maillard é a
formação de aromas e compostos com cor (melanoidinas) [4, 7].
FCUP
Off-flavours em bebidas
39
Fig. 1.2 – Esquema simplificado da reação de Maillard. Adaptado de Hodge [8].
1.3. Degradação de aminoácidos
A degradação de aminoácidos pode ser induzida pela luz e pela presença de
riboflavina, produzindo off-flavours, amónia e dióxido de carbono. Todos os
aminoácidos podem ser degradados desta forma, mas os aminoácidos que contêm
enxofre na sua estrutura (sobretudo a metionina) são considerados os principais
responsáveis pelos off-flavours. Na cerveja, a exposição à luz induz a degradação de
isohumulonas formando radicais livres que reagem com a cisteína, levando à
formação de 3-metil-2-buten-1-tiol. O 3-metiltiopropanal (metional) foi identificado em
leite resultante da oxidação da metionina na presença de luz e riboflavina. A formação
de um composto sulfurado (4-metil-2-isopropiltiazole) foi detetada num sumo de
ananás, a partir dos aminoácidos cisteína, valina e metionina, na presença de
riboflavina [9].
A degradação de aminoácidos pode originar aldeídos através da reação de
Strecker, entre aminoácidos e compostos α-dicarbonílicos. A reação envolve uma
transaminação seguida da descarboxilação do cetoácido formando um aldeído com
menos um átomo de carbono do que o aminoácido que lhe deu origem [6]. O 3-
metilbutanal, responsável por aromas amílicos em vinhos, é um produto da
40 FCUP
Off-flavours em bebidas
degradação de Strecker, formado a partir da reação da leucina com compostos
carbonílicos do vinho [10]. O odor a “queijo” poderá resultar da presença de 2-
metilpropanal se o aminoácido degradado for a valina [10]. O aroma a “vegetais
cozinhados” foi identificado em vinho branco resultante da formação de metional por
oxidação ou degradação de Strecker da metionina [11].
1.4. Atividade microbiológica
Os microrganismos são uma fonte comum de off-flavours em bebidas, sobretudo
quando o produto não é esterilizado por aquecimento ou irradiação ou não é
conservado com agentes antimicrobianos. O aparecimento de off-flavours pode
também resultar de uma fermentação mal controlada, da presença de enzimas ativas
resultantes da lise de microrganismos ou do crescimento dos microrganismos na
bebida resultando na libertação de metabolitos [1]. O diacetilo (butan-2,3-diona) resulta
do processo de fermentação e, acima de determinado nível, é um dos principais off-
flavours em bebidas fermentadas. Nos vinhos os principais compostos α-dicarbonílicos
presentes são o glioxal, o metilglioxal, o diacetilo e a pentano-2,3-diona [12]. A
interação entre a Saccharomyces cerevisae e alguns fungos presentes no mosto pode
originar octen-3-ona responsável pelo odor a “fungo” ou “cogumelo”. Por outro lado, as
bactérias envolvidas na fermentação malolática produzem diacetilo [3]. A
contaminação de vinhos com Brettanomyces é um das principais causas do
aparecimento de off-flavours em vinhos, nomeadamente através da formação de 4-
etilguaiacol e 4-etilfenol [13].
FCUP
41
2. Técnicas de extração de off-flavours de
bebidas
A análise química de compostos responsáveis por off-flavours é um procedimento
de garantia de qualidade de produtos alimentares complementar à análise sensorial e
apresenta uma série de desafios. A presença de um dado off-flavour num alimento ou
bebida é geralmente evidenciada por uma alteração no aroma ou sabor do produto.
Desta forma deteta-se a existência de um problema e surge a necessidade de
identificar a sua origem, nomeadamente saber qual ou quais os compostos
responsáveis pelo off-flavour e determinar o seu teor no produto. A maioria dos
compostos químicos responsáveis pelos off-flavours tem uma elevada atividade
sensorial e são percetíveis em níveis de concentração muito baixos. Este facto
representa um dos maiores desafios da análise química de off-flavours devido à
necessidade de detetar concentrações muito baixas desses compostos, na presença
de outros cuja concentração na amostra é muito mais elevada. Nalgumas situações os
compostos químicos que dão origem a determinados off-flavours são conhecidos e a
análise pode ser orientada e otimizada para esses analitos e para a amostra. No
entanto, existem outros casos em que os compostos não estão identificados sendo
necessário recorrer a uma avaliação mais global combinando as análises sensorial e
instrumental.
As técnicas utilizadas para a extração de off-flavours de bebidas são semelhantes
aos utilizados para a extração de outros compostos orgânicos de forma a obter um
extrato que seja compatível com a técnica analítica. A particularidade da extração de
off-flavours é a necessidade de extrair analitos presentes em concentrações muito
baixas. A maioria dos compostos químicos responsáveis pelos off-flavours é volátil e
as técnicas de extração utilizadas são as mesmas usadas para a determinação de
outros compostos voláteis. A separação, identificação e quantificação desses
compostos é habitualmente realizada por cromatografia líquida (LC) ou por
cromatografia gasosa (GC).
As técnicas de extração para a identificação e quantificação de off-flavours em
alimentos e bebidas têm atraído a atenção de muitos investigadores com o intuito de
desenvolver metodologias simples, de fácil execução, com baixos limites de deteção,
boa capacidade de remoção de interferentes e com baixo consumo de solventes e
42 FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
reagentes. Essas metodologias baseiam-se principalmente na solubilidade dos
analitos em solventes orgânicos (extrações para fase líquida), na sua volatilidade
(extração por headspace, pervaporação, difusão gasosa), na absorção/adsorção em
fases poliméricas (extração para fase sólida) ou em combinações destas.
A microextração tem vindo a assumir um papel de relevo na análise química.
Caracteriza-se pelo reduzido volume de fase extratora relativamente ao volume da
amostra e por não ser uma extração exaustiva. Este conceito originou o
desenvolvimento de novas metodologias com elevados fatores de concentração dos
analitos nas fases extratoras devido às baixas quantidades de solventes utilizadas
(microextração em fase líquida) ou ao não uso de solventes (microextração em fase
sólida). Para além disso, a utilização de reações de derivatização conjuntamente com
a microextração permite não só aumentar os fatores de recuperação, mas também
melhorar a separação, a deteção dos analitos e a rapidez do processo.
Neste capítulo descrevem-se as principais técnicas de extração utilizadas para a
determinação de off-flavours em bebidas, com especial destaque para os
desenvolvimentos mais recentes nesta área. As técnicas foram agrupadas em quatro
grandes grupos de acordo com as principais características da metodologia: (1)
extração em headspace, (2) extração para fase líquida, (3) extração para fase sólida e
(4) extração assistida por membranas.
2.1. Técnicas de extração em headspace
A maioria dos compostos químicos responsáveis pelos off-flavours em bebidas é
volátil e, por isso, as técnicas de extração dos analitos a partir do headspace permitem
recuperar os compostos químicos de interesse e evitam a interferência de
componentes não voláteis da matriz da amostra. Além disso, estas técnicas não
recorrem ao uso de solventes.
As extrações em headspace podem ser realizadas em modo estático ou dinâmico
e podem ser ou não conjugadas com outros processos, como acontece na
microextração em gota suspensa (SDME), na microextração em fase sólida (SPME)
ou na extração sortiva em barra de agitação (SBSE e HSSE), que serão descritas com
mais detalhe nas secções 2.2.2, 2.3.2 e 2.3.3, respetivamente.
FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
43
A extração em modo estático envolve o aquecimento da amostra num recipiente
fechado a uma dada temperatura e durante um determinado intervalo de tempo, para
que os analitos voláteis se equilibrem no headspace. De seguida, uma alíquota gasosa
do headspace é recolhida e injetada diretamente no sistema de GC. Esta metodologia
foi proposta para a determinação de acetoína em cerveja [14]. A temperatura, o
volume de amostra e qualquer modificação à matriz da amostra devem ser bem
controlados. A extração em modo dinâmico é realizada através da recolha contínua do
headspace por arrastamento com um gás inerte. A fase gasosa é removida do
recipiente onde decorre a extração pelo que, em teoria, é possível uma extração
exaustiva dos analitos [15].
Esta técnica de extração é pouco seletiva mas é vantajosa para a análise de perfis
voláteis de bebidas, surgindo sempre associada à GC para permitir a separação dos
analitos extraídos. Uma das principais desvantagens da análise por headspace é a
dificuldade em fazer uma quantificação rigorosa sendo necessário recorrer a padrões
matrix-matched, a padrão interno ou ao método de adição de solução padrão. O
aquecimento da amostra, necessário para promover a volatilização dos analitos
voláteis para o headspace, pode induzir a degradação da amostra e levar à formação
de novos compostos [15].
Atualmente os principais tipos de extração em headspace utilizados na
determinação de off-flavours em bebidas são a SDME, a SPME, a SBSE e a HSSE
(descrição nas secções 2.2.2, 2.3.2 e 2.3.3). A existência de uma fase extratora com
capacidade sortiva aumenta a seletividade e a eficiência do processo de extração.
Além disso, devido ao reduzido volume de fase extratora usado nestas técnicas, é
possível obter elevados fatores de concentração dos analitos. Por essa razão, as
extrações por headspace sem uso de fases sortivas têm sido pouco utilizadas na
determinação de off-flavours em bebidas. Um exemplo de extração por headspace
com uso de uma fase extratora é a metodologia desenvolvida para a determinação de
dicetonas vicinais em cerveja. Nesta metodologia recorre-se à utilização de um módulo
de extração fechado em cujo headspace se encontra suspenso um pequeno módulo
(reator) que contém a fase aceitadora líquida (Fig. 2.1) [16].
44 FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
Fig. 2.1 – Esquema de um módulo de extração por headspace. Adaptado de Pacheco et al. [16]
2.2. Técnicas de extração para fase líquida
2.2.1. Extração líquido-líquido clássica
Uma das técnicas de extração mais comuns na análise de amostras líquidas é a
extração líquido-líquido (LLE), particularmente para a extração de compostos
orgânicos de matrizes aquosas. Esta técnica baseia-se na solubilidade relativa dos
analitos em duas fases líquidas imiscíveis. Geralmente a LLE é aplicada em amostras
aquosas utilizando como fase extratora um solvente orgânico de baixa polaridade e
imiscível com a amostra. O procedimento é realizado manualmente recorrendo a
passos repetitivos de separação de fases. Trata-se de um processo moroso e que
produz grandes quantidades de resíduos orgânicos. Além disso, devido à baixa
seletividade da LLE, pode ser necessário realizar um passo adicional de limpeza e/ou
concentração do extrato antes da análise instrumental, sobretudo para a determinação
de compostos presentes em baixas concentrações.
Apesar destas limitações, a LLE é ainda considerada uma das técnicas mais
adequadas para a extração de compostos voláteis do vinho, como demonstrado num
estudo recente que compara esta técnica com a extração em fase sólida (SPE) e a
microextração em fase sólida (SPME) [17]. Aliás, a LLE tem sido muito utilizada na
FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
45
análise cromatográfica de diversos compostos voláteis em vinho e cerveja (Tabela
2.1).
Tabela 2.1 – Lista de compostos responsáveis por off-flavours em bebidas em que se utilizou a LLE para a extração.
Amostra Analito(s) Técnica analítica Ref.
Cerveja
Aminas biogénicas HPLC-UV [18, 19]
4-vinilsirinjol GC-MS [20]
Vinho
Compostos voláteis GC-MS [17, 21-24]
4-etilfenol e 4-etilguaiacol GC-MS [25]
Compostos α-dicarbonílicos GC-MS, GC-MS/NPDa [12, 26]
Aminas biogénicas HPLC-UV [27]
Vinho do Porto e sumo de uva Aminas GC-MS [28]
a NPD: deteção de azoto/fósforo
2.2.2. Microextração em fase líquida
As técnicas de microextração em fase líquida (LPME) surgiram como resposta ao
desafio de miniaturizar a LLE de forma a reduzir o consumo de solventes, e de
aumentar a sensibilidade das metodologias baseadas na extração com solvente [29].
As primeiras aplicações desta técnica surgiram na década de 1990 usando sistemas
de análise por injeção em fluxo (FIA) [29-31]. A designação LPME é bastante ampla e
define um conjunto de técnicas de extração baseadas no mesmo princípio, a extração
de analitos de uma fase aquosa para um pequeno volume de solvente orgânico. No
entanto, existem algumas diferenças entre as técnicas referidas e é frequente atribuir-
lhes designações diferentes: (i) microextração líquido-líquido (LLME), (ii)
microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME), (iii) microextração em gota
suspensa (SDME), (iv) microextração líquido-líquido por fibra oca (HF-LPME). Alguns
exemplos de aplicações destas técnicas de LPME a bebidas encontram-se referidas
na Tabela 2.2. O uso de abreviaturas para as diferentes abordagens de LPME é
bastante diversificado e é frequente encontrar abreviaturas diferentes para processos
iguais. No entanto, ao longo deste trabalho serão utilizadas as abreviaturas acima
referidas.
46 FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
Tabela 2.2 – Exemplos de aplicações de técnicas de LPME à extração de off-flavours de bebidas
Técnica Amostra Analito(s) Técnica analítica Ref.
LLME
Vinho e cerveja Aminas alifáticas FIA-fotometria [30]
Sumos de fruta Derivados de furfural HPLC-UV [32]
Vinho Compostos sulfurados GC-MS [33]
Vinho 4-etilguaiacol, 4-etilfenol, 4-vinilguaiacol
e 4-vinilfenol GC-MS [34]
DLLME
Vinho Fenóis voláteis GC-MS [35]
Vinho Clorofenóis GC-MS [36]
Água e vinho Geosmina e 2-metilisoborneol GC-MS [37]
Vinho Anisóis e fenóis GC-MS [38]
SDME Cerveja Álcoois GC-FIDa, GC-MS [39, 40]
a FID: deteção por ionização de chama
A LLME é a técnica de LPME mais simples e mais semelhante à LLE convencional,
mas em que se utilizam volumes bastante reduzidos de solvente extrator. Este tipo de
procedimento foi proposto pela primeira vez num sistema FIA para a determinação de
aminas alifáticas em amostras de vinho e cerveja [30]. Nesse sistema o solvente
orgânico e a amostra eram misturados e transportados através de uma câmara em
serpentina onde decorria a extração. No final a mistura era conduzida até uma câmara
maior onde a separação de fases ocorria e o extrato orgânico era analisado utilizando
um detetor fotométrico.
Na LLME é necessário promover o máximo contacto entre a amostra e o solvente
orgânico, de forma a aumentar a eficiência da extração. Deste modo têm surgido
alguns trabalhos com aplicação de agitação por vortex [32] ou por ultrassons [33, 34,
41]. Estes processos permitem aumentar a dispersão do solvente extrator na amostra
aquosa, formando uma espécie de emulsão. Dado que a área de contacto entre os
líquidos é grande, as gotículas formadas pela agitação permitem uma extração mais
rápida e eficiente dos analitos. A utilização de ultrassons na LLME tem vindo a ganhar
maior destaque e a técnica adquiriu até uma designação própria: ultrasound-assisted
emulsification-microextraction (USAEME) [33, 34, 41].
FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
47
A DLLME também surgiu com o intuito de aumentar o contacto entre a amostra e o
solvente extrator. A técnica consiste na adição à amostra de um pequeno volume (da
ordem dos µL) de um solvente orgânico de elevada densidade (solvente extrator;
geralmente tetracloreto de carbono, tetracloroetileno, 1-dodecanol ou hexadecano)
misturado num solvente orgânico miscível com a água (solvente dispersivo,
habitualmente acetonitrilo, acetona ou metanol). Esta mistura forma pequenas gotas
dispersas na fase aquosa criando uma elevada área de contacto entre as fases
líquidas e desta forma promove-se a transferência de massa dos analitos para o
solvente extrator [42]. No final da extração recorre-se à centrifugação para separar as
fases e a fase orgânica é recolhida para análise. O esquema do procedimento
experimental encontra-se na Fig. 2.2. As grandes vantagens desta técnica para a
determinação de off-flavours são os baixos limites de deteção das metodologias (da
ordem dos ng L-1) e o reduzido tempo de extração (abaixo dos 10 min). Porém, a
presença do solvente dispersivo, necessário para a formação da dispersão, pode
diminuir o coeficiente de partição dos analitos entre a amostra e o solvente extrator.
Por isso, nalguns casos é possível obter maior sensibilidade e reduzir o volume de
solventes utilizando a LLME com agitação por vortex ou a USAEME.
Fig. 2.2 – Esquema da extração por DLLME.
A SDME utiliza uma microgota (1 a 10 µL) de solvente extrator habitualmente
suspensa na ponta da agulha de uma seringa para a extração dos analitos, tendo os
primeiros desenvolvimentos nesta área sido propostos por Liu e Dasgupta [31]. A gota
pode ser imersa na amostra aquosa ou ficar suspensa acima da amostra, no
headspace (Fig. 2.3). Na extração por imersão (Fig. 2.3A) utiliza-se um solvente
orgânico imiscível com a fase aquosa, para extrair compostos de baixa polaridade. A
utilização da SDME em headspace (Fig. 2.3B) permite a utilização de uma fase
extratora orgânica ou aquosa dado que esta não se encontra em contacto direto com a
amostra [43]. A transferência de massa no headspace é um processo rápido devido
48 FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
aos elevados coeficientes de difusão na fase gasosa. Com o auxílio de agitação da
amostra, para aumentar a cinética da extração, o equilíbrio termodinâmico entre as
fases aquosa e gasosa pode ser mais rapidamente atingido. Uma vantagem adicional
da extração no headspace é a eliminação da fração não-volátil da amostra que é
geralmente parcialmente extraída quando a extração é realizada por imersão.
Fig. 2.3 – Representação esquemática de SDME por imersão (A) e no headspace (B).
Existe também a possibilidade de utilizar a SDME em modo dinâmico na qual a
extração é realizada no interior da seringa [40]. Durante a extração o êmbolo da
seringa é movido a uma velocidade constante. Em cada movimento a seringa recolhe
um dado volume do headspace da amostra que irá entrar em contacto com o solvente
orgânico contido na seringa. Em cada ciclo de extração é recolhido um novo volume
de headspace o que permite aumentar os fatores de enriquecimento relativamente ao
modo de SDME estático.
A SDME tem sido, sobretudo, utilizada para análise por GC dado que é possível
utilizar a mesma seringa para a extração e para a injeção no sistema cromatográfico
[39, 44]. A SDME é simples, de baixo custo e tem um consumo de solventes
praticamente nulo. No entanto, no caso em que a gota fica imersa na amostra, pode
ocorrer a formação de emulsões, a dissolução da gota na amostra ou instabilidade da
gota devido à agitação.
O outro modo de LPME, a HF-LPME, foi desenvolvido por Pedersen - Bjergaard e
Rasmussen [45] como forma de contornar os problemas de estabilidade da gota em
SDME quando se executa a extração com a fase extratora imersa. A fase extratora é
imobilizada nos poros de uma fibra oca de diâmetro interno reduzido (hollow fibre, HF,
FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
49
Fig. 2.4). Quando se pretende extrair analitos de soluções aquosas a fibra é imersa
num solvente orgânico imiscível com a água e o lúmen2 é preenchido com esse
solvente orgânico (sistema de duas fases) ou com uma solução aquosa (sistema de
três fases) (Fig. 2.4). Para além de ser uma técnica de microextração em fase líquida,
a HF-LPME pode também ser agrupada nas técnicas de extração assistidas por
membranas e, por isso, será discutida mais detalhadamente na secção 2.4.1.
Fig. 2.4 – Imagens de microscopia eletrónica de varrimento de uma membrana HF: (a) secção transversal, (b)
superfície interior, (c) superfície exterior, (d) e (e) secções transversais parciais com diferentes aumentos. Retirado de
Sukitpaneenit et al. [46].
2.3. Técnicas de extração para fase sólida
As técnicas de extração para fase sólida são caracterizadas por processos
sortivos. Os analitos são inicialmente retidos numa fase sólida e, posteriormente, são
removidos dessa fase extratora com um solvente ou por dessorção térmica. O
sorvente deve apresentar uma elevada afinidade para os compostos de interesse de
forma a reter e concentrar esses analitos.
2.3.1. Extração em fase sólida
A extração em fase sólida (SPE) é uma técnica sortiva que envolve uma partição
líquido-sólido, em que a fase extratora é um sorvente sólido contido em cartuchos
2 Cavidade interior da HF.
50 FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
descartáveis. Esta técnica tem sido muito utilizada para extrair e/ou concentrar
compostos orgânicos presentes em baixas concentrações em amostras líquidas. A
passagem da amostra pelo sorvente resulta na retenção dos analitos à sua superfície
enquanto os outros componentes da amostra passam sem ficarem retidos. O processo
inverso, isto é, a retenção dos outros componentes da amostra e a passagem dos
analitos sem retenção no sorvente, pode também ser utilizado como forma de limpar a
amostra antes da análise [47, 48].
Genericamente, o procedimento experimental de SPE decorre em quatro passos:
condicionamento da fase extratora, em que os grupos funcionais do
adsorvente são solvatados de forma a poderem interagir com a amostra;
retenção dos analitos, sendo os analitos sorvidos na coluna de SPE;
lavagem seletiva da fase extratora, em que as espécies não retidas são
removidas do sorvente;
eluição, em que os analitos são removidos por eluição do sorvente e
recolhidos para análise.
Existem vários tipos de sorventes disponíveis comercialmente mas os mais
comuns são as fases ligadas com base de sílica e, mais recentemente, com base
polimérica. A escolha do sorvente é influenciada pela matriz da amostra e pelos
analitos [49]. Para o desenvolvimento da metodologia é necessário estudar o pH, força
iónica, polaridade e fluxo do solvente de eluição e conhecer as características do
sorvente utilizado. Uma das principais desvantagens da SPE é a influência da matriz
da amostra no processo de extração, nomeadamente através de processos de
retenção competitivos com a fase extratora entre o(s) analito(s) e outros componentes
da amostra.
Na determinação de off-flavours em bebidas, a SPE é utilizada para extrair os
analitos diretamente da amostra para posterior análise [17, 24, 50-55] ou os produtos
de reações de derivatização dos analitos [56-60]. Os extratos obtidos são adequados
para a análise cromatográfica e por essa razão a maioria das metodologias são para
GC e HPLC. Na Tabela 2.3 encontram-se alguns exemplos da utilização da SPE na
extração de compostos responsáveis por off-flavours presentes em bebidas. O uso de
SPE em sistemas FIA foi também desenvolvido para a determinação de aminas
biogénicas em vinho [61].
FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
51
Tabela 2.3 – Lista de aplicações da SPE na extração de off-flavours de bebidas para análise por LC, GC e eletroforese
capilar (CE).
Técnica de
separação Deteção Amostra Analito(s) Ref.
HPLC
FLD
Sumo de laranja 4-vinilguaiacol [50, 62]
Vinho Aminas biogénicas [51, 59, 60, 63]
Cerveja Diacetilo e pentano-2,3-diona [64]
Sumo de laranja Furaneol e 4-vinilguaiacol [52]
Cerveja Aminas [59, 65]
UV
Vinho Aminas biogénicas [57, 66]
Vinho Histamina [56]
Vinho e cerveja Glioxal, metilglioxal e diacetilo [47]
Cerveja Aminas [58, 65]
Vinho Compostos dicarbonílicos [48]
Cerveja Furfural [55]
Água Aldeídos [67]
MS Vinho e cerveja Aminas biogénicas [59]
GC
MS Vinho Compostos voláteis [17, 24, 54, 68]
FID Vinho Fenóis voláteis [53]
CE UV Vinho Aminas biogénicas [61]
2.3.2. Microextração em fase sólida
A microextração em fase sólida (SPME) é uma técnica de extração sem solventes,
que usa uma fibra de sílica fundida revestida com um sorvente inserida num
dispositivo com funcionamento semelhante ao de uma seringa, conforme o esquema
da Fig. 2.5. O processo de extração decorre em dois passos principais: (1) partição
dos analitos entre a amostra e o sorvente que reveste a fibra e (2) dessorção térmica
52 FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
ou eluição química dos analitos retidos no sorvente. Geralmente a extração dos
analitos não é exaustiva. A sensibilidade máxima é obtida quando se atingem as
condições de equilíbrio, no entanto não é necessário atingir esse ponto e a extração
pode ser realizada num período de tempo pré-definido (controlo cinético). A
temperatura e o tempo de extração e a agitação da amostra devem ser otimizados
para cada aplicação. A SPME é uma técnica de extração que pode ser facilmente
automatizada, já existindo sistemas que possibilitam o uso de sistemas de SPME em
injetores automáticos para GC. No entanto, a extração é habitualmente realizada de
forma manual conseguindo-se, apesar disso, reprodutibilidade elevada.
Fig. 2.5 – Representação de um dispositivo de extração de SPME. Adaptado de Lord e Pawliszyn [69].
A técnica foi originalmente desenvolvida há mais de 20 anos [70] e é atualmente
uma das técnicas de extração de voláteis mais utilizadas nas várias áreas da química
analítica. No que diz respeito à determinação de off-flavours em bebidas, a utilização
da SPME no vinho é a que mais se destaca nas publicações científicas mais recentes.
A SPME pode ser utiliza por imersão direta da fibra na amostra líquida ou mantendo-a
no headspace; no entanto, devido à complexidade das matrizes alimentares, a SPME
é maioritariamente utilizada em headspace. Algumas das aplicações mais relevantes a
amostras de bebidas são referidas na Tabela 2.4. A imersão da fibra na amostra pode
danificar a fase extratora ou provocar a adsorção irreversível de alguns compostos
químicos da amostra. Uma forma de contornar este problema é a utilização de uma
membrana oca de celulose a proteger a fibra. Porém, este processo requer um tempo
de extração mais longo e pode ocorrer a obstrução da membrana [15].
FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
53
Tabela 2.4 – Lista de aplicações de SPME em modo headspace e de imersão na amostra para a determinação de
alguns compostos responsáveis por off-flavours em bebidas.
Modo de
extração Amostra Analito(s) Técnica analítica Ref.
Headspace
Água Compostos carbonílicos GC-ECD [71]
Café Fração volátil GC-MS [72]
Vinho
4-etilguaiacol e 4-etilfenol GC-FID [73, 74]
Off-flavours GC-MS [75]
Compostos voláteis GC-MS [17, 76]
Haloanisóis GC-MS [77]
Fenóis voláteis GC-MS [78]
Cerveja
Aldeídos GC-MS [79]
Compostos voláteis GC-FID [80]
Fração volátil GC-MS [81]
Compostos carbonílicos GC-MS [82]
Fenóis voláteis GC-MS [83]
Whisky Compostos voláteis GC-MS [84]
Cidra Fenóis voláteis GC-MS [85]
Imersão
Água Compostos carbonílicos GC-ECD [71]
Café Fração volátil GC-MS [72]
Whisky Compostos voláteis GC-MS [84]
As principais vantagens da SPME são a eliminação total do uso de solventes, a
combinação da amostragem e da extração num só passo experimental, a possibilidade
de analisar pequenas quantidades de amostra e um elevado fator de concentração
para os componentes mais retidos. A gama de aplicabilidade da SPME é ampla tanto
na polaridade dos analitos como no tipo de amostras e pode ser usada na preparação
de amostras para análise por GC e LC. Contudo, o reduzido volume de sorvente fixado
54 FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
na fibra de SPME pode resultar em extrações incompletas e limitar a capacidade de
enriquecimento dos analitos na fibra. Habitualmente a quantificação é feita usando
padrões matrix-matched, padrão interno ou o método de adição de solução padrão de
forma a eliminar o efeito de matriz. Tal como na SPE, a presença de concentrações
elevadas de alguns componentes da amostra pode resultar na ligação competitiva à
fase extratora, diminuindo a eficiência da extração de alguns compostos e dificultando
a quantificação.
