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Abelhas sem ferrão no monitoramento de resíduos de pesticidas e qualidade do mel

Profa. Dra. Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki

• Polinizadores de muitas espécies de plantas cultivadas e matas naturais

• São responsáveis por até 90% da polinização em áreas naturais

• O que acontece se esses insetos se contaminam com pesticidas ou outros compostos xenobióticos?

• O que acontece com a sua cria, o ninho, a colmeia e com os seus produtos que muitas vezes são utilizados por nós?

•Relatos de casos de sumiço de abelhas nativas sem ferrão – Paraná

•Será que os pesticidas, em especial inseticidas podem estar relacionados com esse sumiço?

Caixa abandonada de Plebeia droryana Cambé-PR

Caixa abandonada de Leurotrigona muelleri Cambé-PR

• Esse desaparecimento de abelhas sem ferrão está muito parecido com a Desordem do Colapso das Colônias (CCD) descrita para as abelhas Apis mellifera – primeiro relato em outubro de 2006 na costa leste dos EUA

• CCD - ausência de abelhas vivas ou morta na colônia, mas com a presença de crias e alimento, podendo ser encontrado, em alguns, uma pequena quantidade de operárias e a rainha dentro da colmeia.

• Em colmeias em há operárias observa-se uma relutância da colônia em consumir o alimento energético ou proteico fornecido.

• Prováveis causas da CCD em A. mellifera: ▫ uma nova doença que acomete as abelhas – parasita

ou patógeno▫ envenenamento por defensivos agrícolas ▫ desnutrição▫ alto nível de consanguinidade ▫ estresse ambiental▫ manejo apícola inadequado

•CCD pode estar afetando as abelhas nativas sem ferrão?

•Será que as causas são as mesmas que afetam as A. mellifera?

•Um dos fatores seria a ação de pesticidas como inseticidas e herbicidas

• Por que estudar os efeitos de agrotóxicos em jataí?▫ Ocorrência alta▫ Facilidade de criação▫ Facilidade de manutenção

• Espécies de Tetragonisca e sua distribuição▫ Tetragonisca angustula (Latreille, 1811) – Ocorre do

México, América Central e América do Sul

▫ Tetragonisca fiebrigi (Schwarz, 1938) – Brasil (Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Paraná, Rio Grande do Sul, São Paulo), Argentina, Bolívia e Paraguai

▫ Tetragonisca weyrauchi (Schwarz, 1943) – Bolívia, Perú e Brasil (Acre, Mato Grosso, Rondônia)

▫ Tetragonisca buchwaldi (Friese, 1925) – Costa Rica, Panamá e Equador

Tetragonisca weyrauchi – jataí acreana

Tetragonisca angustula

Tetragonisca fiebrigi

Quatro classes de agrotóxicos de acordo com a CL50 para abelhas: •Classe 1- extremamente tóxicos CL50 > 2μg/abelha• Classe 2- altamente tóxicos CL50 entre 22μg e 10,99μg/abelha• Classe 3- moderadamente tóxicos CL50 entre 11μg e 100μg/abelha• Classe 4- pouco tóxicos CL50 < 100μg/abelha

(Larini, 1999; Hunt, 2000)

Toxicidade dos inseticidas medida CL50 (concentração letal que proporciona a morte de 50% da população)

Abelhas jataí Tetragonisca angustula e Tetragonisca fiebrigi como bioindicadores

• Trabalho desenvolvido por Ana Lucia Paz Barateiro Stuchi – tese de doutorado – Pós-Graduação em Zootecnia (2005 a 2009)

•Nesse estudo foram avaliadas as alterações ocorridas na expressão gênica de abelhas do gênero Tetragonisca após contaminação com agrotóxicos para, posteriormente, utilizar esses insetos como bioindicadores de agrotóxicos.

Perfil eletroforético das esterases em gel de poliacrilamida. A = extratos de cabeça/tórax de operárias de Tetragonisca fiebrigi e B = extratos de cabeça/tórax de operárias de Tetragonisca angustula.

