alterações teciduais agudas em ratos wistar induzidas por t cruzi

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

MESTRADO EM BIOLOGIA

ALTERAÇÕES TECIDUAIS AGUDAS INDUZIDAS

EM RATOS WISTAR POR Trypanosoma cruzi

Mestrando: Kleber Mirallia de Oliveira

Orientador: Prof. Dr. João Roberto da Mata

Goiânia - Goiás

2005

Kleber Mirallia de Oliveira

ALTERAÇÕES TECIDUAIS AGUDAS INDUZIDAS

EM RATOS WISTAR POR Trypanosoma cruzi

Dissertação apresentada ao Curso de

Mestrado em Biologia do Instituto de

Ciências Biológicas da Universidade

Federal de Goiás, como requisito parcial

para a obtenção do grau de Mestre em

Biologia.

Área de Concentração: Morfologia

Orientador: Prof. Dr. João Roberto da Mata

Goiânia - Goiás

2005

DEDICATÓRIAS

À minha amada esposa Elaine Ferreira dos Santos

Mirallia,

Aos meus filhos Adam, Kaique, Yohana e Ryan.

Por serem a família que justifica todos os esforços em

direção à felicidade.

À minha mãe Felícia Maior Mirallia,

que tudo deu sem esperar nada em troca.

Aos mestres,

que numa demonstração de sabedoria, instruíram o

ignoto ajudando-o a dar mais um passo em direção

ao entendimento.

AGRADECIMENTOS

A Deus, o Pai Eterno,

cuja crença me levou adiante nos momentos

desesperadores;

Aos que me dificultaram o caminho,

verdadeiros professores que me ensinaram a

manter o caráter e moral à altura, e o desejo da

conquista vivo como uma chama ardente no

coração;

Aos que me facilitaram o caminho,

complemento misericordioso ao fraco e aflito,

que com seu exemplo me ensinam a conduta

correta necessária a quem deseja ensinar.

MUITO OBRIGADO!!!

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS LISTA DE FIGURAS LISTA DE GRÁFICOS RESUMO/ABSTRACT 1 INTRODUÇÃO........................................................................................... 01 2 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 14

Animais......................................................................................................... 14

Isolado, parasita e inoculação.......................................................................14

Grupos .......................................................................................................... 15

Parasitemia.................................................................................................... 15

Eutanásia dos animais................................................................................... 16

Métodos histológicos e histoquantitativos................................................... 16

Documentação fotográfica........................................................................... 17

Analise estatística......................................................................................... 17 3 RESULTADOS............................................................................................ 18

Peso corporal................................................................................................. 18

Curvas parasitêmicas induzidas pelo isolado.............................................. 19

Alterações teciduais morfológicas induzidas pela infecção........................ 24

4 DISCUSSÃO................................................................................................ 32 5 CONCLUSÕES............................................................................................ 37 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................ 38

ANEXO........................................................................................................ 52

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Distribuição dos animais e grupos usados no experimento............................... 16 Tabela 2 - Valores médios do peso corporal em gramas de ratos Wistar inoculados aos 15 dias de idade e sacrificados aos 38 dias de idade, com 10.000 e 100.000 tripomastigotas por animal (tripo/animal). ................................................................................................... 20 Tabela 3 - Valores médios do peso corporal em gramas de ratos Wistar inoculados aos 60 dias de idade e sacrificados aos 83 dias de idade, com 10.000 e 100.000 tripo/animal...... 21 Tabela 4 - Número médio de ninhos de amastigotas íntegros no coração de ratos Wistar inoculados aos 15 ou 60 dias de idade, com 10.000 e 100.000 tripo/animal, de T. cruzi... 33 Tabela 5 - Número médio de processos inflamatórios focais (PIF) no coração de ratos Wistar inoculados aos 15 ou 60 dias de idade, com 10.000 ou 100.000 tripo/animal, de T.

cruzi. ................................................................................................................................... 33 Tabela 6 - Número médio de infiltrados perivasculares (IPV) no coração de ratos Wistar inoculados aos 15 ou 60 dias de idade, com 10.000 ou 100.000 tripo/animal, de T. cruzi.34 Tabela 7 - Valores individuais do peso em gramas de ratos controle e inoculados aos 15 dias com 10.000 ou 100.000 tripo/animal, de T. cruzi........................................................42 Tabela 8 - Valores individuais do peso em gramas de ratos controle e inoculados aos 60 dias com 10.000 ou 100.000 tripo/animal, de T. cruzi........................................................43 Tabela 9 - Parasitemia (valores individuais, média e desvio padrão) de ratos inoculados aos 15 dias de idade com 10.000 tripo/animal, de T. cruzi........................................................44 Tabela 10 - Parasitemia (valores individuais, média e desvio padrão) de ratos inoculados aos 15 dias de idade com 100.000 tripo/animal, de T. cruzi................................................45 Tabela 11 - Parasitemia (valores individuais, média e desvio padrão) de ratos inoculados aos 60 dias de idade com 10.000 tripo/animal, de T. cruzi..................................................46 Tabela 12 - Parasitemia (valores individuais, média e desvio padrão) de ratos inoculados aos 60 dias de idade com 100.000 tripo/animal, de T. cruzi................................................47 Tabela 13 – Demonstrativo (valores individuais, média e desvio padrão) do número de ninhos íntegros ratos inoculados com 10.000 ou 100.000 tripo/animal, aos 15 e 60 dias...48 Tabela 14 – Demonstrativo (valores individuais, média e desvio padrão) do número de infiltrados perivasculares em ratos inoculados com 10.000 ou 100.000 tripo/animal, aos 15 e 60 dias................................................................................................................................49 Tabela 15 – Demonstrativo (valores individuais, média e desvio padrão) do número de processos inflamatórios focais, em ratos inoculados com 10.000 ou 100.000 tripo/animal, aos 15 e 60 dias....................................................................................................................50

LISTA DE FIGURAS Fig. 1- Barbeiro – agente transmissor da Doença de Chagas........................................................... 01 Fig. 2 – Mapa das Américas Central e do Sul. Áreas endêmicas da doença de chagas................... 02 Fig. 3 – Ciclo de vida do Tripanosoma cruzi................................................................................... 04

Fig. 4 – Esquema de secções no encéfalo de rato............................................................................ 18 Fig. 5 – Fotomicrografia de parede ventricular do coração de rato (Wistar) do grupo controle, sendo A e B aos 38 dias de idade e C aos 83 dias. Observe miocárdio (seta maior), epicárdio (seta curta) e endocárdio (cabeça de seta) com aspecto normal. Note os núcleos das células (N), discos intercalares (D) e Estrias transversais (E) de acordo com os padrões normais. Hematoxilina/Eosina (HE), 400X....................................................................................................................................... 26 Fig. 6 – Fotomicrografia de coração de rato (Wistar) apresentando ninho integro (seta maior). A – Parede atrial apresentando ninho integro associado a diversas células inflamatórias (CI). Note o epicárdio (cabeça de seta) edemaciado e endocárdio (seta curta) com células inflamatórias infiltradas. Animal inoculado aos 15 dias com 100.000 tripo/animal. HE, 400X. B – Detalhe da fotomicrografia A, apresentando ninho integro (seta). HE, 1000X. C – Parede do ventrículo esquerdo apresentando ninho integro (seta) dentro de cardiomiócito sem processo inflamatório evidente. Rato inoculado aos 60 dias com 100.000 tripo/animal. HE, 1000X................................. 27

Fig. 7 – Fotomicrografia de coração de rato (Wistar) apresentando processo inflamatório focal (seta menor) caracterizado por células inflamatórias sem a presença de ninho visível. A – Processo inflamatório focal em ventrículo esquerdo de rato inoculado aos 15 dias com 100.000 tripo\animal. HE, 400X. B – Processo inflamatório focal em ventrículo direito de rato inoculado aos 60 dias com 100.000 tripo\animal. Note o afastamento (seta maior) dos cardiomiócitos indicando um edema. HE, 400X.......................................................................................................................................... 28

Fig. 8 – Fotomicrografia de coração de rato (Wistar), inoculado aos 15 dias com 100.000 tripo/animal, onde observa parede ventricular esquerda apresentando processo inflamatório focal. Identificamos diversos tipos de células inflamatórias como: linfócitos (L), macrófagos (M), fibroblasto (F), plasmócito (P) e polimorfonucleado (PM). Note o afastamento dos cardiomiócitos (cabeça de seta) indicando edema do tecido subjacente e a desorganização do endomísio (seta). HE, 1000X............................................................................................................................................... 29 Fig. 9- Fotomicrografia do coração de rato (Wistar) inoculado aos 15 dias com 10.000 tripo/animal, onde se observa um processo inflamatório focal (seta) sub-endocárdico, localizado junto a inserção da válvula átrio-ventricular esquerda (V). Observe o endocárdio (E) afastado evidenciando um edema. HE, 400X............................................................................................................................. 30 Fig. 10 - Fotomicrografia do ventrículo esquerdo de coração de rato (Wistar) inoculado aos 15 dias com 10.000 tripo/animal, apresentando infiltrado inflamatório sub endocárdico (A) e sub epicárdico (B). Note o afastamento do endocárdio (seta maior) e do epicárdio (seta menor). HE, 400X................................................................................................................................................. 31 Fig. 11 – Fotomicrografia do coração de rato (Wistar) apresentando infiltrado inflamatório perivascular (seta). HE, 400X. A e B – Infiltrados perivasculares encontrados em torno de vasos (♦) subendocárdicos no septo interventricular. Ratos inoculados aos 15 dias com 100.000 tripo/animal. C – Infiltrado perivascular ao redor de vaso secionado longitudinalmente. Rato inoculado aos 60 dias com 100.000 tripo/animal. D – Infiltrados perivasculares em vasos do ventrículo esquerdo de rato inoculado aos 60 dias com 10.000 tripo/animal. Note o afastamento (cabeça de seta) dos cardiomiócitos................................................................................................. 32

LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICO 1 – Curva de parasitemia (valores médios) em ratos Wistar infectados com T.

cruzi aos 15 dias de idade, usando-se o inóculo de 10.000 tripo/animal............................. 22 GRÁFICO 2 – Curva de parasitemia (valores médios) em ratos Wistar infectados com T.

cruzi aos 15 dias de idade, usando-se o inóculo de 100.000 tripo/animal........................... 23 GRÁFICO 3 – Curva de parasitemia (valores médios) em ratos Wistar infectados com T.

cruzi aos 60 dias de idade, usando-se o inóculo de 10.000 tripo/animal............................. 24 GRÁFICO 4 – Curva de parasitemia (valores médios) em ratos Wistar infectados com T.

cruzi aos 60 dias de idade, usando-se o inóculo de 100.000 tripo/animal........................... 25

RESUMO

O comportamento da infecção da doença de Chagas, descrita em 1909, depende em parte,

do isolado de Trypanosoma cruzi. Neste trabalho procurou-se avaliar a curva de

parasitemia e o comprometimento do coração, língua, esôfago, pulmão, estômago,

intestino delgado e grosso, rins e bexiga de ratos Wistar infectados com Trypanosoma

cruzi isolado de um paciente portador da forma cardíaca e digestiva da doença. Utilizou-se

50 ratos (dez grupos contendo cinco cada um). Dois grupos inoculados aos 15 dias e dois

inoculados aos 60 com 10.000 ou 100.000 tripomastigotas/animal, foram submetidos à

avaliação da parasitemia em dias alternados a partir do 3º dia após a inoculação. Os órgãos

citados foram processados pela técnica histológica de rotina, secionados e as lâminas

foram coradas com hematoxilina e eosina. Os animais de 60 dias, apresentaram picos de

parasitemia de 24.710 formas/ml de sangue em inócuos de 10.000 formas/animal e de

28.240 formas/ml em 100.000 formas/animal. Os animais inoculados aos 15 dias com

10.000 formas, apresentaram pico de 116.490 formas/ml, e ratos inoculados aos

15/100.000 de 229.450. O pico de parasitemia ocorreu entre 21º e o 23º dia após a

inoculação nos quatro grupos avaliados, sendo que os animais inoculados aos 15 dias de

idade apresentaram para ambos os inóculos valores parasitêmicos maiores estatisticamente

que animais inoculados aos 60 dias de idade. A análise histológica demonstrou tropismo

para o coração, com alterações teciduais tais como: processo inflamatório focal e difuso,

infiltrado perivascular e ninhos do parasito íntegros e rompidos. Tais processos

apresentaram macrófagos, linfócitos, polimorfonucleados, plasmócitos e fibroblastos. Os

demais órgãos avaliados apresentaram-se com aspectos histológicos similares aos animais

controle. Houve maior comprometimento do tecido cardíaco dos animais mais jovens (15

dias) submetidos ao maior inóculo. O isolado apresentou perfil que sugere caracteriza-lo

como cepa tipo III.