2.3.3. Extração sortiva em barra de agitação
As técnicas de extração sortiva caracterizam-se pela partição dos analitos entre
uma fase líquida ou headspace e uma fase extratora imobilizada num suporte. A
técnica sortiva mais comum é a extração sortiva em barra de agitação (SBSE),
desenvolvida em 1999 por Baltussen et al. [86] com o intuito de contornar uma das
maiores limitações da SPME: o volume reduzido de fase extratora. Nesta técnica
utiliza-se uma barra de agitação revestida com uma camada superficial de um material
sorvente (Fig. 2.6a) de forma a obter uma elevada área superficial na fase extratora,
permitindo elevados fatores de enriquecimento e extração. A extração é realizada
após imersão da barra na amostra líquida e a dessorção pode ser realizada por
eluição química ou dessorção térmica, tal como em SPME. Comparando estas duas
técnicas, obtêm-se fatores de recuperação muito superiores em SBSE devido ao maior
volume de fase extratora, mesmo quando se utiliza SPME por imersão na amostra.
Habitualmente, em SPME o volume máximo de revestimento da fibra é 0,6 μL (para
100 μm de sorvente na fibra) enquanto em SBSE os volumes de fase extratora variam
entre 25 e 125 μL [72]. Existe outra técnica semelhante mas menos usada em que a
fase extratora se encontra no headspace e é por isso designada habitualmente por
extração sortiva em headspace (HSSE) [72, 87]. Um dispositivo utlizado em HSSE
encontra-se representado na Fig. 2.6b
Em SBSE os limites de deteção obtidos são baixos, sendo uma técnica bastante
adequada para a análise de off-flavours [72, 76, 84, 87-91]. A SBSE foi aplicada em
vinho para a quantificação de fenóis voláteis, haloanisóis e 2-isobutil-3-metoxipirazina
com limites de deteção inferiores a 1 µg L-1 [91]. Este tipo de extração é utilizado
essencialmente para a análise por GC e, em geral, permite a identificação e
quantificação de uma gama alargada de compostos em bebidas.
FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
55
O revestimento mais utilizado é PDMS e, por isso, as técnicas de SBSE e HSSE
são mais adequadas para a extração de analitos de baixa polaridade de amostras
aquosas. No entanto, existem algumas tentativas de aumentar a recuperação de
analitos mais polares através da utilização de barras de agitação revestidas com
PDMS e carvão ativado [92]. As aplicações de SBSE e HSSE na análise alimentar têm
vindo a aumentar mas, devido à utilização quase exclusiva do PDMS nas barras
disponíveis comercialmente, estão limitadas à aplicação em matrizes aquosas e a
analitos de baixa polaridade.
Fig. 2.6 – Representação esquemática de (a) uma barra de agitação revestida com PDMS para SBSE e (b) de um
dispositivo para HSSE. Adaptada de Bicchi et al. [72].
2.4. Técnicas de extração assistidas por membranas
Nas últimas décadas as membranas têm sido cada vez mais utilizadas em
processos industriais de separação tais como a dessalinização, diálise, ultrafiltração,
separação de gases, desumidificação, osmose, osmose inversa e eletrodiálise [93].
Seguindo os mesmos princípios de separação, o uso das membranas com fins de
separação analítica tem sido amplamente estudada para extração, concentração e
limpeza de amostras. Sendo seletiva a uma ou algumas espécies químicas, a
membrana atua como um separador de fases, controlando a transferência de massa
entre elas. A transferência de massa dos analitos pode ser obtida por gradientes
químicos, de pressão ou de potencial elétrico. Têm como principal vantagem a
possibilidade de realizar extrações sem contacto direto entre a amostra e a fase
56 FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
aceitadora. Além disso, é possível realizar a extração com membranas em sistemas
automatizados e em fluxo.
2.4.1. Extração líquido-líquido assistida por membrana
A extração líquido-líquido assistida por membrana caracteriza-se pela extração dos
analitos da solução aquosa para uma outra fase líquida (orgânica ou aquosa) através
da difusão das espécies através dos poros de uma membrana microporosa [93]. A
LLME pode ser realizada em sistema de duas ou três fases. Num sistema bifásico, o
transporte dos analitos ocorre por difusão através dos poros da membrana
microporosa impregnada com o solvente orgânico utilizado como fase extratora. As
duas fases líquidas estão separadas pela membrana e o único contacto entre as fases
ocorre nos poros da membrana. O rendimento máximo da extração é determinado
pelo coeficiente de partição e pela cinética para atingir o equilíbrio e depende das
características da membrana e das condições de agitação. O fator de enriquecimento
de compostos orgânicos de baixa polaridade é geralmente superior aos de compostos
polares ou iónicos, dada a elevada solubilidade destes últimos na fase aquosa.
Na extração em sistema de três fases, habitualmente designada por extração
líquido-líquido suportada em membrana (SLME), uma solução é imobilizada nos poros
da membrana por ação da capilaridade. Neste caso, a membrana serve só como
suporte e a imobilização do solvente é obtida por imersão da membrana no solvente.
Ao contrário da LLME, a SLME é apropriada para a extração de espécies polares ou
iónicas tais como ácidos orgânicos e bases. A seletividade da extração pode ser
alterada por modificação da composição química das soluções que compões as fases
líquidas. Por exemplo, o pH das soluções dadora e aceitadora podem ser ajustados de
forma a facilitar o transporte de analitos da amostra para a solução imobilizada nos
poros da membrana, e desta para a solução aceitadora. Além disso, o ajuste de pH na
solução aceitadora de forma a aumentar a solubilidade dos analitos nesta fase evita
que possam ser extraídos de volta para a amostra. Todas estas características do
SLME são uma vantagem relativamente à LLME, sobretudo porque é possível
aumentar a seletividade da extração.
Existem várias configurações propostas para este tipo de extração que estão
relacionadas com os formatos das membranas, tais como as membranas planas, as
membranas em forma de saco [94] ou as fibras ocas (HF). As membranas planas são
FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
57
geralmente utilizadas em sistemas de fluxo sendo a junção da unidade extratora ao
instrumento de medição analítica a principal característica desta configuração [95],
conforme esquematizado na Fig. 2.7.
Fig. 2.7 – Esquema de um sistema em fluxo usando SLME. Adaptado de Wang et al. [95].
Nas membranas em forma de saco, o solvente orgânico é inserido na membrana
colocada numa ampola contendo a amostra. No final da extração, o extrato orgânico é
recolhido para análise. Na Fig. 2.8 estão representadas algumas das configurações
possíveis da membrana utilizada neste tipo de extração.
Fig. 2.8 – Esquema de diferentes configurações de membranas em forma de saco utilizadas para SLME. Adaptado de
Schellin e Popp [94].
A utilização de HF permite reduzir a quantidade de solvente orgânico utilizado. A
agitação é feita na amostra enquanto a fase aceitadora permanece estática. No
entanto verifica-se que pode haver perdas do solvente extrator quando se utiliza uma
agitação elevada na solução dadora. No final da extração o solvente que se encontra
no interior da membrana é cuidadosamente recolhido para análise. As HF têm sido
utilizadas para o desenvolvimento de procedimentos de microextração devido aos
elevados fatores de enriquecimento que são obtidos. Saaid et al. [96] extraiu aminas
biogénicas de amostras alimentares utilizando HF-LPME com derivatização em
simultâneo. Os analitos eram derivatizados na amostra e posteriormente extraídos
para a fase orgânica contida nos poros e no lúmen da HF. Tal como referido
58 FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
anteriormente (secção 2.2.2) a extração por SLME com HF pode ser realizada em
sistemas de duas ou três fases (Fig. 2.9).
Fig. 2.9 – Representação esquemática da HF-LPME em sistemas de (A) duas e (B) três fases. Adaptado de Psillakis e
Kalogerakis [97].
2.4.2. Difusão gasosa
A técnica de extração por difusão gasosa (GD) baseia-se na transferência de
massa por difusão de espécies voláteis da solução dadora para uma fase aceitadora.
As duas fases líquidas encontram-se fisicamente separadas por uma membrana
impermeável ao solvente mas permeável a gases, evitando que haja contacto direto
entre as duas fases líquidas. O processo de transferência de massa é controlado
essencialmente pela volatilidade dos analitos e pela permeabilidade a gases da
membrana. As espécies voláteis são extraídas da amostra para a fase aceitadora em
três passos: (1) os analitos são transportados do seio da solução dadora até à
vizinhança da membrana; (2) as espécies na forma gasosa difundem-se através da
membrana e (3) os analitos são recolhidos numa fase aceitadora gasosa ou líquida.
Atualmente, a incorporação de módulos de GD em sistemas em fluxo para a
determinação de compostos voláteis encontra-se bem estabelecida [98]. Na literatura
é possível encontrar várias configurações de módulos de GD, sobretudo para
metodologias em sistemas FIA [99-102]. A possibilidade de parar o fluxo da fase
aceitadora durante a extração permite aumentar a sensibilidade da metodologia [103].
A combinação da microextração com a GD levou ao desenvolvimento da
microextração por difusão gasosa (GDME) [104-106] que foi objeto de estudo neste
trabalho (Parte II). A descrição mais detalhada desta técnica de extração será
apresentada na secção 3.2.1.
FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
59
A utilização das HF permite aplicar a microextração à GD, sendo este tipo de
procedimento designado por microextração líquido-gás-líquido (HF-LGLME) [107-109].
A HF é imersa na amostra e no seu interior é colocado um pequeno volume (da ordem
das dezenas de µL) de solução aceitadora. O transporte dos analitos ocorre por
difusão gasosa através dos poros da membrana da HF (Fig. 2.10). A aplicação da HF
à GD permite aumentar a sensibilidade da metodologia comparando com as
metodologias de GD anteriormente descritas, sobretudo devido ao aumento da
superfície de contacto entre a amostra e a membrana e à diminuição do volume de
solução aceitadora. No entanto, o uso da HF apresenta algumas desvantagens
experimentais que serão, talvez, a principal razão para o facto de a técnica não estar
ainda muito explorada. O baixo volume de solução aceitadora e as reduzidas
dimensões das fibras utilizadas tornam o manuseamento dos sistemas de extração
difícil.
Fig. 2.10 – Esquema do processo de extração por HF-LGLME. Adaptado de Farajzadeh e Assadi [107].
Apesar das vantagens da GD na determinação de compostos voláteis, a sua
utilização na análise de bebidas é muito reduzida quando comparada com o número
de aplicações da GD a amostras ambientais. No caso dos vinhos, por exemplo, a
utilização da GD evita o uso de procedimentos de pré-tratamento da amostra para
eliminar a coloração do vinho, quando se utiliza a deteção fotométrica [110].
2.4.3. Pervaporação
A pervaporação (PV) é uma técnica de separação por membranas amplamente
utilizada em processos industriais. No entanto, devido à sua simplicidade e à
possibilidade de miniaturização e automatização, a PV pode ser aplicada com fins
60 FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
analíticos em diversos tipos de amostras [111]. As primeiras aplicações da PV
analítica surgiram no início da década de 1990 com o objetivo de monitorizar
processos de fermentação em contínuo [112].
A PV combina num único sistema dois processos, a evaporação e a difusão
gasosa de analitos através de uma membrana semipermeável. Os analitos voláteis
são transferidos da amostra sólida ou líquida (fase dadora) sob aquecimento para um
espaço gasoso existente entre a fase dadora e a membrana. De seguida as espécies
são transportadas através da membrana e recolhidas numa fase aceitadora (estática
ou em fluxo) geralmente a uma temperatura mais baixa que a da solução dadora. A
diferença de temperatura existente, que resulta na diferença de pressão nos dois lados
da membrana, é considerada a principal força motriz do processo de separação.
Uma das particularidades da PV é a existência do espaço gasoso entre a amostra
e a membrana prevenindo a obstrução e/ou deterioração da membrana. Na Fig. 2.11
encontra-se representado um esquema de um módulo de PV. A amostra é colocada
na câmara inferior do módulo extrator por injeção ou aspiração contínua no caso de
amostras líquidas, ou pesando diretamente a amostra sólida. Na câmara aceitadora os
analitos são recolhidos numa fase aceitadora líquida ou gasosa. Entre as duas
câmaras a membrana é colocada num suporte que se encontra distanciado da
amostra, mantendo um espaço gasoso entre a fase dadora e a membrana. O volume
de espaço gasoso pode ser alterado usando espaçadores de espessura variável de
forma a colocar o suporte da membrana em diferentes posições.
Fig. 2.11 – Esquema de um módulo de PV convencional. Adaptado de Luque de Castro e Gámiz-Gracia [113].
Dado que os módulos de PV podem ser facilmente adaptáveis a sistemas em fluxo,
esta técnica permite simplificar e miniaturizar alguns sistemas analíticos complexos.
As utilizações mais comuns da PV em determinações analíticas são o controlo de
processos como a fermentação [112] e a análise de amostras sólidas [114]. A
FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
61
possibilidade de integrar facilmente os módulos de PV em sistemas FIA tem levado ao
desenvolvimento de inúmeras aplicações utilizando esta técnica de extração. No caso
de amostras líquidas é possível automatizar todo o processo analítico dado que, como
referido anteriormente, a amostra é inserida no módulo de PV por injeção ou
aspiração. Quando se utilizam amostras sólidas em sistemas FIA, a câmara inferior do
módulo de PV permite realizar a lixiviação dos analitos e/ou a sua derivatização [115-
119]. O uso da derivatização é frequente e pode ser aplicada tanto na fase dadora de
forma a aumentar a volatilidade dos analitos, como na fase aceitadora para tornar os
analitos adequados à técnica de deteção. A deteção dos analitos pode ser realizada
fora do módulo de PV ou diretamente no módulo colocando o detetor no interior da
câmara aceitadora [116]. Nesta última situação, se for utilizado um sistema em fluxo, o
fluxo da fase aceitadora pode ser parado durante algum tempo de forma a acumular
os analitos nessa fase aumentando a sensibilidade da metodologia [117, 119, 120].
A PV pode ser uma alternativa à GD para a extração de espécies voláteis com a
vantagem de não haver contacto entre a amostra e a membrana devido à existência
de um espaço gasoso entre elas. Para além de evitar a colmatação dos poros e a
deterioração da membrana, o espaço gasoso permite utilizar temperaturas elevadas
na câmara dadora sem comprometer as características da membrana nem alterar a
fase aceitadora. As altas temperaturas de extração aumentam a volatilidade dos
analitos e, consequentemente, a transferência de massa. No entanto, nalguns casos a
existência desse espaço gasoso pode diminuir a eficiência do transporte de massa,
diminuindo a sensibilidade da metodologia. A utilização da PV em sistemas de
amostragem para GC pode também ser uma alternativa à amostragem em headspace
[121].
A PV tem sido bastante aplicada na determinação de off-flavours usando sistemas
dinâmicos. Este tipo de sistemas permite realizar extrações simples, rápidas e de
baixo custo, indo ao encontro de um dos principais requisitos da indústria de bebidas,
que é o controlo em linha dos processos de produção e de controlo de qualidade. A
PV pode ser facilmente acoplada a sistemas analíticos automatizados, minimizando o
manuseamento e o consumo de amostras de reagentes e aumentando
consideravelmente o número de análises por dia. As principais aplicações da PV na
determinação de off-flavours em bebidas encontram-se descritas na Tabela 2.5.
62 FCUP
Técnicas de extração de off-flavours de bebidas
Tabela 2.5 – Lista de aplicações da PV para a determinação de off-flavours em bebidas
Amostra Analito(s) Técnica analítica Ref.
Cerveja
Amónia FIA-espetrofotometria [122]
Diacetilo FIA-espetrofotometria [123]
Vinho
Acidez volátil e SO2 livre CE [124]
SO2 FIA-espetrofotometria [125]
Acetaldeído, acetato de etilo,
metanol, etanol GC-FID [126]
Acidez volátil e total Espetrofotometria [127]
Etanol e glicerol Espetrofotometria e fluorimetria [128]
Sumos e iogurte Acetaldeído Espetrofotometria [114]
Sumo de laranja Butanoato de etilo, limoneno,
pineno, geranial, neral, terpineol GC-MS [129]
Iogurte, leite,
sumos de fruta Acetaldeído e acetona GC-FID [130]
Iogurte, sumos de
fruta e misturas de
iogurte e sumos
Acetona, formaldeído, acetaldeído,
hexenal, trans-2-hexenal CE [131]
O primeiro trabalho surgiu em 1990 e nele foi descrito o desenvolvimento de um
sistema de PV com um biossensor para a determinação de diacetilo e etanol durante a
fermentação na produção de cerveja [112]. A formação de diacetilo na cerveja foi
também medida espetrofotometricamente utilizando um sistema de PV no qual a fase
aceitadora continha um reagente derivatizante [123]. A mesma técnica foi utilizada na
determinação de acetaldeído recorrendo a um método espetrofotométrico [114] e para
a determinação de amónia em cerveja [122]. O acetaldeído e outros voláteis de
importância enológica foram extraídos das amostras para análise direta por GC-FID
sem recurso à derivatização [126].
FCUP
63
3. Enquadramento do trabalho
3.1. Compostos químicos estudados
3.1.1. Compostos α-dicarbonílicos
Os compostos α-dicarbonílicos têm uma elevada importância na qualidade
alimentar visto que a sua formação se deve a processos enzimáticos e químicos,
envolvidos na degradação de alimentos nomeadamente através da reação de Maillard
(secção 1.2). Destes compostos, o diacetilo é um dos mais importantes e é um
marcador de qualidade de produtos fermentados, tais como a cerveja [82], o vinho
[132], a manteiga [133], o iogurte [134] e o queijo [135].
Nos vinhos os compostos α-dicarbonílicos presentes em maiores concentrações
são o glioxal, o metilglioxal, o diacetilo e a pentano-2,3-diona e são formados durante
a fermentação malolática [12]. Para além do impacto sensorial nos vinhos e noutras
bebidas fermentadas, os compostos α-dicarbonílicos podem-se ligar a outros
componentes desses produtos [136] e participar em diversos processos biológicos. A
importância destes compostos químicos em processos biológicos tem sido bastante
discutida nos últimos anos, sobretudo no caso do metilglioxal [137, 138].
A determinação de α-dicarbonilos em bebidas é habitualmente realizada através de
análise cromatográfica, líquida ou gasosa (Tabela 3.1). Em ambos os casos é
necessário extrair os analitos das suas matrizes devido às suas baixas concentrações
nas amostras e à elevada complexidade das matrizes. As técnicas de extração mais
frequentemente utilizadas para análise por GC são a SPME [71, 82] e a LLE [12, 26].
No caso da LC é possível analisar diretamente as amostras sem extração, e
recorrendo à derivatização [139-142]. Um dos derivatizantes mais utilizados é a o-
fenilenodiamina (OFDA) cuja reação com os compostos de α-dicarbonílicos se
encontra representada na Fig. 3.1. Este procedimento tem sido utilizado em diversas
matrizes e faz parte do método de referência da Organização Internacional do Vinho e
da Vinha (OIV) [143]. Apesar de ser possível quantificar os compostos α-dicarbonílicos
em concentrações muito baixas em vinho (50 µg L-1 [143]) e cerveja (0,8 µg L-1 [139])
com este procedimento, a realização de um passo de extração preliminar reduz os
interferentes e os efeitos negativos de outros componentes da matriz (tais como
açúcares, lípidos, pigmentos, etc.) nos sistemas cromatográficos, em particular nas
64 FCUP
Enquadramento do trabalho
colunas cromatográficas. Nesse sentido foram desenvolvidas metodologias utilizando
SPE [47, 48, 64] e GD [16] para análise de α-dicarbonilos por LC.
Tabela 3.1 – Lista de metodologias analíticas para a determinação de compostos α-dicarbonílicos em bebidas.
Técnica
cromatográfica Deteção Extração Amostra Ref.
GC
MS
LLE Vinho [12, 26]
SPME Cerveja [82]
ECD
SPME Água [71]
GD Cerveja [144]
LC
UV
Sem extração
Vinho [12, 143]
Cerveja [139]
SPE Vinho e cerveja [47, 48]
Extração em headspace Cerveja [16]
FLD SPE Cerveja [64]
Fig. 3.1- Esquema representativo da reação química entre a OFDA e os compostos α-dicarbonílicos.
3.1.2. Acetaldeído
Os aldeídos são compostos formados durante o processo de fermentação e têm
um papel importante no sabor e aroma característicos das bebidas. Os aldeídos de
cadeia curta contribuem significativamente para o perfil aromático de bebidas
alcoólicas sendo responsáveis pelos aromas e sabores a noz, maçãs estragadas,
feno/palha, relva cortada, gordura, fruta e picante [145]. Em geral os aldeídos resultam
da fermentação, mas podem também ser formados durante o armazenamento devido
FCUP
Enquadramento do trabalho
65
a diversas reações químicas e bioquímicas. Os níveis de aldeídos nas bebidas podem
ser, em alguns casos, um indicador de deterioração ocasionada pelo processo de
pasteurização, durante o armazenamento ou por contaminação.
O acetaldeído é o aldeído mais abundante em vinhos, sendo um intermediário da
produção bioquímica do etanol. A existência de elevadas concentrações de
acetaldeído em vinhos tintos resulta num aroma/sabor indesejável a maçã, enquanto
que em vinhos brancos é responsável pelo aroma a madeira. Para além das
alterações sensoriais nos vinhos, vários estudos demonstram que a ingestão de
elevadas quantidades de acetaldeído pode induzir uma série de efeitos neurológicos
adversos [146] e pode estar associada aos sintomas de ressaca tais como náuseas,
vómitos, suores, confusão, diminuição da pressão arterial e dores de cabeça [147]. O
acetaldeído tem também importância noutras doenças: está envolvido na fibrose
hepática [148], na dependência do álcool [149] e em alterações no feto durante a
gravidez [146]. Além disso, o acetaldeído é um dos agentes responsáveis pelos
cancros esofágico e gástrico, relacionados com o consumo crónico de álcool [150,
151]. A necessidade de controlar os níveis de acetaldeído nas bebidas alcoólicas é,
por isso, fundamental e a reavaliação da sua segurança tornou-se essencial [152]. No
entanto não existem ainda limites máximos legais para a concentração deste aldeído
nos vinhos.
A concentração de acetaldeído em vinhos depende, entre outros fatores, do tipo de
uva utilizada, da temperatura, do pH do mosto, dos níveis de oxigénio e da quantidade
de sulfito adicionado durante o processo de produção do vinho. A oxidação química do
etanol pode também aumentar a concentração de acetaldeído durante o período de
armazenamento. Dos parâmetros referidos, a presença e concentração de sulfito
adicionado ao vinho é aquele que mais impacto tem no teor de acetaldeído durante os
diferentes passos do processo produtivo. O sulfito atua na atividade da enzima
aldeído-desidrogenase, inibindo a conversão de acetaldeído em etanol; também se
pode ligar ao acetaldeído, diminuindo a quantidade de aldeído passível de ser
convertida em etanol [145].
No pH típico dos vinhos (entre 3 e 4) o sulfito está maioritariamente presente na
forma de ião bissulfito (HSO3-); o restante encontra-se na forma de SO2. O ião HSO3
-
apresenta uma elevada capacidade de se ligar a diversos compostos do vinho
(formando adutos), tais como o acetaldeído, ácido pirúvico, ácido 2-cetoglutárico,
antocianinas, glucose e compostos fenólicos [153]. As reações químicas de formação
66 FCUP
Enquadramento do trabalho
de adutos entre o HSO3- e compostos carbonílicos encontram-se na Fig. 3.2. Assim,
podem definir-se duas frações de sulfito presente em vinhos: a fração livre e a fração
ligada (ou combinada) [154, 155]. Mais de 95% do sulfito adicionado ao vinho está na
forma ligada, enquanto o restante permanece na forma livre. A formação de adutos
estabelece um equilíbrio químico e, portanto, quando a quantidade de SO2 livre
diminui, parte da forma ligada dissocia-se para restabelecer o equilíbrio.
Fig. 3.2 – Equações químicas que representam a formação de adutos entre o HSO3- e compostos carbonílicos [156].
O acetaldeído reage rapidamente com o HSO3- formando adutos não voláteis e,
deste modo, reduzindo a perceção olfativa deste aldeído. Esta é uma das razões pela
qual se adicionam sulfitos ao vinho [157]. Assim como acontece com os sulfitos, as
designações de “forma livre” e “forma ligada” também podem ser atribuídas ao
acetaldeído.
A determinação do acetaldeído em vinhos é habitualmente realizada recorrendo a
GC ou a HPLC, após derivatização. Para a análise por GC a derivatização é
normalmente realizada com o-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzil)hidroxilamina (PFBHA) ou
pentafluorofenilidrazina (PFPH) [158] seguida de deteção por captura eletrónica ou
MS. A extração dos aldeídos das amostras para análise por GC é realizada por SPME
com derivatização na fibra ou por LLE após derivatização dos aldeídos na amostra
[145]. Para a análise por HPLC o reagente de derivatização mais utilizado é a 2,4-
dinitrofenilidrazina (DNPH, Fig. 3.3) que permite aumentar a sensibilidade da deteção
espetrofotométrica e melhorar a separação por HPLC em fase reversa [159]. Ao
contrário das metodologias baseadas em GC, normalmente não se recorre a nenhum
procedimento de extração para análise por HPLC; a derivatização dos analitos é
realizada na amostra, que é de seguida injetada diretamente no sistema
cromatográfico [160-162]. No entanto, tal como referido anteriormente, a realização de
FCUP
Enquadramento do trabalho
67
extração antes da análise cromatográfica permite reduzir a complexidade da matriz
evitando a degradação dos sistemas cromatográficos.
Fig. 3.3 – Equação química que representa a reação do DNPH com aldeídos.
3.1.3. Aminas biogénicas
As aminas estão normalmente presentes em alimentos e bebidas e são formadas,
principalmente, por descarboxilação de aminoácidos ou por aminação (ou
transaminação) de aldeídos e cetonas. São genericamente designadas por aminas
biogénicas e podem ser classificadas em três grupos de acordo com a sua estrutura
química (Fig. 3.4): alifáticas (metilamina, dimetilamina, etilamina, putrescina,
cadaverina, espermidina), aromáticas (tiramina, feniletilamina) e heterocíclicas
(histamina, triptamina) [163].
Fig. 3.4 – Estruturas químicas de algumas aminas biogénicas.
As aminas biogénicas podem surgir em todos os alimentos e bebidas que
contenham proteínas ou aminoácidos livres, e que estejam sujeitos a condições
68 FCUP
Enquadramento do trabalho
propícias à atividade bioquímica ou microbiológica. Por esta razão as aminas
biogénicas são consideradas marcadores da qualidade alimentar.
O teor total de aminas formadas depende do tipo de alimento ou bebida e do tipo
de microrganismos presentes. A presença de níveis elevados destes compostos pode
provocar diversos problemas de saúde tais como dores de cabeça, hipo ou
hipertensão, náuseas, palpitações cardíacas, intoxicação renal, entre outros [163].
Além disso, verifica-se que a presença de acetaldeído e etanol nos vinhos potenciam o
efeito tóxico das aminas [51].