(Sociobiology, v. 59, n. 1, 123-134,2012)

A B

EST-2EST-3

EST-4

EST-1

EST-4

+

Agroquímico CL50 (%) 95% Limite de confiançaFipronil – contato 0,00062 0,00053 – 0,00075Fipronil – ingestão 0,00123 0,00121 – 0,00127

Malathion – contato 0,50 -----Malathion – ingestão 0,38 0,22 – 0,55

Neem - contato ----- -----Neem - ingestão ----- -----

Thiamethoxam - contato 0,79 0,61 – 1,04Thiamethoxam –

ingestão0,21 0,17 – 0,27

Concentrações letais a 50% (CL50) das abelhas Tetragonisca fiebrigi submetidas ao fipronil, malathion, neem e thiamethoxam, tanto por contato (papel filtro) como por ingestão (alimento)

Concentrações EsterasesEST-1 EST-2 EST-4

Fipronil (%)0,0001 - - -0,0005 - - -0,0006 - - -0,0007 - - -0,0011 - - -

Malathion (%)0,0017 - - -0,0018 - - -0,0019 - - -0,002 - - -0,004 - - -

Thiamethoxam (%)0,7 - - -0,8 - - -

0,85 - - -0,9 - - ++1 - - -

Inibição da atividade das esterases detectada em T. fiebrigi após contato com fipronil, malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (++) aumento de intensidade da banda

ConcentraçõesEsterases

EST-1 EST-2 EST-4Fipronil (%)

0,0011 - - -0,0012 + - +

0,00125 - - -0,0025 - - -0,025 - - -

Malathion (%)0,2 - - +0,3 - - -0,4 - - -

0,45 - - +0,5 - - -

Thiamethoxam (%)0,15 - - -0,2 - - -

0,22 - - -0,24 - - -0,5 - - -

Inibição da atividade das esterases detectada em T. fiebrigi após ingestão de fipronil, malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (+) inibição parcial

MalathionControle

EST-4

+

EST-3

Perfil eletroforético das esterases de extratos de cabeça/tórax de T. angustula, mostrando a inibição parcial da EST-3 e EST-4, após contaminação por contato com o inseticida malathion na concentração de 0,003%.

Agroquímico CL50 (%) 95% Limite de confiança

Fipronil – contato 0,00053 0,00024 – 0,00064

Fipronil – ingestão 0,00056 0,00053 – 0,00059

Malathion – contato 0,00315 -----

Malathion – ingestão 1,33 0,54467 – 2,18486

Neem – contato ----- -----

Neem – ingestão ----- -----

Thiamethoxam - contato 0,1622 0,06343 – 0,34581

Thiamethoxam – ingestão 0,2133 -0,00039 – 0,5357

Concentrações letais a 50% (CL50) das abelhas T. angustula submetidas ao fipronil, malathion, neem e thiamethoxam, tanto por contato (papel filtro) como por ingestão (alimento)

Concentrações EsterasesEST-3 EST-4

Malathion (%)0,0025 - +0,0028 - -0,003 + +0,004 - -

0,1 - -Thiamethoxam (%)

0,05 - -0,07 - -0,1 + +0,2 - -0,3 - -

Inibição da atividade das esterases detectada em Tetragonisca angustula após contato com malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (+) inibição parcial

Concentrações EsterasesEST-3 EST-4

Malathion (%)0,4 - -0,6 - -1 + +2 - +3 - -

Thiamethoxam (%)0,005 - -0,008 - -0,01 - -0,02 - -0,03 - -

Inibição da atividade das esterases detectada em T. angustula após ingestão de malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (+) inibição parcial

Abelhas jataí bioindicadores da presença de resíduos de Herbicidas

Herbicida Diluição (%) Concentração (g/ml)

Sanson 40 SCNicossulfuron 40 g/l

100 0,000375 0,00022550 0,0001510 0,000031 0,000003

Gramoxone 2001,1'−dimetil−4,4'−bipiridilio dicloreto (paraquat)

200g/l

100 0,001510 0,000151 0,000015

0,1 0,0000015

Trabalho desenvolvido por Fábio Fermino – Dissertação de mestrado – Pós-Graduação em Genética e Melhoramento (2008 a 2010)

Teste Concentração (%)

Concentração

(g/ml)

Mortas

Vivas % Indivíduos mortos

Controle(água

destilada) ---- 0 56 0

Sanson 40 SC® (nicosulfuron)

1 0,000003 0 60 010 0,00003 4 57 6,550 0,00015 0 60 075 0,000225 4 46 8,0

100 0,0003 0 60 0Total 8 339

Controle(água

destilada)----

0 60 0Gramoxone

200®(paraquat) 0.1

0,0000015

0 40 01 0,000015 0 40 0

10 0,00015 0 40 0100 0,0015 4 36 10,0

Total 4 216

Mortalidade de T. angustula nos bioensaios com os herbicidas nicosulfuron (Sanson 40 SC®) e paraquat (Gramoxone 200®) após 24h de exposição.

