MINISTRIO DA SADE

FUNDAO OSWALDO CRUZ

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Curso de Ps-Graduao em Biologia Parasitria

Atividade de amidinas aromticas sobre

Trypanosoma cruzi: Estudos in vitro e in vivo

Cristiane Frana da Silva

Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como

parte dos requisitos para obteno do ttulo de

Doutor em Cincias

Orientao: Dra. Maria de Nazar Correia Soeiro

RIO DE JANEIRO

2011

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Ps-Graduao em Biologia Parasitria

CRISTIANE FRANA DA SILVA

Atividade de amidinas aromticas sobre

Trypanosoma cruzi: Estudos in vitro e in vivo

ORIENTADOR: Prof. Dra. Maria de Nazar C. Soeiro

EXAMINADORES:

Prof. Dra. Leonor Laura Leon (IOC/FIOCRUZ) - Presidente Prof. Dra. Thais Cristina Baeta Soares Souto Padron (UFRJ) - Membro Prof. Dra. Tecia Maria Ulisses de Carvalho (UFRJ) - Membro e revisora Prof. Dra. Maria Terezinha Bahia (UFOP) - Suplente Prof. Dra. Helene Santos Barbosa (IOC/FIOCRUZ)- Suplente

Rio de Janeiro, 06 de julho de 2011

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minha me

Geralda e ao meu

pai, Joaquim,

pelo amor, carinho,

ateno e total

apoio.

S existem dois dias no ano

que nada pode ser feito.

Um se chama ontem

e o outro se chama amanh,

portanto hoje o dia certo para amar,

acreditar, fazer e principalmente viver.

Dalai Lama

No desista, v em frente.

Sempre h uma chance de voc

tropear em algo maravilhoso.

Nunca ouvi falar em ningum

que tivesse tropeado

em algo enquanto estava sentado.

Caio Fernando Abreu

Agradecimentos

A Deus e a Nossa Senhora Aparecida, pelas oportunidades que me foram

dadas na vida, principalmente por ter conhecido pessoas que me

proporcionaram este momento, mas tambm por ter vivido fases difceis, que

foram matrias-primas de aprendizado.

Aos meus pais, Geralda e Joaquim, sem os quais no seria capaz de chegar

at aqui, e por me ajudar nesta caminhada com muita educao, fora para

encarar a vida de frente, carinho, amor, broncas, ateno e apoio.

A Dra. Maria de Nazar Soeiro, a melhor orientadora que eu poderia desejar,

que sempre me estimulou a seguir em frente e no desistir, principalmente por

sua grande capacidade como pesquisadora, orientadora e pessoa! Alm disso,

ela mostrou o tempo todo muito mais pacincia do que eu mereceria!!! Sou

inteiramente grata por essa pessoa maravilhosa, que Deus colocou no meu

caminho!!! Muito, muito obrigado!!! Mesmo!!!

A Dra. Solange Lisboa De Castro, que est sempre disposta a ouvir e ajudar

da maneira que pode!!! E tambm, por ser uma tima chefe e orientadora no

oficial!!!!

Ao Renato e Letcia, pelo apoio, ateno, amor, passeios e principalmente por

me dar dois sobrinhos maravilhosos, Miguel e Gustavo.

A Kika, minha eterna companheira, transmitindo paz e calma nas horas difceis

e por estar sempre ao meu lado em todos os momentos.

A Dra. Miriam Pereira, Dra. Kelly Salomo, Dra. Elen Mello e Dra. Anissa

Daliry, pela pacincia e ensinamentos disponibilizados que de alguma forma

especial contribuiu para a concluso desse trabalho e, consequentemente,

para minha formao profissional.

Ao Marcos Meuser, obrigada pelo apoio tcnico fundamental e por deixar

marcas e lies para a minha vida, proporcionando-me alegrias, conhecimento

e crescimento pessoal.

A Dra. Denise, por toda pacincia que ela tem comigo pois passamos muitas

horas juntas, por ser uma tima profissional, companheira de experimentos e

uma colaboradora sempre presente auxiliando-me de muitas formas, em

diferentes momentos. Por ser uma amiga tambm fora do trabalho, sempre

com sorriso no rosto e alegria, carinho e cumplicidade, durante todos esses

anos, pois sem essa fora seria muito mais difcil atravessar esse mesmo

caminho.

As minhas amigas, Ana Maria, Camila Coronel e Michele Longo, que em

alguns casos no sabiam muito sobre minha tese, mas que sempre me

ajudaram, a toda ateno dispensada comigo, as festas, passeios e viagens

que eram pra distrair a cabea. Sempre que estou com elas parece que tenho

paz, calma, tranqilidade, que so itens fundamentais para seguir em frente!!!

Obrigada de corao, vocs no so apenas parte de mim, mas da minha

vida!!!

Ao Laboratrio de Biologia Celular, Aline Nefertiti, Aline Onofre, Erica,

Evelyn, Haynna, Julianna, Phelipe, Natalia, Michele Casal, pelo apoio a esta

tese. E principalmente, a Patrcia Bernadino, por ser uma tima companheira

de trabalho e muito competente. Por me mostrar que preciso muita fora de

vontade e dedicao. Afinal, cada escolha uma renuncia!!!!

A Giani Frana e Sandra Maria, por toda a simpatia, tima companhia e

amiga dentro e fora da FIOCRUZ.

Aos meus amigos do Setor de Experimentao Animal, Dr. Gabriel,

Wanderson, Monique e Diana, pelo apoio tcnico, conversas, confidencias e

risadas do dia-a-dia.

A todos que fizeram parte da minha vida de alguma forma, a minha eterna

gratido! Sem vocs essa trajetria no seria to prazerosa!!!

Esta tese foi desenvolvida sob orientao da Dra. Maria de Nazar Correia

Soeiro no Laboratrio de Biologia Celular do Instituto Oswaldo Cruz, Fundao

Oswaldo Cruz, com o apoio financeiro da Fundao Carlos Chagas Filho de Amparo

a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (APQ1- E26/170.627/07 and Pensa Rio - E-

26/110.401/2007), Conselho Nacional Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico

(CNPq - 304119/2006-7), DECIT/SCTIE/MS e MCT pelo CNPq (410401/2006-4),

PAPES V/FIOCRUZ (403451/2008-6) e pelo Consortium for Parasitic Drug

Development (CPDD).

Esta tese composta por 05 artigos:

1. da Silva, C. F., M. M. Batista, D. G. J. Batista, E. M. De Souza, P. B. da Silva, G.

M. de Oliveira, A. S. Meuser, A. R. Shareef, D. W. Boykin, and M. N. Soeiro. (2008).

In vitro and in vivo studies of the trypanocidal activity of a diarylthiophene diamidine

against Trypanosoma cruzi. Antimicrob. Agents Chemother. 52:3307-3314.

2. da Silva CF, da Silva PB, Batista MM, Daliry A, Tidwell RR, Soeiro M de N. The

biological in vitro effect and selectivity of aromatic dicationic compounds on

Trypanosoma cruzi. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2010:105(3):239-45.

3. Da Silva CF, Junqueira A, Lima MM, Romanha AJ, Sales Junior PA, Stephens

CE, Som P, Boykin DW, Soeiro Mde N. 2011 a. In vitro trypanocidal activity of

DB745B and other novel arylimidamides against Trypanosoma cruzi. J Antimicrob

Chemother. 66(6):1295-7.

4. Da Silva CF, Daliry A, Silva PB; De Castro SL, Boykin DW, Soeiro MNC. 2011b.

The Efficacy of Novel Arylimidamides Against Trypanosoma cruzi in vitro. Submetido.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Da%20Silva%20CF%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Junqueira%20A%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lima%20MM%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Romanha%20AJ%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sales%20Junior%20PA%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stephens%20CE%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stephens%20CE%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Som%20P%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Boykin%20DW%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Soeiro%20Mde%20N%22%5BAuthor%5Djavascript:AL_get(this,%20'jour',%20'J%20Antimicrob%20Chemother.');javascript:AL_get(this,%20'jour',%20'J%20Antimicrob%20Chemother.');

5. da Silva CF,Batista DGJ, de Oliveira GM, De Souza EM, Hammer ER, da Silva

PB, Daliry A, Araujo JS, Stephens CE, Som P, Britto CC, Rodrigues ACM, Boykin

DW, Soeiro MNC. 2011c. In vitro and In vivo investigation of amidine DB1965 and

DB1831 efficacy against Trypanosoma cruzi infection. Submetido.

Prmio:

1. Simpsio Internacional Comemorativo do Centenrio da Descoberta da Doena

de Chagas (Julho de 2009).