Nos vinhos as aminas estão geralmente presentes na forma ionizada e são
inodoras. No entanto, ao pH da boca as aminas passam à forma não ionizada e o seu
sabor/odor pode tornar-se percetível [51]. A origem destes compostos nos vinhos pode
ser devida à presença de aminas no mosto, por formação durante a fermentação
alcoólica pelas leveduras, ou por ação de bactérias envolvidas na fermentação
malolática [61, 164]. A sua formação depende da presença de certos microrganismos
bem como do teor dos aminoácidos percursores, duração da fase inicial da
fermentação, do período de contacto do mosto com a casca das uvas, dos níveis de
SO2, do pH e da duração do contacto do vinho com as borras de leveduras. Na cerveja
o aparecimento de aminas biogénicas está relacionado com a atividade das leveduras,
com contaminações microbiológicas ou com a qualidade das matérias-primas [165].
De uma forma geral, a dificuldade na determinação de aminas biogénicas reside no
facto de estarem presentes em muito baixas concentrações em amostras complexas
tais como os vinhos e cerveja. Existem algumas metodologias analíticas para a
determinação de aminas biogénicas em bebidas baseadas em CE [61, 166-169] e GC
[28]. Porém a LC é a técnica mais utilizada.
Para a análise por LC é geralmente necessário recorrer à derivatização dos
analitos de forma a aumentar a seletividade e sensibilidade das metodologias. Os
reagentes de derivatização mais comuns são o o-ftalaldeído (OPA) [63, 170, 171], o
cloreto de dansilo (DNS-Cl) [18, 57] e o cloreto de dabsilo [172]. Neste trabalho foi
utilizado o isotiocianato de fenilo (PITC) para a derivatização das aminas estudadas.
Este reagente, designado também por reagente de Edman, é habitualmente utilizado
para a determinação de aminoácidos, mas reage igualmente bem com aminas
primárias e secundárias formando feniltioureias (PTC) (Fig. 3.5). Apesar de ser menos
FCUP
Enquadramento do trabalho
69
utilizado do que os derivatizantes acima referidos, o PITC foi aplicado à determinação
de aminas em vinhos [56] e águas [173].
Fig. 3.5 – Esquema que representa a reação química entre o PITC e as aminas.
Independentemente do reagente utilizado para a derivatização das aminas, é
necessário realizar uma etapa de limpeza e/ou concentração da amostra quando se
pretende determinar aminas em níveis de concentração muito baixos sem a
interferência de outros componentes da amostra. A determinação de aminas de baixo
peso molecular em soluções aquosas é particularmente desafiante devido à elevada
polaridade desses compostos que os tornam muito solúveis em água. A abordagem
mais simples é análise cromatográfica da amostra após a realização de derivatização
das aminas na amostra sem recurso a limpeza ou extração dos analitos [174-176].
Porém, devido aos problemas associados à determinação de aminas acima descritos,
foram desenvolvidas metodologias em que se realiza uma etapa de extração. A LLE
clássica (antes ou depois da derivatização das aminas) [18, 27] e a SPE têm sido
utilizadas para o isolamento das aminas (ou dos seus produtos da derivatização) antes
da análise dos extratos por LC. A SPE tem sido mais usada devido às suas vantagens
relativamente à LLE [51, 56, 57, 63, 65]. Loukou e Zoutou descreveram uma
metodologia em três passos que inclui o pré-tratamento da amostra de vinho com
polivinilpirrolidona para a remoção de interferentes, seguido da derivatização das
aminas e finalmente a utilização da SPE para a limpeza do extrato [59].
3.1.4. Fenóis voláteis
Os fenóis voláteis são compostos com elevada importância no aroma e sabor de
bebidas e são responsáveis por determinadas características sensoriais próprias
desses produtos. Por vezes, quando estes compostos excedem determinados níveis
de concentração podem tornar a bebida inaceitável para consumo. Nalguns tipos de
cerveja, dois dos mais importantes fenóis, o 4-vinilfenol e o 4-vinilguaicol, são
considerados essenciais para o aroma e sabor característicos dessas bebidas [177]
enquanto noutras cervejas os seus níveis têm de ser controlados. Os fenóis voláteis 4-
70 FCUP
Enquadramento do trabalho
vinilfenol e 4-vinilguaiacol podem ser produzidos pela descarboxilação térmica ou
enzimática dos ácidos p-cumárico e ferúlico, respetivamente (Fig. 3.6) [177]. Durante a
produção da cerveja, por exemplo, as elevadas temperaturas utilizadas durante a
ebulição do mosto e a pasteurização, podem degradar os ácidos fenólicos formando
os fenóis voláteis correspondentes.
Fig. 3.6 – Mecanismo da formação enzimática de vinilfenóis e etilfenóis por Brettanomyces (adaptado de [157]).
Nos vinhos os fenóis voláteis estão presentes numa gama de concentrações muito
variável, sendo os mais abundantes o 4-vinilfenol, o 4-vinilguaiacol, o 4-etilfenol e o 4-
etilguaicol. As suas concentrações variam de acordo com o tipo e variedade do vinho.
Apesar de estarem descritos vários mecanismos para a formação destes fenóis nos
vinhos, a descarboxilação enzimática causada pela contaminação com a levedura
Brettanomyces (Fig. 3.7) é considerada a mais significativa [13]. O mecanismo da
formação enzimática dos quatro principais fenóis produzidos no vinho por esta via
encontra-se representado na Fig.
3.6. Esta levedura tem sido referida
como uma das maiores
preocupações na vinificação pois é
responsável pelo aparecimento do
conhecido aroma/sabor fenólico.
Esta característica nos vinhos é
sobretudo devida à presença de 4-
etilfenol e 4-etilguaiacol, e torna-se
especialmente significativa quando
a concentração total destes dois
compostos excede 600 µg L-1 [13].
Fig. 3.7 – Imagens obtidas por microscopia eletrónica de
varrimento de células de levedura Brettanomyces [178].
FCUP
Enquadramento do trabalho
71
Os fenóis voláteis em bebidas podem ser determinados por LC ou GC.
Habitualmente é necessário recorrer à extração e/ou concentração destes compostos
devido à elevada complexidade das matrizes e às baixas concentrações dos analitos.
As técnicas de extração geralmente utilizadas nas metodologias por GC são a LLE, a
SPE [179], a SPME [73, 74, 83, 85] e a SBSE [88]. Mais recentemente têm vindo a ser
exploradas as técnicas de extração dispersivas para a extração de fenóis voláteis em
bebidas. A DLLME é uma técnica promissora tirando partido do contacto direto entre o
solvente orgânico e a amostra. Além disso, ultrapassa as principais desvantagens da
LLE convencional, reduzindo os volumes de solvente e amostra necessários, o tempo
de extração e a manipulação da amostra [35, 38]. A USAEME foi também aplicada
recentemente à determinação de fenóis voláteis em vinhos [34].
Geralmente, nas metodologias publicadas para a análise de fenóis voláteis por LC,
não é utilizado nenhum procedimento de extração; as amostras são simplesmente
filtradas e injetadas diretamente no sistema cromatográfico com ou sem diluição prévia
[13, 177, 180-183]. Os trabalhos encontrados na literatura que recorrem extração (por
SPE) para análise por HPLC só determinam o 4-vinilguaiacol em sumos de laranja [50,
52, 62, 184, 185]. Este fenol é um dos principais responsáveis pelo aroma e sabor a
fruta podre em sumos de citrinos, daí o interesse da sua determinação [184, 186].
Apesar de ser possível detetar a maioria dos fenóis voláteis presentes em baixas
concentrações nas bebidas (para níveis superiores a 1 µg L-1) por HPLC usando
metodologias que não recorrem a extração prévia [180, 183], a utilização de um passo
de “limpeza” da amostra será benéfico para evitar os efeitos prejudiciais de alguns
componentes da matriz da amostra (açúcares, lípidos, pigmentos, etc.) na análise
rotineira de bebidas, ou seja para aumentar a robustez das metodologias e
separações cromatográficas e prevenir a degradação a longo prazo dos sistemas
cromatográficos, em particular do desempenho das colunas cromatográficas.
3.2. Técnicas de extração utilizadas neste trabalho
3.2.1. Microextração por difusão gasosa
A microextração por difusão gasosa, abreviada para GDME (do inglês, gas-
diffusion microextraction) é uma técnica de extração de espécies voláteis e semi-
voláteis desenvolvida em 2010 por Pacheco et al. [104] e patenteada em 2013 [187]. O
72 FCUP
Enquadramento do trabalho
processo de extração consiste na difusão gasosa das espécies através de uma
membrana, e a recolha dos compostos extraídos numa solução aceitadora contida no
interior do módulo extrator. Na Fig. 3.8 encontra-se representado o módulo de GDME.
O módulo extrator é constituído por um corpo e uma cabeça perfurados, fabricados
em PTFE, entre os quais se coloca uma membrana porosa impermeável às soluções
dadora e aceitadora criando-se, assim, um espaço gasoso nos poros da membrana
através dos quais se podem difundir as
espécies gasosas. As configurações e
medidas do módulo e as membranas
utilizadas podem ser facilmente
alteradas de forma a ajustar a
sensibilidade da metodologia para a
utilização com diversas matrizes,
analitos e técnicas analíticas. As
membranas são obtidas por corte de
membranas comerciais de maiores
diâmetros.
Fig. 3.8 – Representação esquemática do módulo de
GDME.
O procedimento experimental (Fig. 3.9) consiste na imersão parcial do módulo de
GDME com a membrana numa solução dadora (amostra) termostatizada e em
agitação. No interior do módulo é colocado um pequeno volume (inferior a 1 mL) de
uma solução aceitadora (Fig. 3.9A). Após um determinado período de tempo, definido
de acordo com a sensibilidade pretendida, a solução aceitadora é recolhida e
analisada por uma técnica analítica adequada.
Fig. 3.9 – Esquema do procedimento experimental de GDME e representação do processo de extração quando na
solução aceitadora existe um reagente derivatizante β a reagir com o analito α, originando γ.
FCUP
Enquadramento do trabalho
73
A seletividade e sensibilidade desta técnica dependem em grande parte da
composição da solução aceitadora e é na modificação da sua composição que se
podem tirar grandes vantagens da GDME. A abordagem mais frequente tem sido a
utilização de um agente derivatizante na solução aceitadora. Em muitos casos é a
derivatização dos analitos que permite a sua deteção. A utilização de derivatizantes
específicos para determinadas espécies químicas permite aumentar a seletividade da
extração. Além disso, a presença do reagente derivatizante na solução aceitadora faz
com que, no decorrer do processo, a quantidade de analito que vai chegando a essa
solução vá diminuindo (por reação com o derivatizante), aumentando a eficiência da
extração (princípio de Le Chatelier, Fig. 3.9).
Um dos problemas associados à difusão gasosa (GD) é a necessidade da troca
frequente das membranas devido à colmatação dos poros por partículas presentes na
amostra. Nos processos tradicionais por GD que operam em fluxo é frequente a
necessidade de interromper o processo para substituir a membrana. Este aspeto é um
dos principais inconvenientes dos processos por GD. O módulo de GDME representa
uma alternativa simples aos módulos de GD convencionais, visto que é possível trocar
a membrana rapidamente desapertando a parte inferior do módulo. Além disso, as
membranas utilizadas em GDME têm um tamanho mais reduzido que as
habitualmente usadas em GD.
3.2.2. Extração líquido-líquido assistida por salting-out
O processo de salting-out consiste na adição de um eletrólito a uma solução
aquosa de forma a modificar o coeficiente de distribuição de um dado soluto entre
duas fases [188] e tem sido utilizado com diferentes fins. De forma genérica a adição
de um eletrólito (ou mistura de eletrólitos) a uma solução permite alterar as forças de
solvatação entre os solutos e a água.
O salting-out tem sido bastante aplicado em técnicas de preparação de amostra,
nomeadamente em extrações baseadas na formação de um headspace [43, 189] nas
quais, geralmente, a extração de analitos para o headspace pode ser favorecida pela
adição de um sal à amostra. Porém, existem outras aplicações interessantes do
salting-out que incluem a adição de um sal para separar água de solventes orgânicos
que, sem isso, seriam miscíveis com a água (acetonitrilo, acetona, metanol, etanol,
etc.) formando um sistema líquido bifásico. Uma das primeiras demonstrações deste
74 FCUP
Enquadramento do trabalho
efeito foi publicada em 1914 por Frankforter e Cohen [190] que estudaram vários sais
inorgânicos para separar água e acetona. Mais tarde, em 1973, Matkovich e Christian
[191] utilizaram o cloreto de cálcio para separar a mesma mistura de solventes. Para a
escolha do sal para o processo de separação de dois líquidos miscíveis por salting-out
deve ter em conta três premissas: (1) que a solubilidade do sal no solvente orgânico
deve ser considerada desprezável, (2) que a solubilidade do sal na água deve ser a
mais elevada possível para maximizar a interação entre os iões e a água e (3) que a
capacidade de salting-out dos sais segue a série liotrópica (ou série de Hofmeister)
[192]. O processo de separação de líquidos miscíveis ocorre porque um dos solventes
solvata preferencialmente o eletrólito, tornando-o indisponível para solvatar o outro
solvente e, portanto, ocorrer a miscibilidade.
A possibilidade de separar líquidos miscíveis através do processo de salting-out
levou ao desenvolvimento de técnicas de extração baseadas neste princípio e que têm
assumido várias designações: separação induzida por sal, extração líquido-líquido
assistida por salting-out (SALLE), extração líquido-líquido homogénea por salting-out
(SHLLE). Ao longo deste trabalho será adotada a designação SALLE.
Após a publicação, em 1973, da aplicação de SALLE para a extração de quelatos
metálicos de água utilizando acetona [191] o interesse por este processo de extração
não parou de crescer. Ainda na década de 1970, Nagaosa [193-195] iniciou a
expansão desta técnica a outros solventes orgânicos miscíveis com a água,
nomeadamente ao acetonitrilo, e aplicou-o à extração de catiões metálicos presentes
em soluções aquosas. Ao longo dos anos têm sido testados outros solventes [196-
198], no entanto o acetonitrilo é um dos solventes extratores mais promissores em
múltiplas aplicações. O acetonitrilo é miscível com a água em todas as proporções e a
sua polaridade é favorável à extração de uma vasta de gama de compostos; para além
disso é adequado à análise por LC e GC. Como o acetonitrilo é um solvente orgânico
menos tóxico que a maior parte dos solventes orgânicos utilizados na LLE clássica, é
mais adequado no contexto da Química Verde. Tendo em conta que os solventes
utilizados em SALLE são miscíveis com a água, os extratos orgânicos obtidos são
compatíveis com diversas técnicas analíticas: voltametria [191, 193-195, 199], LC
[196, 200-205], CE [206, 207], espectrofotometria de emissão atómica com plasma
acoplado indutivamente [208], espetrofotometria de absorção atómica [209], entre
outros.
FCUP
Enquadramento do trabalho
75
No campo das biomoléculas, a SALLE tem provado ser um processo de extração
vantajoso relativamente às técnicas convencionais de LLE, fazendo com que esta
técnica tenha adquirido um grande impulso. Para além das vantagens mais óbvias
(baixo consumo de solventes, possibilidade de automação, baixo custo), a utilização
de solventes orgânicos de alta polaridade permite expandir as vantagens da extração
líquido-líquido a uma maior gama de compostos, de baixa até elevada polaridade
[210]. Além disso, a utilização do salting-out é reconhecidamente útil na precipitação
de proteínas em matrizes biológicas. Apesar da SALLE já ter sido descrita na década
de 1980 para a extração de fármacos de amostras biológicas [204], só recentemente é
que lhe tem sido dada maior atenção para aplicações analíticas [203, 211, 212].
A utilização do SALLE para realizar extrações em matrizes complexas tais como
plantas [213], amostras ambientais [214] e alimentos [215-217] tem sido crescente nos
últimos anos. A metodologia QuEChERS revigorou o salting-out aplicado à análise
química extração sobretudo na área do controlo alimentar de pesticidas em alimentos
[215, 216, 218].
Parte II
Microextração por difusão gasosa
FCUP
79
4. Introdução
Como referido anteriormente a técnica de GDME surgiu da combinação das
técnicas de PV, LLME e GD, tirando partido das principais vantagens de cada uma
delas. A caracterização da técnica de GDME começou por ser realizada com o intuito
de otimizar procedimentos de extração de aldeídos e dicetonas presentes em bebidas.
Neste trabalho pretendeu-se realizar uma caracterização mais profunda desta técnica
avaliando alguns dos principais parâmetros experimentais: natureza e características
da membrana, modo de extração, força iónica, temperatura, tempo, agitação da
solução dadora, presença do derivatizante na solução aceitadora e agitação desta
solução (Capítulo 6).
Além dos estudos de caracterização da GDME, foram desenvolvidas metodologias
analíticas para a extração e determinação de alguns compostos responsáveis por off-
flavours em bebidas: aminas (Capítulo 7), acetaldeído (Capítulo 8) e compostos α-
dicarbonílicos (Capítulo 9).
FCUP
81
5. Execução experimental
5.1. Materiais e equipamentos
Os materiais e equipamentos utilizados para a realização do trabalho experimental
foram os seguintes:
Balança de precisão Mettler, modelo PE2000, para pesagem de reagentes.
Balança analítica Mettler, modelo AE50, para pesagem rigorosa de reagentes.
Banho de ultrassons Bandelin Sonorex, modelo TK100, para a homogeneização e
desgaseificação de soluções e amostras.
Medidor de pH Metrohm, modelo 605, equipado com elétrodo combinado de vidro
calibrado com soluções tampão de referência de pH 4 e 7.
Micropipetas Brand Transferpette (2 – 20 μL; 20 – 100 μL), Gilson Pipetman (P100 -
capacidade máxima de 100 µL; P200 – capacidade máxima de 200 µL; P1000 -
capacidade máxima de 1000 µL), Brand e Selecta (capacidade máxima de 5 mL)
para medição rigorosa de pequenos volumes. A medição de volumes superiores a 5
mL foi realizada com pipetas volumétricas de vidro.
Sistemas de purificação de água Millipore Simplicity e Direct-Q3 UV, para
purificação de água (água ultrapura com resistividade superior a 18 MΩ cm)
utilizada para a preparação de soluções e dos eluentes para HPLC.
Módulo de extração por difusão gasosa (GDME) fabricado em PTFE (Fig. 3.8).
Membranas porosas com as características indicadas na Tabela 5.1.
82 FCUP
Execução experimental
Tabela 5.1 - Características principais das membranas utilizadas no módulo de GDME.
Designação Material Tamanho do
poro (µm)
Espessura
(µm) Marca Morfologia
SureVent PVDF modificado 0,22 125 Millipore Porosas
simples Mitex PTFE 5 170 Millipore
Fluoropore 0,22 PTFE com
suporte de HDPE 0,22 150 Millipore
Porosas
suportadas Fluoropore 0,45 PTFE com
suporte de HDPE 0,45 150 Millipore
Zefluor PTFE suportado 2 152 Pall Corporation
Sistema de HPLC com deteção espetrofotométrica utilizado para a determinação de
acetaldeído (secção 8) constituído por:
Bomba com unidade de gradiente quaternário Jasco, modelo PU-2089 Plus;
Unidade de desgaseificação Jasco, modelo DG-1580-54;
Detetor espetrofotométrico Jasco, modelo UV-2070 Plus;
Injetor manual Rheodyne, modelo 7725i, com loop de injeção de 20 µL.
Interface Jasco, modelo LC-Net II/ADC.
Programa Jasco ChromPass Chromatography Data (versão 1.7.403.1) para
o controlo de sistema cromatográfico, a aquisição e a análise dos dados.
Sistema de HPLC com deteção espetrofotométrica utilizado para a determinação de
aldeídos, compostos α-dicarbonílicos (secções 6 e 9) e aminas alifáticas (secção 7)
constituído por:
Bomba de gradiente quaternário PerkinElmer, modelo S200;
Detetor espetrofotométrico PerkinElmer, modelo S200
Amostrador automático PerkinElmer, Flexar com loop de injeção de 100 μL.
FCUP
Execução experimental
83
Programa TotalChrom Navigator (PerkinElmer, versão 6.3.2) para o controlo
do sistema cromatográfico, a aquisição e a análise dos dados.
Sistema de HPLC-DAD-MS/MS para a identificação de compostos obtidos nos
extratos de GDME (secção 8.5) constituído por:
Bomba com unidade de gradiente quaternário Thermo Electron Corporation;
Injetor automático Thermo Electron Corporation;
Detetor espetrofotométrico com rede de díodos;
Detetor MS ion-trap quadrupolo com fonte de ionização por electrospray
(ESI) Finnigan LCQ Deca XP Plus;
Programa XCalibur (versão 1.4) da Thermo Electron Corporation para o
controlo do sistema cromatográfico, a aquisição e a análise dos dados.
Colunas cromatográficas com as características indicadas na Tabela 5.2.
Tabela 5.2 – Características das colunas cromatográficas utilizadas nas separações dos compostos extraídos por
GDME.
Coluna Comprimento Diâmetro
interno
Tamanho da
partícula
Dimensões da
pré-coluna Marca
Gemini C18 250 mm 4,6 mm 5 µm 4 x 3,0 mm Phenomenex
Eurospher C18 250 mm 4,0 mm 5 µm 5 x 4 mm Knauer
Hypersil GOLD 150 mm 4,6 mm 3 µm 10 x 4 mm Thermo
Scientific
5.2. Preparação de soluções
As soluções padrão stock (1 g L-1) dos compostos carbonílicos (Sigma-Aldrich) em
estudo foram preparadas em acetonitrilo e armazenadas a -20 ºC à exceção das
soluções padrão de glioxal, metilglioxal e formaldeído que foram preparadas em água
ultrapura e armazenadas a 4 ºC. As soluções diluídas destes compostos foram
preparadas diariamente em água ultrapura a partir das soluções stock.
84 FCUP
Execução experimental
A solução de 0,01% (m/v) de o-fenilenodiamina (OFDA, 98% pureza, Sigma-
Aldrich) foi preparada diariamente por dissolução do reagente em solução tampão
fosfato 0,1 mol L-1, pH 7 e armazenada ao abrigo da luz. A solução tampão foi
preparada com hidrogenofosfato de sódio (VWR) e o pH foi ajustado com HCl (1 mol L-
1, Panreac).
As soluções de DNPH (0,25% ou 0,6%, m/v) para a derivatização dos aldeídos
foram preparadas por dissolução do reagente comercial (grau de pureza 97%, Sigma-
Aldrich) numa mistura (50:50, v/v) de acetonitrilo e HCl (40 mmol L-1).
As soluções padrão stock (1 g L-1) de metilamina, dimetilamina e etilamina (Sigma-
Aldrich) foram preparadas em HCl (0,1 mol L-1, VWR) e armazenadas a 4 ºC. As
soluções diluídas das aminas foram preparadas diariamente em água ultrapura a partir
das soluções stock. A solução de fenilisotiocianato (PITC, 98% pureza, Sigma-Aldrich)
para derivatização das aminas foi preparada por diluição do reagente em acetonitrilo
(para HPLC, Fisher).
Para as separações cromatográficas utilizou-se acetonitrilo (Panreac, qualidade
para HPLC), solução tampão acetato (20 mmol L-1), preparada a partir da mistura
equimolar de acetato de sódio e ácido acético (Merck) e solução aquosa (0,1%, v/v) de
ácido fórmico (Sigma-Aldrich). Os eluentes para HPLC foram filtrados por filtro de
Nylon (0,45 µm, Whatman) e desgaseificados antes da sua utilização.
5.3. Procedimentos experimentais
5.3.1. Caracterização do processo de extração
As extrações de compostos carbonílicos foram realizadas utilizando 25 mL de
solução padrão num copo termostatizado. No interior do módulo de GDME eram
colocados 0,5 mL de solução aceitadora. Foram testados diferentes parâmetros da
extração: (1) tipo de membrana utilizada (ver Tabela 5.1), (2) modo de extração, (3)
força iónica, (4) temperatura, (5) tempo, (6) agitação da solução dadora, (7) presença
do derivatizante na solução aceitadora e (8) agitação da solução aceitadora.
A análise cromatográfica dos extratos obtidos a partir da extração de soluções
padrão de glioxal, metilglioxal, diacetilo, pentano-2,3-diona e hexano-2,3-diona era
realizada utilizando uma coluna Gemini C18 (ver Tabela 5.2) à temperatura ambiente
utilizando uma fase móvel em modo isocrático com uma mistura 50:50 (v/v)
FCUP
Execução experimental
85
acetonitrilo-solução tampão acetato (20 mmol L-1) durante 15 min e um caudal de 0,8
mL min-1. A deteção era realizada a 315 nm e eram injetados 20 µL de amostra.
Os restantes compostos eram separados por LC numa coluna Gemini C18 (ver
Tabela 5.2) à temperatura ambiente, com um caudal de eluente de 1 mL min-1. O
eluente era composto por acetonitrilo e solução tampão acetato (10 mmol L-1) e foi
utilizado em modo gradiente: (1) de 0 a 25 min a composição de acetonitrilo aumentou
linearmente de 50% a 100%; (2) nos 5 min seguintes a composição da fase móvel
regressou às condições iniciais mantendo-se por mais 10 min. A deteção era realizada
a 360 nm.
5.3.2. Determinação de aminas biogénicas alifáticas
O esquema do procedimento de preparação da amostra encontra-se
esquematizado na Fig. 5.1. No copo termostatizado eram colocados 15 mL de amostra
e no interior do módulo GDME eram colocados 500 µL da solução aceitadora (10
mmol L-1 de NaH2PO4, VWR). As membranas utilizadas, com 10 mm de diâmetro, são
obtidas a partir de corte das membranas Mitex com 47 mm de diâmetro (Tabela 5.1).
Para iniciar a extração, eram adicionados 500 µL de uma solução de NaOH (1 mol L-1,
VWR) e a extração prosseguia a 40 ºC durante 10 min com agitação da amostra e da
solução aceitadora. No final da extração, o extrato era recolhido na totalidade e
transferido para uma ampola de 2 mL para proceder à derivatização das aminas. Para
a reação eram adicionados ao extrato 100 µL de Na3PO4 (0,1 mol L-1, VWR) e 1 mL da
solução de PITC (0,5%, v/v). A reação decorria à temperatura ambiente durante 10
min. Por fim, para parar a reação adicionavam-se 100 µL de HCl (0,1 mol L-1) antes da
análise por HPLC-UV.
Fig. 5.1 – Esquema do procedimento experimental utilizado para a determinação de aminas alifáticas.
86 FCUP
Execução experimental
A análise dos extratos foi efetuada de acordo com o procedimento descrito por
Sahasrabuddhey et al. [173] com pequenas modificações. A separação cromatográfica
era realizada à temperatura ambiente numa coluna Eurospher C18 (Tabela 5.2). O
caudal de eluente utilizado era de 0,8 mL min-1 utilizando um gradiente binário de uma
fase móvel constituída por acetonitrilo e 0,1% de ácido fórmico em água do seguinte
modo: (1) 0 – 8 min a 45% de acetonitrilo; (2) aumento linear até 100% de acetonitrilo
em 7 min; (3) regresso às condições iniciais em 5 min, (4) seguidos de mais 5 min
para estabilização antes da injeção anterior. Eram injetados 20 µL de amostra e a
deteção era feita a 254 nm.
As amostras de vinho analisadas foram adquiridas comercialmente e as amostras
de cerveja foram gentilmente cedidas pela UNICER-Bebidas de Portugal (S. Mamede
de Infesta). A designação, o teor alcoólico e o pH das amostras analisadas encontram-
se referidas na Tabela 5.3.