ABSTRACT

The behavior of the infection of Chagas disease, descript in 1909, depends in part, on

isolation of Trypanosoma cruzi. In this work it was looked to evaluate the curve of

parasitemy and the alterations in the tissues of the heart, thong, esophagus, lung, stomach,

thin and thick intestine, encephalon, kidneys and bladder of Wistar rats infected with

isolated Trypanosoma cruzi of a carrying patient of the cardiac and digestive form of the

disease. It was used ten groups of five rats, two groups inoculated at the 15 days of born,

and two inoculated at the 60, with 10.000 or 100.000 trypomastigote/animal, had been

submitted to the evaluation of the parasitemy in days alternated from 3º day after the

inoculation. The cited tissues had been processed by the routine histological technique,

confectioned blades and stained with hematoxylin and eosin. The group inoculated at 60

days, present peaks of the parasitemy of 24,710 forms/ml of blood in inoculums of 10.000

forms/animal, and 28,240 forms/ml in 100.000 forms/animal. The animals inoculated at 15

days/10.000 forms, had presented peak of 116,490 trypomastigotes/ml, and animals

inoculated at the 15/100,000 of 229.450. The parasitemy peak occurred between 21º and

23º days after the inoculation among all evaluated groups. The animals inoculated at the

15 days of age, had presented for both inoculums, bigger parasitemic values statistically

than inoculated at the 60 days of age. The histological analysis demonstrated tropism for

the cardiac tissues, with histological alterations such as: focal and diffuse inflammatory

process, infiltrated around the vase and complete or breached nests of the parasite. Such

processes presented macrophages, lymphocyte, polymorph nuclear cells, plasmocyte and

fibroblasts. The other tissues had presented themselves with similar histology’s aspects like

the groups of animals controlled. It had greater alterations of the cardiac tissues of the

animals youngest (15 days) submitted to the greater inoculate. The isolation comportment

suggest characterizes it as strains type III.

1

1 – INTRODUÇÃO

No inicio do século XX intensificam-se as epidemias e endemias nos sertões

brasileiros. Na tentativa de se desbravar o interior do Brasil, várias expedições foram

organizadas e estradas de ferro construídas como alternativas para levar o progresso e o

socorro médico às populações isoladas. Muitos trabalhadores destas obras foram

acometidos pela malária entre outros males. Com o intuito de amenizar este problema

chega a Minas Gerais o médico recém formado Carlos Chagas, enviado por Oswaldo Cruz

(COURA, 2003) que à época era o responsável pela aplicação dos princípios de controle

epidemiológico da então capital do Brasil, Rio de Janeiro.

O médico e pesquisador CHAGAS (1909) identificou um protozoário flagelado a

partir de exames em uma paciente que apresentava anemia, trombose intracardíaca e febre.

Ao examinar o conteúdo intestinal de grandes insetos conhecidos por barbeiro (fig. 1),

comuns sugadores de sangue humano, os quais coabitavam com os trabalhadores em seus

rústicos casebres de pau-a-pique, observou a presença do protozoário flagelado muito ativo

identificando-o como pertencente á família dos tripanosomas, graças à experiência de

Carlos Chagas no estudo do Trypanosoma cruzi (T. cruzi) em macacos silvestres (DIAS,

1944). O protozoário foi identificado como uma nova espécie e denominado de T. cruzi em

homenagem a Oswaldo Cruz, mestre de Chagas (BRENER, 1989).

Fonte: www.alertamedico.med.br. Fig. 1 – Barbeiro – agente transmissor da Doença de Chagas. Contando apenas com os recursos da época, CHAGAS (1909, 1910 e 1911)

realizou a descrição do curso da doença, seu impacto no coração e aparelho digestório,

além de descrever o ciclo do parasito.

2

Um século mais tarde, a hoje denominada doença de Chagas acomete pessoas desde

o sul dos Estados Unidos até o sul da Argentina (fig. 2). BRENER (1962) e mais

recentemente COURA (2003), destacaram a relação da doença com o desmatamento e a

pobreza, o primeiro por retirar o inseto de seu habitat natural e eliminar seus hospedeiros

silvestres como tatus e gambás, a segunda por oportunizar aos insetos, condições propícias

como habitações inadequadas e farta alimentação, concentrada em um só ambiente: o

doméstico.

Fig. 2 - Mapa das Américas Central e do Sul mostrando as áreas endêmicas da doença de chagas.

Segundo a FUNASA (2002), cerca de 7% da população latino-americana é

portadora da doença, e cerca de 90 milhões de pessoas estão expostas à contaminação.

CAROD-ARTAL (2003) afirma que 16 milhões de pessoas apresentam a infestação e que

25% da população da América Latina corre o risco de contraí-la. COURA (2003) assevera

que quase metade do território brasileiro (44%) é considerada área endêmica e, além disso,

existem casos isolados de infestações familiares no norte e no sul do Brasil. A mídia

noticiou em 2005 (Anexo) a infecção de dezenas de pessoas em Santa Catarina e Amapá,

que teriam se contagiado por via oral através de alimentos contaminados.

Fonte : http://www.paho.org/english/hcp/hct/dch/chagas.htm

Área infestada

Área onde comprovadamente houve interrupção de transmissão vetorial.

Distribuição Geográfica de Triatomineos. (América Latina e Caribe, 2004)

3

Ao se alocarem nas células dos tecidos de órgãos como coração, encéfalo,

glândulas, rins e músculos esquelético e liso, os protozoários perdem o flagelo assumindo a

forma de amastigotas, forma esférica e aflagelada. Estes, por sua vez, utilizando os

nutrientes presentes no citoplasma celular, efetuam sua multiplicação por fissão binária. O

ninho toma toda a célula e acaba por destruí-la. Antes do rompimento da membrana as

amastigotas voltam a desenvolver o flagelo, retornando à forma tripomastigota, forma

flagelada e extremamente ativa. A partir desse momento pode ocorrer novamente outro ciclo

ou então o parasito pode ser sugado por um triatomídeo (barbeiro), que ingerindo a forma

tripomastigota, permite a transformação do mesmo em epimastigota, o qual no intestino do

hospedeiro invertebrado também se multiplica por divisão binária. Após multiplicação voltam

a forma tripomastigota e permanecem nas fezes do vetor invertebrado até o momento de

penetrar em células de um hospedeiro vertebrado em busca de células para uma segunda

invasão (ANDRADE & ANDRADE 1979, GARCIA & AZAMBUJA 1991, TANOWITZ et

al. 1992, BRENER et al. 2000, UMEKITA & MOTA 2000, FUNASA 2002 e BUSCAGLIA

& NOIA 2003).

DIAS (1944) e COURA (2003) reconhecem a ocorrência de três tipos de barbeiro:

silvestres, peridomiciliares e domésticos. Esta variedade se deve a intensa adaptação que o

triatomideo demonstrou ao longo de sua jornada da mata para a casa (DIAS, idem). A

tromba do barbeiro possui substancias anestésicas e o ataque não é percebido pelo

hospedeiro. O inseto defeca após a picada, colocando o parasita em contato com a pele da

vítima possibilitando a infestação.

O curso da infecção varia em função do tipo de cepa e do hospedeiro. A 1ª fase da

infecção é denominada de aguda. É caracterizada pela proliferação crescente dos parasitos

nos tecidos corporais causando lesões em órgãos específicos de acordo com o tropismo da

cepa. É notório desde Chagas que a ação dos protozoários se procede elegendo um ou mais

órgãos preferenciais, o que constitui o tropismo. A evolução da infecção pode ser

acompanhada pela curva parasitêmica descrita por BRENER (1962) que possui um início,

um pico (máximo número de formas) e um término, onde não se localiza mais formas

tripomastigota no sangue examinado. A fase aguda geralmente dura, em humanos, de 2 a 3

meses ou mais. No início desta fase ocorre linfocitopenia que parece estar relacionada com o

estado de imunossupressão característico da doença de Chagas humana e experimental

(revisões em TEIXEIRA, 1987; KIERSZENBAUM & SZTEIN, 1990; MINOPRIO, 1991;

TALERTON, 1991).

4

Fonte: therion.dna.uba.ar/ labchagas/investiga.htm

Fig. 3 – Ciclo de vida do Tripanosoma cruzi.

Na fase aguda da doença de Chagas humana, dentre outros sinais, ocorre

irritabilidade, transpiração abundante, anorexia, e às vezes vômito (LARANJA, 1956). Nessa

fase, os achados clínicos incluem dores musculares, febre contínua ou intermitente, com

exacerbação vespertina que vão declinando à medida que as defesas do hospedeiro vão

sobrepujando o parasita. Os pacientes podem apresentar taquicardia, linfadenopatia,

esplenomegalia, e edema, sendo a miocardite a principal manifestação clínica (ANDRADE &

ANDRADE 1979, CANÇADO 1980, TEIXEIRA, 1987, revisto por PRATA, 1994). Ao

microscópio eletrônico, no miocárdio de camundongo em fase aguda da infecção, descrevem-

se lesões relacionadas com os parasitas contidos no interior dos cardiomiócitos e lesões mais

graves relacionadas com o processo inflamatório. (TAFURI, 1969). SOARES & SANTOS

(1999) relatam que as lesões das células cardíacas e fibras de condução no coração, na fase

aguda, ocorrem ao romperem-se os ninhos de amastigotas seguida de secreção de fatores

auto-imunes.

