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Aula de Bioquímica Avançada
Tema:
Fosforilação OxidativaCadeia transportadora de elétrons
Prof. Dr. Júlio César BorgesDepto. de Química e Física Molecular – DQFM
Instituto de Química de São Carlos – IQSCUniversidade de São Paulo – USP
E-mail: borgesjc@iqsc.usp.br
Fosforilação oxidativa
Representa o fim das rotas metabólicas de produção de energia em organismos aeróbicos
- Representa o estágio 3 do processo Acoplamento da oxidação de NADH e FADH2 e síntese de
ATP- É o principal sítio de produção de ATP em organismos
aeróbicos não fotossintetizantes - Envolve o consumo de O2 e formação de H20
Envolve a teoria Quimiosmótica proposta por Peter Mitchel 1961
Amplamente amparada experimentalmente
Nobel Prize Winner, 1978, Chemistry
Teoria Quimiosmótica- Fluxo de elétrons por carreadores criam um gradiente de concentração de prótons na
membrana mitocondrial- A quebra deste gradiente está acoplada com a síntese de ATP
Fosforilação oxidativa
Matriz mitocondrial- Local de oxidações- Ciclo de Krebs- β-oxidação de lipídeos- Oxidação de Aminoácidos
LOCAL: MITOCÔNDRIA
- Organela de eucariotos Possui duas membranas
Membrana Mitocondrial externa - MME- Permeável a pequenas moléculas
Membrana Mitocondrial interna - MMI- Impermeável a maioria das moléculas
- Inclusive H+
- Necessidade de transportadores de membrana
Espaço intermembranal-Cristas membranais
MitocôndriaOs carreadores que transportam os elétrons do NADH e FADH2 até O2 estão na MMI
A oxidação de NADH e FADH2 é promovida pela CTE
Alguns desses centros redox são móveis ou proteínas integrais de membrana
Fosforilação oxidativaLOCAL: MITOCÔNDRIA
A MMI contém proteínas que acoplam processos:Fluxo de elétrons (favorável) com o fluxo de prótons (desfavorável);Fluxo de prótons (favorável) a fosforilação oxidativa (desfavorável);
Os elétrons passam por uma série de carreadores
MMI-~ 75% de proteínas: mais rica em proteínas do que a
MME
-É permeável a O2, CO2 e H2O
- Contém proteínas de transporte que controlam a passagem de metabólitos,
como ATP, ADP, o piruvato, o Ca2+ e o fosfato
A impermeabilidade da MMI para a maioria dos íons e metabólitos permite a formação de um gradiente de íons
através dessa barreiraResulta na compartimentalização das funções
metabólicas entre o citosol e a mitocôndria
Fosforilação oxidativaLOCAL: MITOCÔNDRIA
Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS OU CADEIA RESPIRATÓRIA
Os carreadores que transportam os elétrons do NADH e FADH2 até O2 estão na MMI- A oxidação de NADH e FADH2 é promovida pela cadeia de transporte de elétrons
- Alguns desses centros redox são móveis ou proteínas integrais de membrana- Dependem dos grupos protéticos associados
A sequência de carreadores de elétrons reflete seus potenciais de redução relativos O processo é exergônico
Transporte de e’1) 1 e’ Fe3+ para Fe2+
2) 1 e’ + 1 H+
3) 2 e’ na forma de :H-
Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS OU CADEIA RESPIRATÓRIA
'0E
Potencial de transferência de elétrons
= potencial de redução= potencial redox= potencial de oxidorredução