Tabela 5.3 – Designação, teor alcoólico e pH das amostras de vinho e cerveja analisadas para a determinação de
aminas alifáticas.
Designação da amostra Teor alcoólico (%, v/v) pH
Vinho branco 1 10,5 3,1
Vinho branco 2 12,0 3,1
Vinho branco 3 12,0 3,2
Vinho tinto 1 10,0 3,3
Vinho tinto 2 12,5 3,6
Vinho rosé 11,5 3,4
Cerveja preta 5,0 4,2
Cerveja Pilsner 5,1 3,9
Cerveja sem álcool < 0,5 4,1
5.3.3. Determinação de acetaldeído livre e total em vinhos
O procedimento experimental seguido para a extração foi baseado no trabalho de
Gonçalves et al. [219] com algumas modificações. No copo termostatizado eram
FCUP
Execução experimental
87
colocados 20 mL de amostra. No módulo de GDME, utilizado com as membranas
Mitex (Tabela 5.1) e imerso na amostra, era colocado 1 mL da solução de DNPH
(0,6%, m/v). As extrações eram efetuadas a 50 ºC durante 15 minutos. Os extratos
eram filtrados num filtro de Nylon (VWR, 0,5 µm poro) antes da análise por HPLC-UV.
O acetaldeído livre era determinado a partir da extração direta das amostras de
vinho. Para a determinação do acetaldeído total as amostras de vinho eram diluídas
em solução tampão fosfato (0,1 mol L-1, pH 12,5) antes da extração para permitir a
dissociação dos adutos acetaldeído-HSO3-.
As separações cromatográficas eram realizadas à temperatura ambiente numa
coluna Gemini C18 (Tabela 5.2). A fase móvel era composta por acetonitrilo e tampão
acetato (20 mmol L-1, pH 4) e era utilizada a 1 mL min-1 em modo gradiente do
seguinte modo: (1) nos primeiros 15 min ocorria um aumento linear de 50% a 60% de
acetonitrilo, (2) nos 5 min seguintes a composição da fase móvel voltava às condições
iniciais e estas condições e (3) eram mantidas durante mais 10 minutos para
estabilização antes da injeção seguinte. A deteção do derivado do acetaldeído era
feita a 365 nm e foram injetados 20 µL de amostra.
As amostras analisadas foram adquiridas comercialmente. A designação, o teor
alcoólico e o pH das amostras encontram-se referidas na Tabela 5.4.
Tabela 5.4 – Designação, teor alcoólico e pH das amostras de vinho analisadas para a determinação de acetaldeído
livre e total.
Designação da amostra Teor alcoólico (%, v/v) pH
Vinho tinto 1 11,5 3,7
Vinho tinto 2 10,0 3,3
Vinho tinto 3 12,5 3,6
Vinho rosé 11,5 3,4
Vinho branco 1 11,5 3,2
Vinho branco 2 10,5 3,1
Vinho branco 3 12,0 3,2
Vinho branco 4 12,0 3,1
88 FCUP
Execução experimental
Para os ensaios por HPLC-DAD-MS/MS as separações cromatográficas eram
efetuadas na coluna cromatográfica Hypersil GOLD (Tabela 5.2). As separações
cromatográficas eram realizadas nas mesmas condições utilizadas para as análises
por HPLC-UV mas a um fluxo de 0,4 mL min-1 e usando um volume de injeção de 25
µL. O detetor de MS foi utilizado em modo negativo nas condições descritas na Tabela
5.5.
Tabela 5.5 – Condições utilizadas no detetor de MS para os estudos de identificação dos compostos extraídos por
GDME.
Temperatura do capilar 325 ºC
Corrente da fonte 5,0 kV
Corrente do capilar 4,0 V
Fluxo do sheat gas (N2) 80 unidades arbitrárias
Fluxo do gás auxiliar (N2) 30 unidades arbitrárias
Intervalo de deteção 120–2000 m/z
5.3.4. Determinação de compostos α-dicarbonílicos em amostras alimentares
Num copo termostatizado a 55 ºC eram colocados 25 mL de amostra e, no módulo
de GDME imerso na amostra, eram colocados 500 µL de solução de OFDA (0,01%,
m/v). A membrana utilizada era a SureVent (Tabela 5.1). A extração dos compostos α-
dicarbonílicos da amostra para a solução aceitadora decorria durante 10 min, a 55 ºC
e com agitação contínua da amostra.
A separação cromatográfica dos extratos era realizada numa coluna Phenomenex
Gemini C18 (Tabela 5.2), à temperatura ambiente, com um caudal de eluente de 0,8
mL min-1. A fase móvel era usada em modo isocrático com uma mistura 50:50 (v/v)
acetonitrilo-solução tampão acetato (20 mmol L-1) durante 15 min. A deteção era feita
a 315 nm e eram injetados 20 µL de amostra.
As amostras analisadas (vinho do Porto, chá preto e molho de soja) foram
adquiridas comercialmente. As amostras de vinho e molho de soja eram utilizadas
diretamente no procedimento de extração. A amostra de chá era preparada por
FCUP
Execução experimental
89
infusão, de acordo com as indicações da embalagem (um saco de chá para 200 mL de
água quente). A infusão resultante era utilizada para o procedimento de extração.
FCUP
91
6. Caracterização do processo de extração
O desenvolvimento da GDME surgiu na sequência de modificações de outras
técnicas de extração que recorrem a membranas tais como a PV, a LLME e a GD
(secção 2.4). Pretendia-se conjugar numa única técnica as vantagens de cada uma
das referidas anteriormente, tentando simplificar o mais possível o procedimento
experimental. Uma das principais características desta técnica e que a torna diferente
da PV, da GD e da LLME é a realização de extrações baseadas na difusão gasosa
dos analitos através dos poros de uma membrana microporosa que separa duas
soluções líquidas (fases dadora e aceitadora). No início do desenvolvimento da GDME
foram realizados estudos para avaliar a influência de alguns parâmetros na extração
de dicetonas vicinais presentes em cerveja, tais como a temperatura, tempo, força
iónica, agitação, pH e volume de solução aceitadora [104]. Com o desenvolvimento de
novas aplicações para a GDME a outros analitos, nomeadamente para a determinação
de aldeídos em amostras de cerveja [105] e de diacetilo em vinho [106], foi necessário
voltar a estudar e otimizar alguns destes parâmetros para essas metodologias. No
entanto, não tinha ainda sido realizada nenhuma caracterização de caráter
fundamental sobre a técnica de extração, o que motivou a realização de estudos mais
detalhados sobre vários parâmetros experimentais que serão discutidos nas secções
seguintes.
6.1. Influência da natureza e características da membrana
As características das membranas utilizadas em processos de difusão gasosa
influenciam a eficiência e a seletividade da extração. No caso de membranas
microporosas, a eficiência e seletividade da extração pode estar relacionada com o
tamanho dos poros. De forma a estudar a influência da natureza e das características
da membrana no processo de extração por GDME, foram realizadas extrações de
soluções aquosas de cetonas e aldeídos utilizando as membranas hidrofóbicas
descritas na Tabela 5.1, mantendo constantes a temperatura e o tempo de extração
(55 ºC e 10 min, respetivamente). Os cromatogramas obtidos nas separações
cromatográficas dos compostos analisados encontram-se representados na Fig. 6.1 e
na Fig. 6.2. As membranas estudadas podem ser agrupadas em dois grandes grupos
de acordo com a sua morfologia: membranas porosas simples e membranas porosas
suportadas. Estas diferenças morfológicas associadas ao tamanho dos poros e à
92 FCUP
Caracterização do processo de extração
espessura da membrana influenciam o mecanismo de transporte das espécies através
das membranas, afetando a seletividade e eficiência da extração [220, 221].
Fig. 6.1 - Cromatograma obtido na separação cromatográfica de uma solução padrão com uma concentração de 1 mg
L-1 de cada um dos compostos α-dicarbonílicos. As extrações foram realizadas a 55 ºC durante 10 min e as condições
cromatográficas foram as descritas na secção 5.3.1.
Fig. 6.2 – Cromatograma obtido na separação cromatográfica de uma solução padrão com uma concentração de 2 mg
L-1. As extrações foram realizadas a 55 ºC durante 10 min e as condições cromatográficas foram as descritas na
secção 5.3.1.
Os resultados apresentados na Fig. 6.3 correspondem à soma das áreas dos picos
cromatográficos dos compostos analisados. De forma geral verificou-se que a extração
foi mais eficiente quando se utilizaram membranas de poros maiores (membranas
Mitex e Zefluor), quer para as membranas porosas simples quer para as suportadas.
Ou seja, verificou-se que quanto maior o tamanho do poro, maior é o fluxo de espécies
através da membrana.
FCUP
Caracterização do processo de extração
93
Fig. 6.3 – Soma das áreas dos picos cromatográficos de cetonas e aldeídos extraídos a partir de misturas aquosas
destes compostos utilizando diferentes membranas hidrofóbicas (Tabela 5.1). As extrações foram realizadas com
soluções padrão contendo 1 mg L-1 de cada composto dicarbonílico e 5 mg L-1 de cada aldeído e acetoína, a 55 ºC
durante 10 min.
No entanto, analisando as respostas individuais dos compostos analisados,
verificou-se que para alguns analitos a extração foi mais eficiente quando se utilizaram
membranas de poros menores (Fig. 6.4). Estes resultados mostraram que o tamanho
dos poros da membrana afeta não só a eficiência mas também a seletividade do
processo. Para além disso verificou-se que a eficiência da extração para membranas
com poros do mesmo tamanho (SureVent e Fluoropore 0,22) não foi igual, como se
verifica pela análise dos resultados da Fig. 6.4. Assim, concluiu-se que a eficiência
depende também da porosidade (volume de espaço gasoso contido na membrana), da
distribuição dos poros, da natureza e morfologia da membrana. No caso das
membranas suportadas, a seletividade é também determinada pela composição da
superfície da membrana [220]. Este facto poderá explicar as diferenças na eficiência
da extração de alguns compostos utilizando duas membranas com o mesmo tamanho
de poro mas morfologicamente diferentes.
94 FCUP
Caracterização do processo de extração
Fig. 6.4 – Áreas dos picos cromatográficos do formaldeído, metilglioxal e acetoína obtidos a partir da extração de
soluções aquosas utilizando diferentes membranas hidrofóbicas (Tabela 5.1). As extrações foram realizadas com
soluções padrão contendo 1 mg L-1 de metilglioxal e 5 mg L-1 de formaldeído e acetoína, a 55 ºC durante 10 min.
Se a dependência da eficiência global da extração com o tamanho dos poros da
membrana corresponde ao esperado, isto é, que poros de maiores dimensões
permitem uma mais fácil passagem de analitos, a seletividade verificada é mais difícil
de explicar. Por exemplo para o acetaldeído e o diacetilo (Fig. 6.5), a seletividade do
processo de separação não está exclusivamente dependente do tamanho dos poros
da membrana e, por isso, poderá estar também relacionada com as características e
propriedades das espécies a separar e da morfologia da membrana.
Fig. 6.5 – Áreas dos picos cromatográficos do acetaldeído e diacetilo obtidos a partir da extração de soluções aquosas
utilizando diferentes membranas hidrofóbicas (Tabela 5.1). As extrações foram realizadas com soluções padrão
contendo 5 mg L-1 de acetaldeído e 1 mg L-1 de diacetilo, a 55 ºC durante 10 min.
FCUP
Caracterização do processo de extração
95
Como foi referido anteriormente, é difícil estimar a seletividade do processo de
extração com membranas. No entanto, é possível tentar prever quais as propriedades
dos compostos a separar que poderão influenciar os resultados obtidos, tendo por
base a teoria simplificada do transporte de espécies gasosas através de membranas
[221]. O transporte de gases por difusão através de membranas pode ser descrito pela
primeira lei de Fick
Equação 6.1
em que F é o fluxo do gás através da membrana, D é o coeficiente de difusão e dC/dx
é o gradiente de concentração na membrana. Sabendo que no estado estacionário o
fluxo é constante e se assumirmos que D é constante, a Equação 6.1 pode ser
integrada, obtendo-se
Equação 6.2
em que C0 e Cl são as concentrações do analito nas extremidades da membrana e l é
a espessura da membrana. Para pressões baixas, a concentração do analito na forma
gasosa no interior da membrana pode ser expressa através da lei de Henry e a
Equação 6.2 passa a ser expressa por
Equação 6.3
em que KH é a constante de solubilidade de Henry (definida por C/p) e p0 e pl
correspondem à pressão da espécie gasosa nas extremidades da membrana.
A partir da análise da Equação 6.2 e da Equação 6.3 verifica-se que a difusão de
espécies gasosas através da membrana será tanto maior quanto menor a espessura
da membrana, maior o gradiente de concentração entre as soluções dadora e
aceitadora e maiores forem os valores de D e KH do analito. A seletividade (αA/B) do
processo será dada por
96 FCUP
Caracterização do processo de extração
Equação 6.4
em que A e B são os analitos. Assim, a seletividade da extração será influenciada
pelas diferenças nos coeficientes de difusão e nas constantes de Henry das duas
espécies.
Em suma, a escolha da membrana para a extração por GDME deverá levar em
conta os seguintes aspetos:
o tamanho do poro pode afetar a eficiência global da extração;
a morfologia da membrana (porosa simples ou suportada) pode afetar a
seletividade da extração;
as propriedades dos compostos a separar afetam a eficiência e seletividade
do processo de extração, nomeadamente através dos coeficientes de
difusão e das constantes de Henry.
6.2. Estudo do modo de extração: módulo imerso ou em
headspace
A GDME baseou-se desde o seu início na extração de analitos de uma solução
aquosa dadora para outra aceitadora também aquosa, separadas por uma membrana
hidrofóbica que cria um espaço gasoso entre as duas fases. Como se pode verificar
pelos resultados apresentados na secção 6.1, com esta técnica de extração é possível
determinar uma vasta gama de compostos com diferentes características e
propriedades. Sendo a GDME uma técnica de extração de espécies voláteis, é
interessante avaliar qual o efeito que a imersão da membrana na solução aquosa tem
na eficiência da extração dessas espécies. Assim, efetuaram-se estudos acerca da
extração de cetonas e aldeídos de soluções aquosas, em dois modos distintos (Fig.
6.6):
A. extração com o módulo imerso na solução dadora – em que o transporte
dos analitos ocorre por difusão gasosa através da membrana;
FCUP
Caracterização do processo de extração
97
B. extração com o módulo colocado no headspace da solução – em que o
transporte dos analitos ocorre por pervaporação.
Fig. 6.6 – Esquema dos modos de extração por GDME estudados: (A) com o módulo imerso na solução dadora e (B)
com o módulo no headspace da solução dadora.
No modo de extração A (Fig. 6.6), o transporte de analitos da fase dadora para a
solução aceitadora ocorre em três passos: (1) passagem dos analitos da solução
dadora para a fase gasosa (nos poros da membrana), (2) difusão dos analitos na fase
gasosa através da membrana, e (3) passagem dos analitos para a fase aquosa da
solução aceitadora. Por seu lado, no caso em que o módulo se encontra no
headspace da solução dadora (modo de extração B na Fig. 6.6), existe um passo extra
inicial que consiste na passagem dos analitos para a fase gasosa no headspace, antes
da sua difusão através da membrana.
Para estudar a eficiência do processo de extração nestes dois modos de extração
na eficiência do processo, foram realizadas extrações de soluções aquosas de
cetonas e aldeídos utilizando as membranas SureVent, mantendo constantes a
temperatura e o tempo de extração (55 ºC e 10 min, respetivamente). A membrana
SureVent foi escolhida por se ter verificado que a seletividade da extração não se
encontra limitada pelas características da superfície da membrana, como é o caso das
membranas suportadas (discutido na secção 6.1). Além disso, verificou-se que foi
mais eficiente na extração de compostos de baixa volatilidade, tal como o metilglioxal
(Fig. 6.4).
98 FCUP
Caracterização do processo de extração
Os resultados obtidos (Fig. 6.7) mostraram que existem compostos (metilglioxal,
diacetilo, acetoína, formaldeído e furfural) cuja extração é mais eficiente quando o
módulo se encontra imerso na solução dadora (Fig. 6.6A). Para os restantes
compostos estudados a eficiência da extração foi superior para a situação em que o
módulo de GDME se encontrava em headspace (Fig. 6.8).
Fig. 6.7 – Áreas dos picos cromatográficos dos compostos cuja eficiência da extração é superior quando se realiza a
extração com o módulo de GDME imerso na solução dadora. As extrações foram realizadas com soluções padrão
contendo 1 mg L-1 de metilglioxal e diacetilo e 2 mg L-1 de acetoína, formaldeído e furfural, a 55 ºC durante 10 min e
utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1).
Fig. 6.8 - Áreas dos picos cromatográficos dos compostos cuja eficiência da extração é superior quando se realiza a
extração com o módulo de GDME no headspace da solução dadora. As extrações foram realizadas com soluções
padrão contendo 1 mg L-1 de pentano-2,3-diona e hexano-2,3-diona e 2 mg L-1 de cada um dos restantes compostos, a
55 ºC durante 10 min e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1).
De acordo com a Equação 6.2 e a Equação 6.3 referidas na secção anterior, o
transporte através da membrana está relacionado com o coeficiente de difusão da
espécie através da membrana (D), da constante de Henry (KH) e da diferença de
FCUP
Caracterização do processo de extração
99
pressão (ou concentração) entre os dois lados da membrana. Relacionando os
resultados obtidos (Fig. 6.7 e Fig. 6.8) com os valores de KH dos compostos
analisados (Tabela 6.1) verifica-se que para os compostos menos voláteis (compostos
da Fig. 6.7) a extração com o módulo imerso é mais eficiente do que com o módulo em
headspace, com exceção da pentano-2,3-diona e da hexano-2,3-diona. Estas
interpretações com base no valor de KH podem dar uma indicação acerca do
comportamento dos compostos nos dois modos de extração estudados. Estas
conclusões devem, porém, ser aplicadas de forma cautelosa devido à dependência de
KH com a temperatura, força iónica, solvente, entre outros.
Tabela 6.1 – Lista dos valores das constantes de Henry (KH) para as cetonas e aldeídos estudados por ordem
crescente de volatilidade.
KH /mol m-3 atm-1 Ref.
Diacetilo 5,08 x 106 a [222]
Pentano-2,3-diona 3,82 x 106 a [222]
Metilglioxal 3,70 x 106 a [222]
Formaldeído 2,97 x 106 b [223]
Hexano-2,3-diona 2,87 x 106 a [222]
Acetoína 9,71 x 104 a [222]
Furfural 7,46 x 104 a [222]
Benzaldeído 3,75 x 104 b [223]
trans-2-hexenal 2,04 x 104 b [224]
Acetaldeído 1,50 x 104 b [225]
2-octenal 1,36 x 104 b [224]
Propanal 1,36 x 104 b [224]
trans-2-pentenal 1,34 x 104 a [222]
Butanal 8,70 x 103 b [224]
Acroleína 8,20 x 103 b [225]
trans-2-heptenal 7,63 x 103 a [222]
Pentanal 6,80 x 103 b [224]
100 FCUP
Caracterização do processo de extração
Hexanal 4,69 x 103 b [224]
trans-2-nonenal 4,33 x 103 a [222]
Heptanal 3,70 x 103 b [224]
trans-2-decenal 3,26 x 103 a [222]
Octanal 1,95 x 103 b [224]
Nonanal 1,36 x 103 b [224]
Decanal 5,56 x 102 b [226]
a Valor estimado.
b Valor obtido experimentalmente.
Por outro lado, o transporte através da membrana depende também do coeficiente
de difusão (D) (ver Equação 6.3). Em membranas porosas com poros de dimensões
superiores a 0,05 μm assume-se que o processo de transporte através dos poros pode
ser descrito através do modelo de difusão de Knudsen3 [221]. Neste modelo a
constante de difusão da espécie A (DA) pode ser definida por4:
Equação 6.5
Assim, para o fenómeno de transporte de massa através de membranas porosas
contribuem, para além da volatilidade do analito (representada pelo valor de KH),
também o diâmetro do poro (dporo), a temperatura (T) e a massa molecular (MA) do
analito. Assim, para o mesmo tamanho de poro e temperatura constante, DA varia com
a raiz quadrada do inverso da massa molecular do analito. O parâmetro DKH da
equação (3) será o resultado dos diversos fatores acima descritos e todos eles
deverão ser considerados para prever o comportamento de cada espécie química
durante a extração.
3 A difusão de Knudsen ocorre quando o percurso médio livre das moléculas de gás é maior do que o tamanho de poro.
Neste caso, as colisões das moléculas com a parede do poro são mais frequentes do que as colisões entre moléculas
(Javaid, Chem. Eng. J. (2005), 112, 219-226).
4 kB é a constante de Boltzmann.
FCUP
Caracterização do processo de extração
101
Relativamente ao modo de extração B (Fig. 6.6), no qual o módulo de GDME se
encontra no headspace da solução dadora, será a primeira etapa da extração (a
passagem dos analitos para a fase gasosa no headspace) a condicionar de modo
mais significativo o transporte de analitos através da membrana. Se só for considerada
a volatilidade do analito, quanto menor for o valor de KH (maior volatilidade) maior será
a concentração da espécie no headspace da solução. Desta forma, o gradiente de
pressão (ou concentração) nos dois lados da membrana será maior e o transporte
dessas moléculas é favorecido. Assim se podem explicar os resultados obtidos com os
analitos mais voláteis (Fig. 6.8).
Com estes estudos conclui-se que é possível realizar a extração por GDME de
uma vasta gama de compostos com características e propriedades distintas em dois
modos de extração diferentes: por imersão do módulo na solução dadora ou com o
módulo colocado no headspace da solução. A utilização do módulo imerso na solução
é especialmente vantajosa para a extração de compostos de baixa volatilidade em
soluções aquosas.
6.3. Influência da força iónica
A adição de um sal à amostra num processo de extração é um procedimento de
reconhecida utilidade para aumentar a eficiência através do efeito de salting-out. Para
avaliar o efeito do aumento da força iónica da amostra na extração de compostos por
GDME, foram realizados ensaios com adições de diferentes quantidades de NaCl
(entre 0 e 2 mol L-1) à solução dadora. Os ensaios foram realizados com o módulo
imerso na solução dadora utilizando as membranas SureVent.
Para os compostos analisados (à exceção do metilglioxal) verificou-se um aumento
do sinal analítico com o aumento da concentração de NaCl na solução dadora, mais
significativo nos compostos mais voláteis e com baixa solubilidade em água (com
menor valor de KH). Na Fig. 6.9 estão representados os resultados obtidos para dois
compostos com valores de KH diferentes (ver Tabela 6.1). Como se verifica na Fig. 6.9,
a variação do sinal analítico com o aumento da força iónica é muito maior para o
decanal (KH = 5,56 x 102 mol m-3 atm-1) do que para o formaldeído (KH = 2,97 x 106 mol
m-3 atm-1), na gama de concentrações de NaCl estudadas.
102 FCUP
Caracterização do processo de extração
Fig. 6.9 – Áreas dos picos cromatográficos do formaldeído e do decanal para a extração por GDME destes compostos
com diferentes concentrações de NaCl na solução dadora. As extrações foram realizadas com soluções padrão
contendo 2 mg L-1 de formaldeído e decanal, a 55 ºC durante 10 min e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1).
O metilglioxal foi o único composto para o qual não se verificou aumento da
eficiência da extração com o aumento da força iónica (resultados apresentados na Fig.
6.10).
Fig. 6.10 - Áreas dos picos cromatográficos do metilglioxal para a extração por GDME com diferentes concentrações de
NaCl na solução dadora. As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1 mg L-1 metilglioxal, a 55 ºC
durante 10 min e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1).
Os resultados obtidos neste estudo permitiram mostrar que a força iónica da
solução dadora em GDME tem maior influência na extração de compostos com baixa
solubilidade em água e elevada volatilidade, isto é, com valores de KH mais baixos. O
facto de não se terem observado diferenças mais significativas nos compostos com
valores de KH superiores, como por exemplo o formaldeído (Fig. 6.9), poderá estar
relacionado com a gama de concentrações de NaCl estudada. A concentração de sal
necessária para produzir um efeito mais significativo na volatilização dos analitos
FCUP
Caracterização do processo de extração
103
depende de KH e quanto maior for o valor desta constante (maior solubilidade em água
e menor volatilidade) maior será a quantidade de sal necessária para produzir um
efeito de salting-out [227]. Assim, seria provavelmente necessária uma maior
quantidade de sal na solução dadora para aumentar a eficiência da extração de
compostos como o formaldeído (Fig. 6.9) e o metilglioxal (Fig. 6.10).
6.4. Influência da temperatura de extração
A influência da temperatura na extração por GDME foi estudada em soluções
aquosas de compostos dicarbonílicos (metilglioxal, diacetilo, pentano-2,3-diona e
hexano-2,3-diona) entre 25 e 65 ºC, durante 10 min. Não foram testadas temperaturas
superiores para evitar perdas de solução aceitadora por evaporação. Os resultados
obtidos (Fig. 6.11) mostram que o aumento de temperatura aumenta a extração dos
compostos para a solução aceitadora. Verificou-se que o aumento do sinal analítico
variou de forma quase linear com a temperatura para o diacetilo, a pentano-2,3-diona
e a hexano-2,3-diona. Por seu lado, o comportamento do metilglioxal seguiu uma
tendência exponencial com a temperatura. Ou seja, o efeito da temperatura na
extração não foi a mesma para todos os compostos testados.
Fig. 6.11 – Áreas dos picos cromatográficos do metilglioxal, diacetilo, pentano-2,3-diona e hexano-2,3-diona realizando
a extração por GDME a temperaturas diferentes (entre 25 e 65 ºC). As extrações foram realizadas com soluções
padrão contendo 1 mg L-1 de cada analito, durante 10 min e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1)
Como discutido nas secções anteriores, o transporte de massa em GDME depende
do coeficiente de difusão (D) da espécie química e do seu KH. Por sua vez estas duas
variáveis dependem da temperatura, e por isso o efeito que este parâmetro terá na
104 FCUP
Caracterização do processo de extração
eficiência da extração depende do analito. Assim, a temperatura será um importante
parâmetro a estudar quando se pretende desenvolver um novo processo de extração.
A otimização da temperatura deverá ter em conta, sobretudo, a sensibilidade desejada
para os analitos.
6.5. Influência do tempo de extração
A influência do tempo da extração por GDME foi avaliada na extração de soluções
aquosas de compostos dicarbonílicos (metilglioxal, diacetilo, pentano-2,3-diona e
hexano-2,3-diona) a 55 ºC. Pela análise dos resultados (Fig. 6.12) verifica-se um
aumento do sinal analítico de todos os compostos analisados com o aumento do
tempo de extração.
Fig. 6.12 – Variação das áreas dos picos cromatográficos dos compostos dicarbonílicos (metilglioxal, diacetilo,
pentano-2,3-diona e hexano-2,3-diona) com o tempo de extração. As extrações foram realizadas com soluções padrão
contendo 1 mg L-1 de cada analito, a 55 ºC e utilizando as membranas SureVent (Tabela 5.1).