Segue-se a forma latente ou indeterminada, na qual os sinais clínicos estão ausentes,

sendo a parasitemia e as alterações histopatológicas normalmente discretas ou ausentes,

porém com sorologia positiva. Sua duração é medida em décadas, não havendo cura

espontânea (revisto por ANDRADE, 1991). Em torno de 24% dos pacientes nesta forma

desenvolvem as formas crônica, cardíaca (forma cardíaca), digestiva com megaesôfago ou

megacolo (forma digestiva) ou ambas (revisto por PRATA, 1994). Na fase crônica há um

5

comprometimento de órgãos acometidos paulatinamente, sem detecção de parasitos no

sangue, contudo com positivação sorológica. Devido a grande área geográfica onde o

barbeiro é encontrado, a variabilidade de cepas é bem compreensível. Do mesmo modo, o

tropismo varia suscitando parasitismos preferenciais no tecido cardíaco, encéfalo, vísceras

e músculo esquelético (TEIXEIRA, 1984).

HERRERA & URDANETA-MORALES (2001) inocularam ratos através da injeção

intra-escrotal com a cepa CO57 e observaram alterações teciduais no fígado, baço, pulmão,

órgãos urogenitais e nódulos linfáticos. ALVES et al. (1994) observou hipertrofia das

glândulas salivares em ratos albinos Wistar infectado com a cepa Y. HIGUCHI (1999)

estudando pacientes chagásicos observou miocardite, com a presença de fibrose e dilatação

dos micro-vasos cardíacos. MELO & MACHADO (2001) observaram a participação de

linfócitos e macrófagos no processo inflamatório em corações de ratos. LANE et al (2003)

localizou através da hibridização in situ no tecido cardíaco DNA do T. cruzi em ratos

inoculados com a cepa Y.

ARAÚJO-JORGE (1999) em estudo de revisão sobre o mecanismo de entrada do T.

cruzi na célula do hospedeiro relata que após a célula ter sido penetrada uma vez, há

facilitação para uma segunda entrada nas 24 horas seguintes. Este aumento da permeabilidade

parece ocorrer devido à alterações na membrana plasmática. A interação do T. cruzi com

receptores de membrana induz a fagocitose em 70% dos casos além de alterar a conformação

das junções tipo gap, do citoesqueleto, dos receptores tipo lectina e da matriz extracelular.

Tais alterações poderiam representar alterações no DNA do hospedeiro e na reorganização

das organelas.

Uma cepa de T. cruzi é uma população isolada de espécie infectado, mantida por

passagens seriadas em animais de laboratório (camundongos), a fim de tê-la disponível

para inoculações e estudos diversos (LUMSDEN, 1970; ANDRADE, 1974).

MOMEN (1999) analisando os critérios para uma taxionomia adequada das cepas,

observa que READY & MILES (1980) propõem a classificação através das isoenzimas e

morfologia externa. BRENER (1977) sugere dois tipos polares de cepas: Y e CL.

ANDRADE & ANDRADE (1979), revisto por COURA (2003), utilizando-se de critérios

mistos como: morfologia externa, virulência (capacidade de proliferação), pico de

parasitemia, amplitude da curva parasitêmica, patogenicidade (capacidade de causar lesão)

e curso da infecção propõe classificação nos três tipos seguintes:

TIPO I – cepas com alta parasitemia e pico parasitêmico precoce, em torno de 10

dias. Ocorre mortalidade elevada devido à alta virulência, tropismo pelo tecido intersticial

com formas delgadas na fase aguda e tecido muscular com formas largas na fase crônica.

6

São exemplos as cepas Y, Tulauhen e Peruana (PIZZI & PRAGER, 1952). A alta

virulência e patogenicidade leva a morte dos animais ainda na fase aguda.

TIPO II – predominância de formas largas e lesões miocárdicas em todo curso da

infecção. Virulência relativamente lenta com picos irregulares entre 12 e 20 dias e

patogenicidade variável. Ocorrem infiltrados focais nos plexos mioentéricos de modo

irregular com a presença de parasitos. São exemplos as cepas encontradas na área

endêmica do recôncavo baiano como Berenice e outros (LANA, 1986).

TIPO III – Virulência baixa com pico entre 20 e 30 dias, baixa patogenicidade com

mortalidade nula até os 50 dias. Miotropismo predominante em quase todo o curso da

infecção. Como exemplo, a cepa colombiana. Os plexos nervosos bem como a musculatura

lisa raramente apresentam lesões.

Sejam quais forem os sinais da infecção, o diagnóstico preciso deve ser feito para

que haja exatidão no tratamento, pois pacientes já vieram a óbito devido a diagnóstico

equivocado (PRATA, 1975; BRENNER & ANDRADE, 1979). ALQUÉZAR (1995) e

COURAS (2003) relatam que o primeiro método de diagnostico da tripanosomíase

brasileira foi o xenodiagnóstico. Consistia em picar um hospedeiro suspeito com barbeiros

não contaminados e verificar se havia o desenvolvimento de formas do T. cruzi em cobaias

picadas pelos mesmos. Este método foi abandonado por exigir um longo tempo até o

resultado.

Se o paciente estiver na fase aguda, o método de exame do sangue em microscópio

de luz pode ser eficiente (BRENER, 1962). Com o fim da fase aguda, as formas

desaparecem do sangue impossibilitando sua localização, contudo os anticorpos

permanecem graças ao processo inflamatório indutor de sua formação. A reação de

hemaglutinação (HA), imunofluorescência indireta (IFI) e ELISA (revisto por PORTELA

& SHIKANAI, 2003), constituem as mais usadas em ordem crescente de sensibilidade. A

reação em cadeia de polimerase (PCR) tem sido usada para elucidação de casos que

necessitam maior sensibilidade.

A fase crônica não exibe cura espontânea, podendo evoluir para uma nova

agudização , causando lesões progressivas e cumulativas que levam a falência de órgãos

vitais como o coração ou vísceras onde predominam músculos lisos, como os intestinos e

esôfago, induzindo a formação de megacolo ou megaesôfago chagásico (DIAS, 1944;

TEIXEIRA, 1980; PRATA, 1994).

O comprometimento do SNC pelo T. cruzi foi verificado logo após os primeiros

relatos de CHAGAS (1909, 1911) e constitui importante fator de caracterização do tipo de

cepa. Analisaremos o curso da infecção do sistema nervoso de acordo com o modelo

7

biológico usado, na seguinte ordem: gatos, cães, camundongos, ratos e por fim as infecções

chagásicas humanas.

1 - Gatos

VIANNA (1911) relatou a presença de focos múltiplos disseminados no córtex,

núcleos centrais, ponte e bulbo, na infecção aguda em gatos.

2 - Cães

TORRES & VILLAÇA (1919) induziram a primeira infecção experimental em cães

sem informar a cepa ou inóculo, demonstrando um quadro de “encefalomielite benigna com

hipertrofia glial e amastigotas dentro e fora das células nos focos inflamatórios ou distantes

destes, com maior freqüência na substância branca”. Cães inoculados com T. cruzi

desenvolveram um quadro de encefalomielite com a presença de parasitas no sistema nervoso

central, lesões degenerativas com reação glial e alterações vasculares (VILLELA e TORRES,

1926; CAMPOS, 1927; KRAMER, 1972). GOBLE (1950) na infecção canina experimental

com as cepas A, B (100.000 tripomastigotas) e W (500.000 tripomastigotas), relatou que os

animais que apresentaram sinais clínicos de comprometimento do SNC desenvolveram

encefalite multifocal com parasitismo. Nos animais sem manifestações neurológicas

observaram amastigotas no cérebro sem reação glial. ALENCAR & ELEJALDE (1959),

também em infecção canina sem citar a cepa e inoculo, observaram no SNC focos de

leptomeningite, infiltrados perivasculares, e acúmulos de células com características

“granulomatosas”.

QUEIROZ (1975) em estudo histopatológico dos encéfalos e medulas espinhais de

cães na fase aguda da infecção experimental pela cepa 12SF (cepa São Felipe) sem informar o

inoculo, encontrou nódulos gliais, parasitismo discreto e difuso com nítida predileção para a

substância branca tanto no encéfalo quanto na medula espinhal. O autor não encontrou lesões

neuronais que justificassem a paralisia progressiva dos membros posteriores que ocorre na

segunda semana após a inoculação. PITTELLA et al. (1990) estudaram oito cães infectados

com 1.000 tripomastigotas por grama de peso corporal da cepa colombiana. Relataram a

morte de três animais na fase aguda os quais apresentaram encefalite multifocal. Um destes

animais apresentou lesões recentes com parasitas, e os outros dois, lesões esparsas sem

parasita, sugestivo de um processo em resolução. Os outros cinco cães foram sacrificados na

fase crônica e não apresentaram alterações encefálicas. PITTELLA et al. (1995) compararam

o encéfalo de cães inoculados com 2.000 tripomastigotas/kg das cepas Berenice (Be-62 e Be-

8

78) do T. cruzi e sacrificados na fase aguda verificando maior parasitismo e processo

inflamatório mais intenso nos animais inoculados com a cepa Be-78. MACHADO et al

(2001) em cães inoculados com as cepas 147 e SC-1 não observaram alterações nos plexos

submucoso e mioentérico do esôfago durante a fase crônica.

3 - Camundongos

ALENCAR & ELEJALDE (1960) estudaram o comprometimento do SNC de

camundongo albino, infectado com a cepa Y sem citar o inóculo, durante a fase aguda da

infecção experimental pelo T. cruzi, demonstrando a presença de granulomas pequenos

situados principalmente nas proximidades dos vasos sangüíneos. JARDIM (1967) citou a

diminuição acentuada das células de Purkinje na fase aguda da doença de Chagas em

camundongos infectados com a cepa Y, sem contudo informar o inóculo.

SANÁBRIA (1968 e 1969) estudou o cérebro de camundongos, sob inóculo

intracerebral, através de microscopia eletrônica de transmissão, sem informar a idade dos

animais, a cepa e precisamente o inóculo. Este autor observou 100% de infecção nos animais

inoculados com parasitismo em macrófagos, astrócitos e algumas vezes em axônios.

AMARAL et al. (1975) estudaram o encéfalo de camundongos inoculados com 1.000.000 a

1.500.000 tripomastigotas das cepas, Y, MR, FL, Berenice e PNM, em cortes semi-seriados

na fase aguda da infecção. Os animais infectados com as cepas FL, MR, Berenice e Y

mostraram parasitismo encefálico baixo e parasitismo geral elevado e aqueles infectados com

a cepa PNM apresentaram intenso parasitismo encefálico e parasitismo de outros órgão

menos freqüentes. Com estes resultados os autores aventaram a hipótese de um possível

tropismo da cepa PNM para o SNC. Recentemente, SILVA (1996) em estudo de

caracterização fenotípica das células presentes no infiltrado inflamatório no parênquima do

SNC de camundongo C3H/He infectado com 100 tripomastigotas da cepa Colombiana,

durante a fase aguda, demonstrou a presença de células CD4+, Mac-1+ e CD8+, com

predomínio das últimas.

4 - Ratos

O envolvimento da medula espinhal com destruição neuronal foi observado em ratos

chagásicos na fase crônica (SCHWARTZBURD & KOBERLE, 1959) e na fase aguda

(VICHI,1964). VICHI (1961) estudando a medula espinhal de rato Wistar, sem informar a

cepa e precisamente o inóculo ou a idade dos animais, verificou que o parasitismo do T. cruzi

é maior no nível lombar do que nos níveis torácico e cervical e também maior na substância

cinzenta do que na substância branca.