IsoenzimasHerbicidas MDH-2 MDH-3 SOD-1 EST-3 EST-4

Nicosulfuron (%)

1% + + + + +10% + + + + +50% + + + + +75% + + + +- +-

100% + + + +- +-Paraquat (%)

0,1% + + + + +1% + + + +- +-

10% + + ++ - -100% + + ++ - -

Inibição da atividade das isoenzimas malato desidrogenase (MDH), superóxido dismutase (SOD) e esterase (EST) detectada em T. angustula após contato com Nicosulfuron e Paraquat. (+) ausência de inibição; (+-) inibição parcial; (-) inibição total; (++) aumento na expressão.

Isoenzimas

Herbicidas MDH-2 MDH-3 SOD-1 EST-1 EST-2 EST-4

Nicosulfuron (%)

1% + + + + + +

10% + + + + + +

50% + + + + + +

75% + + + +- +- +-

100% + + + +- +- +-

Paraquat (%)

0,1% + + + + + +

1% + + + - - -

10% + + ++ - - -

100% + + ++ - - -

Inibição da atividade das isoenzimas malato desidrogenase (MDH), superóxido dismutase (SOD) e esterase (EST) detectada em T. fiebrigi após contato com Sanson e Paraquat. (+) ausência de inibição; (+-) inibição parcial; (-) inibição total; (++) aumento na expressão.

ALTERAÇÃO DA EXPRESSÃO DE ESTERASES E PROTEÍNAS TOTAIS DE TETRAGONISCA ANGUSTULA LATR.VISITANTES DE FLORES DE CAFÉ (COFFEA ARABICA L.) APÓS PULVERIZAÇÃO COM O INSETICIDA NEEMTrabalho desenvolvido por Mayra Cristina de

Araujo – Monografia – especialização em Biotecnologia aplicada a agroindústria - UEM

Vista da florada de cafezal (C. arábica) em Apucarana-PR - 2009

Vista da entrada do ninho de T. angustula utilizado no bioensaio durante a florada de cafezal em Apucarana-PR

• Local: Cafezal do Sítio Penitente em Apucarana – Paraná• Início da florada (botões florais começando a abrir)

cafeeiros foram pulverizados com o inseticida neem comercial

• Caixa comerciais de jataí foram instaladas como segue a aproximadamente 100m do pés de café:

▫ Tratamento: uma das caixas foi instalada a 100m de uma fileira lateral e 24 horas depois foi realizada a aplicação do inseticida comercial neem de acordo com as instruções constantes da embalagem;

▫ Controle: A segunda caixa de jataí foi instalada na extremidade oposta a aproximadamente 600m de distância da caixa anterior e 24 horas depois foi realizada pulverização apenas com água.

• Operárias adultas foram coletadas na entrada do ninho tratado e controle após:▫ 24h ▫ 48h ▫ 72h

• Análise das esterases: inibição parcial das EST-3 e EST-4 após 48h da contaminação, em comparação com o controle.

• Análise das proteínas totais: ocorreu um aumento na quantidade de peptídeos após 24h da contaminação

• No campo foi observado que:▫ os pés de café pulverizados com neem repeliram

parte das T. angustula que estavam forrageando ▫ e que não houve mortandade de abelhas após a

aplicação do inseticida.

Análise da expressão gênica em Tetragonisca angustula L. após a contaminação com inseticidas

•Trabalho desenvolvido por Carlos Vinício Prescinato De Oliveira – Dissertação de mestrado – Pós-Graduação em Genética e Melhoramento

• Inseticidas reguladores de crescimento

▫Galaxy EC 100 – princípio ativo Novaluron▫Natuneem – extrato da planta neem (Azadirachta

indica )– princípio ativo azadiractina▫AzaMax – princípio ativo azadiractina

• Contaminação por contato dentro das colmeias por longo período de tempo

• Concentrações subletais

• Bioensaios realizados no setembro de 2010 a outubro de 2011

• Gallaxy EC 100 princípio ativo - novaluron (100g/L), é um inseticida regulador de crescimento que atua principalmente na síntese da cutícula do inseto, inibindo a síntese de quitina e, consequentemente, inibindo a muda do inseto.

• Azadiractina - pode afetar a sobrevivência, causar repelência, deterrente alimentar (impede que outros organismos se alimente da planta), regular o crescimento, reduzir a fertilidade de fêmeas, causar anormalidades anatômicas, provocar efeitos histopatológicos prejudiciais em glândulas produtoras de neurôrmonios, em tecidos reprodutivos e em células epiteliais do intestino, afetar o metabolismo de proteínas em insetos.