A criação de um modelo para interpretar os mecanismos de transferência de
massa em GDME é bastante complexa devido à existência de diversas variáveis que
influenciam o transporte dos analitos da solução dadora (amostra) para a fase
aceitadora. Para a extração por SPME já existem modelos matemáticos simplificados
para descrever a cinética da extração [228]. O mesmo tipo de tratamento matemático
foi igualmente desenvolvido para a extração por HF-LPME [229]. Nesses casos, a
interpretação teórica da extração baseia-se nos seguintes pressupostos:
existência de duas interfaces: amostra/membrana e membrana/solução
aceitadora;
FCUP
Caracterização do processo de extração
105
consideram que no interior da membrana não existe gradiente de
concentração, admitindo que na fase gasosa os coeficientes de difusão são
muito superiores aos coeficientes de difusão na fase líquida;
consideram que no estado estacionário, o fluxo de massa na interface
amostra/membrana é igual ao da interface membrana/solução aceitadora.
Nestas condições o processo de extração pode ser descrito por5:
Equação 6.6
em que: n é a quantidade de analito extraída; A é a área da interface; maceit é o
coeficiente de transferência de massa do analito na solução aceitadora; k é a
constante da velocidade de evaporação; VAM, Vm e Vaceit são os volumes da amostra,
dos poros da membrana e da solução aceitadora, respetivamente; K1 e K2 são os
coeficientes de equilíbrio de partição nas interfaces amostra/membrana e membrana
/solução aceitadora, respetivamente; t é o tempo; e C0 é a concentração inicial do
analito na amostra.
Assim, atendendo à Equação 6.6, conclui-se que a quantidade de analito extraída
(n) varia de forma assintótica com o tempo de extração (t) e que, para tempos de
extração constantes, a quantidade extraída varia linearmente com a concentração de
analito na amostra (C0). É, aliás, esta dependência linear de n com C0 que possibilita a
aplicação destas técnicas de extração em metodologias de quantificação.
Transpondo estas previsões teóricas para os resultados apresentados na Fig. 6.12
verifica-se que o sinal analítico do diacetilo, da pentano-2,3-diona e da hexano-2,3-
diona varia de forma assintótica com o tempo de extração de acordo com o previsto
pela Equação 6.6. Porém, para o metilglioxal, a quantidade extraída ao longo do
tempo varia de forma linear para tempos superiores a 20 min (r2 = 0,996). Para este
composto, atendendo à elevada solubilidade em água e à sua baixa volatilidade, a
velocidade de passagem ao estado gasoso é pequena; assim, para os tempos de
5 Adaptação da equação que descreve o processo de extração por SPME em headspace (J. Ai, Anal. Chem. 69 (1997)
3260-3266).
106 FCUP
Caracterização do processo de extração
extração estudados, verifica-se que n varia linearmente com t, de acordo com a
seguinte equação [228]:
Equação 6.7
Os estudos descritos nas secções seguintes para avaliar as influências da agitação
da solução dadora, da presença do derivatizante na solução aceitadora e a agitação
dessa solução estão de acordo com esta interpretação teórica.
6.6. Influência da agitação da solução dadora
A agitação da solução dadora tem como principal função o aumento da difusão dos
analitos do seio desta solução para a superfície da membrana permitindo aumentar a
eficiência da extração. A influência da agitação foi estudada em soluções aquosas de
compostos dicarbonílicos a 25 ºC variando o tempo de extração entre 10 e 240 min.
Ao contrário dos ensaios descritos nas secções anteriores que foram realizados a 55
ºC, neste estudo decidiu-se realizar as extrações a temperaturas mais baixas para
garantir que a passagem dos analitos para a fase gasosa fosse o passo limitante do
processo de extração e, assim, conseguir verificar se a presença da agitação
influenciava a eficiência da extração. O metilglioxal não foi utilizado neste estudo dado
que, nestas condições experimentais, não foi possível detetar o seu sinal analítico. Os
resultados obtidos para os compostos estudados (diacetilo, pentano-2,3-diona e
hexano-2,3-diona) foram todos no mesmo sentido e, por isso, só serão apresentados
os resultados obtidos para o diacetilo.
Os resultados obtidos no estudo da agitação da solução dadora são apresentados
na Fig. 6.13. Observa-se que com e sem agitação o sinal analítico varia linearmente
com o tempo de extração. Esta relação é distinta da observada nos resultados
representados na Fig. 6.12 (em que o comportamento era assintótico). No entanto,
neste caso a temperatura de extração utilizada neste estudo, 25 ºC, foi inferior à do
estudo anterior, 55 ºC, e, por isso, o processo de extração está a ser controlado pela
passagem do analito para a fase gasosa. Neste caso, será a Equação 6.7 que
representará o processo de extração nas condições estudadas.
FCUP
Caracterização do processo de extração
107
Fig. 6.13 – Área do pico cromatográfico do diacetilo em função do tempo de extração com e sem agitação da solução
aceitadora. As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1 mg L-1 de diacetilo, a 25 ºC e utilizando as
membranas Mitex (Tabela 5.1).
O aumento da eficiência da extração do diacetilo quando a solução dadora se
encontrava em agitação (Fig. 6.13) foi significativo para os tempos de extração mais
longos (acima dos 60 min). Conclui-se, assim, que no caso em que a passagem dos
analitos para a fase gasosa é o passo limitante do processo, a agitação da solução
dadora só tem maior efeito no aumento da eficiência da extração para tempos de
extração longos.
6.7. Influência do derivatizante na solução aceitadora
De forma a estudar a influência da presença do derivatizante na solução aceitadora
na quantidade de analito extraída e na velocidade da extração, efetuaram-se ensaios
em que a solução aceitadora continha o derivatizante (como nos ensaios
anteriormente descritos) e ensaios em que os analitos eram inicialmente recolhidos em
água e, só após essa recolha, eram derivatizados. Os resultados obtidos para
extrações de diacetilo são apresentados na Fig. 6.14.
A presença do derivatizante na solução aceitadora permite aumentar o gradiente
de concentração do analito entre as duas superfícies da membrana. Isto é, como o
analito que vai chegando à solução aceitadora vai sendo convertido no
correspondente derivado, vai-se mantendo a diferença de concentração de analito nas
108 FCUP
Caracterização do processo de extração
Fig. 6.14 – Área do pico cromatográfico do diacetilo em função do tempo de extração com agitação da solução dadora,
a presença e ausência de derivatizante na solução aceitadora. As extrações foram realizadas com soluções padrão
contendo 1 mg L-1 de diacetilo, a 25 ºC e utilizando as membranas Mitex (Tabela 5.1).
duas faces da membrana, permitindo aumentar a velocidade com que a extração
decorre (como representado na Fig. 3.9). Pelo contrário, quando o derivatizante não
está presente na solução aceitadora, a velocidade de extração vai depender da
velocidade com que o analito se difunde nessa solução. Ou seja, esta etapa passa a
ser o passo limitante do processo e por isso a dependência da quantidade extraída
com o tempo é assintótica de acordo com a Equação 6.8 [228].
Equação 6.8
6.8. Influência da agitação da solução aceitadora
O efeito da agitação da solução aceitadora foi estudado na ausência e na presença
do reagente derivatizante. Quando a extração foi realizada sem derivatizante, a
agitação da solução aceitadora permitiu aumentar a eficiência da extração (Fig. 6.15)
dado que a agitação aumenta a difusão das espécies na solução aceitadora. A
dependência da quantidade extraída com o tempo foi, porém, a mesma verificada nos
resultados apresentados na Fig. 6.14 (extração sem derivatizante) mas em que os
níveis de analito extraído são superiores para cada tempo de extração estudado,
relativamente ao processo de extração sem agitação da solução aceitadora.
FCUP
Caracterização do processo de extração
109
Fig. 6.15 - Área do pico cromatográfico do diacetilo em função do tempo de extração com e sem agitação da solução
aceitadora (não contendo o reagente derivatizante). As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1
mg L-1 de diacetilo, a 25 ºC e utilizando as membranas Mitex (Tabela 5.1).
Quando a extração foi realizada com o derivatizante contido na solução aceitadora,
a agitação desta solução não provocou variações significativas na quantidade de
analito extraída (Fig. 6.16). Estes resultados confirmam o efeito preponderante que a
presença do derivatizante na solução aceitadora tem na eficiência da extração.
Fig. 6.16 – Área do pico cromatográfico do diacetilo em função do tempo de extração com e sem agitação da solução
aceitadora (contendo o reagente derivatizante). As extrações foram realizadas com soluções padrão contendo 1 mg L-1
de diacetilo, a 25 ºC e utilizando as membranas Mitex (Tabela 5.1).
FCUP
111
7. Determinação de aminas biogénicas
alifáticas
Neste capítulo descreve-se o desenvolvimento de uma metodologia por HPLC-UV
para a determinação de aminas biogénicas alifáticas (metilamina, dimetilamina e
etilamina) presentes em bebidas. O procedimento de extração baseia-se na GDME
utilizando uma membrana hidrofóbica de PTFE e recolha dos analitos voláteis numa
solução aceitadora aquosa. Os analitos são posteriormente derivatizados com uma
solução de PITC e depois é feita a análise por HPLC-UV. A metodologia foi otimizada
e aplicada à determinação das três aminas em vinhos e cervejas.
7.1. Otimização dos parâmetros da extração
Os procedimentos desenvolvidos descritos nos capítulos anteriores que recorrem à
GDME foram realizados incluindo a derivatização dos analitos durante a extração [104,
105, 230]. No entanto, no caso das aminas tal não foi possível. Para que a reação
ocorra num período de tempo aceitável (10-20 min) é necessário que a concentração
de PITC seja superior a 0,5%. Sendo este reagente muito pouco solúvel em água, tem
que ser preparado num solvente orgânico, como por exemplo o acetonitrilo. Porém, a
utilização de acetonitrilo como solvente da solução derivatizante inviabiliza o seu uso
em conjunto com as membranas Mitex (Tabela 5.1) no GDME dado que o solvente
atravessa a membrana durante a extração. Assim, optou-se por realizar os
procedimentos de extração e de derivatização em separado.
Para a extração das aminas o controlo do pH tanto da amostra como da solução
aceitadora é um fator chave. Relativamente à extração, dado que esta é baseada na
volatilidade dos compostos, o pH da amostra deverá ser bastante superior ao valor de
pKa dos analitos para que estes estejam na sua forma não ionizada e, portanto, na sua
forma volátil. A adição de NaOH à amostra foi suficiente para aumentar o pH de forma
a extrair as aminas de amostras como o vinho e cerveja (Fig. 7.1).
112 FCUP
Determinação de aminas biogénicas alifáticas
Fig. 7.1 – Áreas dos picos cromatográficos das aminas biogénicas alifáticas utilizando diferentes concentrações de
NaOH na solução dadora. As extrações foram realizadas utilizando soluções padrão de 0,5 mg L-1 de cada analito, a 40
ºC, durante 10 min.
Na solução aceitadora as condições do meio serão as opostas às necessárias na
solução dadora. Ou seja, as aminas alifáticas são extraídas da amostra, passam
através dos poros da membrana e são recolhidas numa solução aceitadora com
características ligeiramente ácidas (NaH2PO4 10 mmol L-1) para que a ionização dos
grupos amina ocorra e os analitos fiquem “retidos“ nessa solução. Pode-se considerar,
assim, que a utilização de uma solução com a capacidade de atuar desta forma nos
grupos funcionais dos analitos exerce um efeito semelhante ao uso de um
derivatizante na solução aceitadora.
Após extrair os compostos é necessário proceder à derivatização dos analitos para
a deteção por UV em HPLC. A reação das aminas com o PITC é favorecida a pH
alcalino obrigando à alteração do pH do extrato obtido no GDME. Foram testados
alguns pares ácido-base conjugados utilizados como solução tampão de forma a
selecionar as melhores condições para o procedimento. O uso de NaOH ou de sais de
carbonato propostos por Sahasrabuddhey et al. [173] foi excluído dado que as
soluções resultantes eram muito instáveis ao contrário dos sais de fosfato que
resultaram na melhor opção. Assim, ao extrato obtido em NaH2PO4 (10 mmol L-1) foi
adicionado Na3PO4 (0,1 mol L-1) de forma a obter um pH alcalino favorável à reação
das aminas com o PITC. No final do tempo definido para a reação de derivatização, a
reação pode ser parada através de uma nova alteração de pH para valores abaixo do
pKa das aminas.
FCUP
Determinação de aminas biogénicas alifáticas
113
Para além do pH, a temperatura e o tempo de extração são parâmetros
experimentais importantes e têm um impacto direto na extração dos compostos. Os
resultados obtidos (Fig. 7.2) mostram que tempos mais longos e temperaturas mais
altas permitem uma maior eficiência de extração. A temperatura de extração foi
estudada no intervalo 25 a 60 ºC (utilizando um tempo de extração de 10 min) e os
resultados mostram que é possível extrair as aminas, mesmo à temperatura ambiente,
ou seja, a volatilização dos compostos é possível através de uma simples alteração do
pH da amostra. No entanto verificou-se que a repetibilidade da extração é superior
para temperaturas mais altas. Assim, foi selecionada a temperatura de 40 ºC para os
ensaios subsequentes porque permitiu uma boa sensibilidade e não é uma
temperatura suficientemente elevada para ocorrer a perda por evaporação dos
analitos na solução aceitadora.
Fig. 7.2 - Áreas dos picos cromatográficos das aminas biogénicas alifáticas utilizando diferentes temperaturas de
extração. As extrações foram realizadas utilizando soluções padrão de 0,5 mg L-1 de cada analito, durante 15 min.
No caso do tempo de extração (testado entre 2 e 20 min) verificou-se que mesmo
utilizando intervalos de tempo curtos (2 minutos) é possível determinar as aminas (Fig.
7.3). Assim como foi concluído a partir dos ensaios da influência da temperatura,
também no caso do tempo de extração se verifica que o pH da amostra é o principal
fator a contribuir para a extração dado que os analitos são muito voláteis. Não
obstante, a escolha de tempos de extração superiores será recomendável de forma a
aumentar a repetibilidade da metodologia.
114 FCUP
Determinação de aminas biogénicas alifáticas
Fig. 7.3 - Representação gráfica das áreas dos picos cromatográficos das aminas biogénicas alifáticas utilizando
diferentes tempos de extração. As extrações foram realizadas utilizando soluções padrão de 0,5 mg L-1 de cada analito,
a 40 ºC.
A agitação da solução dadora desempenha nesta situação dois efeitos positivos.
Por um lado, permite aumentar a difusão dos analitos para a solução aceitadora e, por
outro lado, garante a homogeneização da solução após a adição de NaOH para
aumento do pH da amostra. Neste caso particular, a agitação da solução aceitadora foi
também utilizada dado que se verifica que a quantidade de aminas extraídas é
superior quando se utiliza agitação, e a repetibilidade é também melhorada. Este efeito
estará relacionado com o aumento da difusão das espécies na solução aceitadora,
que aumenta a eficiência da extração.
Em suma, a temperatura e o tempo de extração devem ser otimizados de forma a
obter uma melhor repetibilidade. Temperaturas ligeiramente acima da temperatura
ambiente e tempos de extração superiores a 10 min são recomendáveis. A amostra
(solução dadora) deverá ser ajustada a valores de pH acima do pKa das aminas e a
solução aceitadora deverá ser ligeiramente ácida para permitir a “retenção” dos
analitos.
7.2. Validação da metodologia
As curvas de calibração para as aminas estudadas (entre 80 e 500 µg L-1 para
metilamina e dimetilamina e entre 80 µg L-1 e 5 mg L-1 para etilamina) foram
comparadas com as curvas de adição de padrão destes compostos às amostras. Na
Fig. 7.4 encontram-se representados os cromatogramas da adição de soluções padrão
das aminas a uma amostra. Por aplicação do teste t-Student (com 99% de intervalo de
FCUP
Determinação de aminas biogénicas alifáticas
115
confiança) aos declives das curvas verificou-se que existiam diferenças
estatisticamente significativas entre eles e, portanto, a quantificação dos analitos nas
amostras foi realizada pelo método das adições de padrão.
Fig. 7.4 – Cromatograma obtido para um extrato de uma amostra de cerveja preta de acordo com as condições
referidas na secção 5.3.2.
O desempenho da metodologia foi avaliado usando amostras de vinho branco
fortificadas com adições de metilamina, dimetilamina e etilamina (n = 5). Os limites de
deteção e de quantificação foram calculados a partir de 3 e 10 vezes o desvio-padrão
da regressão linear [231]. A precisão intra-dia (repetibilidade) foi avaliada pela análise
de 5 réplicas da amostra no mesmo dia (Tabela 7.1).
Tabela 7.1 – Limites de deteção (LD) e de quantificação (LQ), e repetibilidade da metodologia desenvolvida para a
quantificação de aminas alifáticas por GDME.
Amina LD (µg L-1) LQ (µg L-1) Repetibilidade
Metilamina 12 39 8%
Dimetilamina 34 112 4%
Etilamina 46 153 5%
116 FCUP
Determinação de aminas biogénicas alifáticas
7.3. Quantificação das aminas em vinho e cerveja
A aplicabilidade da metodologia foi testada através da determinação de metilamina,
dimetilamina e etilamina em seis amostras de vinhos e três amostras de cerveja.
Algumas características das amostras analisadas encontram-se na Tabela 5.3.
Um tratamento preliminar às amostras só foi necessário para as cervejas e
consistiu na desgaseificação por ultrassons durante 5 min. Todas as extrações foram
executadas de acordo com o procedimento descrito na secção 5.3.2. Os resultados da
quantificação das aminas encontram-se na Tabela 7.2. Nas amostras analisadas
foram determinados níveis variáveis das aminas alifáticas em estudo. Nos vinhos a
etilamina estava presente em maior quantidade enquanto que nas cervejas era a
dimetilamina a mais abundante.
Tabela 7.2 – Valores de concentração obtidos para as aminas biogénicas alifáticas por GDME nas amostras de vinho e
cerveja descritas na Tabela 5.3.
Sample
Concentração (desvio padrão) /mg L-1
Metilamina Dimetilamina Etilamina
Vinho branco 1 0,232 (0,002) < LQ 2,09 (0,01)
Vinho branco 2 0,242 (0,003) 0,117 (0,006) 0,87 (0,03)
Vinho branco 3 0,026 (0,007) < LQ 0,67 (0,09)
Vinho tinto 1 0,202 (0,005) 0,093 (0,003) 3,70 (0,08)
Vinho tinto 2 0,087 (0,009) < LQ 2,08 (0,05)
Vinho rosé 0,098 (0,001) 0,133 (0,003) 0,144 (0,002)
Cerveja preta 0,350 (0,001) 0,420 (0,005) 0,317 (0,004)
Cerveja Pilsner 0,140 (0,005) 0,491 (0,003) 0,127 (0,006)
Cerveja sem álcool 0,252 (0,006) 0,677 (0,003) 0,133 (0,002)
FCUP
117
8. Determinação de acetaldeído livre e total
em vinhos
Nos vinhos, a presença de acetaldeído em níveis elevados é responsável não só
por odores e sabores indesejáveis mas também pode provocar diversos efeitos
adversos à saúde humana. A atividade sensorial do acetaldeído pode ser reduzida por
adição de sulfitos durante a produção do vinho devido à formação de adutos entre o
acetaldeído e os sulfitos. No entanto, o acetaldeído ligado pode ser libertado durante o
período de armazenamento sendo, por isso, importante conhecer o seu teor total de
forma a prever a evolução da qualidade do vinho a longo prazo.
A metodologia desenvolvida baseia-se na extração do acetaldeído do vinho
utilizando a GDME e na análise dos extratos por HPLC-UV. A quantidade de
acetaldeído ligado aos sulfitos foi determinada realizando um passo de hidrólise
alcalina antes da extração de forma a dissociar os adutos. A metodologia foi aplicada à
análise de diferentes amostras de vinho. Para além do acetaldeído, foram identificados
outros aldeídos nos extratos por HPLC-MS/MS.
8.1. Otimização das condições de extração
Os resultados obtidos para o estudo da influência do tempo e da temperatura na
extração do acetaldeído encontram-se na Fig. 8.1.
Fig. 8.1 – Variação da área do pico cromatográfico do acetaldeído com (A) o tempo (a uma temperatura de 50 ºC) e (B)
a temperatura de extração (durante 15 min). As extrações foram realizadas utilizando uma amostra de vinho tinto.
A quantidade de acetaldeído extraída aumenta linearmente com o aumento do
tempo de extração e exponencialmente com o aumento de temperatura. Resultados
semelhantes já tinham sido obtidos num trabalho anterior para a extração de
118 FCUP
Determinação de acetaldeído livre e total em vinhos
acetaldeído de amostras de cerveja [219]. Para os estudos seguintes foi utilizado um
tempo de extração de 15 minutos e uma temperatura de 50 ºC. 15 min é um tempo
não muito excessivo e fornece uma boa sensibilidade, e 50 ºC é uma temperatura
relativamente alta para não sofrer alterações com a variação da temperatura ambiente,
não dando lugar a fenómenos de evaporação significativos.
8.2. Estudo da influência do SO2 e do etanol
A formação de adutos entre o HSO3- e compostos carbonílicos é uma reação
reversível e depende do pH da amostra. Como referido anteriormente, ao pH do vinho
o sulfito está na forma de HSO3- e formam adutos com diversas espécies, incluindo o
acetaldeído. No entanto, quando o valor de pH é inferior a 1 (pKa1 = 1,85) ou superior a
8 (pKa2 = 7,2) [232] o sulfito passa a estar presente maioritariamente nas formas SO2 e
SO32-, respetivamente. Nestas condições as ligações dos adutos tendem a quebrar e
as espécies passam a estar preferencialmente na sua forma livre (ver secção 3.1.2).
Por esta razão é possível determinar o teor total de acetaldeído ligado aos sulfitos
realizando uma hidrólise [159, 160]. Apesar de a pH 10 apenas uma pequena
percentagem de HSO3- estar presente, recomenda-se o uso de valores de pH
superiores a 10 para garantir a dissociação total dos adutos [106].
Equação 8.1
Equação 8.2
A influência do SO2 na extração do acetaldeído foi estudada pela adição de
quantidades conhecidas de Na2SO3 (como fonte de SO2) a uma amostra de vinho
antes da extração. Nestes ensaios as extrações foram realizadas a 50 º C durante 15
min. Verificou-se que a adição de SO2 ao vinho provoca a diminuição de acetaldeído
extraído (Fig. 8.2) confirmando que ocorre a formação de adutos entre os dois
compostos.
FCUP
Determinação de acetaldeído livre e total em vinhos
119
Fig. 8.2 – Variação do sinal analítico do acetaldeído com a concentração de SO2 para o estudo do efeito da
concentração de SO2 no teor de acetaldeído extraído. As extrações foram realizadas sobre uma amostra de vinho tinto,
a 50 ºC durante 15 min.
Assim, realizando a extração a um valor de pH típico dos vinhos (entre 3 e 4) só
será possível extrair o acetaldeído que não se encontra ligado ao SO2, isto é, o
acetaldeído livre. Ajustando o pH da amostra a um valor superior (pH 12.5) foi possível
quebrar esses adutos e consequentemente a quantidade de acetaldeído extraída
aumentou, correspondendo ao acetaldeído total (Fig. 8.2). De notar que se verifica que
a quantidade de acetaldeído extraída a pH 12.5 para as diferentes adições de SO2 se
mantem constante, ou seja, é independente da concentração de SO2 adicionada.
Estes resultados demonstram a importância do SO2 na “disponibilidade” do
acetaldeído nos vinhos e a forma como a extração deste aldeído é afetada pela sua
presença. Além disso, confirmam que a alcalinização do vinho permite a quantificação
do acetaldeído total ligado aos sulfitos nas amostras, já que nessas condições ocorre
a dissociação dos adutos.
A influência do etanol na extração também foi avaliada. Na extração de soluções
padrão de acetaldeído (20 mg L-1) verificou-se uma diminuição de 1,5 vezes no sinal
analítico do acetaldeído para um teor de etanol de 15% (v/v). Foram realizados
ensaios idênticos numa amostra de vinho, no entanto a diminuição do sinal não foi tão
significativa como no caso da solução padrão. Na amostra de vinho a diminuição
máxima de acetaldeído extraído (1,3 vezes) verificou-se para incrementos de 25 %
(v/v) de etanol (resultando em cerca de 36,5% de teor total de etanol no vinho). Estes
ensaios mostram que o etanol dificulta a extração do acetaldeído e que esse efeito é
mais significativo em soluções padrão. O efeito de diminuição menos pronunciado nos
120 FCUP
Determinação de acetaldeído livre e total em vinhos
vinhos poderá estar relacionado com a composição da matriz que pode atenuar este
efeito.
8.3. Validação da metodologia
Foram construídas duas curvas de calibração para o acetaldeído, uma utilizando
soluções padrão do analito preparadas em água contendo 12% (v/v) de etanol, e outra
com soluções padrão de acetaldeído preparadas em solução tampão fosfato (0,1 mol
L-1, pH 12,5) contendo 12% (v/v) de etanol. Não se verificaram diferenças
estatisticamente significativas (teste t-Student com intervalo de confiança de 99%)
entre os declives das duas curvas de calibração concluindo-se que o processo de
extração não é afetado pela alteração de pH da amostra.
Foram realizadas adições de padrão a amostras de vinho e amostras de vinho
alcalinizadas e verificou-se, por aplicação do teste t-Student (com 99% de intervalo de
confiança), que existiam diferenças estatisticamente significativas entre os declives
das curvas de adição de padrão e os declives das curvas de calibração. Além disso,
ao contrário do verificado para as soluções padrão, nas amostras a alteração do pH
influenciou o processo de extração. Por estas razões a determinação do acetaldeído
livre e total nas amostras foi realizada pelo método da adição de padrão. As adições
de acetaldeído foram feitas no intervalo de concentração 10 a 250 mg L-1, dependendo
da concentração do aldeído na amostra. As figuras de mérito foram avaliadas
utilizando uma amostra de vinho branco. Os limites de deteção (LD) e de quantificação
(LQ) foram obtidos a partir de 3 e 10 vezes o desvio-padrão da regressão linear,
respetivamente [231]. Para a determinação do acetaldeído livre os valores de LD e LQ
foram 1,1 mg L-1 e 3,5 mg L-1, respetivamente; para a determinação do acetaldeído
total foram 0,8 mg L-1 e 2,5 mg L-1. A repetibilidade foi avaliada pela análise de extratos
de cinco réplicas de uma amostra, realizados no mesmo dia. A reprodutibilidade foi
calculada a partir dos resultados obtidos de três réplicas em quatro dias diferentes. Os
resultados obtidos para a repetibilidade e a reprodutibilidade foram 4,4% e 4,9%,
respetivamente.
8.4. Quantificação do acetaldeído em vinhos
A metodologia desenvolvida foi aplicada à quantificação do acetaldeído livre e total
em oito amostras de vinho descritas na Tabela 5.4. Os resultados (Fig. 8.3) para o
acetaldeído livre variaram entre 5,04 e 25,9 mg L-1 e para o total entre 154,1 e 906,1
FCUP
Determinação de acetaldeído livre e total em vinhos
121
mg L-1. Nos vinhos tintos analisados a quantidade de acetaldeído livre foi praticamente
idêntica entre amostras (concentração média de 13 ± 2 mg L-1) mas nos vinhos
brancos a sua concentração é muito variável. A quantidade de acetaldeído total é em
geral superior nos vinhos brancos assim como o teor de acetaldeído ligado (cerca de
98%). Estes resultados podem ser explicados pelos maiores níveis de SO2
encontrados nos vinhos brancos. No entanto, para todos os vinhos verifica-se que
mais de 90% do acetaldeído presente se encontra na forma ligada.