Durante a realizao desta tese, participei das seguintes publicaes:

1. Soeiro, M.N.C., de Castro, S.L., de Souza, E.M., Batista, D.G.J., Silva, C.F.,

Boykin, D.W. (2008). Diamidine Activity Against Trypanosomes: the State of the Art.

Current Molecular Pharmacology 1:151-161.

2. Soeiro Mde N, Dantas AP, Daliry A, Silva CF, Batista DG, de Souza EM, Oliveira

GM, Salomo K, Batista MM, Pacheco MG, Silva PB, Santa-Rita RM, Barreto RF,

Boykin DW, Castro SL. Experimental chemotherapy for Chagas disease: 15 years of

research contributions from in vivo and in vitro studies. Mem Inst Oswaldo Cruz.

2009;104 Suppl 1:301-10

3. Daliry A, Da Silva PB, Da Silva CF, Batista MM, De Castro SL, Tidwell RR, Soeiro

Mde N. In vitro analyses of the effect of aromatic diamidines upon Trypanosoma

cruzi. J Antimicrob Chemother. 2009: 64(4):747-50.

4. Pacheco MG, da Silva CF, de Souza EM, Batista MM, da Silva PB, Kumar A,

Stephens CE, Boykin DW, Soeiro Mde N. Trypanosoma cruzi: activity of heterocyclic

cationic molecules in vitro. Exp Parasitol. 2009 ;123(1):73-80

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19753489http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19753489http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19671588http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19671588http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19520077http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19520077

5. De Castro S, Batista DGJ, Batista MM, Batista W, Daliry A, De Souza EM, Menna-

Barreto RFS, Oliveira GM, Salomo K, Silva CF, Silva PB, Soeiro MNC.

Experimental chemotherapy for Chagas disease: a morphological, biochemical and

proteomic overview of Trypanosoma cruzi targets. 2011. Molecular Biology

International. In press.

Capitulo de Livro:

1. SOEIRO, M. N. C.; Daliry, A.; Silva CF; de Souza, E. M; OLIVEIRA, G. G.;

SALOMO, K; MENNABARRETO, R ; CASTRO, S. L. Electron microscopy

approaches for the investigation of the cellular targets of trypanocidal agents

in Trypanosoma cruzi. In: A. Mndez-Vilas A, Daz J. (Org.). Microscopy:

Science, Technology, Applications and Education. Badajoz: Formatex

Research Center, 2010, v. 1, p. 191-203.

http://lattes.cnpq.br/1225895689761854http://lattes.cnpq.br/2294633719051509http://lattes.cnpq.br/0578783224078302http://lattes.cnpq.br/1189390369196500

RESUMO

O atual tratamento da doena de Chagas (DC) se baseia em dois compostos

nitroderivados, o Nifurtimox (Nf) e benznidazol (Bz), ambos introduzidos na clnica

mdica h cerca de 40 anos e que tm sido considerados insatisfatrios

principalmente devido baixa atividade, sobretudo na fase crnica, alm de alta

toxicidade e/ou ocorrncia de isolados do parasito resistentes a ambos

nitroderivados. Assim como um dos principais desafios ainda a serem enfrentados

h mais de cem anos depois da descoberta da DC diz respeito a identificao de

novas terapias alternativas para o tratamento desta negligenciada parasitose, esta

temtica representou o principal objetivo da presente tese. Assim, estudos in vitro e

in vivo foram conduzidos visando avaliar a eficcia de amidinas aromticas, incluindo

diamidinas e arilimidamidas (AIAs) sobre o T.cruzi, analisando ainda a localizao e

distribuio dos compostos aromticos assim como seus alvos celulares. Nossos

dados revelaram a ao tripanocida de diamidinas e AIAs sobre formas sanguneas

e amastigotas do parasito, em faixa micro e nanomolar, respectivamente. Alguns dos

compostos estudados, em especial as AIAs DB745 e DB1831 exibiram excelente

efeito sobre formas sanguneas na presena de sangue a 4C, demonstrando seu

potencial uso tambm na profilaxia de bancos de sangue. De modo geral, as

amidinas testadas, incluindo as AIAs, apresentaram superior eficcia que as drogas

de referencia, incluindo o Bz e a violeta de genciana. AIAs como a DB745 foram

ativas sobre diferentes cepas do T.cruzi, incluindo YuYu e Colombiana, que

apresentam resistncia natural a nitroderivados. Estudos ultra-estruturais e por

ensaios fluorescentes (microscopia e citometria de fluxo) revelaram que o ncleo e a

mitocndria do parasito representam potenciais alvos dos compostos estudados. No

entanto, no foi observada correlao entre atividade e maior acmulo destes

agentes na mitocndria (kDNA) do T.cruzi. Os ensaios in vivo demonstraram que

estes compostos aromticos so ativos sobre modelos experimentais de infeco

aguda pelo T.cruzi, reduzindo carga parasitria e a inflamao, oferecendo 100% de

proteo na mortalidade dos animais tratados. A AIA DB1965 revelou eficcia

semelhante ao Bz e a sua combinao com esta droga de referncia resultou em

100% de sobrevida e nveis superiores a 99% de supresso de parasitemia, sem

alcanar cura parasitolgica avaliada pelo hemocultivo e PCR. O excelente efeito de

amdinas, em especial de AIAs contra o T. cruzi, refora o rastreamento por novos

anlogos que possam ser usados sozinhos ou em combinaes com outras drogas,

para o tratamento da doena de Chagas.

ABSTRACT

The current treatment of Chagas disease (CD) is based on two old drugs, the

Nifurtimox (Nf) and benznidazole (Bz), both introduced in clinical medicine for nearly

40 years ago. Both are not considered adequate mainly due to their low activity,

especially in the chronic phase, and high toxicity and/or occurrence of parasite

strains naturally resistant to both nitro-derivatives. Then, one of the main challenges

still to be faced after more than a century after the discovery of CD is respect to need

of identifying new alternative therapies for the treatment of this neglected illness, and

this issue represents the main objective of the present thesis. Thus, in vitro and in

vivo studies were conducted to evaluate the efficacy of aromatic amidines, including

diamidines and arylimidamides (AIAs), and to evaluate the localization and

distribution of these compounds as well as their potential cellular targets upon T.

cruzi. Our data revealed trypanocidal activity of diamidines and AIAs against

bloodstream and intracellular amastigotes under micro and nanomolar range,

respectively. Some of the studied compounds, especially AIAs, DB745 and DB1831,

exhibited an outstanding effect on bloodstream forms even in the presence of blood

at 4C, also demonstrating their potential prophylactic use in blood banks. In general,

amidines mainly AIAs, showed higher efficacy than the reference drugs, including Bz

and gentian violet. AIAs, as DB745, were active on different strains of T. cruzi,

including Colombian and YuYu, which have natural resistance to nitro-derivatives.

Ultrastructural studies and fluorescent tests (microscopy and flow cytometry)

revealed that the nucleus and mitochondria of the parasite are potential targets of the

compounds studied. However, there was no correlation between activity and greater

accumulation of these agents in the mitochondria (kDNA) of T. cruzi. In vivo testing

demonstrated that these aromatic compounds are active on experimental models of

acute infection of T. cruzi, by reducing cardiac parasite load and inflammation, and

offering 100% of protection upon the mortality of treated animals. The AIA, DB1965,

also showed similar efficacy of Bz and its combination with this reference drug

resulted in 100% survival and >99% of parasitemia suppression, without achieving,

parasitological cure assessed by blood culture and PCR. The excellent effect of

amidines (especially of AIAs) against T. cruzi, justify the screening of novel amidine

analogues that could be used alone or in combination with other drugs to treat

Chagas disease.

NDICE

RESUMO x

ABSTRACT xi

INTRODUO 01

1.1 Doena de Chagas 02

1.2 A doena e suas fases 03

1.3 Transmisso 04

1.4 O parasita e seu ciclo de vida 06

1.5 Quimioterapia 08

1.6 Diamidinas e anlogos 10

OBJETIVOS 16

RESULTADOS 19

DISCUSSO 95

CONCLUSES 106

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 109

Introduo

1

Introduo

Introduo

2

1.1 Doena de Chagas Doenas tropicais negligenciadas, como por exemplo, a Doena de Chagas

(DC), afetam aproximadamente um bilho de indivduos que vivem em reas muito

pobres, sendo uma das principais causas de impedimento para o avano

socioeconmico em muitos pases em desenvolvimento, alm de causar alta

morbidade e mortalidade (Richard & Werbovetz, 2010; Soeiro e De Castro, 2009).