9

MENEZES (1964), estudando a fase aguda da infecção chagásica experimental em

ratos infectados aos 21 dias de idade com 200.000 tripomastigotas sem definir a cepa,

observou em alguns animais paralisia nos membros posteriores que progredia para os

anteriores e histologicamente lesões granulomatosas justavasculares, “pseudocistos” íntegros

e rotos no encéfalo e medula espinhal.

MENEZES e ALCÂNTARA (1959) avaliaram o parasitismo do SNC na fase aguda

da infecção experimental em ratos inoculados aos dois dias com 300.000 tripomastigotas da

cepa Y, relatando maior parasitismo da porção média do encéfalo, provavelmente devido a

sua maior vascularização, e na medula espinhal cervical a qual foi mais parasitada que a

torácica e a lombar.

MOSQUERA e HERRERA (1965) em infecção experimental em ratos sem

informar a idade dos animais, a cepa ou o inóculo, observaram no cérebro alterações

neuronais como “cariólise, basofilia do citoplasma e perda da substância cromidial”;

encefalite focal na substância branca sem parasitas e por vezes formações granulomatosas na

substância cinzenta.

ALCÂNTARA (1959) avaliou quantitativamente o parasitismo no sistema nervoso

central de ratos albinos Wistar com dois dias de idade inoculados com a cepa Y sem informar

o inóculo, encontrando intenso parasitismo ao nível do cérebro, cerebelo e bulbo. A síntese

protéica das células de Purkinje do cerebelo foi estudada por CAMPOS (1969), durante a fase

aguda da infecção, em ratos inoculados ao nascimento ou entre 18 e 21 dias de idade com a

cepa Y, porém sem informar o inóculo. O autor observou diminuição na síntese protéica

diretamente proporcional ao parasitismo tecidual glial e sugeriu que as lesões das células

gliais parasitadas repercutiriam no metabolismo dos neurônios dependentes da glia.

Estudando o núcleo do terceiro par craniano (oculomotor) durante a fase aguda da

infecção chagásica em ratos, sem definir a idade dos animais, inoculados com a cepa Y, e sem

informar o tamanho do inóculo, JARDIM (1971a) encontrou como sintomatologia clínica

ptose palpebral, demonstrando parasitismo em 70% dos casos e redução do número de

neurônios ao nível daquele núcleo. EDGCOMB (1973) estudando ratos silvestres (Rattus

rattus) naturalmente infectados encontrou o quadro de meningoencefalite e demonstrou

granulomas cuja composição celular foi definida como astrócitos, linfócitos e micróglia.

Lesões de terminações nervosas simpáticas e parassimpáticas induzidas por T. cruzi

em ratos têm sido relatadas (MACHADO et al,1975; 1978; 1979; 1987; 1989), porém não

observadas por RIBEIRO et al (2002).

COSENZA et al. (1984) observaram, em ratos inoculados com a cepa Y do T. cruzi

(300.000 tripomastigotas inoculados aos 27 - 29 dias de idade), que o conteúdo de

10

noradrenalina do tronco encefálico e do hipotálamo não diferem significativamente daqueles

encontrados em ratos controle apesar da intensa desenervação noradrenérgica ao nível do átrio

cardíaco. Os achados indicam que as lesões neuronais na doença a de Chagas são

discriminativas com relação aos neurônios noradrenérgicos periféricos e centrais.

5 – Humanos

DeCOURSEY (1935) relatou elevado número de células inflamatórias e parasitas no

miocárdio de uma criança, porém no encéfalo, as lesões foram focais, discretas e sem

parasitas. VILLELA & VILLELA (1932) relataram a presença de parasitas na infecção do

SNC em macrófagos do revestimento meníngeo, células da glia e excepcionalmente

neurônios. Pequenos nódulos de proliferação glial, com ou sem parasitas podem ser

encontrados de modo esparso no sistema nervoso central de indivíduos na fase aguda com ou

sem manifestações neurológicas evidentes. Estes nódulos foram caracterizados por técnicas

de impregnação argêntea como constituídos por elementos da micróglia (VILLELA &

VILLELA, 1932; CARDOSO, 1960). ELEJALDE (1958), estudando as lesões cerebrais ao

nível da microscopia de luz em uma criança aos 11 meses de idade que faleceu na fase aguda

da doença de Chagas, encontrou células gliais parasitadas sem reação inflamatória e

formações granulomatosas constituídas por micróglia, tanto na substância branca quanto na

substância cinzenta, mais freqüentes nas proximidades dos vasos.

Examinando o encéfalo e a medula espinhal de 4 crianças com óbitos durante a fase

aguda da doença de Chagas, CARDOSO (1960) apontou o tronco encefálico como local de

lesões parasitárias freqüentes e as diagnosticou como encefalite aguda granulomatosa com

nódulos inflamatórios de natureza microglial. A natureza microglial foi definida através das

técnicas argênteas de Hortega. Ainda neste trabalho observou-se a presença do parasita tanto

na substância branca quanto na cinzenta, porém com nítida preferência pela última.

Estudando as células de Purkinje cerebelares em pacientes chagásicos adultos, a

maioria na fase crônica da doença, BRANDÃO & ZULIAN (1966) encontraram diminuição

na população neuronal em 52% dos casos analisados e constataram destruição celular

variando desde casos mais leves até severos.

ALENCAR (1967) verificou redução no número de células de Purkinje em pacientes

chagásicos crônicos portadores de insuficiência cardíaca congestiva falecidos com idades em

torno de 30 anos. Do ponto de vista da semiologia neurológica clínica, poucas vezes são

encontrados elementos suficientes para caracterizar síndromes neurológicas, pois a maioria

dos chagásicos crônicos apresenta exames neurológicos normais ou com leves alterações

(JARDIM, 1971b, 1977).

11

Em estudos histopatológico do hipotálamo anterior de indivíduos chagásicos

crônicos, através da hematoxilina crômica de Gomori, constatou-se desenervação, aumento da

substância Gomori-positiva e presença de corpos de Herring exuberantes e anormais em 35%

dos casos (COSTA & GALLINA, 1971).

QUEIROZ (1973) relatou o caso de um paciente de 62 anos de idade que após

apresentar sintomas neurológicos por duas semanas veio a óbito, a autópsia revelou lesão

semelhante a tumor no cérebro onde se encontrou o T. cruzi, a mesma não foi encontrada em

outros órgãos. HOFF et al. (1978) verificaram que o parasitismo do sistema nervoso central,

na fase aguda da doença de Chagas, parece ser mais freqüente do que se pensava. Assim de

11 pacientes com idades até 15 anos, foi possível isolar o T. cruzi em 8, sendo que apenas 4

apresentaram alterações liquóricas e nenhum demonstrou comprometimento neurológico

evidente. Já GUTIÉRREZ et al. (1977) estudando o líquor cefalorraquidiano de pacientes

portadores da doença de Chagas, sem informar a idade dos pacientes, não observou

características exudativas ou alterações nas proteínas liquóricas, porém 8 entre 14 pacientes

apresentaram líquor com perfil gamaglobulínico.

QUEIROZ (1978) estudou os encéfalos de cinco casos humanos, com idades entre

quatro meses e 17 anos, na fase aguda da doença de Chagas e encontrou macroscopicamente

edema e congestão encefálica. Um paciente apresentou encefalite multifocal glial com

predileção para a substância branca. Foi observado parasitismo moderado com amastigotas

isoladas ou no interior de células gliais no córtex. Dois pacientes apresentaram lesão neuronal

focal no córtex cerebral.

LIBONATTI et al. (1977) observaram em estudo de 221 pacientes chagásicos

(16,8% na fase aguda e 83,2% na fase crônica) que o quadro completo de meningoencefalite

ocorreu entre crianças de 2 a 4 anos, sendo porém de pouca freqüência. As formas

convulsivantes são mais numerosas antes dos dois anos de idade. A forma nervosa mais

amena caracteriza-se por cefaléia, astenia e sonolência. JORG et al. (1980), em três casos de

crianças na fase aguda da infecção chagásica observaram distúrbios psicomotores, ataxia,

afasia, alternância entre letargia e agitação, sintomas de cerebelite em um paciente e

transtornos de conduta nos outros dois.

SPINA-FRANÇA et al. (1988) encontraram anticorpo anti-T. cruzi no líquor de um

paciente aidético com reagudização da doença de Chagas e em outros dois pacientes

chagásicos não soro positivos, sendo um portador de epilepsia e o outro de acidente vascular

cerebral. O autor não informa a idade dos pacientes. QUEIROZ (1976), estudando 120

pacientes chagásicos crônicos, encontrou infartos cerebrais e cerebelares em 23,3% dos casos;

atrofia cerebral em 10,7% e encefalite focal, representada por acúmulos focais de células

12

gliais em 2,5% dos casos. Em pacientes humanos na fase aguda com manifestações

neurológicas graves observaram-se edema e congestão cerebral intensos, às vezes com

pontilhados hemorrágicos nas meninges e tecido nervoso. Os achados histológicos

evidenciaram meningoencefalite intensa caracterizada por focos inflamatórios meníngeos e

encefálicos sendo estes representados por nódulos gliais com a presença do parasita

(QUEIROZ, 1976). MEDRADO-FARIA et al. (1976) realizaram investigação

epidemiológica visando demonstrar associação causal entre infecção chagásica e síndrome

epiléptica, encontrando pequena prevalência da doença de Chagas no grupo epiléptico,

quando comparado ao grupo controle não epiléptico. Enfatizaram a necessidade de novos

estudos para esclarecer melhor a possível correlação. Estudando o cérebro de 31 casos de

humanos chagásicos na fase crônica com a forma cardíaca, PITTELLA (1985) encontrou em

10% dos pacientes, encefalite granulomatosa múltipla sendo que muitos granulomas estavam

na proximidade de pequenos vasos do tecido nervoso e ausência de parasitismo de neurônios.

Estudo histoquantitativo das células neuronais do núcleo dorsal do vago e do

hipoglosso em chagásicos crônicos com e sem megaesôfago demonstrou redução do número

de neurônios nos portadores de megaesôfago. Isto sugere que não se pode excluir a

participação da lesão do núcleo dorsal do vago na fisiopatologia do megaesôfago (LOPES et

al. 1969; revisto por Rey, 1991).

Na fase crônica da doença de Chagas, pouco se conhece sobre alterações no SNC,

fato que decorre provavelmente da realização de análises pontuais nesta fase da doença

(revisto por PITTELLA, 1991). Na fase aguda descrevem-se infiltração leucocitária

mononuclear das leptomeninges, congestão, hemorragia perivascular, infiltração linfocitária

perivascular, e proliferação glial.

PITTELLA et al. (1993), em estudo histopatológico e imunohistoquímico do cérebro

e coração de 50 pacientes portadores da forma cardíaca da fase crônica da doença de Chagas,

não observaram parasitas ou alterações inflamatórias no cérebro da maioria dos casos

analisados, sendo constantes as alterações inflamatórias cardíacas. Assim afirmaram que não

há bases histopatológicas que suportem a existência da forma nervosa crônica da doença de

Chagas.