Fig. 8.3 – Concentração de acetaldeído livre e total (barras) e da percentagem de acetaldeído ligado (pontos) obtidas
nas amostras de vinho descritas na Tabela 5.4. As extrações foram realizadas de acordo com o procedimento descrito
na secção 5.3.3.
8.5. Identificação por HPLC–DAD–MS/MS dos compostos
extraídos
Para além do acetaldeído, verificou-se que foi possível extrair outros compostos
carbonílicos das amostras de vinho. A identificação desses compostos foi realizada
através de análises por HPLC-MS/MS de extratos de amostras de vinho, comparando
os espetros de massa obtidos com os de soluções padrão e com a informação
recolhida na literatura [233-235]. Um cromatograma típico de um extrato de vinho tinto
encontra-se na Fig. 8.4 e a lista dos compostos identificados em amostras de vinho e
os seus principais fragmentos encontram-se na Tabela 8.1.
122 FCUP
Determinação de acetaldeído livre e total em vinhos
Fig. 8.4 - Cromatograma de um extrato de uma amostra de vinho utilizando as condições descritas na secção 5.3.3; os
picos numerados representam os compostos identificados e que se encontram listados na Tabela 8.1.
Tabela 8.1 – Compostos identificados por HPLC-DAD-MS/MS em extratos de amostras de vinho.
Pico Compostoa tR /min λmáx/nm [M-H]- Fragmentos típicos (intensidade)
1 Acetoínab (isómero Z) 10,4 364 267 152 (100), 179 (72), 177 (62), 120 (13), 153 (10)
2 Formaldeído 11,8 355 209 163 (100), 151 (72), 120 (57), 179 (57), 123 (20)
3 Acetoína (isómero E) 12,9 370 267 152 (100), 179 (75), 177 (28), 122 (20), 151 (15)
4 Acetaldeído 14,3 364 223 163 (100), 179 (92), 151 (63), 152 (39), 120 (37),
163 (27), 151 (27)
5 Furfural 17,7 394 275 228 (100), 163 (44), 179 (43), 151 (16), 120 (15),
111 (14)
6 Propanal 19,0 364 237 163 (100), 179 (69), 151 (41), 152 (34), 191 (30),
192 (24), 120 (22), 207 (14), 153 (12)
7 Acroleínac 20,6 376 433 235 (100), 223 (62), 179 (47), 167 (10)
8 Butanal 23,1 360 251 163 (100), 221 (91), 152 (68), 179 (52), 151 (50),
120 (35), 153 (31), 205 (24), 176 (19), 191 (11)
9 iso-butanal 24,0 363 251 163 (100), 179 (66), 205 (34), 152 (27), 151 (27),
120 (24), 153 (24), 221 (18)
a Compostos identificados como derivados de DNPH.
b 3-Hidroxi-2-butanona
c Propen-2-al
Nos extratos analisados foram identificados sete aldeídos e uma cetona. Todos
estes compostos são derivados de DNPH com fragmentos característicos deste tipo
FCUP
Determinação de acetaldeído livre e total em vinhos
123
de compostos (m/z 120 e 179). Foram também encontrados alguns outros fragmentos
típicos (m/z 152 e 122) resultantes de múltiplas fragmentações MS/MS dos
compostos, tal como [M-H]-→[M-H-30]-→m/z 152→m/z 122 [233].
Os aldeídos e as cetonas podem ser distinguidos pela presença de um fragmento
intenso com m/z 163 nos derivados de aldeídos e que é residual nos derivados de
cetonas. Nestes últimos compostos, o fragmento com m/z 179 é mais intenso do que o
de m/z 163. O derivado do furfural é caracterizado por dois iões resultantes de
fragmentação: [M-H-47]- (m/z 228) e [M-H-164]- (m/z 111). Verificou-se também que o
máximo de absorção na região UV é superior aos valores observados nos aldeídos
acíclicos.
A acroleína (propen-2-al) foi o único aldeído insaturado detetado no vinho. O
fragmento mais intenso, com m/z 433, corresponde a uma molécula de acroleína que
reagiu com duas moléculas de DNPH [234]. O fragmento mais representativo deste ião
é o m/z 235, que corresponde à perda de uma molécula de DNPH.
A distinção entre o butanal e o iso-butanal não é simples dado que a semelhança
das suas estruturas químicas resulta numa fraca separação cromatográfica e o
máximo de absorção no UV é praticamente o mesmo. Para além disso, os seus
espetros de massa são idênticos e os padrões de fragmentação também. As tentativas
de identificação utilizando soluções padrão podem ser infrutíferas dado que, em
muitos casos, ambos os compostos estão presentes nos padrões. No entanto existe
uma pequena diferença nos padrões de fragmentação dos dois aldeídos. A
fragmentação do ião com m/z 251 nos aldeídos não ramificados origina um ião
característico de m/z 191 com cerca de 10% de abundância (relativamente a m/z 163),
e que não é visível nos aldeídos ramificados [233]. Assim, os compostos com tempo
de retenção 23,1 e 24 minutos foram identificados como butanal-DNPH e iso-butanal-
DNPH, respetivamente.
A única cetona identificada, a acetoína, originou dois picos cromatográficos,
atribuídos aos isómeros Z e E do composto acetoína-DNPH. Este tipo de resultado é
comum em derivados de DNPH e caracteriza-se pela observação de ligeiras
diferenças nos máximos de absorção no UV e que permitem a distinção isomérica
[235].
FCUP
125
9. Determinação de compostos α-
dicarbonílicos em amostras alimentares
9.1. Otimização das condições de extração
Nos resultados apresentados e discutidos na secção 6.2 verificou-se que a
extração de compostos com elevada solubilidade em água e baixa volatilidade, como é
o caso do metilglioxal, era favorecida quando o módulo de GDME se encontrava
imerso na solução dadora. O sinal analítico do metilglioxal aumentou cerca de 4 vezes
quando o módulo de GDME se encontra imerso em solução (Fig. 6.7), quando
comparado com a situação em que o módulo foi colocado no headspace da solução
dadora. Por isso, realizaram-se os ensaios seguintes com o módulo imerso na
amostra.
A partir do estudo da natureza e características da membrana descrito na secção
6.1 verificou-se que a eficiência da extração foi superior para as membranas SureVent
(Fig. 6.4). A comparação dos sinais analíticos do metilglioxal, diacetilo e pentano-2,3-
diona obtidos por extração com as membranas Mitex e com as membranas SureVent
encontra-se na Fig. 9.1. Neste estudo utilizou-se uma solução padrão contendo 1 mg
L-1 dos três analitos e realizou-se a extração a 55 ºC durante 10 min. Para os três
compostos analisados verificou-se um aumento na eficiência da extração com a
membrana SureVent, sendo a maior diferença obtida para o metilglioxal, para o qual
se registou um aumento de 2,5 vezes. Por esta razão, os ensaios seguintes foram
realizados com a membrana SureVent.
Fig. 9.1 – Áreas dos picos cromatográficos do metilglioxal, diacetilo e pentano-2,3-diona obtidos a partir da extração de
uma solução padrão (contendo 1 mg L-1 de cada analito) utilizando as membranas de SureVent e Mitex; as extrações
foram realizadas em triplicado a 55 ºC durante 10 min.
126 FCUP
Determinação de compostos α-dicarbonílicos em amostras alimentares
Os resultados obtidos no estudo da temperatura e tempo de extração são
apresentados na Fig. 6.11 e na Fig. 6.12, respetivamente. Verificou-se que os sinais
analíticos aumentaram com o aumento da temperatura e do tempo de extração. No
entanto, de forma a obter o melhor compromisso entre a sensibilidade e o tempo de
extração optou-se por realizar o procedimento a 55 ºC durante 10 min.
9.2. Validação da metodologia
A quantificação dos compostos α-dicarbonílicos nas amostras foi realizada pelo
método das adições de padrão, dado que se verificaram diferenças estatisticamente
significativas entre os declives das curvas de calibração e das curvas da adição de
padrão (teste t-Student com 99% de intervalo de confiança). Foram feitas adições de
soluções padrão contendo os compostos α-dicarbonílicos em quatro níveis de
concentração (ensaios realizados em triplicado). As adições foram feitas nas seguintes
gamas de concentração, dependendo da concentração dos analitos nas amostras:
metilglioxal entre 0,2 e 4 mg L-1; diacetilo entre 0,1 e 4 mg L-1 e pentano-2,3-diona
entre 0,05 e 0,8 mg L-1.
A linearidade foi avaliada pela análise de extratos obtidos a partir de solução
padrão dos compostos α-dicarbonílicos nas gamas de concentrações habitualmente
encontradas nas amostras. Os coeficientes de determinação (r2) obtidos foram todos
superiores a 0,994. A repetibilidade (precisão intra-dia) foi obtida a partir da análise de
três réplicas de extratos de uma amostra de vinho do Porto Tawny no mesmo dia. A
reprodutibilidade (precisão inter-dia) foi avaliada pela análise de três réplicas da
mesma amostra em três dias diferentes. Os valores obtidos para a precisão intra-dia
foram de 4,1%, 3,5% e 4,5% para o metilglioxal, diacetilo e pentano-2,3-diona,
respetivamente. A precisão inter-dia foi de 6%, 8% e 9% para o metilglioxal, diacetilo e
pentano-2,3-diona, respetivamente.
9.3. Quantificação dos compostos α-dicarbonílicos nas
amostras
A metodologia desenvolvida foi aplicada à quantificação de metilglioxal, diacetilo e
pentano-2,3-diona em amostras de vinho do Porto, molho de soja e chá preto. Os
resultados obtidos são apresentados na Fig. 9.2. O metilglioxal foi determinado nas
amostras em concentrações entre 0,24 e 1,7 mg L-1. A concentração mais alta foi
obtida para uma das amostras de vinho do Porto Tawny. Esta amostra foi aquela em
FCUP
Determinação de compostos α-dicarbonílicos em amostras alimentares
127
que os níveis de diacetilo e pentano-2,3-diona foram mais baixos (0,6 ± 0,1 mg L-1 e
0,06 ± 0,01 mg L-1, respetivamente) de entre as amostras de vinho do Porto
analisadas. Na amostra de molho de soja o metilglioxal foi o composto α-dicarbonílico
presente em maior quantidade (0,6 ± 0,1 mg L-1) seguido do diacetilo (0,10 ± 0,02 mg
L-1) e da pentano-2,3-diona (0,023 ± 0,008 mg L-1). Na amostra de chá preto só foi
determinado o metilglioxal (0,25 ± 0,02 mg L-1).
Fig. 9.2 – Concentrações de metilglioxal, diacetilo e pentano-2,3-diona obtidas nas amostras analisadas e descritas na
secção 5.3.4.
FCUP
129
10. Conclusões
A técnica de extração GDME, estudada neste capítulo, é uma técnica de aplicação
simples que permite a extração de compostos voláteis de matrizes complexas. O
reduzido tamanho das membranas utilizadas e a facilidade com que estas podem ser
trocadas são duas das principais vantagens desta técnica. A eficiência e a seletividade
do processo de extração dependem de vários fatores, tais como as características da
membrana, a força iónica, a temperatura, o tempo, a composição da fase aceitadora e
a agitação. A influência destes fatores na eficiência e seletividade foram estudados em
soluções aquosas modelo de cetonas e aldeídos.
O estudo de diferentes membranas permitiu verificar que o tamanho dos poros
afeta sobretudo a eficiência da extração. No conjunto dos compostos estudados, em
que a gama de dimensões moleculares era bastante diversa, observou-se que a
eficiência da extração foi superior nas membranas com poros maiores (2 e 5 μm). Por
outro lado, a seletividade do processo de extração parece estar também estar
relacionada com a morfologia da membrana (porosa simples ou porosa suportada) e
com as propriedades físico-químicas dos analitos, nomeadamente com os coeficientes
de difusão nos poros da membrana e com a volatilidade da espécie (relacionada com
a constante de Henry). Foi a partir deste estudo que foi possível verificar que a
eficiência da extração de compostos pouco voláteis e de elevada solubilidade em água
(como o metilglioxal) pode ser melhorada utilizando membranas de poros de
dimensões menores.
Um outro aspeto importante na técnica de GDME é a realização da extração por
imersão do módulo na amostra. A comparação da eficiência da extração nestas
condições com a situação em que o módulo foi colocado no headspace da amostra
permitiu verificar que a imersão do módulo na amostra aumenta a eficiência da
extração dos compostos menos voláteis.
De forma geral verificou-se que a eficiência da extração aumenta com o aumento
do tempo e da temperatura utilizados. A força iónica apresentou um efeito mais
significativo na extração dos compostos mais voláteis.
A influência da agitação da solução dadora e da solução aceitadora e a presença
do derivatizante na solução aceitadora foram avaliadas. Verificou-se que a agitação da
solução dadora tem um efeito de aumento da eficiência da extração para tempos de
130 FCUP
Conclusões
extração longos (acima de 60 min). A presença do derivatizante na solução aceitadora
aumenta a eficiência da extração visto que, ao converter os analitos noutra espécie
química na solução aceitadora, mantém elevado o gradiente de concentração nas
duas superfícies da membrana. A agitação da solução aceitadora, quando na
presença do derivatizante, não teve efeito significativo na eficiência da extração. Por
outro lado, na ausência do derivatizante na solução aceitadora, a agitação dessa
solução permite aumentar a quantidade de analitos extraída visto que é promovida a
difusão dos analitos na solução. A importância da agitação da solução aceitadora
quando não está presente o derivatizante foi igualmente verificada no processo de
extração de aminas biogénicas alifáticas.
Para além do estudo de caracterização da técnica, a GDME foi utilizada para o
desenvolvimento de metodologias analíticas para a determinação de aminas
biogénicas alifáticas, acetaldeído e outros aldeídos, e compostos α-dicarbonílicos em
bebidas.
Os estudos apresentados neste capítulo contribuíram para uma mais adequada
compreensão desta técnica de extração para aplicação à análise de amostras
aquosas, e principalmente a analitos que não tinham ainda sido extraídos por GDME.
Os estudos de caracterização da técnica permitiram compreender melhor os
fenómenos de transferência de massa no processo de extração e a influência que
diferentes parâmetros experimentais têm na eficiência e seletividade da extração.
Parte III
Extração líquido-líquido assistida por
salting-out
FCUP
135
11. Introdução
Apesar de ser uma técnica conhecida há várias décadas, a extração líquido-líquido
assistida por salting-out (SALLE) é um instrumento para preparação de amostras que
só recentemente passou a ser mais utilizado pela Química Analítica. Este facto explica
a razão para o uso desta técnica na preparação de amostras para análise por LC ser
ainda reduzida, e existirem oportunidades para expandir a sua aplicação a
metodologias de análise química.
Nesta parte do trabalho foi estudada a utilização da SALLE como técnica de
extração de compostos de amostras líquidas para análise por HPLC. No capítulo 13
apresenta-se um estudo fundamental do processo SALLE com particular ênfase nas
misturas água-acetonitrilo, fazendo uma avaliação do efeito de alguns parâmetros
experimentais considerados como os mais influentes neste tipo de extração. Os efeitos
de cada parâmetro foram avaliados com base na separação dos dois líquidos (água e
acetonitrilo) em duas fases induzida pela adição de sal e na eficiência da extração de
compostos α-dicarbonílicos de soluções padrão aquosas e de amostras. Com base
nestes estudos, desenvolveu-se uma metodologia para a determinação desses
compostos em amostras de vinho e cerveja (capítulo 14).
No capítulo 15 apresenta-se uma aplicação da extração SALLE com base num
procedimento desenvolvido recentemente que tem sido bastante utilizado na análise
de pesticidas em amostras sólidas, a metodologia QuEChERS (acrónimo de Quick,
Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe). Este procedimento envolve dois passos na
preparação da amostra, (1) uma extração líquido-líquido do tipo SALLE e (2) uma
limpeza do extrato orgânico obtido através de uma extração em fase sólida dispersiva
(d-SPE). Apresenta-se, assim, no capítulo 15 uma aplicação da metodologia
QuEChERS para a análise de fenóis voláteis por LC. O objetivo foi desenvolver uma
metodologia simples para a determinação de fenóis voláteis em bebidas por LC. Dado
que a maioria das metodologias existentes que recorrem à LC não envolve nenhuma
preparação da amostra, pretendia-se que a metodologia proposta pudesse ser uma
solução eficiente para a limpeza da amostra sem complicar demasiado o processo
analítico. A necessidade de realizar uma limpeza da amostra tem particular
importância na prevenção dos sistemas analíticos, sobretudo das colunas
cromatográficas. Além disso, pretendeu-se que a metodologia correspondesse a uma
aplicação inovadora para o procedimento QuEChERS, isto é, que pudesse representar
136 FCUP
Introdução
o alargamento desse procedimento a outros analitos e matrizes, mantendo o modo
original como o procedimento foi criado.
FCUP
137
12. Execução experimental
12.1. Materiais e equipamentos
Os materiais e equipamentos utilizados para a realização deste trabalho foram os
seguintes:
Balança de precisão Mettler, modelo PE2000, para pesagem de reagentes.
Balança analítica Mettler, modelo AE50, para pesagem rigorosa de reagentes.
Banho de ultrassons Bandelin Sonorex, modelo TK100, para a homogeneização e
desgaseificação de soluções e amostras.
Medidor de pH Metrohm, modelo 605, equipado com elétrodo combinado de vidro
calibrado com soluções tampão de referência de pH 4 e 7.
Micropipetas Brand Transferpette (2 – 20 μL; 20 – 100 μL), Gilson Pipetman (P100 -
capacidade máxima de 100 µL; P200 – capacidade máxima de 200 µL; P1000 -
capacidade máxima de 1000 µL), Brand e Selecta (capacidade máxima de 5 mL)
para medição rigorosa de pequenos volumes. A medição de volumes superiores a 5
mL foi realizada com pipetas volumétricas de vidro.
Sistemas de purificação de água Millipore Simplicity e Direct-Q3 UV, para
purificação de água (água ultrapura com resistividade superior a 18 MΩ cm)
utilizada para a preparação de soluções e eluentes para HPLC.
Sistema de HPLC com deteção espetrofotométrica utilizado para a determinação de
fenóis (secção 15) constituído por:
Bomba com unidade de gradiente quaternário Jasco, modelo PU-2089 Plus;
Unidade de desgaseificação Jasco, modelo DG-1580-54;
Detetor espetrofotométrico Jasco, modelo UV-2070 Plus;
Injetor manual Rheodyne, modelo 7725i, com loop de injeção de 20 µL.
Interface Jasco, modelo LC-Net II/ADC.
138 FCUP
Execução experimental
Programa Jasco ChromPass Chromatography Data (versão 1.7.403.1) para
o controlo de sistema cromatográfico, a aquisição e a análise dos dados.
Sistema de HPLC com deteção espetrofotométrica utilizado para a determinação de
aldeídos, compostos α-dicarbonílicos (secções 13 e 14) constituído por:
Bomba de gradiente quaternário PerkinElmer, modelo S200;
Detetor espetrofotométrico PerkinElmer, modelo S200;
Amostrador automático PerkinElmer, Flexar com loop de injeção de 100 μL.
Programa TotalChrom Navigator (PerkinElmer, versão 6.3.2) para o controlo
de sistema cromatográfico, a aquisição e a análise dos dados.
Colunas cromatográficas com as características referidas na Tabela 12.1:
Tabela 12.1 – Características das colunas cromatográficas utilizadas nas separações cromatográficas dos compostos
extraídos por SALLE.
Coluna Comprimento Diâmetro
interno
Tamanho da
partícula
Dimensões da
pré-coluna Marca
Gemini C18 250 mm 4,6 mm 5 µm 4 x 3,0 mm Phenomenex
Eurospher C18 250 mm 4,0 mm 5 µm 5 x 4 mm Knauer
12.2. Preparação de soluções
As soluções padrão stock (1 g L-1) dos compostos α-dicarbonílicos foram
preparadas por diluição da quantidade apropriada do reagente comercial (Sigma-
Aldrich) no solvente apropriado. As soluções de glioxal e metilglioxal foram preparadas
a partir dos reagentes comerciais (40% v/v em água) em água ultrapura e
armazenados a 4 ºC. As soluções dos restantes α-dicarbonilos foram preparadas a
partir de diacetilo (97%), a pentano-2,3-diona (97%) e a hexano-2,3-diona (90%) em
acetonitrilo e armazenados a -20 ºC. As soluções de trabalho foram preparadas por
diluição das soluções de 1 g L-1 em solução tampão fosfato (0,1 mol L-1, pH 7). A
solução tampão foi preparada com dihidrogenofosfato de sódio (Merck) e o pH foi
ajustado com ácido clorídrico (Merck).
FCUP
Execução experimental
139
A solução de extração/derivatização contendo OFDA (0,5%, m/v) foi preparada
diariamente a partir da dissolução do reagente comercial (98%, Sigma-Aldrich) em
acetonitrilo (Fisher) e armazenada ao abrigo da luz.
As soluções padrão individuais (1 g L-1) dos fenóis voláteis (fenol, cresol, 4-
vinilfenol, 4-vinilguaiacol, 4-etilfenol, 4-etilguaiacol e eugenol) foram preparadas em
acetonitrilo a partir de padrões com um grau de pureza superior a 98% (exceto o 4-
vinilfenol, que era uma solução 10% em propilenoglicol) e armazenadas a -20 ºC. As
soluções de trabalho foram preparadas diariamente a partir das soluções de 1 g L-1 por
diluição em água ultrapura.
Os sais utilizados eram de grau analítico (Sigma-Aldrich): carbonato de potássio
(K2CO3), sulfato de magnésio (MgSO4), acetato de sódio (CH3COONa), acetato de
amónio (CH3COONH4), sulfato de amónio [(NH4)2SO4], cloreto de sódio (NaCl), cloreto
de amónio (NH4Cl), sulfato de sódio (Na2SO4), nitrato de sódio (NaNO3), cloreto de
cálcio (CaCl2), brometo de sódio (NaBr), carbonato de sódio (Na2CO3) e tiocianato de
amónio (NH4SCN).
Os ensaios com mistura de sais de citrato foram realizados utilizando os tubos de
extração comercias (Sigma-Aldrich), constituídos por 1 g NaCl, 0,5 g de
dihidrogenocitrato de sódio sesquidratado, 1 g de citrato de trissódio dihidratado e 4 g
de MgSO4. As restantes misturas de sais foram preparadas com a seguinte
composição: (A) 2 g NaCl, (B) 2 g NaCl + 2 g MgSO4 e (C) 2 g acetato de sódio + 2 g
MgSO4.
Para o passo de limpeza do extrato na metodologia QuEChERS foram testados
três tubos d-SPE comerciais (Sigma-Aldrich) e dois não comerciais (preparados no
laboratório a partir de sorventes fornecidos pela Sigma-Aldrich). A composição de
cada tubo testado encontra-se descrita na Tabela 12.2.
140 FCUP
Execução experimental
Tabela 12.2 – Designações e composições dos tubos comerciais e não comerciais de d-SPE testados na limpeza do
extrato em acetonitrilo.
Designação Composição do tubo
Comerciais
Tubo PSA 150 mg PSA6 + 900 mg MgSO4
Tubo PSA/C18 150 mg PSA + 150 mg C18 + 900 mg MgSO4
Tubo PSA/GCB 150 mg PSA + 15 mg GCB7 + 900 mg MgSO4
Não comerciais
Tubo GCB 15 mg GCB + 900 mg MgSO4
Tubo C18 150 mg C18 + 900 mg MgSO4
A solução tampão acetato (10 mmol L-1) utilizada na fase móvel de HPLC-UV foi
preparada a partir de acetato de sódio e ácido acético (Merck) em água ultrapura. Os
eluentes para HPLC foram filtrados com um filtro de Nylon (0,45 μm, Whatman) e
desgaseificados antes da sua utilização.
12.3. Procedimentos experimentais
12.3.1. Determinação de compostos α-dicarbonílicos para o estudo da
SALLE
A derivatização dos analitos era realizada por adição de o-fenilenodiamina (OFDA,
98%, Sigma-Aldrich) à solução padrão de trabalho de forma a obter uma concentração
final de OFDA de 0,2% (m/v). A reação decorria ao abrigo da luz durante 1 hora. À
solução padrão dos compostos α-dicarbonílicos derivatizados (5 mg L-1) era
adicionado o solvente a testar na proporção 1:1 (v/v). Para induzir a separação dos
solventes era adicionada a quantidade necessária de sal de forma a obter uma
concentração final de 1 mol L-1 no volume total da mistura. A mistura era agitada e
centrifugada a 6000 rpm durante 5 min. Nos casos em que ocorria formação de duas
fases líquidas, recolhia-se a fase superior para posterior análise por HPLC-UV. O
esquema simplificado do procedimento encontra-se na Fig. 12.1. A razão de volume
6 PSA: adsorvente contendo N-propiletilenodiamina de base polimérica
7 Carbono preto grafitizado não poroso
FCUP
Execução experimental
141
das fases foi calculada e definida como R = Vsup./Vinf., em que Vsup. e Vinf. são os
volumes de fase superior e inferior, respetivamente, obtidos após a centrifugação das
soluções. Foi igualmente calculada a fração extraída definida por (mA/mA’) x 100, em
que mA e mA’ correspondem à massa de analito extraída para a fase superior e a
massa total de analito presente no início da extração, respetivamente.
Fig. 12.1 – Esquema simplificado do procedimento de extração por SALLE para o estudo da técnica em misturas
acetonitrilo-água.
Os extratos obtidos por SALLE foram analisados por HPLC-UV de acordo com o
procedimento descrito por Pacheco et al. [104]. A separação cromatográfica era
realizada à temperatura ambiente numa coluna Gemini C18 (Tabela 12.1). A fase
móvel, constituída por uma mistura 50:50 (v/v) de acetonitrilo e solução tampão
acetato (10 mmol L-1, pH 4,8), era utilizada em modo isocrático a 0,8 mL min-1. O
volume de amostra injetado era de 20 µL e o comprimento de onda de deteção era
315 nm.
As amostras de cerveja analisadas (cerveja sem álcool e cerveja com 5,6% de
álcool) foram gentilmente cedidas pela UNICER-Bebidas de Portugal (S. Mamede de
Infesta, Portugal).
12.3.2. Determinação de compostos α-dicarbonílicos em amostras de
bebidas utilizando a SALLE
As amostras de bebidas eram diluídas (2:5, v/v) com solução tampão acetato (0,2
mol L-1, pH 4) e era adicionado o padrão interno (hexano-2,3-diona) para uma
concentração final de 0,25 mg L-1. Num tubo de 10 mL misturava-se 2 mL da amostra
diluída, 2 mL de solução de OFDA (0,5%, m/v) e 0,13 g NaCl. Depois de agitar
vigorosamente a mistura até à dissolução quase completa do sal, a solução era
mantida ao abrigo da luz durante 1 hora à temperatura ambiente para ocorrer a
extração e derivatização simultânea dos analitos. No final, os tubos eram
142 FCUP
Execução experimental
centrifugados a 6000 rpm durante 2 minutos para facilitar a separação das fases e era
recolhida uma alíquota para análise por HPLC-UV. O esquema simplificado do
procedimento experimental encontra-se na Fig. 12.2.
Fig. 12.2 – Esquema do procedimento experimental para a determinação de compostos α-dicarbonílicos utilizando
SALLE.