Doena de Chagas, ou tripanosomase americana uma infeco causada

pelo protozorio flagelado Trypanosoma cruzi (WHO, 2002), sendo a prevalncia

global da infeco humana de aproximadamente 8-12 milhes de pessoas, o que

representa uma reduo de cerca de 50% nas taxas de infeco observadas em

1990. (WHO, 2007). Dados recentes sugerem que 90-100 milhes de pessoas

estejam em risco de contrair esta parasitose em reas endmicas (Pinto Dias, 2006;

Clayton, 2010). Um dos motivos da DC permanecer com alta incidncia a grande

quantidade de reservatrios, tendo sido relatada a infeco por T.cruzi de mais de

150 espcies domsticas, rurais e de animais selvagens (gatos, cachorros, porcos,

roedores, marsupiais, tatus) (Rassi e cols., 2010). Vrias estimativas relatam cerca

de 20.000 mortes por ano em decorrncia da DC, representando a segunda doena

mais importante entre as doenas tropicais nas Americas (Coura, 2009; Coura e

Dias, 2009)

Em 1909, Carlos Chagas descreveu a doena, o ciclo, a transmisso e o

parasita. Aps 102 anos esta doena continua sendo um importante problema de

sade pblica em 22 pases em desenvolvimento na Amrica, compreendendo a

faixa que se estende a partir do sul dos Estados Unidos at a Argentina meridional

(Pinto Dias, 2006; Rocha e cols., 2007). Hoje, a DC tambm representa um novo

desafio mundial devido a sua expanso para pases no-endmicos, como os

Estados Unidos de Amrica, Canad, Japo, Frana e Espanha, como resultado de

migrao de indivduos infectados (Coura e Borges-Perreira, 2010). Relatos da

literatura descrevem caractersticas clnicas da DC, como o megacolon, em mmias

de diferentes reas da Amrica Latina datadas de aproximadamente ~7.000 AC a

~1,500 DC (Arajo e cols., 2009).

Apesar de esforos agregados a partir de diferentes iniciativas

governamentais (Iniciativas de pases do Cone Sul) e no-governamentais (ex. DNDi

e Mdicos Sem Fronteiras -MSF) que resultaram no declnio acentuado de novos

casos agudos, a doena de Chagas ainda apresenta muitos desafios, inclusive a

falta de terapias profilticas e de esquemas efetivos de quimioterapia em especial

Introduo

3

para pacientes crnicos tardios (Rodrigues Coura e De Castro, 2002; Dias 2007).

Como todas as doenas negligenciadas, a DC no de interesse para as indstrias

farmacuticas, principalmente, devido a falta de potencial mercado nos pases

afetados e consequentemente retorno financeiro compatvel aos elevados custos de

investimento necessrios para o desenvolvimento de novos frmacos (Buckner e

Navabi, 2010). Dados revelam que de 1975-2004, somente cerca de 1,3% da verba

total para desenvolvimento de novas drogas foi dedicado para tratamento de

doenas altamente negligenciadas, especialmente Leishamniose, Dengue, Doena

do Sono e DC (Chatelein e Loset, 2011). O custo relativo ao cuidado da sade

somado a perda de produtividade que se atribui a DC alcana de 40 a 800 milhes

de dlares, por pais, por ano. Alm disso, anualmente a Amrica Latina tem perdas

econmicas na ordem de 18 bilhes de dlares como resultado da morbidez e

mortalidade de pacientes chagsicos em plena idade produtiva (Parker e Sethi,

2011).

1.2 A doena e suas fases

DC possui duas fases consecutivas: a fase aguda, que inicia-se logo aps a

infeco, e a fase crnica, na qual 30-40% dos pacientes apresenta sintomatologia

clnica aps um perodo silencioso de anos ou dcadas, chamado de forma

indeterminada (Rodrigues Coura e De Castro, 2002; Clayton, 2010a; Coura e

Borges-Perreira, 2010). A fase aguda dura entre 4 a 8 semanas e caracterizada

pela alta parasitemia. Na maioria dos indivduos infectados assintomtica, podendo

ainda ser oligosintomtica apresentando febre, dores musculares, sudorese,

aumento do tamanho do fgado e bao, parada cardaca devido a inflamao do

miocardio, e, menos freqentemente, meningoencefalite. O envolvimento cardaco

est presente em 90% dos casos. Outros sintomas que tambm podem ocorrer

durante a fase aguda incluem anorexia, nusea, diarria e edema. Uma

particularidade o forte edema presente no local de inoculao conhecido como

chagoma de inoculao ou Sinal de Roman, neste ltimo caso, quando o indivduo

que sofre a inoculao do parasito na mucosa da conjuntiva ocular (Coura e Dias,

2009). O chagoma pode persistir durante vrias semanas, regredindo

espontaneamente. Na fase aguda o falecimento visto em menos de 5% dos casos

sintomticos e pode ser atribuvel a complicaes mais severas ou em recm-

nascidos com infeco congnita, crianas e indivduos imunocomprometido (Rassi

e cols., 2010).

Introduo

4

Aproximadamente dois meses aps a infeco, a doena evolui para a fase

crnica, na qual 60% a 70% dos indivduos infetados permanecem na forma

indeterminada caracterizada pela ausncia de sintomas clnicos, mas sorologia

positiva e leve dano cardaco causado pela persistente inflamao (Marin Neto e

Rassi, 2009). Entretanto, aps 10 a 30 anos, os demais portadores evoluem ento

para a forma crnica sintomtica na qual 5% a 10% desenvolvem manifestaes

gastrointestinais (megacolon e megaesfago) e a grande maioria, alteraes

cardacas, que progridem at a falncia do rgo (Coura e Vias, 2010, Rodrigues

Coura e De Castro, 2002). Na fase crnica, existe uma grande variedade regional

quanto as caractersticas de sua morbidade cardaca e/ou digestiva (Coura e Borges

Perreira, 2010).

Embora seus mecanismos patolgicos no estejam plenamente entendidos,

dados da literatura mostram a persistncia do parasita nos rgos que sustenta a

manuteno de uma resposta inflamatria relacionada a patognese da DC (Higuchi

e cols., 2003, Marino e cols., 2005). Por outro lado, a discrepncia entre a

severidade das leses e a baixa carga parasitria observada na fase crnica sugere

que outros fatores alm do parasita possam estar relacionados ao desenvolvimento

da patologia chagsica, incluindo ds-regulao da resposta imune do paciente.

Neste sentido, vrios estudos tm implicado o fenmeno da auto-imunidade como

um dos fatores envolvidos no desenvolvimento da patologia da DC. No entanto,

dados apontam que embora a resposta imune contribua fortemente para as leses

dos tecidos em especial quando exacerbada e descontrolada, o parasita ainda

reconhecido como principal fator desencadeador da doena (Gutierrez e cols., 2009;

Bonney e cols., 2011).

O diagnostico da DC crnica baseado em dados clnicos, eletrocardiogrfico

e sorolgico. Os testes sorolgicos, comumente, so baseados na fixao do

complemento, imunofluorescncia ou ensaios de ELISA. DC pode ser ainda

diagnosticada por testes moleculares de alta sensibilidade (especficas para o DNA

do T. cruzi) atravs de ensaios de reao em cadeia de polimerase (PCR) (Maya e

cols., 2010).

1.3 Transmisso

A DC principalmente transmitida por seu vetor da ordem Hemptera, famlia

Reduviidae. Dentro desta famlia o Triatoma infestans, Rhodnius prolixus, Triatoma

dimidiata so os trs principais vetores da infeco humana. Os triatomneos vivem

Introduo

5

nas rachaduras e fendas das casas de lama ou em casas de sap (pau-a-pique) e

saem noite para se alimentar. A maioria das picadas ocorre na face, parte

descoberta do corpo, resultando no nome vulgar do inseto conhecido no Brasil por

barbeiro (Rassi e cols., 2010).

A transmisso vetorial do T. cruzi envolve trs ciclos: (i) o ciclo domstico

(responsvel pela manuteno da doena em humanos) que ocorre principalmente

em reas urbanas e peri-urbanas, sendo humanos, ces e gatos os principais

reservatrios do parasita; (ii) o ciclo silvestre, no qual triatomneos silvestres

infectam roedores, marsupiais e outros mamferos e, (iii), o ciclo peridomiciliar, que

representa um elo entre o ciclo domstico e o silvestre. No ciclo peridomiciliar ocorre

o fluxo de mamferos (roedores domsticos, marsupiais, gatos, cachorros, entre

outros) entre casas e reas silvestres bem como a ocorrncia de espcies de

triatomneos silvestres infectados que acessam s casas infectando diretamente

pessoas, animais e mesmo alimentos (Remme e cols., 2006).