PITTELLA (1993) fez excelente revisão sobre a infecção humana pelo T. cruzi

destacando que: 1) a fase inicial aguda da infecção pelo T. cruzi é normalmente assintomática

e sub-clínica; 2) somente pequena porcentagem de casos desenvolve encefalite na fase aguda

da doença de Chagas principalmente crianças; 3) as formas agudas sintomáticas

acompanhadas de encefalite chagásica são graves, com morte usualmente em todos os casos;

4) os portadores da forma aguda assintomática e da forma aguda sintomática leve não

13

apresentam infecção no sistema nervoso central ou em alguns casos encefalite discreta, com

focos esparsos e involução total das lesões; 5) a reativação da infecção no sistema nervoso

central da forma crônica da doença de Chagas é incomum e ocorre somente em pacientes

imunossuprimidos.

O estado de imunossupressão apresentado por pacientes portadores da síndrome da

imunodeficiência adquirida (AIDS) induz intensificação do processo infeccioso

freqüentemente com comprometimento agudo do SNC (CASTILLO et al., 1990; GALLO et

al., 1992; ODDO et al., 1992; PEREZ et al., 1992; LABARCA et al., 1992; SOLARI et al.,

1993; PIMENTEL et al., 1996). KOLODNY (1939) observou que animais de até 20 dias

de idade, portanto com sistema imunológico imaturo, são mais suscetíveis à infecção

chagásica ocorrendo mortes em quase 100 % dos ratos inoculados. Este fato também foi

verificado por REVELLI et al (1987) e DA MATA (2000).

Como constatamos pela análise da literatura, a tripanosomíase americana varia o curso

de sua infecção em função das características próprias de cada isolado do T. cruzi, da idade

dos animais ou humanos infectados e ainda se caracteriza pelo parasitismo preferencial por

determinados órgãos.

Usamos neste trabalho um isolado de T. cruzi obtido de um paciente portador da

forma cardíaca e digestiva da doença de Chagas, isolado no Hospital das Clínicas da

Universidade Federal de Goiás (UFG), com o objetivo de:

� Avaliar as alterações teciduais no encéfalo, coração, pulmão, língua, esôfago,

estomago, intestino delgado e grosso, rim e bexiga durante a fase aguda da

infecção experimental em ratos Wistar, induzida pelo isolado de T. cruzi

mencionado.

� Avaliar a possível ocorrência de parasitismo preferencial (tropismo) dentre os

órgãos analisados.

� Contribuir para a caracterização deste isolado de T.cruzi frente à infecção

experimental em ratos Wistar.

14

2 - MATERIAL E MÉTODO

Esta pesquisa constitui-se como trabalho experimental, quantitativo, no qual

induzimos infecção experimental em ratos Wistar por meio de um isolado de T. cruzi já

mencionado. Os materiais utilizados na pesquisa e as fases metodológicas do experimento

estão descritos a seguir.

2.1 - Os animais

Foram usados 50 ratos Wistar de ambos os sexos com 15 e 60 dias de idade,

fornecidos pelo Biotério do Instituto de Ciências Biológicas (ICB) da UFG. Os animais foram

separados em 8 grupos experimentais e dois grupos controle, submetidos aos tratamentos

conforme descritos no item 2.3 e mantidos no Laboratório de Neurobiologia do Departamento

de Morfologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFG, recebendo ração comercial

Labina/Purina e água à vontade até o momento de serem eutanasiados.

2.2 - O isolado, parasita e inoculação

Para induzir a infecção experimental dos animais inoculou-se uma população de T.

cruzi, isolada de um paciente do Hospital das Clinicas da UFG, portador da forma cardíaca e

digestiva da doença de Chagas. Os tamanhos dos inóculos utilizados foram de 10.000 e de

100.000 tripomastigotas do T. cruzi por animal (tripo/animal). A inoculação intraperitoneal

(10 µl de sangue) foi realizada após a pesagem dos animais em balança (PRECISION) com

precisão de uma (1) grama. Os animais do grupo controle receberam 10 µl de solução

fisiológica pela mesma via intraperitoneal.

15

2.3 - Os grupos experimentais e controle foram assim distribuídos:

Grupo Finalidade Idade dos

animais

Inoculado

10.000

tripo/animal

Inoculado

100.000

tripo/animal

Inoculado

soro fisiológico

1 Parasitemia 15 dias X

2 Analise

histológica

15 dias X


4 Analise

histológica

15 dias X

5 Controle 15 dias X


7 Analise

histológica

60 dias X


9 Analise

histológica

60 dias X

10 Controle 60 dias X

Tabela 1 – Distribuição dos animais usados no experimento, com suas respectivas idade e tratamentos utilizados nos 8 grupos contaminados e 2 controle.

2.4 - Parasitemia

A contagem de parasitas no sangue foi realizada em dias alternados a partir do

terceiro dia da inoculação, conforme método descrito por BRENER (1962). Através da secção

da extremidade da cauda dos animais, obteve-se 5µl de sangue que colocados entre lâmina

histológica de vidro e lamínula de 22 mm x 22 mm foram observados sob aumento de 400X.

Procedeu-se a contagem das formas tripomastigotas vivas em 100 campos e utilizou-se um

fator de correção (17,65) calculado para o microscópio utilizado a fim de se obter o número

total de tripomastigotas em 5µl de sangue, e a seguir a multiplicação por 200 resultou no

número estimado de formas por mililitro de sangue.

2.5 - Eutanásia dos animais

16

A eutanásia ocorreu 23 dias após a inoculação em razão da proximidade ao pico de

parasitemia (DA MATA, 2000), pretendendo-se trabalhar em época de maior densidade de

ninhos de amastigotas.

No dia da eutanásia os animais foram pesados e anestesiados com cloral hidratado

(Reagen), na dose de 325 mg/kg de peso corporal, diluído em soro fisiológico e aplicado por

via intraperitoneal. Após anestesiados foram feitas incisões no tórax expondo o coração e,

através do ventrículo esquerdo, realizada perfusão intra-cardíaca com solução de NaCl a

0,9%, contendo 0,01g de heparina (Liquemine - Roche) por 10 minutos, seguida da perfusão

de paraformaldeido à 4% em tampão fosfato 0,1M; pH 7,2 por mais 10 minutos à temperatura

ambiente e sob pressão constante.

2.6- Métodos histológicos e histoquantitativos a que foram submetidas as amostras de tecidos

coletados.

Fixadas por perfusão intracardíaca, retirou-se os seguintes órgãos: encéfalo, coração,

pulmão, língua, esôfago, estômago, intestino delgado e grosso, rim e bexiga. Os mesmos

foram seccionados longitudinalmente (coração, pulmão, rim e língua) ou transversalmente

(encéfalo, bexiga, esôfago, estômago, intestino delgado e grosso). Estas secções foram

imersas na mesma solução fixadora de paraformaldeido tamponado por mais 12 horas, sendo

então desidratadas em etanol e incluídas em parafina (Histosec).

Os níveis das secções do encéfalo foram determinados a fim de possibilitarem

avaliações da histologia das estruturas encefálicas (fig. 4). O encéfalo com as meninges foram

retirados e secionados no plano frontal em três fragmentos transversais, como segue:

1º - fragmento do limite anterior do paraflóculo ventral até a parte média do bulbo (medulla

oblongata); 2º - fragmento, do limite do infundíbulo hipofisário até o limite anterior do

paraflóculo ventral (paraflocculus ventralis); 3º - fragmento, limitado anteriormente pelo

quiasma óptico e caudalmente pelo infundíbulo hipofisário.

Os blocos de tecidos foram montados com os dois fragmentos (metades inteiras) do

órgão posicionados lado a lado, exceto o encéfalo, o qual foi montado em 3 blocos, um para

cada fragmento. Nestes blocos foram feitas secções de 5µm de espessura e colhidas 3 lâminas

em intervalos de 70µm cada uma com os dois cortes vizinhos, iniciando-se pela face anterior

de cada fragmento. As três lâminas de cada bloco, contendo 6 cortes (exceto as do encéfalo

que continham 3 cortes), foram coradas pela técnica de hematoxilina-eosina e analisadas para

estudos histológicos e histoquantitativos diretamente no microscópio de luz.

17

Fig.4 - Esquema dos cortes usados para o estudo do encéfalo. (Da Mata, 2000).

2.7- Documentação fotográfica

Para a ilustração fotográfica utilizamos o fotomicroscópio Axioplan-2 (Zeiss) e filme

Gold plus de 100 ASA (kodak). As fotos foram escaneadas pelo scanner de mesa HP-300 e

processadas pelo programa MS Word 2000, para a colocação de legendas e formatação.

2.8- Analise estatística

Para a comparação dos resultados obtidos onde analisamos a variação do peso dos

animais, número de tripomastigotas em 1 ml de sangue, número de ninhos íntegros, número

de processos inflamatórios focais e número de infiltrados perivasculares; utilizou-se o

software Estatística, versão 6.0 para os tratamentos adequados. Procedeu-se a analise de

variância (ANOVA) e o teste não paramétrico (TUCKEY) com relevância estatística para um

nível de confiança de 95 % e p < 0,05.

18

3 – RESULTADOS

3.1 – Peso Corporal.

O grupo de animais inoculados aos 15 dias de idade, com 10.000 ou 100.000

tripo/animal, apresentou ao longo dos 23 dias de infecção, ganhos de pesos

estatisticamente semelhantes em relação aos apresentados pelos animais do grupo controle

(tabela 2). Os valores individuais, médios e respectivos desvios padrões estão exibidos no

anexo (tabela 6).

Tabela 2 – Valores do peso corporal em gramas (média+desvio padrão) de ratos Wistar inoculados aos 15 dias de idade, com 10.000 e 100.000 tripo/animal, de Trypanosoma cruzi, e aos 38 dias de idade (23 dias após a inoculação) Os pesos dos animais do grupo controle também são apresentados. Valores máximos e mínimos entre parênteses. Idade Grupos Inóculo Peso médio dos animais

(Tripo/animal) Dia da inoculação Dia da eutanásia (15 dias de idade) (38 dias de idade)

Inoculado 10.000 22,9+1,34 (21,5 -

25)

117+14,40 (101 – 132)

15 dias Inoculado 100.000 29,4+3,05 (26 – 33) 106+7,84 (100 – 116)

Controle - 26,4+2,09 (23 – 28) 110,8+6,30 (104 –

120)

Os valores não apresentaram diferenças significativas (p < 0,05).

Animais inoculados aos 60 dias de idade com 10.000 ou 100.000 tripo/animal não

apresentaram diferenças significativas quanto ao ganho de peso, entre si ou em relação aos

animais controle (tabela 3). Não houve mortes durante toda a fase aguda, em nenhum dos

grupos experimentais. Os valores individuais, médios e respectivos desvios padrões estão

exibidos no anexo (tabela 8).