Os derivados dos compostos α-dicarbonílicos (quinoxalinas) eram determinados
por HPLC-UV usando uma coluna Gemini C18 (características na Tabela 12.1) à
temperatura ambiente. A fase móvel era composta por (A) acetonitrilo e (B) tampão
acetato (10 mmol L-1) utilizada a um fluxo de 0,8 mL min-1 em modo gradiente: (1) nos
primeiros 5 min era mantida a composição em 30% de A; (2) até aos 15 min
aumentava-se A linearmente até 50%; (3) nos 5 minutos seguintes a composição da
fase móvel regressava às condições iniciais e (4) mantinha-se por mais 15 min antes
da injeção seguinte. O volume de amostra injetado era de 20 µL e a deteção realizava-
se a 315 nm.
As amostras de vinho e cerveja de origem portuguesa analisadas foram adquiridas
em supermercados. Algumas das suas características encontram-se descritas na
Tabela 12.3.
FCUP
Execução experimental
143
Tabela 12.3 – Designação, teor alcoólico e pH das amostras analisadas para a determinação de compostos α-
dicarbonílicos após extração por SALLE.
Amostra Teor alcoólico (%, v/v) pH
Vinho branco 1 11,0 3,1
Vinho branco 2 11,5 3,4
Vinho branco 3 12,5 3,3
Vinho branco 4 13,0 3,5
Vinho tinto 1 13,5 3,5
Vinho tinto 2 11,5 3,4
Vinho tinto 3 12,5 3,7
Vinho rosé 9,0 3,3
Cerveja Pilsner 5,0 4,1
Cerveja preta 5,0 4,2
12.3.3. Determinação de fenóis voláteis através da metodologia QuEChERS
Em tubos de 10 mL eram colocados 5 mL de amostra aos quais eram adicionados
2,5 mL de acetonitrilo. A mistura era agitada durante 1 min. Para permitir a separação
da mistura em duas fases, eram adicionados 2 g de NaCl aos tubos, que
posteriormente eram agitados por mais 1 min e centrifugados a 6000 rpm. Da fase
superior era recolhido 1 mL que se transferia para um tubo PSA. O tubo era agitado
durante 1 min, seguido de centrifugação a 6000 g durante 10 min. Por fim, o extrato
era recolhido e analisado por HPLC-UV-FLD. O esquema do procedimento de
preparação da amostra encontra-se na Fig. 12.3. As fotografias junto aos esquemas
dos tubos ilustram o aspeto da amostra ao longo do procedimento.
144 FCUP
Execução experimental
Fig. 12.3 – Esquema do procedimento de preparação da amostra para a determinação de fenóis voláteis por HPLC-UV-
FLD.
As separações cromatográficas eram realizadas à temperatura ambiente numa
coluna Eurospher C18 (Tabela 12.1). A fase móvel era composta por acetonitrilo (para
HPLC, Fisher) e tampão acetato (10 mmol L-1, pH 4,7) e era utilizado um fluxo de 0,7
mL min-1 em modo gradiente: (1) nos primeiros 25 min o acetonitrilo aumentava
linearmente de 30 a 35%; (2) nos 5 min seguintes o teor de acetonitrilo aumentava
para 50%; (3) a composição da fase móvel regressava às condições iniciais nos 5 min
seguintes e (4) essas condições eram mantidas durante mais 5 min para estabilização
antes da injeção seguinte. Os comprimentos de onda utilizados para a deteção dos
fenóis voláteis foram escolhidos de forma a obter a máxima sensibilidade para cada
analito. O detetor UV fixado a 280 nm foi utilizado para a deteção de 4-etilfenol, 4-
etilguaiacol e eugenol; os restantes fenóis foram detetados por fluorimetria a λexcitação =
260 nm e a λemissão = 305 nm, para o fenol e cresol, e a λexcitação = 259 nm e a λemissão =
341 nm, para 4-vinilfenol e 4-vinilguaiacol.
As amostras de cerveja foram gentilmente cedidas pela UNICER-Bebidas de
Portugal (S. Mamede de Infesta, Portugal). As amostras de vinho, de sumos e de
néctares foram adquiridas em supermercados locais.
FCUP
145
13. Estudo da extração líquido-líquido
assistida por salting-out em misturas
acetonitrilo-água
Neste capítulo discute-se o fenómeno de salting-out aplicado a misturas líquido-
líquido homogéneas de acetonitrilo-água, para posterior aplicação na extração de
compostos responsáveis por off-flavours em bebidas. Como analitos para testar o
processo de extração foram utilizados alguns compostos α-dicarbonílicos e os extratos
foram analisados por HPLC-UV. O cromatograma de um extrato de solução padrão
encontra-se representado na Fig. 13.1. O estudo focou-se no efeito de alguns
parâmetros experimentais considerados mais relevantes em SALLE. O processo de
extração foi caracterizado através da análise da fração extraída dos compostos de α-
dicarbonílicos e da separação da mistura líquida água-acetonitrilo.
Fig. 13.1 – Cromatograma obtido a partir da extração de uma solução padrão contendo 5 mg L-1 de cada um dos
compostos analisados utilizando as condições de extração e de separação cromatográfica descritas na secção 12.3.1.
146 FCUP
Estudo da extração líquido-líquido assistida por salting-out em misturas acetonitrilo-água
13.1. Estudo do efeito do solvente orgânico e dos sais na
extração
O iso-propanol, o etanol e o acetonitrilo são três dos solventes mais utilizados em
SALLE devido à sua miscibilidade com a água em todas as proporções. Inicialmente
foram testados vários sais orgânicos e inorgânicos (concentração na mistura de 1 mol
L-1) para a separação de misturas água-solvente 1:1 (v/v). Os resultados obtidos com o
iso-propanol e o etanol foram muito semelhantes. Dos sais estudados só com o
K2CO3, o (NH4)2SO4, o Na2SO4 e o Na2CO3 foi possível obter separação de fases.
Apesar disso, na maioria dos casos em que houve separação, o volume obtido na fase
superior era maior que o da fase inferior (R superior a 1). Este facto demonstrava que
o extrato obtido na fase superior continha uma elevada quantidade de água.
Nas misturas acetonitrilo-água só não se verificou separação dos dois solventes da
mistura quando se utilizou NaNO3, NaBr ou NH4SCN. Com os restantes sais
estudados foi possível separar o acetonitrilo da água (Fig. 13.2), sendo possível
distinguir três grupos de sais de acordo com a razão de fases (R) e a fração extraída:
(1) acetatos e cloretos, (2) carbonatos e sulfatos8 e (3) MgSO4. Verificou-se que o
anião do eletrólito será o principal responsável pelas diferenças na eficiência da
separação dos solventes e da extração dos analitos, seguindo a ordem SO42- ≈ CO3
2- >
CH3COO- ≈ Cl-, como na série de Hofmeister [236]. Na extração com MgSO4, apesar
de se ter obtido um sistema líquido bifásico, o volume de fase inferior obtido no final da
extração era muito reduzido. Portanto, a fase superior continuava a ser uma mistura
de água e acetonitrilo. O comportamento observado com o MgSO4 foi idêntico ao
referido por Tabata et al. [197].
Dado que os resultados das misturas acetonitrilo-água foram mais promissores do
que as outras misturas testadas e também porque o uso de acetonitrilo é mais
favorável à separação cromatográfica dos compostos analisados por HPLC em fase
reversa, os ensaios seguintes foram realizados usando o acetonitrilo como solvente
extrator.
8 A única exceção é o MgSO4.
FCUP
Estudo da extração líquido-líquido assistida por salting-out em misturas acetonitrilo-água
147
Fig. 13.2 – Representação gráfica da fração extraída média em função da razão de fases (R) obtidos para a extração
dos derivados dos compostos α-dicarbonílicos de soluções de acetonitrilo-água (1:1, v/v) usando diferentes sais com
concentração na mistura de 1 mol L-1. As extrações foram realizadas utilizando soluções padrão 5 mg L-1 de cada
analito.
13.2. Estudo do efeito da concentração de sal na extração
O efeito da concentração de sal na separação dos dois solventes da mistura
acetonitrilo-água e na extração dos analitos foi avaliado utilizando sais pertencentes
aos três grupos representados na Fig. 13.2 na gama de concentrações na mistura
entre 0,2 e 2,5 mol L-1. Os eletrólitos escolhidos foram o MgSO4, o Na2CO3 e o NaCl e
as suas concentrações na mistura acetonitrilo-água mostraram ter influência distinta
no processo de extração dos compostos α-dicarbonílicos.
A alteração das concentrações de NaCl ou Na2CO3 em solução não afetaram a
separação dos dois solventes (R igual a 0,6 e 1, respetivamente) na gama de
concentrações de sais estudada. Por outro lado, o volume de fase superior recolhida
nos ensaios com MgSO4 variou com o aumento da concentração do sal. Para as
concentrações testadas mais baixas (0,25 e 0,5 mol L-1) o valor de R foi mais elevado
(R = 3) e diminuiu com o aumento da concentração de MgSO4. Estes resultados estão
de acordo com os reportados por outros autores [237].
Relativamente à fração extraída foram igualmente encontradas diferenças para os
três sais testados (Fig. 13.3). A quantidade de compostos α-dicarbonílicos extraídos
148 FCUP
Estudo da extração líquido-líquido assistida por salting-out em misturas acetonitrilo-água
para a fase superior utilizando diferentes concentrações de MgSO4 seguiu uma
tendência similar ao verificado para a razão de fases; o aumento da concentração de
sal resultou numa diminuição pouco acentuada da quantidade de analitos extraídos.
Fig. 13.3 – Fração extraída dos compostos α-dicarbonílicos em função da concentração de sal na mistura acetonitrilo-
água para os três sais testados (MgSO4, o Na2CO3 e o NaCl). As extrações foram realizadas utilizando soluções
padrão 5 mg L-1 de cada analito.
O aumento da concentração de Na2CO3 não provocou alterações significativas na
fração extraída dos compostos. Nos ensaios realizados com o NaCl a quantidade de
analitos extraída foi maior para as concentrações de sal mais elevadas. Resultados
idênticos aos obtidos neste trabalho têm sido também reportados por outros autores
em diversos estudos sobre a capacidade do NaCl em separar misturas acetonitrilo-
água [237-240]. Analisando mais detalhadamente os resultados obtidos para a
extração utilizando este sal, verificou-se que o valor de fração extraída é diferente para
cada composto analisado. Quanto menos polar é o analito, maior será a quantidade
extraída para a fase orgânica. Tal seria de esperar tendo em conta as diferenças de
polaridade dos dois solventes da mistura. Ou seja, o derivado do glioxal foi aquele em
que os valores de fração extraída foram mais baixos, por oposição à hexano-2,3-diona
cujas quantidades extraídas foram as mais elevadas. Analogamente, a concentração
mínima de sal necessária para obter o máximo valor de fração extraída foi diferente
para os compostos analisados. Para o derivado da hexano-2,3-diona só foi necessária
uma concentração de sal de 0,4 mol L-1 para que se atingisse a eficiência máxima de
extração para este analito (cerca de 95%). Essa quantidade de sal aumentou quando
a polaridade do derivado do composto α-dicarbonílico é maior, verificando-se que para
o derivado do glioxal já é necessária uma concentração de 1,3 mol L-1 para que se
consiga extrair a maior quantidade possível (fração extraída de 81%).
FCUP
Estudo da extração líquido-líquido assistida por salting-out em misturas acetonitrilo-água
149
13.3. Estudo do efeito do volume de acetonitrilo na extração
Com o objetivo de verificar de que forma a razão de volumes água-acetonitrilo
influencia o processo de SALLE foram realizados ensaios em que, mantendo-se o
volume de solução aquosa em 2 mL, se variava o volume de acetonitrilo adicionado
(entre 1 e 4 mL). Os ensaios foram realizados utilizando o MgSO4, o Na2CO3 ou o
NaCl e mantendo a concentração de sal constante (concentração na mistura de 0,5
mol L-1) em todos os ensaios.
Da análise dos resultados obtidos verifica-se que o volume de fase superior
recolhida aumenta proporcionalmente com o aumento do volume de acetonitrilo
adicionado no início da extração (Fig. 13.4A). No entanto, verifica-se que a
proporcionalidade entre as duas variáveis (volume recolhido e volume de acetonitrilo
inicial) é diferente para os três sais estudados, de acordo com os resultados obtidos
anteriormente e discutidos nas secções 13.1 e 13.2. No caso do MgSO4 o volume
recolhido é superior ao volume de acetonitrilo inicial, para o Na2CO3 o volume
recolhido é praticamente idêntico ao volume adicionado inicialmente e, quando se
utilizou o NaCl, o volume recolhido é inferior à quantidade inicial de solvente orgânico
adicionado.
Fig. 13.4 – Representações gráficas da variação do volume de fase orgânica recolhida (A) e da fração extraída do
derivado de glioxal (B) em função do volume de acetonitrilo adicionado para a extração usando os três sais estudados
(MgSO4, o Na2CO3 e NaCl). As extrações foram realizadas utilizando soluções padrão 5 mg L-1 de cada analito com
uma concentração constante de sal na mistura de 0,5 mol L-1.
Na Fig. 13.4B estão representados os resultados da fração extraída do derivado de
glioxal para diferentes volumes de acetonitrilo utilizado. Os resultados obtidos para os
outros compostos α-dicarbonílicos em estudo foram similares aos obtidos para o
glioxal. O aumento do volume de solvente extrator (acetonitrilo) adicionado conduziu a
150 FCUP
Estudo da extração líquido-líquido assistida por salting-out em misturas acetonitrilo-água
uma variação mínima da quantidade de analito extraída nos ensaios com MgSO4 e
Na2CO3 (entre 89 e 104% para o MgSO4 e entre 67 e 76% para o Na2CO3). À
semelhança dos resultados obtidos nos estudos anteriores sobre o efeito da
concentração de sal na extração (secção 13.2), o NaCl originou resultados diferentes
dos outros dois sais. Verificou-se que a quantidade de analito extraída aumenta com o
aumento do volume de acetonitrilo adicionado até um volume de 3 mL. Acima desse
volume a eficiência de extração dos analitos manteve-se praticamente constante.
13.4. Aplicação do processo de extração à análise de bebidas
De forma a verificar se as conclusões obtidas nos estudos realizados com soluções
padrão de compostos α-dicarbonílicos eram válidas para amostras reais foram
realizados ensaios em amostras de cerveja fortificadas com os compostos α-
dicarbonílicos (5 mg L-1). As condições de extração utilizadas foram as mesmas dos
estudos com soluções modelo.
Na Fig. 13.5 estão representados os valores de fração extraída do derivado de
glioxal em soluções modelo e em amostras utilizando os diferentes sais testados nos
casos em que ocorreu a separação da mistura em duas fases líquidas. Os resultados
obtidos com as amostras foram semelhantes aos obtidos para as soluções modelo,
para a maioria dos sais testados. No entanto observaram-se diferenças significativas
nas extrações com MgSO4, Na2CO3 e CH3COONa. Nos dois primeiros casos verificou-
se que a quantidade de analito extraída para a fase orgânica foi superior, no caso da
cerveja com álcool, à registada para as soluções modelo e para a amostra de cerveja
sem álcool. Relativamente aos resultados das extrações utilizando o CH3COONa,
apesar de não ter havido diferenças nos volumes de fase superior recolhidos, a
eficiência da extração nas amostras foi superior à obtida para a solução padrão. Para
os restantes compostos analisados os resultados que se obtiveram foram semelhantes
para as três situações.
FCUP
Estudo da extração líquido-líquido assistida por salting-out em misturas acetonitrilo-água
151
Fig. 13.5 – Fração extraída média9 de compostos α-dicarbonílicos em soluções padrão (5 mg L-1) e em amostras de
cerveja sem e com álcool dopadas com os cinco compostos α-dicarbonílicos (5 mg L-1), utilizando diferentes sais para a
extração com acetonitrilo com uma concentração na mistura de 1 mol L-1.
Relativamente aos ensaios sobre o efeito da concentração de sal no SALLE
verificou-se que o volume de fase superior recolhida na solução padrão e nas
amostras era diferente, para diferentes concentrações de sal. No entanto, as
quantidades de analitos extraídos nas soluções modelo e nas amostras mantinham-se
idênticas. Para o caso do NaCl, os volumes de extrato recolhidos nas amostras são
diferentes dos recolhidos nas soluções padrão para concentrações de NaCl inferiores
a 1,3 mol L-1 (Fig. 13.6A). Por outro lado não se verificaram diferenças nas
quantidades de analitos extraídas para a fase superior (Fig. 13.6B).
Fig. 13.6 – Razão de fases (A) e fração extraída média dos compostos α-dicarbonílicos (B) em função da concentração
de NaCl utilizada para a extração de compostos α-dicarbonílicos de soluções padrão (5 mg L-1) e de amostras de
cerveja sem e com álcool dopadas com os cinco compostos α-dicarbonílicos (5 mg L-1).
9 Média dos valores de fração extraída obtidos para os cinco compostos analisados.
FCUP
153
14. Determinação de compostos α-
dicarbonílicos em bebidas utilizando a
SALLE
14.1. Efeito do reagente derivatizante na extração
No capítulo anterior (secção 13.4) demonstrou-se ser possível extrair compostos α-
dicarbonílicos de amostras de cerveja utilizando a SALLE. Os analitos eram
inicialmente derivatizados com OFDA
na amostra e posteriormente as
quinoxalinas eram extraídas com
acetonitrilo por salting-out
(procedimento A na Fig. 14.1). Contudo
este procedimento podia ser
simplificado executando a extração e
derivatização em simultâneo
(procedimento C na Fig. 14.1),
permitindo minimizar os riscos de
variabilidade nos resultados e
simplificando o processo. Foi
igualmente testado um procedimento
em que inicialmente era realizada a
extração dos α-dicarbonilos seguida da
derivatização com OFDA para avaliar o
efeito que a presença ou ausência da
OFDA na solução extratora
(procedimento B na Fig. 14.1) tinha na
recuperação dos compostos na fase
orgânica.
Fig. 14.1 – Esquemas dos procedimentos
experimentais (A, B e C) realizados para o estudo do
efeito do reagente derivatizante na extração usando
uma solução padrão de α-dicarbonilos (0,5 mg L-1).
Os resultados dos procedimentos testados (Fig. 14.2) permitem concluir que o uso
do agente derivatizante durante a extração (procedimento C da Fig. 14.1) aumenta a
recuperação dos analitos por comparação com o procedimento B. Dado que a OFDA é
mais solúvel em acetonitrilo do que em água, a sua presença na fase extratora permite
154 FCUP
Determinação de compostos α-dicarbonílicos em bebidas utilizando a SALLE
deslocar o equilíbrio químico no sentido do solvente orgânico devido à reação de
derivatização favorecendo o processo de extração dos analitos. Como se pode
verificar, as diferenças nos sinais analíticos obtidos com os procedimentos B e C são
maiores para os compostos mais polares, o glioxal e o metilglioxal. Os resultados
obtidos para o procedimento C foram semelhantes aos obtidos usando o procedimento
A, no qual se realiza primeiro a derivatização da amostra e posteriormente a extração
das quinoxalinas. Assim, atingido o objetivo da simplificação do procedimento
experimental, foi adotado o procedimento C (extração e derivatização simultâneas)
para os estudos subsequentes. Todas estas conclusões foram igualmente verificadas
em amostras de vinho dopadas com os analitos (0,5 mg L-1).
Fig. 14.2 – Áreas dos picos cromatográficos dos quatro compostos estudados realizando os três procedimentos
representados na Fig. 14.1. As extrações foram realizadas com uma solução padrão contendo 0,5 mg L-1 de cada
analito e utilizando NaCl com uma concentração na mistura de 0,5 mol L-1.
14.2. Efeito da natureza do sal utilizado na extração
Do estudo da influência do sal utilizado na SALLE discutido na secção 13.1
conclui-se que diferentes sais têm efeito na eficiência da obtenção da separação da
mistura acetonitrilo-água em duas fases e na extração dos analitos para a fase
orgânica. Dado que o procedimento experimental foi modificado relativamente ao do
capítulo anterior, realizando-se, neste caso, a extração e a derivatização em
simultâneo, este estudo foi novamente realizado utilizando três sais (NaCl, Na2CO3 e
CH3COONa). Os ensaios foram realizados com uma solução padrão (0,5 mg L-1)
contendo os compostos α-dicarbonílicos em estudo e os resultados mostraram que o
sal utilizado como agente de salting-out praticamente não afeta a resposta analítica.
FCUP
Determinação de compostos α-dicarbonílicos em bebidas utilizando a SALLE
155
Fig. 14.3 – Áreas dos picos cromatográficos dos analitos para extrações SALLE realizadas com NaCl, Na2CO3 e
CH3COONa com concentrações na mistura de 0,5 mol L-1. Foram utilizadas soluções padrão de compostos α-
dicarbonílicos contendo 0,5 mg L-1 de cada um dos analitos.
Os mesmos estudos foram realizados em amostras de vinho (branco e tinto) e de
cerveja dopadas (0,25 mg L-1). Os resultados encontram-se apresentados na Fig. 14.4
e mostram que nas amostras o sal utilizado influenciava muito a quantidade de
analitos presentes no extrato, ao contrário do que se havia observado para as
soluções padrão. Verificou-se que, inclusivamente, a extração/derivatização do mesmo
composto em amostras diferentes era afetada de forma distinta, consoante o sal
utilizado. Por exemplo, na amostra de vinho branco a área de pico máxima é obtida
com o NaCl, enquanto na amostra de vinho tinto foi obtida com o Na2CO3. Estes
resultados indicam a existência de uma interação do sal com a matriz da amostra que
afeta a quantidade de analitos extraídos. A primeira e mais óbvia hipótese de
justificação destes resultados é a da existência de uma alteração de pH da amostra
provocada pela adição de sal, o que pode ocorrer com a adição de CH3COONa e
Na2CO3. Os resultados obtidos com as soluções padrão (Fig. 14.3) permitiram concluir
que essa alteração de pH não afeta nem a extração nem a derivatização dos
compostos dado que o sinal analítico obtido foi semelhante para os três sais. Assim,
será a capacidade dos compostos α-dicarbonílicos se ligarem ou reagirem com
constituintes do vinho, como por exemplo os sulfitos [106] ou aminoácidos [10], que
poderá justificar estes resultados. Como a maioria destas reações é dependente do
pH, a alteração desta propriedade pode levar à formação ou quebra daquelas ligações
e por isso a quantidade de α-dicarbonilos extraída poderá ser afetada. Assim, tornou-
se necessário fazer um estudo sobre a influência do pH da amostra na quantidade de
analitos extraídos.
156 FCUP
Determinação de compostos α-dicarbonílicos em bebidas utilizando a SALLE
Fig. 14.4 – Áreas dos picos cromatográficos dos analitos para extrações SALLE realizadas com NaCl, Na2CO3 e
CH3COONa (numa concentração de 0,5 mol L-1 na mistura) utilizando amostras de vinho branco, vinho tinto e cerveja
dopadas com os compostos α-dicarbonílicos em estudo (0,25 mg L-1).
14.3. Efeito do pH da amostra
O efeito do pH da amostra na quantidade de analitos extraída foi inicialmente
estudado na gama entre 1 a 10 utilizando soluções padrão dos analitos (0,25 mg L-1)
preparadas em soluções tampão com valores de pH correspondentes. O NaCl foi
utilizado para induzir o salting-out dado que não interfere com o pH da solução. Os
resultados mostram que as áreas dos picos cromatográficos do glioxal e do
metilglioxal aumentam com o aumento do pH. Por outro lado, para os compostos
diacetilo e pentano-2,3-diona a influência do pH na extração era menos acentuada. No
entanto, para pH 1 e superior a 9 a quantidade extraída de diacetilo era menor. Com
FCUP
Determinação de compostos α-dicarbonílicos em bebidas utilizando a SALLE
157
base nestes resultados, selecionou-se a gama de pH entre 2 e 8 para ser estudada
nas amostras.
De forma a estudar o efeito do pH em amostras, diluíram-se amostras de vinho
(2:5, v/v) com as soluções tampão correspondentes aos valores de pH a testar. A
quantificação dos compostos nas amostras era realizada através do método da adição
de padrão. Na Fig. 14.5 estão representadas as concentrações de α-dicarbonilos
determinadas numa amostra de vinho tinto pelo método da adição de padrão para
diferentes valores de pH. Os resultados obtidos para uma amostra de vinho branco
seguiram o mesmo comportamento. Verificou-se que a quantidade de glioxal extraída
diminuiu muito com o aumento do pH na gama testada (pH entre 2 e 8), ao contrário
do verificado com as soluções padrão. Para a pentano-2,3-diona também se
observaram variações nas amostras analisadas.
Fig. 14.5 – Concentrações dos compostos α-dicarbonílicos obtidas para diferentes valores de pH da amostra de vinho
tinto.
O efeito do pH na extração de α-dicarbonilos e outros compostos carbonílicos de
amostras com matrizes complexas, tais como o vinho, é ainda uma questão a ser
clarificada. Existem muitos estudos acerca da influência do pH na interação entre
carbonilos e outros componentes do vinho e o seu impacto na determinação analítica
daqueles compostos [10]. No entanto, são necessários estudos mais detalhados das
reações dependentes do pH e das suas implicações no procedimento de extração.
Existem alguns trabalhos sobre o estudo do efeito do pH na extração de α-dicarbonilos
considerando a sua interação com os sulfitos [106, 160, 241]. Porém, considerando os
resultados deste trabalho será certamente necessário averiguar a existência de outro
158 FCUP
Determinação de compostos α-dicarbonílicos em bebidas utilizando a SALLE
tipo de interações na amostra e estudar de que forma a alteração de pH afeta essas
interações. Por esta razão, o controlo do pH da amostra para a realização da extração
é essencial. Dado que os resultados do estudo do pH não foram ainda clarificados e
que o objetivo deste trabalho era a aplicação da técnica SALLE à determinação de α-
dicarbonilos, foi selecionado um valor de pH próximo das amostras em estudo de
modo a evitar uma grande alteração das condições na matriz. Assim, a determinação
dos analitos realizou-se após o ajuste do pH da amostra para 4 por diluição com
solução tampão acetato (0,2 mol L-1, pH 4).
14.4. Validação da metodologia
A linearidade da metodologia foi avaliada através da construção de curvas de
calibração utilizando extratos de soluções padrão preparadas em solução tampão pH 4
nas gamas de concentração em que geralmente os compostos α-dicarbonílicos se
encontram nas bebidas analisadas. A extração foi realizada de acordo com o
procedimento descrito na secção 12.3.2 e cada solução foi analisada em triplicado. O
padrão interno (hexano-2,3-diona) foi utilizado para compensar qualquer variação do
processo de extração. A partir da aplicação da regressão linear aos pontos
experimentais obtiveram-se coeficientes de determinação elevados (r2 superiores a
0,993, Tabela 14.1). Os limites de deteção (LD) e de quantificação (LQ) foram obtidos
a partir de 3 e 10 vezes o desvio-padrão da regressão linear da curva de calibração,
respetivamente [231] (Tabela 14.1).
Tabela 14.1 – Equações das curvas de calibração, coeficientes de determinação e limites de deteção e quantificação
dos compostos α-dicarbonílicos extraídos de soluções padrão de acordo com o procedimento descrito na secção
12.3.2.