Forma oxidada (oxidante) →Par redox
Forma reduzida (redutor) →
X−
XH+ : H2
Potencial de redução = 0 V
Potencial de redução ˂ 0A forma oxidada tem menor afinidade por elétrons que o H2
Potencial de redução ˃ 0A forma oxidada tem maior afinidade por elétrons que o H2
Um agente redutor forte (como o NADH) tem a tendência de doar elétrons (E’0 < 0); um agente oxidante forte (como o O2) está pronto para aceitar elétrons (E’0 > 0)
A força impulsora da fosforilação oxidativa é o potencial de transferência de elétrons de NADH e FADH2 em relação ao do O2
Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS OU CADEIA RESPIRATÓRIA
Os carreadores de e’ NAD(P)H
São carreadores de elétrons solúveis em água, que se associam reversivelmente a
desidrogenasesSubstrato reduzido + NAD(P)+ ↔ Substrato oxidado + NAD(P)H + H+
**Desidrogenases remoção de 2 átomos de H do substrato
:H- → NAD+
H+ → Liberado do meio
NADH → carreador de elétrons das vias catabólicas até a porta de entrada na CTE
NADPH → geralmente supre elétrons para reações anabólicas
][][
+NADNADH
][][
+NADPNADPH
NADPHRazão alta Poder redutor a reações
anabólicas
NADHRazão baixa carreador de e- no
catabolismo
Nas células
Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS OU CADEIA RESPIRATÓRIA
Os carreadores de e´
FlavoproteínasContêm um nucleotídeo de flavina (FMN ou FAD) → parte do sítio ativo da
flavoproteína
Pode aceitar 1 elétron → semiquinona ou 2 elétrons → FADH2 FMNH2
A forma oxidada (FMN) reage com um próton e um elétron, convertendo-se na forma semiquinona (FMNH●); a incorporação de mais um próton e um elétron resulta na forma totalmente reduzida (FMNH2).
Flavoproteínas podem participar da transferência de 1 ou 2 e- → intermediários entre reações onde 2e-
são doados (desidrogenações) e onde 1 e- é doado (redução de uma quinona a hidroquinona).
Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS OU CADEIA RESPIRATÓRIA
Os carreadores de e´
Ocorrem 3 tipos de transferência de elétrons na CTE① Transferência direta como na redução de Fe3+ a Fe2+
② Transferência na forma de um átomo de hidrogênio (H+ + e-)
③ Transferência como íon hidreto (:H+) que tem 2 elétrons
+ 3 tipos de moléculas carreadoras de elétrons atuam na CTE:
① Ubiquinona (quinona hidrofóbica)
② Citocromos
③ Proteínas ferro- enxofreProteínas (diferentes) que contêm ferro
Carreadores não podem atravessar a MMI, MAS os equivalentes redutores podem ser lançados através da membrana indiretamente
Equivalentes redutores termo geral para um elétron ou equivalente de elétron na forma de um átomo de hidrogênio ou de um íon hidreto.
Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS
Os carreadores de elétrons na mitocôndria COENZIMA UBIQUINONA (Q)- Pequena e Lipossolúvel
Quinona → composto benzênico com duas funções cetona
Constituída de unidades isoprenóides (cada uma com 5C)
A coenzima Q10 é a mais comum em mamíferos (10
unidades de isopreno)
Fácil de desprotonar, formando um radical
aniônico de semiquinona
Forma que fixa mais firmemente seus prótons
Aceita 1 elétron
Aceita 2 elétrons