Diluições dos inseticidas utilizados nos experimentos

Inseticidas utilizados

Concentrações em %

Gallaxy EC 100 0,56,2510

NatuNeem 0,52,5100

AzaMax 15

Procedimento experimental•Inseticidas diluídos em água destilada•Aplicou-se 01 mL do inseticida diluído em

folha de papel filtro (12,5 ± 0,1 cm) – colocadas para secar.

•Folhas de Papéis filtros contaminadas foram introduzidas no interior dos colmeias

•Controle – mesmo procedimento para os ninhos contaminados, porém aplicou-se apenas 01 mL de água destilada

•Coletas de operárias para análise das esterases e proteínas totais:▫48 horas▫120 horas▫168 horas▫30 dias ▫ 60 dias

Esterases

Galaxy ED 100

NatuNeem AzaMax

EST-4 + 60 dias 0,5%

+ 48 horas 2,5%

- 30 dias 0,5%

- 48 horas 1%

+ 60 dias 1%

EST-3 Sem alteração

Sem alteração

Sem alteração

Inseticidas utilizados

Concentrações em %

Gallaxy EC 100 6,25 Síntese de novos peptídeos até 168 horas

NatuNeem 0,5 Redução da síntese proteica e surgimento de peptídeos após 60 dias

2,5 Surgimento de peptídeo após 48 horas alterações até 168 horas

100 Novo peptídeo (120 horas) e alterações na síntese até 168 horas

AzaMax 1 Aumento da síntese proteica até 168 horas

Eletroforese SDS-PAGE 7% de T. angustula após a exposição ao inseticida Gallaxy EC 100 6,25% por 120 horas, coloração nitrato de prata. Os asteriscos seguidos de letras são para identificar horizontalmente as regiões de peptídeos afetados. P.M: padrão de peso molecular. 01-09: controle. 11-20: tratados.

•Após 48 horas da contaminação com AzaMax a 5% não foi possível coletar abelhas na entrada do ninho - nos períodos de forrageamento, manhã e tarde, a partir de 48 horas após contaminação a quantidade de abelhas na entrada do ninho e forrageando diminuiu drasticamente ao longo dos dias. Nenhuma abelha morta foi encontrada no entorno do ninho.

•seria a ação repelente do AzaMax?

• Pesticidas em concentrações subletais alteram a expressão de esterases e de proteínas solúveis em abelhas T. angustula e T. fiebrigi

• Essas alterações refletem o metabolismo intermediário dessas abelhas – detoxificação

• O aumento de síntese de proteínas pode estar levando essas abelhas a apresentarem uma resposta ao estresse ambiental (presença do pesticida) que pode ser:▫Nova proteína sintetizada▫Comportamental, por exemplo: alteração na

orientação, abandono do ninho

Questões a serem respondidas

•A rainha é afetada pelos pesticidas? E a cria?

•Há contaminação do mel e pólen?

•Com quais pesticidas ocorre alteração comportamental ? Quais alterações?

•Quais as concentrações míneemas que afetam as abelhas e seus produtos?

Qualidade do Mel• É importante destacar que a composição exata de qualquer

mel depende, principalmente, das fontes vegetais das quais ele é derivado, mas também do clima, solo e outros fatores

• Várias metodologias utilizadas para a determinação de resíduos de agrotóxicos são baseadas em métodos cromatográficos

• Resíduos de contaminantes também podem ser identificados em amostras de pólen - cromatografia líquida com espectrometria de massa

• A presença de resíduos de pesticidas pode ser identificada ainda com o corpo das abelhas – mas não há técnica eficiente. Uma técnica utilizada é a cromatografia gasosa

Alguns cuidados que podem diminuir a contaminação com agrotóxicos

•Se houver cultivo nas proximidades verificar se há uma grande faixa de vegetação nativa – início da faixa – 1,5 Km da lavoura

•Os limites estabelecidos de acordo com o RT (tempo residual) de cada substância devem ser respeitados, e evitar a aplicação de inseticidas que tenham RT acima de 8h.

• Não se deve fazer pulverizações quando a temperatura estiver muito baixa – porque isso aumenta o RT

• Não se aplicar pesticidas durante o pleno florescimento da cultura ou de plantas presente nas proximidades

 • Usar as formulações menos perigosas quando for

possível – formulações granuladas e em solução. Evitar o uso de microcápsulas – liberam o ingrediente ativo gradativamente

 • As instruções estabelecidas pelos fabricantes devem

ser obedecidas, respeitando a quantidade e a forma de aplicação.

Obrigada!