coordenadora de estágio: margarida santana francisco pascoal ana coelho sara medinas
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Quantos e qual o tipo de micróbios que existem em alguns miligramas de solo?
Coordenadora de estágio: Margarida Santana
Francisco PascoalAna CoelhoSara Medinas
DNAConstituído por duas
cadeias de nucleótidos;Cada nucleótido tem
uma pentose, uma base fosfato, e uma base azotada;
Todos os nucleótido são essencialmente iguais, variando apenas a base azotada.
A - Introdução
DNA
As duas cadeias formam uma dupla hélice e têm sentidos opostos, como está evidenciado na figura.
Os nucleótidos das cadeias ligam-se através das bases azotadas.
Adenina(A)-Timina(T)Guanina(G)- Citosina (C)
DNA
As ligações G-C são triplas (mais fortes)
As ligações A-T são duplas (mais fracas)
Bactérias
Legenda:1. DNA cromossómico;2. Plasmídeos;
16s rDNA
O genoma bacteriano é constituído por cromossoma e plasmídeo, o DNA codificante do RNA ribossomal (16s rDNA) está no cromossoma
Replicação do DNA é semi-conservativa
O PCR imita a replicação do DNA
O que é necessário para o PCR? DNTP (nucleótidos no meio de reacção); Iniciadores; Enzima (DNA polimerase termo estável,
isolada a partir de uma bactéria termofilica); Tampão com magnésio.
Após a primeira replicação cada molécula de DNA origina duas moléculas.
Consequentemente, a quantidade de moléculas formadas será 2ⁿ, sendo n o número de replicações.
Com este processo e a partir de pequenas quantidades de DNA, obtemos grandes quantidades – amplificação.
1
2Legenda:1. Iniciador2. DNTP
Nota: São necessários dois iniciadores, um “forward“ e um “reverse”.
Os iniciadores a utilizar dependem da parte que se quer amplificar.
No nosso caso, utilizámos o P341 F-GC e P518 R, que são primers universais bacterianos.
1. Desnaturação de DNA a alta temperatura (95ºC);2. Descida de temperatura para os iniciadores se unirem à
cadeia;3. Subida à temperatura optima de extensão da DNA
polimerase;
1,2 e 3, constituem um ciclo que é repetido 35 vezes.
DGGE
No final do PCR obtemos um único fragmento, mas que corresponde a uma enorme quantidade de DNA de diferentes microrganismos. Para os podermos separar usamos o DGGE
Como funciona? Temos um gel com um gradiente de concentração de ureia, (maior concentração em baixo do gel.) A ureia vai desnaturar o DNA. Como temos diferentes sequencias de DNA, umas com mais G-C do que outros, estas vão oferecer maior resistência à desnaturação do que as ricas em A-T.
As moléculas mais ricas em G-C migram mais, só desnaturando na zona do gel com mais ureia.
Micro pipetas
Para pipetar pequenos volumes, as micro pipetas são um utensílio fundamental, que tivemos de aprender a utilizar correctamente.
B – Material e métodos
Verificação do DNA Em 1 está colocado um gel de agarose, ligado a uma fonte de alimentação. No gel colocámos as amostras de DNA recolhido.O DNA migra do pólo negativo para o positivo, separando-se de acordo com o seu tamanho.
1
Como vamos ver as bandas de DNA? Usamos Brometo de Etidio, que se intercala no DNA e é visível sob UV.
Corrida do gel
Para evitar contaminações as reacções de PCR são preparadas numa câmara previamente tratada com UV.
Após a preparação das soluções, fizemos o PCR no termociclador.
Preparação dos géis para o DGGE
1.Placa de agitação2.Agitadores magnéticos3.Gradientador: dois tubos que levam soluções com diferente concentração de ureia.4. Bomba peristáltica.
2
1
4
3
6Em 6 temos placas de vidro, onde é depositado o gel, que deriva do gradientador.
Tina de eletroforece
Aqui é colocado o gel
C- Resultados
2
1
1. Marcador;2. Amostra B (sem
manganésio);3. Amostra M (com
manganésio);
Por comparação com o marcador, podemos inferir que a amostra B tem menos concentração do que a amostra M.
3
Após o PCR vêm-se bandas da região amplificada, correspondente a um fragmento de cerca de 200 Pb.
De novo, percebe-se que há mais concentração de amostra B do que de M.
200pb
MarcadorBSem manganésio
Migração dos fragmentos em DGGE
M Com
magnésio
D- Discussão
• É difícil visualizar as bandas da amostra B, muito provavelmente devido à quantidade de DNA presente.
•A banda assinalada na foto anterior não existe em B e poderá corresponder a um organismo que se adapta melhor a solos ricos em manganésio
Também se conclui que temos poucos microrganismos, ou seja, pouca diversidade; o gel ao lado é exemplo dos muitos microrganismos esperados em solos “saudáveis”
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