Insetos triatomneos so abundantes nos Estados Unidos, e um recente

estudo demonstrou que 41% dos insetos presentes na rea peroidomiciliar de

Tucson, no Arizona esto infetados com T. cruzi, ilustrando o potencial risco de

transmisso vetorial na Amrica do Norte (Reisenman e cols., 2010). Uma

preocupao tambm crescente tem sido os numerosos casos de cachorros

infectados do Texas, Tennessee, Louisiana, Oklahoma, Gergia, Sul, Carolina, e

Virgnia, demonstrando que existe um ciclo de transmisso ativo em ces (Parker e

Sethi, 2011).

Nas ltimas trs dcadas, a transmisso vetorial (em especial mediada pelo

T. infestans) da DC foi significativamente reduzida nas reas endmicas devido a

polticas do Cone Sul de controle epidemiolgico (Coura e Dias, 2009; Dias 2009;

Moncayo e Silveira 2009). De fato, vrios pases latinos americanos, inclusive o

Brasil em 2006, receberam a certificao de OPAS/WHO referente a interrupo de

transmisso vetorial por T. infestans (Moncayo e Silveira 2009).

Migraes rurais para reas urbanas bem como para pases no endmicos,

tem contribudo significativamente para a mudana do padro epidemiolgico da DC,

tornando a transfuso sangunea o segundo principal modo de transmisso desta

parasitose (Coura, 2009) devido ao aumento da sua prevalncia em bancos de

sangue de pases no endmicos, incluindo Amrica do Norte e pases da Europa

(Coura, 2009). Historicamente, a transfuso de sangue contaminado uma fonte

reconhecida de transmisso na America Latina, porm casos de infeco por

Introduo

6

transfuso em pacientes imunocomprometidos tm sido documentados nas ltimas

duas dcadas nos Estados Unidos e Canad (Schmunis, 2007). No entanto, o

Centro para Controle e Preveno de Doenas (CDC) informou que

aproximadamente 800 casos de DC foram confirmados em centros de coleta de

sangue nos Estados Unidos desde 2007. A maioria destes casos concentrou-se em

reas ricas de imigrantes latinos americanos tais como: Califrnia, Texas, Flrida, e

Nova Iorque (Parker e Sethi, 2011). O CDC estimou que cerca de 18 milhes de

pessoas migraram do Mxico e de pases da America do Sul e Central para os

Estados Unidos e que pelo menos 300 mil infectados vivem atualmente nos Estados

Unidos (Parker e Sethi, 2011).

Outra maneira de transmisso da doena de Chagas por via congnita,

sendo a terceira via de maior importncia, podendo ocorrer desde o terceiro ms de

gestao, com um em vinte neonatos nascidos de mes soropositivas para DC

(Parker e Sethi, 2011). A transmisso pode ocorrer tambm atravs do transplante

de rgos infectados, por acidentes em laboratrio e como relatados em vrios

surtos no Brasil, por via oral, devido ao consumo de alimentos contaminados (Dias,

2006; Rassi e cols., 2010).

A transmisso por alimentos contaminados (carne crua ou sucos de cana-de-

acar, goiaba ou aa) com fezes de insetos triatomneos (Pereira e cols., 2010)

tem sido uma real ameaa. A partir de 2004, houve na regio Amaznica, um

significativo aumento do nmero de casos agudos devido a ingesto de sucos (como

o de aa), o que evidenciou a necessidade de maior controle e vigilncia

epidemiolgica da DC nesta regio (Moncayo e Silveira, 2009)

1.4. O parasita e seu ciclo de vida

De acordo com a classificao taxonmica, o T.cruzi pertence ordem

Kinetoplastida, famlia Trypanosomatidae e gnero Trypanosoma. O T. cruzi tem um

ciclo de vida que consiste em formas morfologicamente e bioquimicamente distintas,

sendo: duas proliferativas, epimastigota encontrada nos triatomneos, e amastigota

que se multiplica no interior da clula do hospedeiro vertebrado, e uma no

proliferativa - tripomastigota - que circula no sangue perifrico, sendo tambm

encontrado no intestino posterior do inseto vetor com a denominao de

tripomastigota metacclico (De Souza, 2010; Brener,1973). Durante o repasto

sanguneo de um hospedeiro mamfero infectado, o inseto vetor ingere

tripomastigotas sanguneos, que se diferenciam ao longo do intestino do inseto vetor

Introduo

7

em formas epimastigotas. Aps de 34 semanas, formas tripomastigotas

metacclicas presentes na poro posterior do intestino do barbeiro so liberadas

junto as fezes e urina do vetor no momento do novo repasto sanguneo. A

transmisso para o novo hospedeiro vertebrado ocorre quando as fezes contendo

parasitas contaminam mucosas, conjuntivas e/ou superfcies lesionadas. Assim,

aps infectar clulas do hospedeiro vertebrado, o parasito se diferencia, em formas

amastigotas, que aps vrios ciclos de multiplicao intracelular, se transformam em

formas tripomastigotas, que so as principais formas liberadas aps a ruptura das

clulas hospedeiras, ganhando acesso as correntes sangunea e linftica e/ou sendo

ingeridas pelo inseto vetor, completando ento seu ciclo de vida. O parasita capaz

de invadir qualquer clula nucleada (Brener, 1973; De Souza, 1984; Stuart e cols.,

2008).

As diferentes formas do T. cruzi presentes em seus diferentes hospedeiros

podem ser reconhecidas a partir de suas caractersticas morfolgicas e bioqumicas.

Com relao aos aspectos morfolgicos, a posio do cinetoplasto em relao ao

ncleo, e a posio do flagelo so importantes pontos a serem avaliados na

diferenciao entre amastigotas, epimastigotas e tripomastigotas. O T. cruzi, bem

como todos os membros da famlia Tripanosomatidae, apresenta uma nica

mitocndria que se ramifica por todo o corpo deste parasito. Nela, grande parte do

seu DNA se organiza sob a estrutura de minicrculos e maxicirculos concentrados

numa determinada regio localizada logo abaixo do corpsculo basal, denominada

de cinetoplasto. (De Souza, 1999). Os tripomastigotas possuem o cinetoplasto em

forma arredondada localizado na regio posterior ao ncleo, com o flagelo

emergindo a partir da bolsa flagelar localizada na regio posterior do parasito. As

formas amastigotas apresentam cinetoplasto em forma de basto, anterior ao

ncleo, com flagelo curto. O epimastigota tambm apresenta o cinetoplasto em

forma de basto sendo anterior ao ncleo (De Souza e cols, 2000). O flagelo dos

tripanosomatdeos est envolvido em pelo menos dois importantes processos

biolgicos: movimento celular e adeso superfcie de clulas do hospedeiro (De

Souza, 1999). Este parasita tambm apresenta outras organelas, que por sua

peculiaridade, tm sido consideradas alvos celulares para desenho de novas drogas

incluindo: glicossomos (estruturas ricas em catalases e outras enzimas envolvidas

na via glicoltica), e acidocalcisomas (organelas acdicas ricas em clcio, fosfato

entre outros elementos) (De Souza, 1999).

Introduo

8

1.5 Quimioterapia

O atual tratamento da DC baseado em dois frmacos: nifurtimox (Nf) e o

benznidazol (Bz). Ambos foram introduzidos na clnica nas dcadas de 60-70 do

sculo passado, sendo que o primeiro teve sua produo descontinuada na dcada

de 80, tendo sido recentemente re-introduzido na clnica e distribudo pela

Organizao Mundial de Sade (Urbina e Docampo, 2003; Steverding e Tyler, 2005;

WHO, 2009). Estes compostos (Nf e Bz) so parcialmente efetivos e apresentam

severos efeitos colaterais (Rodrigues Coura e De Castro, 2002; Villa e cols., 2007),

assim como requerem longos perodos de tratamento, levando freqentemente ao

abandono do tratamento (Jannin e Villa, 2007, Soeiro e cols., 2009). H ainda

diferenas expressivas quanto ao perfil de suscetibilidade de diferentes cepas do

parasita a ambos nitroderivados (Filardi e Brener, 1987). O tratamento

recomendado para a fase aguda, crnica recente e em casos de reativao.

Entretanto, ambos apresentam resultados variveis principalmente relacionados

rea endmica, fase da doena e idade dos pacientes (Rodrigues Coura e De

Castro, 2002; Romanha e cols., 2010). Os mecanismos de ao destes compostos

ainda so pouco conhecidos, tendo sido atribudos, pelo menos em parte, ao

estresse oxidativo, pela gerao de radicais livres e/ou metablicos eletroflicos que

se associam a lipdeos, protenas e DNA do parasita (Maya e cols., 2007; Muoz e

cols., 2011).