Analito Equação da curva de calibração a r2 b LD /mg L-1 LQ /mg L-1
Glioxal y = (0,73 ± 0,03)x + (0,2 ± 0,2) 0,996 0,019 0,063
Metilglioxal y = (2,85 ± 0,03)x + (0,12 ± 0,08) 0,999 0,008 0,028
Diacetilo y = (3,96 ± 0,08)x + (0,22 ± 0,09) 0,999 0,007 0,023
Pentano-2,3-diona y = (1,69 ± 0,08)x - (0,02 ± 0,02) 0,993 0,011 0,036
a y = ax + b; a: declive ± desvio padrão (n = 5) em L mg-1; b: ordenada na origem ± desvio padrão (n = 5)
b Coeficiente de determinação
FCUP
Determinação de compostos α-dicarbonílicos em bebidas utilizando a SALLE
159
A influência da matriz da amostra na quantificação dos compostos α-dicarbonílicos
foi avaliada através da análise de três amostras diferentes (vinho branco, vinho tinto e
cerveja). Cada amostra foi fortificada em quatro níveis de concentração e cada
solução foi analisada em triplicado. As concentrações para a fortificação foram
escolhidas de acordo com o teor dos analitos nas amostras e de forma a obter
incrementos de sinal entre 50% e 200%. Os declives das curvas da adição de solução
padrão foram comparados com os declives das curvas de calibração utilizando o teste
t-Student (99% de intervalo de confiança) verificando-se diferenças estatisticamente
significativas entre eles. Assim, utilizou-se o método da adição de solução padrão para
quantificar os analitos nas amostras. Os cromatogramas obtidos para os extratos da
adição de solução padrão a uma amostra de vinho tinto encontra-se representados na
Fig. 14.6.
Fig. 14.6 – Cromatogramas obtidos a partir da extração de amostras de vinho tinto (vinho tinto 2, Tabela 12.3) com
diferentes adições de soluções padrão de compostos α-dicarbonílicos, As condições utilizadas para a separação
cromatográfica encontram-se na secção 12.3.2.
A repetibilidade foi avaliada pela análise, no mesmo dia, de cinco réplicas de
extratos de amostras fortificadas. A reprodutibilidade foi calculada a partir dos
resultados obtidos de três réplicas em quatro dias diferentes. Os resultados obtidos
para a repetibilidade e a reprodutibilidade em três amostras encontram-se na Tabela
14.2.
160 FCUP
Determinação de compostos α-dicarbonílicos em bebidas utilizando a SALLE
Tabela 14.2 – Valores de repetibilidade e reprodutibilidade para os compostos α-dicarbonílicos estudados obtidos a
partir da análise de extratos de amostras de vinho branco, vinho tinto e cerveja.
Repetibilidade (%) Reprodutibilidade (%)
Vinho
branco
Vinho
tinto
Cerveja
Pilsner
Vinho
branco
Vinho
tinto
Cerveja
Pilsner
Glioxal 8,8 6,2 3,9 11,7 9,3 6,6
Metilglioxal 4,9 2,6 4,3 5,0 4,6 9,8
Diacetilo 7,6 2,6 5,1 9,5 3,3 6,9
Pentano-2,3-diona 4,6 5,5 5,9 4,7 8,1 9,1
14.5. Determinação de compostos α-dicarbonílicos em vinho e
cerveja
A metodologia desenvolvida foi aplicada na quantificação dos compostos α-
dicarbonílicos em amostras de vinho e de cerveja descritas na Tabela 12.3. Os
resultados são apresentados na Fig. 14.7. Todos os compostos foram quantificados
nas amostras analisadas à exceção do metilglioxal na cerveja branca (valor de
concentração abaixo do LQ) e a pentano-2,3-diona na amostra de cerveja preta (valor
de concentração abaixo do LD). O diacetilo não foi determinado na cerveja preta
porque se verificou a existência de uma interferência no sinal cromatográfico,
correspondente a um composto que co-eluía com o derivado do diacetilo.
A concentração mais elevada de glioxal foi determinada numa amostra de vinho
branco (vinho branco 4; 12,1 ± 0,5 mg L-1). Todos os valores de concentração obtidos
para este analito em vinhos brancos encontram-se na gama de concentração descrita
por outros autores em vinhos portugueses [48]. O teor de glioxal nos vinhos tintos e
rosé foram determinados numa gama de concentrações entre 0,95 ± 0,05 e 8,8 ± 0,6
mg L-1. Nas cervejas os valores de glioxal quantificados foram mais baixos (0,29 ± 0,04
e 0,53 ± 0,04 mg L-1).
O valor médio do teor de metilglioxal nos vinhos foi de 0,7 mg L-1, exceto para uma
das amostras cuja concentração determinada foi bastante superior (3,2 ± 0,2 mg L-1).
O teor de diacetilo determinado nos vinhos brancos (valor médio de 1,4 mg L-1) foi
bastante inferior aos obtidos nos vinhos tintos (cerca de 5,6 mg L-1).
FCUP
Determinação de compostos α-dicarbonílicos em bebidas utilizando a SALLE
161
De forma geral, a pentano-2,3-diona foi o composto α-dicarbonílico presente em
menor quantidade nas amostras analisadas (entre 0,12 ± 0,03 e 0,62 ± 0,07 mg L-1).
Fig. 14.7 – Valores de concentração do glioxal, metilglioxal, diacetilo e pentano-2,3-diona obtidos para as amostras de
vinho e de cerveja analisadas (Tabela 12.3). (ND, não detetado; NQ, não quantificado; a, não determinado).
FCUP
163
15. Determinação de fenóis voláteis em
bebidas através da aplicação da
metodologia QuEChERS
Neste capítulo é apresentado o desenvolvimento de uma metodologia
desenvolvida para a análise de fenóis voláteis em bebidas baseada no procedimento
QuEChERS. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma metodologia para a
extração destes compostos presentes em bebidas para análise por LC. O
procedimento desenvolvido é simples, não tem requisitos especiais em termos de
equipamento de laboratório e tem um consumo reduzido de solventes. Além disso,
permite a “limpeza” do extrato antes da análise cromatográfica, prevenindo a longo
prazo a degradação das colunas cromatográficas, especialmente em análises de
rotina. Resumidamente o procedimento de preparação da amostra divide-se em duas
etapas: (1) a amostra é submetida a uma extração líquido-líquido assistida por salting-
out (SALLE) com um solvente orgânico miscível com a água e (2) o extrato orgânico é
sujeito a um procedimento de lavagem utilizando uma extração em fase sólida
dispersiva (d-SPE).
15.1. Seleção do solvente extrator
O principal fator para a escolha do solvente extrator foi a sua miscibilidade com o
solvente das amostras, isto é, com a água. O acetonitrilo e o metanol foram testados
na extração dos fenóis utilizando uma mistura de 2 g NaCl com 2 g MgSO4 para
induzir a separação de fases. Estes solventes foram os escolhidos para o estudo por
se adaptarem à posterior separação cromatográfica dos fenóis. O acetonitrilo acabou
por ser o solvente selecionado, dado que não foi possível induzir a separação das
fases da mistura água-metanol.
De modo a estudar a influência do volume de solvente extrator na sensibilidade da
metodologia e nas taxas de recuperação dos analitos foram realizados alguns ensaios
utilizando diferentes razões de volumes amostra/acetonitrilo (entre 1:1 e 5:1). Estes
estudos foram realizados usando uma amostra de vinho tinto dopada com 0,5 mg L-1
de cada um dos fenóis estudados. A razão 2:1 (amostra/acetonitrilo) foi a que resultou
em melhores valores de recuperação dos analitos e que permitiu uma melhor
separação entre as fases aquosa e orgânica.
164 FCUP
Determinação de fenóis voláteis em bebidas através da aplicação da metodologia QuEChERS
15.2. Seleção do sal a utilizar na extração dos fenóis voláteis
Após a mistura da amostra com o acetonitrilo é necessário induzir a separação em
duas fases e que o equilíbrio de distribuição seja deslocado no sentido do solvente
orgânico. Para isso é adicionado um sal ou mistura de sais à solução para que, após
centrifugação, ocorra a separação da água e do acetonitrilo [242]. Foram estudadas
vários sais (ou misturas de sais) geralmente utilizadas nos procedimentos QuEChERS
contendo MgSO4, NaCl, tampão citrato ou acetato de sódio. Os resultados encontram-
se apresentados na Fig. 15.1.
Fig. 15.1 – Áreas dos picos cromatográficos registados para os fenóis estudados utilizando diferentes sais ou misturas
de sais (secção 12.2) para a extração dos compostos de uma amostra de vinho tinto dopada com 0,5 mg L-1 de cada
fenol (a etapa de d-SPE foi realizado com o tubo PSA).
Analisando os resultados obtidos (Fig. 15.1) verificou-se que não houve diferenças
significativas nas quantidades extraídas de fenóis quando se utilizavam diferentes
composições de sais. As únicas exceções foram o 4-etilguaiacol e o eugenol para os
quais a eficiência da extração com tampão citrato+MgSO4 foi a menor.
De seguida decidiu-se comparar a necessidade da utilização do MgSO4 neste
processo. Geralmente este sal é utilizado na metodologia QuEChERS de forma a
remover a água residual existente no extrato orgânico, de forma a eliminar os efeitos
adversos que esta possa ter na segunda etapa da metodologia, o d-SPE [243]. De
forma a verificar a influência do MgSO4 na extração dos fenóis foram realizados
ensaios em que só era utilizado NaCl. Os resultados (Fig. 15.2) mostram que a
resposta analítica para todos os fenóis é superior quando é utilizado NaCl sem MgSO4.
Assim, para os ensaios subsequentes foi utilizado somente o NaCl para o processo de
salting-out. A quantidade mínima de NaCl necessária para que ocorresse a separação
FCUP
Determinação de fenóis voláteis em bebidas através da aplicação da metodologia QuEChERS
165
da mistura amostra/acetonitrilo foi de 2 g para a separação de 5 mL de amostra e 2,5
mL de acetonitrilo.
Fig. 15.2 - Áreas dos picos cromatográficos registados para os fenóis estudados utilizando NaCl com e sem MgSO4
para a extração dos compostos de uma amostra de vinho tinto dopada com 0,5 mg L-1 de cada fenol (d-SPE foi
realizado com o tubo PSA).
15.3. Seleção do adsorvente para a limpeza do extrato por d-
SPE
Nesta etapa do procedimento de preparação da amostra estudaram-se as
condições de limpeza do extrato para remover alguns compostos químicos da amostra
extraídos pelo acetonitrilo e que devem ser evitados na análise cromatográfica, tais
como ácidos orgânicos, açúcares e pigmentos. Os ensaios para a escolha do melhor
adsorvente a utilizar na extração dos fenóis foram efetuados utilizando uma amostra
de vinho tinto fortificada com 0,5 mg L-1 em cada fenol em estudo. As condições
experimentais utilizadas para a primeira etapa da preparação da amostra foram as
selecionadas nos estudos anteriores (secções 15.1 e 15.2, usando 5 mL de amostra,
2,5 mL de acetonitrilo e 2 g NaCl). Os tubos de d-SPE testados encontram-se
descritos na Tabela 12.2.
De uma forma geral, os resultados obtidos (Fig. 15.3) foram semelhantes para
todos os adsorventes testados. Desta forma verifica-se que o impacto que esta etapa
do procedimento tem na extração é reduzido. A escolha do adsorvente foi feita com
base no volume recolhido após o passo de limpeza do extrato, na limpidez do extrato,
e nas diferenças observadas nos cromatogramas resultantes da injeção direta da
amostra (sem extração) e da análise do extrato obtido através da metodologia em
estudo.
166 FCUP
Determinação de fenóis voláteis em bebidas através da aplicação da metodologia QuEChERS
Fig. 15.3 - Áreas dos picos cromatográficos registados para os fenóis estudados utilizando diferentes sorventes (Tabela
12.2) para a etapa de d-SPE em extratos obtidos da extração de uma amostra de vinho tinto dopada com 0,5 mg L-1 de
cada fenol usando 2 g NaCl.
Visualmente os extratos obtidos recorrendo aos tubos PSA e PSA/GCB eram os
mais límpidos, ao contrário dos extratos obtidos com o tubo C18, em que nenhuma
limpeza pareceu ter ocorrido. Assim, o tubo PSA foi o escolhido dado que o extrato da
amostra obtido era o mais límpido e as diferenças observadas nos cromatogramas
obtidos antes e após a realização do procedimento de preparação da amostra eram as
mais significativas (Fig. 15.4).
Fig. 15.4 – Cromatogramas obtidos a partir da análise de uma amostra de vinho tinto dopada com 0,5 mg L-1 de cada
fenol (a vermelho) e de um extrato da mesma amostra utilizando 2 g NaCl para o SALLE e o tubo PSA para o d-SPE (a
azul).
FCUP
Determinação de fenóis voláteis em bebidas através da aplicação da metodologia QuEChERS
167
15.4. Validação da metodologia
Para cada composto fenólico estudado foram obtidas curvas de calibração a partir
da análise de duas réplicas para cinco níveis de concentração (entre 0,02 e 2,2 mg L-
1). As curvas de calibração e de adição de padrão forma comparadas através do teste
t-Student (com 99% de intervalo de confiança) verificando-se que não existiam
diferenças estatisticamente significativas nos seus declives. Assim, a quantificação
dos fenóis foi realizada a partir da curva de calibração.
Os limites de deteção (LD) e de quantificação (LQ) foram calculados a partir 3 e 10
vezes o desvio-padrão da regressão linear das curvas de calibração, respetivamente
[231]. A repetibilidade da metodologia foi avaliada através da análise no mesmo dia de
três réplicas de uma amostra de vinho tinto dopada com 0,5 mg L-1 de cada fenol. Para
o cálculo da reprodutibilidade forma analisadas três réplicas da mesma amostra
durante três dias diferentes. Os resultados encontram-se na Tabela 15.1.
Tabela 15.1 – Limites de deteção e de quantificação, repetibilidade, reprodutibilidade e taxas de recuperação da
metodologia desenvolvida para a determinação de fenóis voláteis em bebidas.
Analito LD (mg L-1)a LQ (mg L-1)a Repetibilidade
(%)b
Reprodutibilidade
(%)
Recuperação
± DPc (%)
Fenol 0,055 0,101 2,8 5,4 100 ± 7
Cresol 0,025 0,115 2,0 8,8 100 ± 5
4-vinilfenol 0,018 0,083 0,2 3,9 105 ± 4
4-vinilguaiacol 0,001 0,055 0,3 2,2 96 ± 3
4-etilfenol 0,001 0,048 6,2 6,9 92 ± 6
4-etilguaiacol 0,003 0,092 4,3 3,6 108 ± 9
Eugenol 0,001 0,012 3,5 10,0 94 ± 3
a Valores calculados para a concentração na amostra.
b Calculada através do desvio padrão relativo.
c Desvio padrão relativo.
A existência de efeito de matriz foi estudada através da análise de uma amostra de
vinho tinto dopada com concentrações conhecidas dos fenóis (0,25 a 1 mg L-1). Os
valores de recuperação dos fenóis analisados variam entre 92% e 108% (Tabela 15.1).
168 FCUP
Determinação de fenóis voláteis em bebidas através da aplicação da metodologia QuEChERS
15.5. Quantificação dos fenóis nas amostras
A aplicabilidade da metodologia desenvolvida foi avaliada fazendo a análise (em
triplicado) dos fenóis voláteis em diferentes bebidas (vinho, cerveja, sumos de fruta e
néctares de fruta). O fenol e o cresol não foram detetados em nenhuma das amostras.
O 4-vinilfenol só foi detetado nas amostras de cerveja e no vinho tinto 1, mas o valor
obtido encontrava-se abaixo do LQ. O mesmo aconteceu com o 4-vinilguaiacol,
detetado na amostra de cerveja mas igualmente abaixo do LQ. Os resultados obtidos
para as amostras de cerveja corroboram os resultados obtidos por Vanbeneden et al.
[244] em que foram determinados níveis baixos dos fenóis vinílicos e concentrações
elevadas de 4-etilfenol e 4-etilguaiacol. Os resultados obtidos para a concentração dos
fenóis voláteis presentes em maior concentração nas amostras encontram-se na
Tabela 15.2.
Tabela 15.2 – Concentrações (mg L-1) obtidas para os fenóis voláteis quantificados nas amostras de bebidas
analisadas.
4-etilfenol 4-etilguaiacol Eugenol
Cerveja Pilsner <LD 1,14 ± 0,01 <LD
Cerveja preta <LD 0,28 ± 0,01 0,032 ± 0,002
Vinho branco 1 0,19 ± 0,01 1,14 ± 0,01 <LD
Vinho branco 2 0,15 ± 0,01 0,46 ± 0,01 <LD
Vinho tinto 1 1,11 ± 0,01 1,23 ± 0,01 0,052 ± 0,002
Vinho tinto 2 0,83 ± 0,01 0,90 ± 0,01 0,052 ± 0,002
Néctar de pêra <LQ 0,10 ± 0,01 <LQ
Néctar de manga 0,12 ± 0,01 0,13 ± 0,01 0,032 ± 0,002
Sumo natural de laranja e maçã <LQ 0,13 ± 0,01 <LD
Sumo natural de maçã e cenoura <LQ 0,15 ± 0,01 <LQ
Refrigerante de ananás <LD 0,19 ± 0,01 <LD
Nas cervejas Pilsner e preta o 4-etilguaiacol foi determinado em concentrações de
1,14 e 0,28 mg L-1, respetivamente. Nas amostras de vinho analisadas, o teor de 4-
FCUP
Determinação de fenóis voláteis em bebidas através da aplicação da metodologia QuEChERS
169
etilguaicol encontrado foi superior aos de 4-etilfenol. As concentrações de 4-
etilguaiacol determinadas variaram entre 0,46 e 1,23 mg L-1 e as de 4-etilfenol entre
0,19 e 1,11 mg L-1. A grande variabilidade no teor destes compostos em vinhos está
relacionada com a origem das uvas e o processo de produção utilizado, mas
geralmente os vinhos tintos possuem concentrações mais elevadas de 4-etilfenol e 4-
etilguaiacol do que os vinhos brancos [157].
Nos sumos e néctares de fruta as concentrações de 4-etilguaiacol determinadas
foram muito semelhantes entre as amostras. Por outro lado, o 4-etilfenol só foi
quantificado no néctar de manga. Nas amostras de bebidas não alcoólicas, a maior
concentração de 4-etilguaiacol foi obtida na amostra de refrigerante (0,19 mg L-1).
O eugenol foi quantificado em poucas amostras e em níveis de concentração muito
baixos (entre 0,032 e 0,052 mg L-1). Nas amostras analisadas a maior quantidade de
eugenol foi determinado nas duas amostras de vinho tinto. Os valores obtidos estão de
acordo com os valores típicos deste fenol em vinhos tintos [54].
A metodologia desenvolvida para a determinação de fenóis voláteis foi também
aplicada ao estudo da evolução do teor desses compostos ao longo do tempo de
armazenamento a 4 ºC. Para esse estudo foram recolhidas alíquotas das amostras em
estudo semanalmente, durante oito semanas.
As concentrações de 4-etilfenol e 4-etilguaiacol, os fenóis presentes em maior
quantidade nas amostras, foram determinados ao longo das oito semanas de ensaio e
os resultados encontram-se na Fig. 15.5. Nas amostras de vinho analisadas o teor de
4-etilfenol manteve-se praticamente constante ao longo do tempo de armazenamento
enquanto para o 4-etilguaiacol se verificou um aumento, mais significativo nas
amostras de vinho tinto.
Nas cervejas analisadas verificou-se um grande aumento de 4-etilfenol nas duas
primeiras semanas de ensaio, seguido de um decréscimo da sua concentração até às
8 semanas. No caso do 4-etilguaiacol, o comportamento observado para as cervejas
Pilsner e preta foi distinto. Na cerveja Pilsner a concentração deste fenol diminuiu logo
durante a primeira semana até atingir valores muito semelhantes ao longo das
restantes semanas em que o ensaio decorreu. Na cerveja preta na primeira semana
houve um pequeno aumento da concentração de 4-etilguaiacol, seguido de uma
diminuição para valores de concentração próximos dos obtidos para a cerveja Pilsner.
170 FCUP
Determinação de fenóis voláteis em bebidas através da aplicação da metodologia QuEChERS
No néctar de pera não se registou praticamente nenhuma variação das
concentrações de 4-etilfenol, 4-etilguaiacol e eugenol mas curiosamente registou-se
um decréscimo na concentração de 4-etilfenol no néctar de manga nas duas primeiras
semanas. Por outro lado, nas duas amostras de sumo natural as concentrações de 4-
etilguaiacol aumentaram ao longo do tempo de armazenamento, especialmente a
partir da quarta semana. Os teores de 4-etilfenol variaram de forma diferente nestas
duas amostras analisadas. No sumo de laranja e maçã verificou-se um aumento de
concentração e para o sumo de maçã e cenoura registou-se um máximo na quarta
semana seguido de um decréscimo.
Fig. 15.5 – Concentrações de 4-etilfenol e 4-etilguaiacol determinadas nas amostras de vinho, cerveja, néctares e
sumos de fruta ao longo do tempo de armazenamento a 4 ºC.
FCUP
171
16. Conclusões
A SALLE tem sido bastante utilizada para desenvolver metodologias analíticas
para aplicação em amostras biológicas, ambientais, plantas e alimentos como
alternativa à LLE clássica, devido ao baixo consumo de solventes e à utilização de
solventes orgânicos de elevada polaridade. Além disso, a metodologia de extração é
de fácil execução, não tem requisitos especiais em termos de equipamento e material
de laboratório e permite obter extratos diretamente compatíveis com diversas técnicas
analíticas, nomeadamente a LC em fase reversa. A utilização desta técnica tem vindo
a ser revigorada através da implementação da metodologia QuEChERS.
Neste trabalho o processo de SALLE foi estudado em misturas homogéneas de
acetonitrilo-água com o objetivo de aplicar esta técnica à extração de compostos
responsáveis por off-flavours em bebidas. Foram utilizadas soluções aquosas modelo
de compostos α-dicarbonílicos para estudar o efeito do tipo e concentração de sal e do
volume de fase extratora (acetonitrilo) na eficiência da extração. A fração de analitos
extraídos para a fase orgânica foi superior nos casos em que a separação em duas
fases líquidas foi mais eficiente. De acordo com estes resultados foi possível identificar
três grupos de sais com diferentes capacidades de salting-out e que estão
relacionados com o anião do sal: (1) cloretos e acetatos, (2) carbonatos e sulfatos
(exceto MgSO4) e (3) MgSO4. O aumento da concentração de sal foi testado para um
sal de cada um destes grupos (MgSO4, Na2CO3 e NaCl) verificando-se que o NaCl foi
o sal cuja variação de concentração mais afetou a quantidade de analitos extraída.
A aplicabilidade da SALLE foi testada através do desenvolvimento de uma
metodologia analítica para a determinação de compostos α-dicarbonílicos em
amostras de vinho e cerveja. A particularidade desta metodologia é a utilização de um
reagente derivatizante na solução extratora, que permitiu aumentar a eficiência da
extração dos analitos, para além de simplificar o procedimento experimental (evitando
que a derivatização seja realizada num passo experimental diferente). Nesta
metodologia verificou-se que a extração dos compostos α-dicarbonílicos foi afetada
pelo pH da amostra e que, por isso, é importante controlar este parâmetro na extração.
Foi também desenvolvida uma metodologia para a determinação de fenóis voláteis
em diversas bebidas, baseada no procedimento QuEChERS. O procedimento de
preparação da amostra divide-se em duas etapas: (1) a amostra é submetida a um
procedimento SALLE com acetonitrilo e (2) realiza-se uma limpeza do extrato orgânico
172 FCUP
Conclusões
obtido na primeira etapa por d-SPE. Dada a quase inexistência de metodologias de
extração de fenóis voláteis de bebidas para análise por LC, a metodologia
desenvolvida neste trabalho constitui uma proposta inovadora na preparação de
amostra com esse objetivo. A segunda etapa do procedimento de preparação de
amostra (a d-SPE) permite remover alguns compostos da matriz (pigmentos,
açúcares, lípidos, etc.) o que se revela útil para análises de rotina, de forma a prevenir
a degradação a longo prazo das colunas cromatográficas.
Parte IV
Propostas de trabalho futuro
FCUP
177
As metodologias analíticas desenvolvidas neste trabalho basearam-se em duas
técnicas de extração, a GDME e a SALLE, e tiveram como objetivo a determinação de
compostos voláteis responsáveis por off-flavours em bebidas. As metodologias
desenvolvidas permitiram expandir a aplicabilidade de ambas as técnicas a diferentes
amostras e analitos. Destaca-se a possibilidade de aplicar a GDME a analitos pouco
voláteis e de elevada solubilidade em água e a uma gama alargada de analitos com
diferentes propriedades físico-químicas. O estudo da SALLE permitiu explorar esta
técnica para a utilização em Química Analítica, nomeadamente para a extração de
analitos de amostras aquosas. Com este propósito, foi desenvolvida uma metodologia
baseada no procedimento QuEChERS. Este trabalho foi pioneiro dado que este
procedimento não tinha ainda sido aplicado na quantificação de compostos, para além
de pesticidas em amostras líquidas.
Tendo em conta as principais conclusões deste trabalho, sugere-se o seguinte:
Seria interessante explorar a técnica de GDME para a extração de analitos com
características semelhantes às do metilglioxal, ou seja, alguma volatilidade e
elevada solubilidade em água. Nalguns casos a determinação de compostos com
essas características pode ser também dificultada pela presença de outros
compostos da matriz. Por isso, a extração por GDME poderá permitir realizar uma
extração seletiva e evitar a extração de compostos interferentes não voláteis.
A GDME tem estado ainda limitada a um pequeno grupo de compostos (aldeídos,
cetonas e aminas). Será importante expandir a técnica a outros compostos, quer
de baixa quer de elevada volatilidade, usando outros agentes derivatizantes.
O desenvolvimento de metodologias para análise por GC seria um passo
importante para a técnica de GDME. O problema da transferência das aplicações
de LC para GC reside na necessidade de utilizar solventes orgânicos na solução
aceitadora para análise por GC. Assim, terá que se garantir que a membrana
utilizada seja impermeável a esses solventes para que os poros da membrana
estejam preenchidos só com ar. Só assim se garante que o processo de
transferência de massa ocorrerá por difusão gasosa. A existência cada vez maior
de membranas comerciais com diferentes características poderá facilitar o
desenvolvimento de aplicações com solventes orgânicos na fase aceitadora.
178 FCUP
Propostas de trabalho futuro
A aplicação da SALLE a amostras líquidas poderá ser explorada para muitos
outros analitos e a outras matrizes aquosas. A utilidade da SALLE na preparação
de amostras para a análise por LC ficou comprovada neste trabalho e, por isso,
poderá ser aplicada a muitos outros analitos com vantagens relativamente à LLE
clássica. Além disso, dadas as capacidades e características da técnica de SALLE,
designadamente a utilização de solventes orgânicos de elevada polaridade, poderá
ser interessante avaliar mais detalhadamente as vantagens da utilização destes
solventes na extração de compostos de diferentes polaridades.
Seria igualmente interessante explorar a aplicação da técnica para a preparação
de amostras para a análise por GC, nomeadamente por modificação do
procedimento QuEChERS, tal como foi feito para a determinação de fenóis
voláteis.
A aplicação do procedimento QuEChERS tem estado um pouco limitado ao
objetivo da sua criação, a extração de pesticidas de amostras sólidas. No entanto,
sendo a base do procedimento a SALLE, as possibilidades de extração de outros
compostos para além de pesticidas são muito grandes. Seria, por isso, importante
caracterizar melhor a técnica SALLE e o procedimento QuEChERS para o
desenvolvimento de novas aplicações para a determinação de diversos compostos
em matrizes sólidas.
FCUP
181
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