Lipossolúvel→ se difunde livremente no espaçointermembranas→ Capaz de fazer a junção entre o doadorde 2e- e um aceptor de 1e- (como asflavoproteínas)→ Carrega tanto elétrons como prótons** acopla fluxo de e- com o movimento de
prótons
Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS
Os carreadores de elétrons na mitocôndria
PROTEÍNAS COM CENTROS DE FERRO-ENXOFRE- Estrutura variável simples a complexas- O íon Fe sofre reações de óxido-redução
Os átomos de ferro estão ligados a átomos de enxofre inorgânico ou com átomos de enxofre
em resíduos de cisteína ou com ambos
Podem ter de 1 a 4 átomos de ferro
*** Proteínas ferro-enxofre de Rieske1 Fe está associado com dois resíduos de His ao
invés de Cys
Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS
Os carreadores de elétrons na mitocôndria Citocromos a, b e c
Seus grupos prostéticos – grupos HemeCitocromo c solúvel no espaço intermembrana
Podem interagir com a MMI
Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS
O fluxo de elétrons pelos carreadores vai daquele com menor potencial para o maior potencial
- Potencial Redox diferentes aos das moléculas livres devido a interação com proteínas
NADH Q Cit b Cit c1 Cit c Cit a Cit a3 O2
Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS
Os carreadores de elétrons na MMI: 4 complexos
Complexo I é do NADH para formar UbiquinolNADH:Ubiquinona-oxidoreductase ou NADH-desidrogenase
Complexo II é do FADH2 para formar UbiquinolSuccinato-desidrogenase
Complexo III é do Ubiquinol para o Citocromo cUbiquinona:Citocromo c-oxidoreductase
Complexo IV é do Citocromo c para o O2Citocromo c-oxidase
Fosforilação oxidativaCOMPLEXO I: NADH:UBIQUINONA-OXIDOREDUTASE OU NADH-DESIDOGENASE
Porta de entrada dos e’ do NADH produzidos dentro da mitocôndria
-O Complexo catalisa 2 processos simultâneos e acoplados1) NADH + H+ + Q NAD+ + QH2
Exergônico2) Transferência de 4 H+ para o espaço intermembrana
Endergônica
Grupos prostéticos: FMN e Fe-S
Fosforilação oxidativaCOMPLEXO II: SUCCINATO-DESIDOGENASE
Porta de entrada dos e’ do FADH2 produzidos no ciclo do ácido cítrico
Canaliza diretamente os e’ do succinatopara a cadeia transportadora de e’
FADH2 + Q FAD + QH2
Exergônico
Sem transferência de H+ para o espaço intermembrana
QH2: Porta de entrada de parte dos e’ do NADH produzidos no citoplasma
Porta de entrada de e’ de outras vias oxidativas
- β-oxidação de ácidos graxos
Fosforilação oxidativaCOMPLEXO I E COMPLEXO II
Vias de entrada de e’ para a
ubiquinona:
1) NADH mitocondrial,
2) Succinato do ciclo do ácido
cítrico,
3) e’ da β-oxidação de ácidos
graxos via Acil-CoA-desidrogenase
e do glicerol dos triacilglicerois
4) NADH citosólico via glicerol 3-
fosfato
1)
2) 3)
4)
A ubiquinona é o ponto de convergência dos e- (Fontes 1 a 4)
O ubiquinol de todas essas reações (pool de QH2) é oxidado no Complexo III
Fosforilação oxidativaCOMPLEXO III: UBIQUINONA:CITOCROMO C-OXIDOREDUTASE
Canaliza os 2 e’ do Ubiquinol (QH2) para o Citocromo C com a transferência de H+ da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana
- possui duas unidades de Citocromo b enterrados em 1 fenda na membranaQH2 + 2 Citc1 (Oxi) + 2 H+