Em geral, a administrao do nifurtimox (oralmente, trs vezes ao dia) segue

os seguintes esquemas teraputicos: (a) crianas de 0-10 anos: 15-20 mg/kg/dia por

60-90 dias; (b) jovens de 11-16 anos: 12,5-15 mg/kg/dia, por 90 dias; e (c) adultos:

8-10 mg/kg/dia, por 60-90 dias (Wegner e Rohwedder, 1972; Amato Neto, 1999). Os

efeitos colaterais mais freqentes incluem anorexia, dor de cabea, vmitos, perda

de peso, insnia, mialgia, manifestaes cutneas, clicas intestinais, diarria, entre

outros (Rodrigues Coura e De Castro, 2002; Castro e cols., 2006).

Beznidazol administrado durante 60 dias na dose de 5-10 mg/kg/dia

podendo ser estendido por at cinco meses no caso de tratamento de pacientes

imunocomprometidos. Em casos de indivduos que foram infectados acidentalmente

o tratamento pode ser abreviado, utilizando-se esquema profiltico restrito a 10-15

dias (Amato Neto, 1999; Maya e cols., 2007). Os principais efeitos colaterais

relatados so: anorexia, dor de cabea, vmitos, insnia, mialgia, manifestaes

cutneas incluindo dermatites, edemas generalizados, febre, depresso da medula

Introduo

9

ssea, trombocitopenia, e polineuropatias perifricas (Castro e cols., 2006; Maya e

cols., 2007, Viotti e cols., 2009).

Todos os casos congnitos devem ser tratados com Bz ou Nf. A precocidade

do tratamento est relacionado a uma melhor resposta teraputica. Efeitos colaterais

em crianas so menos intensos que em adultos e 98% dos neonatos tratados

resultam em negativao de sorologia e parasitemia (Apt, 2010).

Alm destes frmacos, outros poucos compostos tambm tm sido usados,

de modo restrito, na clnica da DC, incluindo derivados azlicos como o cetoconazol,

e o alopurinol, sendo este ltimo utilizado para reduo da reativao da parasitemia

em pacientes imunossuprimidos, havendo, contudo, controvrsias quanto a sua

aplicao por apresentar apenas efeito tripanosttico transitrio (Stoppani, 1999; de

Alemida e cols., 2009). Com relao ao alopurinol, este no apresentou eficcia na

fase crnica da doena de Chagas (Rassi e cols., 2007).

Outro desafio est relacionado transfuso de sangue em reas endmicas,

pois o nico agente tripanocida atualmente disponvel a violeta de genciana, que

alm de apresentar hepatotoxicidade, resulta em mudana de cor do sangue (cor

purprea), podendo ainda manchar a pele e mucosa dos receptores, sendo motivo

de rejeio (Chiari e cols., 1996; Clayton, 2010b).

Como acima discutido, apesar das 500 mil mortes por ano e do atual

tratamento ainda considerado insatisfatrio, apenas cerca de 1% de todas as drogas

desenvolvidas durante os ltimos 30 anos so voltadas para o tratamento de

doenas tropicais como a DC (Soeiro e De Castro, 2009), o que justifica e demonstra

claramente a necessidade urgente por novas drogas tripanocidas.

Assim, baseado no conhecimento atual da biologia do parasita e do

hospedeiro, um candidato ideal para terapia da DC teria as seguintes caractersticas:

(i) alto nvel de atividade contra as formas evolutivas presentes nos hospedeiros

mamferos e contra diferentes cepas do parasita incluindo aquelas naturalmente

resistentes a nitroderivados com Bz e Nf; (ii) eficcia nas fases aguda e crnica

(recente e tardia); (iii) administrao oral em poucos doses; (iv) baixa toxicidade e

segurana (incluindo formulaes para crianas e mulheres em idade de

reprodutiva); (v) baixo custo e alta estabilidade para temperaturas tropicais e (vi)

altos nveis de acumulao em diferentes tecidos alm de meia vida longa (Nwaka &

Hudson, 2006; Soeiro e cols., 2009; Soeiro e De Castro, 2009, Buckner e Navabi,

2010).

Introduo

10

1.6. Diamidinas e anlogos

Compostos dicatinicos aromticos, como a pentamidina (Pt) e o berenil tm

sido utilizaoas por mais de 60 anos para o tratamento da tripanossomase africana

(infeces humanas e de outros animais), sendo ainda a Pt usada para terapia de

leishmaniose cutnea e visceral em casos de resistncia a agentes antimoniais

(Blum e cols., 1994, Werbovetz, 2006). Desde ento, a ao destes compostos tem

sido investigada sobre diversos parasitos (Soeiro e cols., 2005). De fato, diamidinas

aromticas (DA) exibem alta atividade contra diferentes classes de patgenos tais

como bactrias, fungos e protozorios (Werbovetz, 2006; Wilson e cols., 2008).

Diamidinas aromticas representam uma classe de ligantes de DNA com forte

especificidade para fenda menor do DNA, em regies ricas em bases A-T (Wilson e

cols., 2008). Embora o exato mecanismo de ao no seja completamente

elucidado, ensaios termodinmicos sugerem que estes agentes sejam capazes de

induzir alteraes na organizao e topologia do DNA, resultando na

desestruturao e mesmo fragmentao desta molcula (Tidwell e Boykin, 2003;

Wilson e cols., 2008). Estes compostos aromticos heterocclicos podem ainda se

associar a regies ricas em sequncias GC, porm essa ligao menos freqente

e de menor intensidade em decorrncia da menor eletronegatividade destas regies

ricas em sequncias CG. Alternativamente, diamidinas e anlogos podem interferir

(inibio estrica) no reconhecimento e mesmo interao de

enzima/fatores/protenas ao DNA e/ou podem ainda inibir diretamente na

transcrio, ativando vias de morte celular, incluindo morte celular programadas do

tipo I (apoptose) (De Souza e cols., 2006a; Soeiro e De Castro, 2009). Outros

mecanismos de ao que tm tambm sido propostos incluem: inibio de

proteases, polimerases, protena cinase A, inibio de sntese de fosfolipdios e

distrbios no metabolismo de poliaminas (Soeiro e cols., 2005; Werbovetz, 2006).

Apesar da atividade antimicrobiana, as diamidinas hoje disponveis na clnica

mdica e veterinria apresentam freqentemente considervel toxicidade, como

cardiotoxicidade, nefrotoxicidade e complicaes pancreticas, e a sua

biodisponibilidade oral limitada, que se deve ao carter cationico destes

compostos (Werbovetz, 2006).

Em tripanosomatideos, dados sugerem fortemente que o kDNA possa ser um

dos alvos primrios de diamidinas e anlogos. Estudos tm revelado que embora

alguns destes compostos aromticos, com fluorescncia intrnsica (ex. DB75 ou

furamidina), se acumulem no ncleo (DNA) e mitocondria (kDNA) de T.brucei

Introduo

11

(Mathis e cols., 2006, 2007) e T.cruzi (De Souza e cols., 2004, Batista e cols.,

2010), sendo predominantemente localizados e acumulados na ltima estrutura, no

h correlao entre eficcia de DA e preferencial localizao e distribuio no kDNA

(Mathis e cols., 2007, Daliry e cols., 2009). Estudos ultra-estruturais e biofsicos tem

revelado danos seletivos ao complexo mitocondria-cinetoplasto atribudos ao

potencial de associao destes agentes dicatinicos ao kDNA, em especial, devido

a seu rico contedo de adenina e timina (Soeiro e cols., 2005; Werbovetz, 2006;

Soeiro e De Castro, 2009), representando um importante alvo na ao tripanocida, e,

assim, correlaao com sua atividade biolgica (Ismail e cols., 2006; Mathis e cols.,

2007).

Buscando superar e ultrapassar as limitaes farmacolgicas das DA

atualmente disponveis na clnica mdica, novos anlogos tem sido sintetizados. A

DB75 (furamidina), um anlogo da pentamidina, apresentou excelente atividade in

vitro contra modelos experimentais de infeces por T.brucei, Pneumocystis jiroveci

e Plasmodium sp. (Soeiro e cols., 2005). Contudo, a DB75 apresenta uma

considervel toxicidade. Assim, com o intuito de manter a sua atividade e diminuir a

toxicidade foi sintetizado uma prodroga, oralmente efetiva, a DB 289 (2,5-bis[4-(N-

metoxiamidino) que esteve em Fase III de ensaios clnicos para o tratamento da

tripanossomase africana. Apesar de indcios iniciais de baixa toxicidade em

populaes africanas, asiticas, caucasianas e hispnicas (Soeiro e cols., 2008),

resultados posteriores revelaram sua hepatotoxicidade que resultou na retirada da

DB289 da triagem clnica.