19 Tabela 3 – Valores do peso corporal em gramas (média+desvio padrão) de ratos Wistar inoculados aos 60 dias de idade, com 10.000 e 100.000 tripo/animal, de Trypanosoma cruzi, e aos 83 dias de idade (23 dias após a inoculação) Os pesos dos animais do grupo controle também são apresentados. Valores máximos e mínimos entre parênteses. Idade Grupos Inóculo Peso médio dos animais

(Tripo/animal) Dia da inoculação Dia da eutanásia

(60 dias de idade) (83 dias de idade)

Inoculado 10.000 220,6+13,61 (203 –

241)

258+16,31 (240 –

278)

60

dias

Inoculado 100.000 200,4+17,62 (178 –

225)

240+62,06 (218 –

223)

Controle - 209,8+3,11 (207 –

215)

260,2+1,92 (258 –

263)

Os valores não apresentaram diferenças significativas (p < 0,05). 3.2 - Curvas parasitêmicas induzidas pelo isolado de Trypanosoma cruzi

Os valores da parasitemia foram obtidos em todos os animais infectados aos 15 e 60

dias de idade com 10.000 e 100.000 tripo/animal, respectivamente dos grupos 1

(15/10.000), 3 (15/100.000), 6 (60/10.000) e 8 (60/100.000). Os valores médios da

parasitemia durante a fase aguda da infecção estão apresentados nos gráficos de 1 a 4. Os

valores individuais, médios e respectivos desvios padrões estão exibidos no anexo (tabelas

9, 10, 11 e 12).

A inoculação de 10.000 tripo/animal aos 15 dias de idade induziu curva

parasitêmica com início no 5º dia, pico máximo no 23º dia após a inoculação e término do

período de parasitemia patente no 39º dia. O valor da parasitemia média observada no pico

foi de 116.490 tripomastigotas por ml de sangue (Gráfico 1).

20

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45

Dias após a inoculação

Tri

po

ma

sti

go

tas

/

ml

de

sa

ng

ue

GRÁFICO 1 – Curva de parasitemia (valores médios) em ratos Wistar infectados com T. cruzi aos 15 dias de idade, usando-se o inóculo de 10.000 tripo/animal.

Já a inoculação de 100.000 tripo/animal aos 15 dias de idade (Gráfico 2) induziu

curva parasitêmica com início similar (5º dia de infecção), porém com pico levemente

precoce (21ºdia de infecção) e valor parasitêmico médio no pico, 229.450 tripo/animal,

quase duas vezes maior que aquele apresentado pelos animais inoculados com 10.000

tripo\animal. O término da parasitemia patente ocorreu no 41º dia pós-inoculação.

21

0

50000

100000

150000

200000

250000

0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45


Tri

po

masti

go

tas / m

l d

e s

an

gu

e


A inoculação de 10.000 tripo\animal aos 60 dias de idade induziu curva

parasitêmica com início no 13º dia de infecção, pico médio aos 23 dias de infecção com

término da parasitemia patente aos 39 dias após a inoculação (Gráfico 3).

22

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45


Tri

po

ma

sti

go

tas

/ m

l d

e s

an

gu

e


Já a inoculação de 100.000 tripo/animal aos 60 dias de idade determinou curva

parasitêmica com início no 7º dia de infecção, pico médio aos 21 dias de infecção com

término da parasitemia patente aos 33 dias após a inoculação (Gráfico 4).

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

0 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45


Tri

po

masti

go

tas / m

l d

e s

an

gu

e


23

Os valores da parasitemia média observada no pico para animais com 60 dias de

idade e inoculados com 10.000 (24.710) e 100.000 (28.240) não apresentaram diferenças

estatisticamente significativas. Todavia estes valores foram estatisticamente menores

(p<0,05) que aqueles apresentados por animais inoculados com 10.000 aos 15 dias de

idade (116.490) e principalmente inoculados com 100.000 aos 15 dias de idade (229.450).

Ao tomarmos o conjunto dos oito maiores valores de cada um dos quatro grupos, a

analise estatística revelou não haver diferença entre a média dos valores parasitêmicos

máximos dos grupos inoculados com 10.000 e 100.000 tripo/animal dentro da mesma

idade. Contudo, a diferença ficou patente ao compararmos os grupos inoculados aos 15

dias com os de 60 dias com o mesmo inoculo.

24

3.3 Alterações teciduais morfológicas induzidas pela infecção experimental com T. cruzi.

O isolado do T. cruzi avaliado, com ambos os inóculos e em ambas as idades foi

capaz de induzir parasitismo cardíaco. A análise histológica, do coração de animais

controles, demonstrou os cardiomiócitos com arranjos característicos (Fig. 5).

Fig. 5 - Fotomicrografia de parede ventricular do coração de rato (Wistar) do grupo controle, sendo A e B aos 38 dias de idade e C aos 83 dias. Observe em B e C miocárdio (seta maior), epicárdio (seta menor) e endocárdio (cabeça de seta) com aspecto normal. Note em A os núcleos das células (N) e discos intercalares (D) de acordo com os padrões normais. Hematoxilina/Eosina (HE), 400X.

Em animais infectados ocorreu a presença de ninhos de amastigotas íntegros

distribuídos por todo o miocárdio, por vezes associados à presença de células inflamatórias

e outras vezes sem as mesmas (Fig. 6).

25

Fig. 6 – Fotomicrografia de coração de rato (Wistar) inoculado aos 15 dias com 100.000 tripo/animal (HE). A – Parede atrial apresentando ninho associado a células inflamatórias diversas (CI). Note o epicárdio (cabeça de seta) e endocárdio (seta menor) com células inflamatórias infiltradas (400 X). B – Detalhe da fotomicrografia A, apresentando ninho envolto por células inflamatórias (seta) 1000 X. C – Parede do ventrículo esquerdo apresentando ninho integro (seta) dentro de cardiomiócito sem reação inflamatória (1000 X). Rato inoculado aos 60 dias com 100.000 tripo/animal. HE.

Em diversas oportunidades foi observado edema induzindo afastamento das fibras

cardíacas em decorrência do processo inflamatório de intensidade moderada a acentuada

(Fig. 7).

26

Fig. 7 – Fotomicrografia de coração de rato (Wistar) apresentando processo inflamatório focal. A – Processo inflamatório focal (seta) no ventrículo esquerdo de rato inoculado aos 15 dias com 100.000 tripo\animal. HE, 400X. B – Processo inflamatório focal (seta) no ventrículo direito de rato inoculado aos 60 dias com 100.000 tripo\animal. Note o afastamento dos cardiomiócitos evidenciando edema (*). HE, 400X.

As células inflamatórias puderam ser identificadas, através de suas características

morfológicas peculiares. Observou-se a presença de polimorfonucleados, linfócitos,

plasmócitos, macrófagos e fibroblastos. (Fig. 8).

27

Fig. 8 – Fotomicrografia de coração de rato (Wistar), inoculado aos 15 dias com 100.000 tripo/animal, onde se observa parede ventricular esquerda apresentando processo inflamatório focal. Note a sugestiva de diversos tipos de celulares tais como: linfócitos (L), macrófagos (M), fibroblasto (F), plasmócito (P) e polimorfonucleado (PM). Observa-se o afastamento dos cardiomiócitos (*) evidenciando edema e desagregação tecidual subjacente. HE, 1000 X.

Foram encontrados focos inflamatórios distribuídos tanto sob o endocárdio quanto

sob o epicárdio (Fig. 9 e 10).

Fig. 9 – Fotomicrografia do coração de rato (Wistar) inoculado aos 15 dias com 10.000 tripo/animal. Observa-se processo inflamatório focal sub endocárdico (seta), na inserção da válvula átrio-ventricular esquerda (V). HE, 400X.

28

Fig. 10 – Fotomicrografia do ventrículo esquerdo de coração de rato (Wistar) inoculado aos 15 dias com 10.000 tripo/animal, apresentando em A, infiltrado inflamatório sub endocárdico (seta) e em B, sub epicárdico (seta). HE, 400X.

Freqüentemente identificamos a presença de infiltrados perivasculares (Fig. 11).

Constituídos por células inflamatórias em torno do vaso sanguineo.

29

Fig. 11 – Fotomicrografia do coração de rato (Wistar) inoculados aos 15 dias com 100.000 tripo/animal apresentando infiltrado inflamatório perivascular (seta). HE, 400X. A e B – Infiltrados perivasculares encontrados em torno de vasos (♦) sub endocárdicos no septo interventricular. C – Infiltrado perivascular ao redor de vaso (♦) secionado longitudinalmente de rato inoculado aos 60 dias com 100.000 tripo/animal. D – Infiltrados perivasculares em vasos (♦) do ventrículo esquerdo de rato inoculado aos 60 dias com 10.000 tripo/animal. Note o afastamento dos cardiomiócitos (cabeça de seta).

Para todas as idades e inóculos, as análises demonstraram ausência de

comprometimento da musculatura lisa ao serem avaliados o terço posterior do esôfago, o

estomago, terço inicial do intestino delgado e grosso. O músculo esquelético estriado

(língua) e a bexiga não foram parasitados nas secções analisadas.

Além destas regiões, não foram encontrados indícios de alterações teciduais no

encéfalo, pulmão e rins.

O parasitismo cardíaco induzido e aqui expresso pelo número de ninhos íntegros

encontrados, em animais inoculados aos 15 dias de idade sob o inoculo de 10.000 e

100.000 tripo/animal foi estatisticamente maior que o encontrado em ratos de 60 dias de

idade sob os mesmos inoculos (Tabela 4). Os valores individuais, médios e respectivos

desvios padrões estão exibidos no anexo (tabela 13).

Para os animais inoculados aos 60 dias de idade não há diferença estatística entre

os inoculos de 10.000 e 100.000 tripo/animal. Já animais submetidos aos mesmos inóculos,

mas aos 15 dias de idade, apresentaram maior número de ninhos nos animais inoculados

com o maior inoculo (100.000 tripo/animal).

30 Tabela 4 – Número médio (média+desvio padrão) de ninhos de amastigotas íntegros no coração de ratos Wistar inoculados aos 15 ou 60 dias de idade, com 10.000 e 100.000 tripo/animal, de T. cruzi. Valores máximos e mínimos entre parênteses. Os animais do grupo controle não apresentaram ninhos.

Tamanho do inóculo (tripo/animal)

Idade dos animais 10.000 100.000

15 dias 4+1,58 (2 – 6)a 8+1,58 (6 – 10)a *

60 dias 1+0,71 (0 – 2)b 2+1,00 (1 – 3)b

Em cada coluna, os valores com letras diferentes indicam diferenças significativas. Para linhas, apenas o valor assinalado com asterisco (*), apresenta diferença significativa (p < 0,05).

Em relação ao número de processos inflamatórios focais (PIF), observou-se maior

número em animais de menor idade (15 dias), submetidos ao maior inoculo (100.000

tripo/animal). O aumento do inoculo de 10.000 para 100.000 tripo/animal determinou

aumento de PIF apenas em ratos inoculados aos 15 dias de idade. Estes apresentaram o

tecido cardíaco intensamente comprometido por processos inflamatórios difusos e focais

(TAB. 5).

Tabela 5 – Número médio (média+desvio padrão) de processos inflamatórios focais (PIF) no coração de ratos Wistar inoculados aos 15 ou 60 dias de idade, com 10.000 e 100.000 tripo/animal, de T. cruzi. Valores máximos e mínimos entre parênteses. Não foram encontradas alterações em animais do grupo controle.



15 dias 13+2,24 (10 – 16) 25+3,67 (21 – 30) *

60 dias 8+2,55 (5 – 11) 10+3,74 (5 – 13)

Para cada coluna, os valores são semelhantes. Para linhas, apenas o valor assinalado com asterisco (*), apresenta diferença significativa (p>0.05).