N Q + 2 Citc1 (Red) + 4 H+P
Fosforilação oxidativaCOMPLEXO III: UBIQUINONA:CITOCROMO C-OXIDOREDUTASE
2 e’ do Ubiquinol são afunilados no Citc carreador de 1 e’ 2 ciclos de redução do Citc com a formação da Semiquinona (.Q-)
1º Ciclo -1 e’ do QH2 é passado para o
Citc no primeiro ciclo e o outro e’ (via citocromo b) para
a Q formando Semiquinona
- 2 H+ transportados para o espaço intermembrana
2º Ciclo-1 e’ do QH2 é passado para o
Citc e o outro e’ (via citocromob) para a Semiquinonaformando outra QH2
- 2 H+ transportados para o espaço intermembrana
- 2 outros H+ são retirados da matriz
1º Ciclo 2º Ciclo
Fosforilação oxidativaCOMPLEXO IV: CITOCROMO OXIDASE
Os e’ do Citocromo c são entregues ao O2
4 Citc (Red) + 8 H+N + O2 4 Citc (Oxi) + 4 H+
P + 2 H2O
Os e- do citocromo c são entregues ao O2 (reduzindo-o a H2O)
Composto por 13 subunidades aparentemente 3 são essenciais
Sub. II: 2 Cu ligados a resíduos de Cys (centro binuclear CuA)
Sub. I: 2 grupos heme (a e a3) e outro íon Cu (CuB)
Heme a3 e CuB forma outro centro binuclear
Fosforilação oxidativaCOMPLEXO IV: CITOCROMO OXIDASE
Os e’ do Citocromo c são entregues ao O2
4 Citc (Red) + 8 H+N + O2 4 Citc (Oxi) + 4 H+
P + 2 H2O
Envolve a participação de:Ion CuA
Citocromo aCitocromo a3-CuB (Centro Fe-Cu)
O2
4 ciclos são necessários para reduzir 1 O2 a 2 H2O
4 H+ transportados para o Espaço intermembranas
4 outros H+ são retirados da matriz para formar as 2 H2O
2 H+ por par de e-
Fosforilação oxidativaO RESPIROSSOMO
Canalização de substratos na membrana mitocondrial interna- Dados cinéticos e estruturais indicam a associam dos complexos da CTE na MMI
- Complexo III pode ser extraído juntamente com o Complexo I ou complexo IV
Complexo III Vermelho
Complexo IV Verde
Imagens de micrografia eletrônica
Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS
Resumo do processo
Equação Vetorial do transporte de Prótons pela cadeiaNADH + 11 H+
N + ½ O2 NAD+ + 10 H+P + 1 H2O
FADH2 + 6 H+N + ½ O2 FAD + 6 H+
P + 1 H2O
- O ∆E0‘ representa o potencial de redução padrão nas condições padrões para bioquímica
- Um Valor positivo para o ∆E (potencial de redução ou força eletromotiva) sugere espontaneidade da reação
- um valor positivo para o ∆E representa um valor negativo para o ∆G
Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS
NADH + H+ + ½ O2 NAD+ + 1 H2O
A ΔG da reação pode ser medida a partir da diferença de voltagem entre meias células
- Se referente ao trabalho elétrico realizado a pressão e volume constante-Se o onde f é a constante de Faraday (96.485 Cmol-1) e
- n é o número de e’/mol portanto:
+←+ + →+ noxredred
nox BABA
+∆=∆ +
+
nred
nox
noxred
BABARTGG
]][[]][[ln'0
elwwG −=−=∆ '
Enfwel ∆=
EnfG ∆−=∆
−∆=∆ +
+
nred
nox
noxred
BABA
nfRTEE
]][[]][[ln'0 Equação
de Nernst Reorganizando
Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS TEÓRICO
NADH + H+ + ½ O2 NAD+ + 1 H2O
NADH/NAD+ E0’ = + 0,320 V O2/H2O E0’ = +0,816 V
Succinato + ½ O2 Fumarato + 1 H2O
A razão da [NADH]/[NAD+] >1 o que sugere que a ΔG é mais negativa do que -220 kJ/mol!