Enquanto estes agentes dicatinicos tem sido muito estudados principalmente

contra tripanosomas africanos, pouco foi analisado como candidatos contra o T.

cruzi (Wilson e cols., 2008). Nos ltimos anos, nosso laboratrio tem estudado a

atividade destes compostos sobre a infeco por este parasito em ensaios in vitro e

in vivo. Diamidinas como furamidina (DB75), e seu anlogo que apresenta uma

substituio da amidina terminal por um grupo fenila (DB569), como tambm

arilimidamidas tem se revelado promissores agentes anti-T.cruzi (De Souza e cols,

2004, 2006a, 2007, 2010, Silva e cols., 2007a,b; Pacheco e cols., 2009; Batista e

cols., 2010). Alguns destes candidatos exibem considerveis janelas teraputicas

(ndices de seletividade 50), com ndices de seletividade superiores as drogas de

referencia para DC (De Souza e cols., 2004, 2006a, b, 2007, Silva e cols., 2007a, b).

Como resultado da colaborao com o Drs. D. Boykin (Universidade do Estado da

Gergia, E.U.A.) e R. Tidwell (Universidade de Carolina do Norte, E.U.A.), nosso

Introduo

12

grupo tem investigado um grande numero de compostos aromticos dicatinicos

heterocclicos visando uma possvel descoberta de uma droga anti-parasitria.

Dados do nosso grupo, com o composto furamidina (DB75) e seu anlogo

DB569 revelaram uma considervel atividade in vitro de ambas DA contra diferentes

cepas e fases evolutivas do parasita, exibindo valores inibitrios na faixa micromolar.

Parmetros fsico-qumicos da DB569, como sua superior lipofilicidade em relao a

droga parental, permitem sua melhor difuso pelas membranas das clulas do

hospedeiro como tambm pelas membranas dos parasitas, facilitando o contato e

captao do composto pelos patogenos intracelulares, explicando assim, a superior

atividade anti-parasitria da DB569 comparada com a DB75, quando testadas contra

o T. cruzi e T. brucei (De Souza e cols., 2004; Mathis e cols., 2006). Como acima

relatado, devido caracterstica de fluorescncia de ambos compostos, foi possvel

localiz-los em organelas ricas em DNA como ncleo e mitocondria (KDNA) (De

Souza e cols., 2004, Soeiro e cols., 2005). Anlises por citometria de fluxo e

microscopia eletrnica de transmisso (MET) tambm demonstraram que ambas as

drogas tem como alvo a mitocndria e o ncleo do parasita e que conduzem a

mudanas morfolgicas apresentando caractersticas de morte celular programada

do tipo I (De Souza e cols., 2004, 2006b). Estes dados estimularam a anlise in vivo

com DB569 mostrando a reduo da carga parasitria e tambm diminuio da

expresso de clulas T CD8+ nos tecidos cardacos (De Souza e cols., 2006a,

2007). DB569 tambm reverteu alteraes eletrocardiogrficas (ECG) em

camundongos infectados e tratados, e conferiu um aumento na sobrevida deste

grupo quando comparados com os animais no tratados (De Souza e cols., 2007).

No curso da infeco crnica experimental, a DB569 tambm conferiu proteo

contra alteraes eltricas induzidas pela infeco e evidenciadas por ECG,

sugerindo a manuteno de um perfil de ECG normal em parte, devido a reduo do

nmero de infiltrados linfocitrios, em especial de clulas T CD8+ assim como pela

diminuio do parasitismo cardaco nos animais tratados com esta DA (De Souza e

cols., 2006a, 2007).

Em um recente estudo, foi avaliado o efeito ultraestrutural, biolgico e a

localizao subcelular de seis derivados da DB75 contra o T. cruzi in vitro (Batista e

cols., 2010b). Os dados demonstraram a baixa toxicidade destes compostos sobre

clulas de mamferos (LC50> 96 M). Com relao a atividade tripanocida,

observou-se que com a exceo das molculas lineares e de tamanho menor que a

DB75 (ex. DB1627, DB1646 e DB1670), que no foram efetivas, os demais

Introduo

13

derivados (molculas curvas e de tamanho semelhante, e/ou superior e/ou menores

que a DB75) mostraram uma alta atividade contra ambas as formas evolutivas

pertinentes ao hospedeiro (formas sanguneas e intracelulares), com valores de IC50

de 0.15-13.3 M (Batista e cols., 2010b).

Vrios transportadores para diamidinas tm sido estudados no tripanosoma

africano, e em espcies de Leishmania e Plasmodium (Carter e cols., 1995, Barret e

cols., 2003, Bray e cols., 2003). No entanto, os mecanismos envolvidos na

internalizao de diamidinas pelo T. cruzi ainda no so ainda conhecidos. Como j

nos referimos, as caractersticas fluorescentes de alguns destes compostos permite

seguir a distribuio no parasita, como foi realizado previamente em tripanosoma

africano (Mathis e cols., 2006, 2007, Wilson e cols., 2008). Nossos resultados

(Batista e cols., 2010b) em T.cruzi revelaram que a semelhana de T.brucei, estes

seis derivados da DB75 acima descritos se localizam no ncleo e kDNA (com uma

maior intensidade na ltima estrutura) do parasita, sendo que dois deles (DB1582 e

DB1651) foram tambm localizados em organelas citoplasmticas desprovidas de

DNA. Estas organelas foram localizadas preferencialmente na poro anterior do

tripomastigota sanguneo e prximas do ncleo e regies de cinetoplasto em

amastigotas, logo, sugerindo que sejam acidocalcisomas como observados

previamente em Trypanosoma brucei (Mathis e cols., 2006). Como sugerido para

tripanosomas africanos, a localizao destes compostos nestes compartimentos

cidos pode representar um alvo de ao, assim como locais de armazenamento e

estoque dos compostos (Mathis e cols., 2006, 2007).

Outras observaes feitas pelo nosso grupo, revelaram a ao de outras DA

na desorganizao de microtbulos conduzindo formao de axonemas mltiplos

em formas sangneas tratadas (Silva e cols., 2007a, Batista e cols., 2010a). Como

esta estrutura em tripanosomatideos muito resistente, quando comparado com as

estruturas de microtbulos de clulas de mamfero, pode representar um alvo

interessante para desenvolvimento de novas drogas anti-T.cruzi.

Foi sugerido que a natureza dicatinica de DA como a pentamidina permite

seu acmulo na mitocndria de cinetoplastideos podendo levar ao colapso do

potencial da membrana interna mitocondrial, resultando assim na permeabilizao

desta organela, deflagrando a morte dos parasitos (Soeiro e cols., 2005; Werbovetz,

2006, Tidwell e Boykin 2003; Nguyen e cols., 2004; Soeiro e cols., 2008). Recentes

relatos sugerem que a associao das diamidinas com o DNA seja um passo inicial

e que seguido por mudanas morfolgicas que conduzem a instabilidade da

Introduo

14

molcula e modificao e/ou destruio das interaes do DNA com a protena; isto,

levando a erros de replicao, degradao do DNA e morte do parasita (Singh e Dey

2007, Wilson e cols., 2008). Como j discutido, recentes resultados inditos de

nosso grupo com onze novos compostos dicatinicos heterocclicos tambm

derivados da DB75 mostram que embora estas drogas se localizem no T. cruzi em

maior intensidade no cinetoplasto que no ncleo dos parasitos, nenhuma correlao

pode ser identificada entre acmulo no kDNA e atividade (Daliry e cols., 2009). Estes

resultados so consistentes com dados prvios de T. brucei (Mathis e cols., 2006).

Arilimidamidas (AIA), previamente conhecidas como amidinas reversas,

apresentam extraordinria ao contra Leishmania (Stephens e cols., 2003, Rosypal

e cols., 2007, 2008) e T. cruzi (Silva e cols., 2007a, b, Pacheco e cols., 2009). AIAs

diferem de outros anlogos por apresentar a amidina ligada diretamente ao

nitrognio do grupo anilino, contrastando com a amidina original, na qual o grupo

imino est diretamente ligado a um anel arila (Stephens e cols., 2001, 2003; Rosypal

e cols., 2008). Dados da literatura demonstram a atividade de AIAs, em

promastigotas e amastigotas de Leishmania major e Leishmania tropica (Rosypal e

cols., 2008). Os autores demonstraram que a maioria dos compostos (9 de 10)

exibiram uma atividade de 250 a 4.5 vezes superior que a pentamidina (Rosypal et

al. 2008). De acordo, dados in vitro sobre o T. cruzi tambm demonstraram a alta

atividade dose-dependente (IC50 com valores micromolares), sendo tambm superior

a anlogos de DA contendo grupamentos diguanidino (Silva e cols., 2007a). Dados

de MET e citometria de fluxo, tambm mostraram alteraes na mitocndria em

parasitas tratados com AIAs (Silva e cols., 2007b).