O número de infiltrado perivascular (IPV) foi semelhante entre os animais

inoculados com 10.000 tripo/animal, tanto aos 15 quanto aos 60 dias de idade. Já com o

inoculo de 100.000 tripo/animal, os animais mais jovens, inoculados aos 15 dias de idade,

apresentaram maior número de IPV. O aumento do inoculo de 10.000 para 100.000

tripo/animal, determinou aumento de IPV somente em animais inoculados aos 15 dias de

idade (tabela 6).

31 Tabela 6 – Número médio (média+desvio padrão) de infiltrados perivasculares (IPV) no coração de ratos Wistar inoculados aos 15 ou 60 dias de idade, com 10.000 e 100.000 tripo/animal, de T. cruzi. Valores máximos e mínimos entre parênteses. Os animais do grupo controle não apresentaram alterações.



15 dias 5+1,58 (2 – 7)a 15+2,12 (12 – 17)b *

60 dias 3+1,00 (2 – 4)a 4+1,41 (3 – 6)c

Em cada coluna, os valores com letras diferentes indicam diferenças significativas. Para linhas, apenas o valor assinalado com asterisco (*), apresenta diferença significativa (p>0.05).

32

4 - DISCUSSÃO

Discutiremos nossos resultados confrontando-os com a literatura, na qual destaca-

se o volume de pesquisas realizadas no Brasil, a partir da descoberta da infecção causada pelo

T. cruzi em 1909 por Carlos Chagas. COURA et al. (2002) relataram que estão infectadas

pessoas em cerca de 3,6 milhões de quilômetros quadrados, ou seja, 44,5% do território

brasileiro, incluindo 2.450 municípios nos vários estados. Somente na década de 40 é que o

problema da doença de Chagas começou a ser reconhecido no Brasil (DIAS e COURA,

1997). Por outro lado, na América Latina, existem 16 milhões de infectados (WANDERLEY

1994, CAROD-ARTRAL et al., 2003 e RASSI et al., 2000). Estes números caracterizam um

problema de saúde pública e assim esperamos, com os dados que comentaremos, contribuir

para a caracterização desta doença.

As amostras isoladas do T. cruzi que utilizamos apresentaram parasitismo de

intensidade diferente ao infectarem os órgãos estudados, confirmando os achados de

OLIVEIRA (1993) e DA MATA (2002) ao observarem comportamento semelhante em

infecção em camundongo.

Dentre os fatores que influenciam o curso da doença de Chagas em um modelo

experimental, estão os que dependem do parasita e outros inerentes ao hospedeiro.

MENEZES (1964) cita que a cepa do T. cruzi, a susceptibilidade do animal e o número de

parasitas inoculados induzem graus variados na intensidade da gravidade desta doença.

Assim, este trabalho utilizou-se da infecção experimental alterando-se o tamanho do inóculo e

a idade dos animais, o que demonstrou a ocorrência de variações nos achados

histopatológicos.

A infecção que induzimos em ratos jovens e adultos, com menor e maior inóculo,

não causou diferença relevante no ganho de peso em relação ao grupo controle. Estes achados

concordam parcialmente com MELO & MACHADO (1998) e CAMARGO (1991) que

observaram ganho de peso menor em ratos jovens, mas não em adultos. Em nosso

experimento não ocorreu o parasitismo encefálico, principalmente pela cepa utilizada não

possuir tropismo pelo tecido nervoso, ao contrário tal tropismo foi relatado por DA MATA

(2000) e DA MATA (2002) em camundongos jovens inoculados com a cepa Y e que

apresentaram ganho menor de peso em relação ao grupo de animais adultos.

Diferindo de nosso experimento no qual não houve perda de peso nos animais

inoculados com o isolado de T. cruzi utilizado, GUERRA (1996) relatou a perda de peso em

ratos adultos inoculados com a cepa Y. É importante destacar que o tamanho do inóculo

determinou inicio de parasitemia tardio em nossa amostra nos ratos de 60 dias inoculados

33

com 10.000 tripo/animal. Os demais grupos apresentaram maior uniformidade entre si,

diferindo dos resultados de OLIVEIRA (1993) que relatou inicio semelhante entre ratos

adultos e jovens. Constatamos que o pico da parasitemia foi relativamente uniforme nos

grupos experimentais, fato semelhante foi constatado por DA MATA (2002), em torno do 21º

ao 23º dia de infecção. A autora relatou não ter encontrado relação entre o tamanho do

inóculo e pico parasitêmico tardio, o que se assemelha ao nosso experimento.

Nossos achados apontam fim precoce da parasitemia, entre o 33º e 41º dia pós-

inoculação, em relação aos resultados de OLIVEIRA (1993) e DA MATA (2002), que

relatam termino entre 41º e 48º dia. Esta relação sugere uma resolução da fase aguda mais

cedo no rato em relação ao camundongo, animal estudado pelos pesquisadores citados. Este

fato sugere que as defesas orgânicas dos ratos Wistar frente ao inoculo utilizado induz uma

resposta orgânica mais eficiente independendo da idade ou tamanho do inoculo utilizado.

Indagamos se a posição filogenética do rato, superior em relação ao camundongo, não

determinou um aprimoramento filogenético capaz de fazer frente aos recursos do parasita, o

humano de que foi isolada a cepa também não apresentava alterações encefálicas à ocasião do

procedimento. Como já foi relatado, algumas cepas de T. cruzi determinam parasitismo

encefálico em humanos, porém ao se utilizar a mesma cepa com tropismo cardíaco, pode-se

determinar se capacidade imunológica de hospedeiros diferentes favorecem o ataque ao tecido

nervoso.

Consideramos ainda a maturidade do sistema imunológico, que se relaciona

diretamente com a idade, como fator que intervem no desenvolvimento de tropismos e

infecções agudas letais ou não.

Ao considerarmos os picos parasitêmicos médios que expressam o momento mais

intenso da infecção, verificou-se que ela foi mais intensa nos ratos jovens em relação aos

adultos. Estes dados concordam com os relatos de KOLODNY (1939), CULBUSTON &

KESSLER (1942), DIAS (1985), PRATA (1994) e DA MATA (2002). Todos os relatos

destes autores demonstraram a ocorrência de alterações teciduais induzidas pela virulência em

animais jovens independentemente da cepa utilizada.

Nossos experimentos revelaram também que em ratos jovens o aumento do número

de formas inoculadas em dez vezes, 10.000 tripo/animal para 100.000 tripo/animal, duplicou

o valor encontrado como pico parasitêmico. Tal resposta constitui importante aspecto no

curso da infecção chagásica como demonstraram REVELI et al. (1987), BRENER &

KRETTLI (1990) e TARLETON (1995). Quanto maior for o número de formas inoculadas,

tanto maiores serão os achados inflamatórios até o limite da capacidade de reação do

hospedeiro. Inoculos maiores podem determinar a destruição celular exacerbada e a

34

suplantação das defesas do hospedeiro, levando ao óbito, fato relatado por ANDRADE

(1974). Isto não ocorreu em nosso experimento, demonstrando que as defesas orgânicas do

rato Wistar frente à cepa utilizada e ambos os inoculos, suplantaram a infecção durante a fase

aguda da mesma.

Nesta oportunidade observamos que o aumento da parasitemia demonstrou ter

relação proporcional às alterações teciduais encontradas, concordando com KRAMER (1972)

e DA MATA (2002), porem diferindo dos achados de MENESES & ALCANTARA (1965) e

CARNEIRO (1997). A virulência de uma cepa pode se apresentar alta num determinado

modelo animal, enquanto em outro não causar alterações relevantes. Esta situação peculiar

pode explicar a variabilidade encontrada pelos diversos pesquisadores ao utilizar cepas

semelhantes em hospedeiros diferentes.

Não se encontrou alterações ou sinais de infecção encefálica em nenhum dos grupos,

mesmo com o aumento do inoculo e diminuição da idade. Este fato difere dos dados de DA

MATA (2000), ao infectar ratos com a cepa Y, e também de DA MATA (2002) que utilizou

este mesmo isolado em camundongos e constatou parasitismo encefálico. Assim pode-se

inferir que o comprometimento encefálico determinado por este isolado presente em

camundongos não ocorreu em ratos.

Desse modo, a eutanásia dos animais realizada no 23º dia pós-inoculação, em nosso

experimento identificado como o pico da infecção e segundo DA MATA (2000) constitui

momento da máxima presença de células parasitadas, revelou ausência de sinais encefálicos.

Estes resultados contrastam com os achados de COSTA et al. (1986) e DA MATA (2000),

mesmo em animais não imunodeprimidos. Do mesmo modo, SANÁBRIA (1968 e 1969)

observou intenso parasitismo encefálico em camundongos, com parasitismo em macrófagos,

astrócitos e axônios. A ausência de ninhos, infiltrados peri-vasculares, processos inflamatórios

focais e difusos concorda com os resultados encontrados por PITELLA et al. (1993) que

também não encontraram alterações encefálicas na maioria dos pacientes humanos estudados

pelos pesquisadores.

O tropismo do parasita verificado por nós, exclusivamente voltado para o tecido

cardíaco concorda com os relatos de OLIVEIRA (1993) e DA MATA (2002).

Houve uma intensa reação inflamatória no tecido cardíaco, miocardite, tanto no

miocárdio como no epicárdio e endocárdio. Além disso, é evidente a desagregação celular

causada pelo edema e reações inflamatórias generalizadas. ANDRADE et al (1994), ao

estudar cães inoculados com a cepa 12SF, encontrou intensa miocardite o que se assemelha

aos nossos achados. ANDRADE et al (1994) e MELO & MACHADO (2001), relataram a

presença de macrófagos e linfócitos nos infiltrados inflamatórios, neste experimento

35

identificamos além destas células citadas, polimorfonucleados (neutrófilos em atuação no

interstício), plasmócitos e fibroblastos. Achados semelhantes aos de OLIVEIRA et al. (1993)

nos quais os autores ainda relataram fibrose intensa do miocárdio de animais sacrificados aos

180 dias (fase latente ou indeterminada). Nossos achados revelam a presença curiosa de

fibroblastos aos 23 dias, uma vez que tais células são responsáveis pela cicatrização tissular

ao recomporem o tecido conjuntivo com colágeno.

Um episódio encontrado em nosso estudo foi o infiltrado de células inflamatórias em

torno de vasos sanguíneos, relatados como infiltrado perivascular por HIGUCHI et al. (1999).

O próprio CHAGAS (1927) indagou a ausência de sinais inflamatórios nos vasos na fase

crônica, contudo reconheceu os mesmos sintomas causados por doenças como a sífilis e a

arteriosclerose que apresentam infiltrados perivasculares que prejudicam a microcirculação.

Os cardiomiócitos parasitados são sempre acompanhados de destruição celular

adjacente. ANDRADE (1999), observou a necrose de miócitos não parasitados e atribuiu esta

morte celular ao edema e infartos microscópicos causados pelas alterações microvasculares.

Os mesmos aspectos foram encontrados em nossos experimento onde o edema e o

comprometimento micro-vascular foram evidentes. DIAS (1944) afirmou ser o edema

responsável pela dilatação do coração na fase aguda, em vez da hipertrofia do miocárdio

característica da fase crônica, esta manifestação tem origem no desarranjo vascular podendo

causar falência cardíaca se for intensa o suficiente. Tal edema acompanhado de desarranjo

celular e afastamento de fibras foram encontrados no material analisado, resultado semelhante

foi relatado por CARTON (1988) e MARIN-NETO et. al.(1999).