ΔE0’= E0’Red + E0’
oxi = + 1,14 V
)(/22014,1)./5,96(2'0'0 deNADHmolkJVmolVkJEnfG −=−=∆−=∆
)(/150785,0)../5,96(2'0'0 odeSuccinatmolkJVmolVkJEnfG −=−=∆−=∆
E energia liberada é usada para gerar um gradiente de prótons que é então utilizado para a síntese de ATP e para o transporte de metabólitos pela
membrana mitocondrial
Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS EFETIVO
A energia da transferência de e’ é eficientemente conservada em um gradiente
- Gradiente de prótons - Gradiente eletroquímicoFORÇA PROTON-MOTRIZ ENERGIA ELETROQÍMICA
A ΔG associada ao processo de criação dos 2 gradientes é:
C2 = H+pLado positivo da MMI Espaço intermembrana
C1 = H+nLado negativo da MMI Matriz mitocondrial
Z = valor absoluta da carga elétrica 1 para 1 H+
ΔΨ = Diferença do potencial transmembrana
ψzfCCRTG ∆+=∆ )
12ln(
]log[ +−= HpHpHpHpHHHCC
pnnp ∆=−=−= ++ 3,2)(3,2)]log[](log[3,212ln
ψmolkJpHmolkJψzfpHRTG ∆+∆=∆+∆=∆ )./6,95()./7,5(3,2
Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS
A ΔpH da MMI é de 0,75 unidades de pH A ΔΨ da MMI é de 0,15-0,20 V
A ΔG associada à oxidação de 1 mol de NADH é:
molkJmolkJmolkJG /1915,0)./6,95(75,0)./7,5( =+=∆
Equação Vetorial do transporte de Prótons pela cadeiaNADH + 11 H+
N + ½ O2 NAD+ + 10 H+P + 1 H2O
Logo ΔG = 19 kJ/mol*10 = ~190 kJ/molΔG0’ = 220 kJ/mol
Fosforilação oxidativa“VAZAMENTO DE E’ DA CTE)
A formação de EROs: Espécies Reativas de Oxigênio: Radicais LivresÍon superóxido O2
- 0,1-4%
Superóxido dismutase
Glutationa-peroxidase
- Ação dependente de:Glutationa
NADPH
Fosforilação oxidativaSISTEMAS DE TRANSPORTE MITOCONDRIAL
Espaço intermembrana: entre a MME e MMI- equivalente ao citosol no que se refere às concentrações em metabólitos e íons
A MMI é composta por cerca de 75% de proteínas mais rica em proteínas MME- A MMI é permeável a O2, CO2 e H2O
- Contém proteínas de transporte que controlam a passagem de metabólitos, como ATP, ADP, o piruvato, o Ca2+ e o
fosfato
A impermeabilidade da MMI para a maioria dos íons e metabólitos permite
a formação de um gradiente de íons através dessa barreira
Resulta na compartimentalização das funções metabólicas entre o citosol e a
mitocôndria
Fosforilação oxidativaSISTEMAS DE TRANSPORTE MITOCONDRIAL
Transporte seletivo de elétrons produzidos no citoplasma para a mitocôndria- O NADH produzido no citosol pela glicólise deve ter acesso à cadeia transportadora de
elétrons para a oxidação aeróbica Fígado, rim e coração
- Não há uma proteína transportadora de NADH
na MMI
- Somente os elétrons do NADH citosólico são transportados para a
mitocôndria por um dos vários sistemas de
transporte
LANÇADEIRA DE MALATO-ASPARTATO
Fosforilação oxidativaSISTEMAS DE TRANSPORTE MITOCONDRIAL
LANÇADEIRA DE GLICEROL-3-P Músculo esquelético e encéfalo
A glicerol-3-fosfato desidrogenase catalisa a oxidação
do NADH citosólico pela DHAP para produzir NAD+, o qual
retorna à glicólise
Os elétrons do glicerol-3-fosfato são transferidos para a
Flavoproteína-desidrogenase da MMI, formando FADH2
O FADH2 fornece elétrons diretamente para Cadeia
Transportadora de Elétrons QH2
Fosforilação oxidativaSISTEMAS DE TRANSPORTE MITOCONDRIAL
A MMI contém um translocador de ADP-ATP (ou adenina-nucleotídeo translocase)
- Transporta o ATP para fora da matriz mitocondrial acoplado à importação de ADP e Pi
produzidos no citoplasma a partir de ATP- Sistema antiporte
- Mantém balanço eletrolítico pelo gasto de energia quimiosmótica
TRANSLOCADOR DE ATP/ADP-PI
A maior parte do ATP gerado na matriz mitocondrial pela fosforilação oxidativa é
utilizado no citosol
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