Em outro recente estudo verificamos o efeito tripanocida de vrios compostos

heterociclicos catinicos incluindo diamidinas, um monoamidina, uma arilimidamida e

uma guanil-hidrazona. Estes anlogos mostraram atividade em baixas

concentraes sobre parasitas intracelulares e tripomastigotas sangneos de

T.cruzi (Pacheco e cols., 2009). Porm, a potncia e seletividade de uma delas, a

AIA DB613A, confirmou resultados anteriores que demonstram a superior eficcia de

AIAs em relao a outras DA contra este parasita.

Com uma AIA, a DB766, ensaios a 37C in vitro sobre a cepa Y do T. cruzi,

alcanou valores de IC50 de 60 e 25 nanomolar sobre tripomastigotas e amastigotas,

aps incubao por 24 e 72 horas, respectivamente. A atividade desta AIA foi

evidente mesmo a 4C na presena de sangue (96 e 50%). Vale ressaltar a DB766

foi efetiva contra todas as cepas de T.cruzi testadas (12 isoladas de ciclos

Introduo

15

peridomiciliares, silvestres e domsticos, incluindo as cepas YuYu e Colombiana

consideradas resistentes aos nitroderivados Bz e Nf), sempre com superior eficcia

que o Bz (Batista e cols., 2010a).

As anlises in vivo, mostram que a administrao da DB766 reduziu a

parasitemia e o parasitismo cardaco, apresentando atividade sobre a cepa Y e

Colombiana maior ou igual que o BZ, e resultando (dependendo do esquema de

tratamento doses de at 50 mg/kg/dia, por 10 dias consecutivos, iniciando-se

tratamento no incio da parasitemia e somente avaliando animais positivos) em

100% de sobrevida. Entretanto, apesar dos excelentes resultados, o tratamento com

DB766 (intraperitoneal - ip e via oral - p.o.) por at 10 dias no resultou em

significativa cura parasitolgica, avaliada pelo hemocultivo e PCR, que tambm no

foi observado no tratamento com a droga de referncia (Batista e cols., 2011a).

O uso combinado de compostos representa uma interessante abordagem

teraputica. A combinao de Bz (oral) e DB766 (ip) resultou em parasitemia no

detectvel, sobrevida de 100% e recuperao de caquexia. Em relao anlise de

cura parasitolgica avaliada por hemocultivo e PCR, observamos que embora em

nenhum dos protocolos utilizados houvesse cura parasitolgica com o Bz (at 20

dias de tratamento), a terapia combinada de DB766+Bz resultou na cura de 2

animais dos quinze sobreviventes (13%). Este tratamento combinado resultou em

redues superiores a 99.5% na parasitemia e parasitismo cardaco dos animais, e

de 60 e 90% nos nveis de marcadores de leses teciduais (heptico e cardaco,

respectivamente). Verificou-se que um dos trs animais sobreviventes tratados com

DB766 (50 mg/kg/dia, p.o.) revelou-se curado pelos parmetros de hemocultivo e

PCR (Batista e cols., 2011b)

Estes dados estimulam a continuidade de estudos com esta nova classe de

compostos (AIA) isoladamente ou associada a outros frmacos licenciados, como os

medicamentos de referncia NF e Bz, objetivando a identificao de novos

candidatos para o tratamento da doena de Chagas.

Objetivos

16

Objetivos

Objetivos

17

Objetivo Geral

A presente tese tem como proposta avaliar atravs de estudos in vitro e in

vivo a atividade biolgica de diamidinas aromticas, e anlogos como

arilimidamidas, sobre o Trypanosoma cruzi. Neste contexto, os seguintes

objetivos especficos foram contemplados:

Objetivos especficos

Objetivo especfico 1: Avaliar a atividade tripanocida in vitro de

diamidinas aromticas e arilimidamidas contra formas tripomastigotas

sanguneas, amastigotas intracelulares e epimastigotas de diferentes cepas do

T. cruzi, comparando-as com a ao das drogas de referncias (benznidazol e

violeta de genciana).

Objetivo especfico 2: Determinar o limiar de toxicidade in vitro das

diamidinas aromticas e arilimidamidas sobre clulas de mamferos (cultivo

primrio de clulas cardacas).

Objetivo especfico 3: Identificar por ensaios de microscopia de

fluorescncia, microscopia eletrnica de transmisso e citometria de fluxo, a

localizao e distribuio intracelular dos compostos e seus alvos celulares em

formas tripomastigotas sanguneas e intracelulares do T. cruzi frente ao

tratamento in vitro.

Objetivo especfico 4: Com base na determinao dos valores de IC50 e

LC50, estabelecer os ndices de seletividade (IS) dos compostos visando

selecionar os mais ativos para conduo de estudos in vivo.

Objetivo especfico 5: Investigar in vivo a toxicidade aguda e eficcia de

diamidinas aromticas (DB1362) e arilimidamidas (DB1965) sobre diferentes

modelos experimentais de infeco aguda pelo T. cruzi.

Objetivos

18

Objetivo especfico 6: Verificar o efeito in vivo do co-tratamento da

arilimidamida DB1965 associada ao Benznidazol durante a infeco

experimental aguda de camundongos pelo T. cruzi.

Resultados

19

RESULTADOS

Resultados

20

Artigo#01: Publicado na Antimicrobial Agents and Chemotherapy, em 2008

Ttulo: In vitro and in vivo studies of the trypanocidal activity of a

Diarylthiophene dimidine against Trypanosoma cruzi

Estado do conhecimento quando da concepo do trabalho:

A doena de Chagas uma doena tropical negligenciada, mas que apesar

de sua importncia epidemiolgica, ainda no apresenta terapia ideal

justificando a busca por novos agentes quimioterpicos.

Diamidinas aromticas utilizadas na clnica mdica (ex. pentamidina), apesar

de excelente atividade biolgica, apresentam efeitos colaterais indesejveis

alm de baixa biodisponibilidade oral, estimulando vrios grupos de qumica

medicinal a sintetizar anlogos que mantenham sua excelente ao, mas que

apresentem menor toxicidade e que possam ser administrados via oral.

Questes propostas:

1. Investigar atravs de ensaios in vitro, a atividade antiparasitria, toxicidade,

seletividade e alvos celulares da diamidina DB1362 sobre tripomastigotas de

sangue e forma intracelular de Trypanosoma cruzi

2. Correlacionar atividade tripanocida in vivo da DB1362 com a droga de

referncia, o benznidazol, atravs do uso de modelos experimentais de

infeco aguda pelo T.cruzi.

Seguem 8 pginas

ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Sept. 2008, p. 33073314 Vol. 52, No. 90066-4804/08/$08.000 doi:10.1128/AAC.00038-08Copyright 2008, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.

In Vitro and In Vivo Studies of the Trypanocidal Activity of aDiarylthiophene Diamidine against Trypanosoma cruzi

Cristiane Franca da Silva,1 Marcos Meuser Batista,1 Denise da Gama Jaen Batista,1 Elen Mello de Souza,1Patrcia Bernardino da Silva,1 Gabriel Melo de Oliveira,1 Andrea Souza Meuser,1 Abdur-Rafay Shareef,2

David W. Boykin,2 and Maria de Nazare C. Soeiro1*Lab. Biologia Celular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil,1 and

Department of Chemistry, Georgia State University, Atlanta, Georgia2

Received 9 January 2008/Returned for modification 22 February 2008/Accepted 24 June 2008

Aromatic diamidines are DNA minor groove-binding ligands that display excellent antimicrobial activityagainst fungi, bacteria, and protozoa. Due to the currently unsatisfactory chemotherapy for Chagas diseaseand in view of our previous reports regarding the effect of diamidines and analogues against both in vitro andin vivo Trypanosoma cruzi infection, this study evaluated the effects of a diarylthiophene diamidine (DB1362)against both amastigotes and bloodstream trypomastigotes of T. cruzi, the etiological agent of Chagas disease.The data show the potent in vitro activity of DB1362 against both parasite forms that are relevant formammalian infection at doses which do not exhibit cytotoxicity. Ultrastructural analysis and flow cytometrystudies show striking alterations in the nuclei and mitochondria of the bloodstream parasites. In vivo studieswere performed at two different drug concentrations (25 and 50 mg/kg/day) using a 2-day or a 10-day regimen.The best results were obtained when acutely infected mice were treated with two doses at the lower concen-tration, resulting in 100% survival, compared to the infected and untreated mice. Although it did not displayhigher efficacy than benznidazole, DB1362 reduced both cardiac parasitism and inflammation, and in addition,it protected against the cardiac alterations (determined by measurements) common in T. cruzi infection. Theseresults support further investigation of diamidines and related compounds as potential agents against Chagasdisease.