Uma característica marcante em nossos achados foi à prevalência de lesões mais

intensas em animais jovens que em adultos, constituindo um quadro de imunodeficiência

fisiológica frente à cepa utilizada. GUERRA (1996), DA MATA (2000) e DA MATA (2002)

relatam que animais imunossuprimidos, portanto com resposta humoral menos eficiente,

apresentaram um quadro semelhante aos achados deste trabalho.

Além de lesões no miocárdio, encontramos manifestações nos epitélios interno e

externo do coração. ANDRADE (1994) afirmou que fatores auto-imunes produzidos pela

tecido atacado, chegam até os epitélios, interagindo e causando lesões significativas. Nossos

achados indicam comprometimento do epicárdio e endocárdio através do aparecimento de

focos inflamatórios subendocárdicos e subepicárdicos em todos os grupos inoculados, com

prevalência em animais jovens. Este aspecto foi observado por OLIVEIRA (1994); MARIN-

NETO (1999) e DA MATA (2000).

Assim o processo inflamatório desencadeia distúrbios isquêmicos, e a estes

poderiam somar-se a auto-agressão por fatores imunes (COSSIO et al., 1974). Tais infiltrados

36

podem alcançar relevância clínica na insuficiência cardíaca se situados na inserção das

válvulas átrio-ventriculares, podendo evoluir numa lesão que contribua para o funcionamento

deficiente das válvulas do coração na fase crônica, presente nas infecções por cepas com

tropismo cardíaco.

De um modo geral os resultados estiveram em conformidade com dados da

literatura, apresentando infecção de curso e alterações com lesões clássicas induzidas por cepa

do tipo III, não ocorrendo mortes durante o período do experimento.

37

5 – CONCLUSÕES

Com base nos resultados apresentados podemos concluir que:

1) A infecção induzida pelo isolado de T. cruzi utilizado, não determinou alteração no

ganho de peso corporal.

2) A conjugação do maior inóculo em ratos de menor idade, determinou intensificação

da infecção.

3) Foram identificadas morfologicamente células típicas do processo inflamatório tais

como: Linfócitos, macrófagos, polimorfonucleados, plasmócitos e fibroblastos.

4) O isolado de T. cruzi usado para a infecção apresentou características que sugerem sua

classificação como cepa tipo III.

5) Ocorreu tropismo para o músculo cardíaco, sem alterações nos demais órgãos

analisados.

6) Apesar do comprometimento cardíaco ocorrer em todos os animais infectados, não

houve mortalidade durante a fase aguda da infecção.

38

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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51

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Cardiol. Do Est de São Paulo. São Paulo. 4(2): 77-84, 1994.

52

ANEXO

53

Tabela 7 – Valores de pesos em gramas (individuais, médios e desvio padrão) de ratos controle e inoculados com 10.000 ou 100.000 tripo/animal, aos 15 dias de idade (e 23 dias após a inoculação).

Idade Peso dos ratos (gramas) Grupos

Dias Rato 1 Rato 2 Rato 3 Rato 4 Rato 5

Média

Desvio

padrão

15 27

23

28

26

28

26,4

2,07

Controle 38 106

120

104

111

113

110,8

6,30

15 21,5 23 23 22 25 22,9 1,34 Inoculado com

10.000 tripo/animal

38 132 129 120 101 103 117 14,40

15 33 27 32 29 26 29,4 3,05 Inoculado com

100.000 tripo/animal

38 100 113 100 101 116 106 7,84

54

Tabela 8 – Valores de pesos em gramas (individuais, médios e desvio padrão) de ratos controle e inoculados com 10.000 ou 100.000 tripo/animal, aos 60 dias de idade.

Peso dos ratos (gramas) Grupos

Idade

Dias Rato 1 Rato 2 Rato 3 Rato 4 Rato 5

Média

Desvio

padrão

60 215

210

208

209

207

209,8

3,11

Controle 83 260

258

263

261

259

260,2

1,92

60 222 241 217 220 203 220,6 13,61

Inoculado com 10.000 tripo/animal

83 258 278 244 270 240 258 16,31

60 178 225 196 194 209 200,4 17,62

Inoculado com 100.000 tripo/animal

83 197 349 206 222 226 240 62,06

55

Tabela 9 – Parasitemia (valores individuais, média e desvio padrão) de ratos (número de tripomastigotas em 100 campos), inoculados com 10.000 tripo/animal, aos 15 dias de idade.

Animais Dias examinados Rato 1 Rato 2 Rato 3 Rato 4 Rato 5 Média Desvio Padrão

3 0 0 0 0 0 0 0,00 5 1 1 1 1 1 1 0,00 7 1 3 2 2 2 2 0,71 9 7 5 7 9 7 7 1,41

11 25 22 15 9 19 18 6,24 13 12 23 5 12 13 13 6,44 15 17 17 19 23 19 19 2,45 17 10 25 20 20 25 20 6,12 19 17 20 36 39 28 28 9,62 21 16 15 42 43 29 29 13,51 23 16 18 48 50 33 33 16,03 25 20 8 15 30 27 20 8,92 27 8 2 14 3 13 8 5,52 29 3 1 7 1 3 3 2,45 31 1 0 3 0 1 1 1,22 33 2 0 4 2 2 2 1,41 35 1 3 0 0 1 1 1,22 37 1 0 2 1 1 1 0,71 39 0 0 0 0 0 0 0,00 41 0 0 0 0 0 0 0,00 43 0 0 0 0 0 0 0,00 45 0 0 0 0 0 0 0,00 47 0 0 0 0 0 0 0,00

56

Tabela 10 - Parasitemia (valores individuais, média e desvio padrão) de ratos (número de tripomastigotas em 100 campos), inoculados com 100.000 tripo/animal, aos 15 dias de idade.

Animais Dias Examinados Rato 1 Rato 2 Rato 3 Rato 4 Rato 5 Média Desvio Padrão

3 0 0 0 0 0 0 0,00 5 1 1 1 2 0 1 0,71 7 1 1 2 0 1 1 0,71 9 1 2 2 3 2 2 0,71

11 15 18 16 20 21 18 2,55 13 9 13 11 19 13 13 3,74 15 19 25 17 13 21 19 4,47 17 20 25 17 18 20 20 3,08 19 20 35 24 29 32 28 6,04 21 70 85 40 80 50 65 19,36 23 50 48 15 10 42 33 19,03 25 20 10 30 25 15 20 7,91 27 8 16 4 4 8 8 4,90 29 6 2 2 2 3 3 1,73 31 0 6 0 4 0 2 2,83 33 0 6 2 4 3 3 2,24 35 1 3 2 0 4 2 1,58 37 0 0 3 0 2 1 1,41 39 1 1 2 0 1 1 0,71 41 0 0 0 0 0 0 0,00 43 0 0 0 0 0 0 0,00 45 0 0 0 0 0 0 0,00 47 0 0 0 0 0 0 0,00

57



3 0 0 0 0 0 0 0,00 5 0 0 0 0 0 0 0,00 7 0 0 0 0 0 0 0,00 9 0 0 0 0 0 0 0,00

11 0 0 0 0 0 0 0,00 13 1 0 2 1 1 1 0,71 15 0 2 2 1 0 1 1,00 17 2 1 1 2 4 2 1,22 19 1 2 3 3 6 3 1,87 21 2 3 5 7 8 5 2,55 23 4 5 9 8 9 7 2,35 25 4 2 1 1 7 3 2,55 27 1 2 2 2 3 2 0,71 29 2 1 2 4 1 2 1,22 31 2 1 1 0 1 1 0,71 33 3 1 0 0 1 1 1,22 35 2 1 0 0 2 1 1,00 37 1 1 0 0 3 1 1,22 39 0 0 0 0 0 0 0,00 41 0 0 0 0 0 0 0,00 43 0 0 0 0 0 0 0,00 45 0 0 0 0 0 0 0,00 47 0 0 0 0 0 0 0,00

58



3 0 0 0 0 0 0 0,00 5 0 0 0 0 0 0 0,00 7 0 0 0 0 0 0 0,00 9 1 1 0 2 1 1 0,71

11 2 3 3 5 2 3 1,22 13 0 1 1 1 2 1 0,71 15 3 7 0 2 3 3 2,55 17 0 8 8 0 9 5 4,58 19 5 7 9 2 2 5 3,08 21 6 9 10 8 7 8 1,58 23 3 4 5 5 8 5 1,87 25 2 3 3 4 3 3 0,71 27 2 4 2 4 3 3 1,00 29 1 1 2 0 1 1 0,71 31 0 0 0 0 0 0 0,00 33 0 0 0 0 0 0 0,00 35 0 0 0 0 0 0 0,00 37 0 0 0 0 0 0 0,00 39 0 0 0 0 0 0 0,00 41 0 0 0 0 0 0 0,00 43 0 0 0 0 0 0 0,00 45 0 0 0 0 0 0 0,00 47 0 0 0 0 0 0 0,00

59

Tabela 13 – Quadro demonstrativo do número de ninhos íntegros (valores individuais, média e desvio padrão), no coração de ratos Wistar inoculados aos 15 ou 60 dias de idade, com 10.000 ou 100.000 tripo/animal, de T.

cruzi. Os animais do grupo controle não apresentaram alterações.

Animais

Idade

Inóculo tripo/animal

Rato 1

Rato 2

Rato 3

Rato 4

Rato 5

Média

Desvio Padrão

10.000

4

5

6

3

2

4

1,58

15 dias

100.000

6

10

9

8

7

8

1,58

10.000

2

0

1

1

1

1

0,71

60 dias

100.000

2

1

3

3

1

2

1,00

60

Tabela 14 – Quadro demonstrativo do número de infiltrado perivascular (valores individuais, média e desvio padrão), no coração de ratos Wistar inoculados aos 15 ou 60 dias de idade, com 10.000 ou 100.000 tripo/animal, de T. cruzi. Os animais do grupo controle não apresentaram alterações.

Animais

Idade


Rato 1

Rato 2

Rato 3

Rato 4

Rato 5

Média

Desvio Padrão

10.000

5

7

6

3

4

5

1,58

15 dias

100.000

12

15

17

17

14

15

2,12

10.000

3

2

4

2

4

3

1,00

60 dias

100.000

5

6

3

3

3

4

1,41

61

Tabela 15 – Quadro demonstrativo do número de processo inflamatório focal (valores individuais, média e desvio padrão), no coração de ratos Wistar inoculados aos 15 ou 60 dias de idade, com 10.000 ou 100.000 tripo/animal, de T. cruzi. Os animais do grupo controle não apresentaram alterações.

Animais

Idade


Rato 1

Rato 2

Rato 3

Rato 4

Rato 5

Média

Desvio Padrão

10.000

10

16

14

12

13

13

2,24

15 dias

100.000

30

25

21

22

27

25

3,67

10.000

5

11

8

10

6

8

2,55

60 dias

100.000

13

12

5

7

13

10

3,74

alterações teciduais agudas em ratos wistar induzidas por t cruzi

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