Aromatic diamidines, such as pentamidine, have been stud-ied since the 1930s, when significant activity against Africantrypanosomes was reported (25). Since then, several studieshave demonstrated their excellent activity against differentpathogens, such as bacteria, fungi and protozoa, which hasbeen attributed, in part, to the association of the dicationicmolecules to the DNA minor groove at AT-rich sites (28).Although recent data obtained with African trypanosomesshow that neither the DNA affinity nor the distribution in theparasite can be directly related to diamidine (and analogue)activity (16, 17), the concentration of diamidines in parasitemitochondria (kinetoplast) appears to represent a pivotal stepin their antitrypanosomal action, and thus the diamidine-kin-etoplast DNA interaction seems to be an important part oftheir biological activity (13, 17). Chagas disease, caused by theprotozoan Trypanosoma cruzi, is a neglected disease that af-fects 12 to 14 million people in areas of endemicity in LatinAmerica, where approximately 100 million people are at risk(19). The disease is a major public health problem in theaffected areas. The infection triggers an important cardiomy-opathy, for which the pathophysiological mechanisms are notcompletely understood (20, 27). Current chemotherapy is

based largely on nifurtimox and benznidazole (Bz), which areonly partially effective and have considerable side effects (21,29), and this clearly demonstrates the urgent need for newdrugs.

Despite their well-known antimicrobial activity, diamidinesoften exhibit high toxicity, such as cardiotoxicity, nephrotoxic-ity, and pancreatic complications, and display poor oral bio-availability, which is likely due to their cationic character (30).To overcome these limitations, new aromatic dications andtheir prodrugs have been synthesized and screened both invitro and in vivo against different pathogens (2, 26). Recentstudies have shown good in vitro and in vivo activity for di-amidines such as furamidine (DB75), its N-phenyl-substitutedanalogue (DB569), and reversed amidines (5, 7, 8, 23, 24)against T. cruzi. The trypanocidal effect of these dications ledto the evaluation of in vitro and in vivo antiparasitic activity ofthe diarylthiophene diamidine DB1362 against T. cruzi.

MATERIALS AND METHODS

The synthesis of 3-bromo-4-methyl-2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene dihy-drochloride (DB1362) is described in the supplemental material.

Drug solutions. Stock solutions (5 mM) of DB1362 (Fig. 1) were prepared indimethyl sulfoxide, with the final concentration of the latter in the experimentsnever exceeding 0.6%, which did not exhibit any toxicity for the parasite ormammalian host cells (data not shown).

Cell cultures. For both drug toxicity and infection assays, primary cultures ofperitoneal mouse macrophages were obtained as described previously (1),seeded at a density of 5 104 cells/well into 96-well culture plates or at 3 105

cells/well into 24-well culture plates, respectively, and sustained in Dulbeccosmodified medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 4 mM L-glutamine (DMES). All the cell cultures were maintained at 37C in an atmo-

* Corresponding author. Mailing address: Lab. Biologia Celular, Insti-tuto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Avenida Brasil 4365, Manguinhos,21045-900, Rio de Janeiro, RJ, Brazil. Phone: (55-21) 25984534. Fax:(55-21) 25984577. E-mail: soeiro@ioc.fiocruz.br.

Supplemental material for this article may be found at http://aac.asm.org/.

Published ahead of print on 14 July 2008.

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sphere of 5% CO2 and air, and the assays were run three times at least induplicate.

Parasites. The Y strain of T. cruzi was used throughout the experiments. Cellculture-derived trypomastigotes were isolated from the supernatant of Verolineage cells (from green monkey kidney) which had been previously infectedwith bloodstream trypomastigotes (5). Bloodstream forms were harvested byheart puncture from T. cruzi-infected Swiss mice at the parasitemia peak day (4).

Toxicity for mammalian cell cultures. Uninfected peritoneal macrophageswere incubated for 24 to 48 h at 37C in the absence of DB1362 or the presenceof increasing doses (10.6 to 96 M) of DB1362, their viability was evaluated bylight microscopy using the trypan blue exclusion assay (23), and the 50% lethaldose (drug concentration that reduces the number of viable cells 50%) wascalculated.

Trypanocidal analysis. Bloodstream trypomastigotes were incubated at 37Cfor 24 h in the presence of increasing doses (0 to 32 M) of DB1362 diluted inDMES (24). Alternatively, bloodstream parasites were incubated for 24 h at 4Cwith DB1362 diluted in whole blood collected from T. cruzi-infected mice (23).After drug incubation, the death rates were determined by using light microscopyfor direct quantification of the number of live parasites using a Neubauer cham-ber, and the 50% inhibitory concentration (IC50) (drug concentration that re-duces the number of treated parasites 50%) was calculated (24). For the analysisof the effect on intracellular amastigotes, after initial host cell-parasite contact(24 h) with cell culture-derived trypomastigotes, the macrophages were washedto remove free parasites and treated at 37C for 24 and 48 h with DB1362 (0.39to 10.6 M). Infected cultures not subjected to the drug treatment were used ascontrols. All cell cultures were maintained at 37C in an atmosphere of 5% CO2and air, and culture medium was replaced every 24 h. After the drug exposure,the untreated and treated infected cultures were fixed and stained with Giemsasolution and the mean numbers of infected host cells and of parasites perinfected cell were then scored as reported previously (23). Only characteristicparasite nuclei and kinetoplasts were counted as surviving parasites, since irreg-ular structures could indicate parasites undergoing death. The drug activity wasestimated by calculating the endocytic index (percentage of infected cells timesthe average number of intracellular amastigotes per infected host cell) (23).

Flow cytometry analysis. Bloodstream trypomastigotes (2 106 cells/ml) werebriefly washed in phosphate-buffered saline (PBS) and treated for 24 h at 37Cwith the respective IC50 (previously determined) of the compound diluted indimethyl sulfoxide. After treatment, the parasite suspension was incubated for 15min at 37C with 10 g/ml rhodamine 123 (Rh123) (24). Data acquisition andanalysis were performed with a FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson,San Jose, CA) equipped with Cell Quest software (Joseph Trotter, ScrippsResearch Institute, San Diego, CA). A total of 10,000 events were acquired in theregion established as that corresponding to bloodstream trypomastigotes, andthe alterations in the Rh123 fluorescence were quantified by calculating themean percentages of treated and untreated parasite populations that displayeddepolarization of the mitochondrial membrane (designated M2). All assays wererun three times at least in duplicate.

TEM analysis. Bloodstream trypomastigotes and uninfected host cells treatedfor 24 h at 37C with the corresponding IC50 of the drug or left untreated werefixed for 60 min at 4C with 2.5% glutaraldehyde and 2.5 mM CaCl2 in 0.1 Mcacodylate buffer, pH 7.2, and postfixed for 1 h at 4C with 1% OsO4, 0.8%potassium ferricyanide, and 2.5 mM CaCl2 using the same buffer. Samples wereroutinely processed for transmission electron microscopy (TEM) and examinedin a Zeiss EM10C electron microscope (Oberkochen, Germany) (5).

In vivo infection. Male Swiss mice were obtained from the Fundacao OswaldoCruz (FIOCRUZ) animal facilities (Rio de Janeiro, Brazil). Mice were housedat a maximum of eight per cage and kept in a conventional room at 20 to 24Cwith a 12/12-h light/dark cycle. The animals were provided with sterilized waterand chow ad libitum. Infection was performed by intraperitoneal (i.p.) injectionof 104 bloodstream trypomastigotes. The animals (28 to 33 g) were divided intothe following groups: uninfected (not infected and not treated); untreated (in-

fected with T. cruzi but not treated); and treated (infected and treated with 25and 50 mg of DB1362 per kg of body weight per day or with 100 mg/kg/day Bz).For DB1362 treatment, mice received a 0.1-ml i.p. injection at 5 and 8 dayspostinfection (dpi) or starting at 3 dpi for 10 consecutive days as describedpreviously (7). For Bz treatment, infected mice received a 0.2-ml oral dose(gavage) according to the therapeutic schemes described above. At least eightmice from each group were used for analysis in each of two or three independentexperiments that were performed.

Parasitemia, mortality rates, and ponderal curve analysis. Parasitemia wasindividually checked by direct microscopic counting of parasites in 5 l of blood,as described before (7). At 7, 14, and 21 dpi, body weight was evaluated, andmortality was checked daily until 60 dpi and expressed as a percentage ofcumulative mortality (8).

ECG. Electrocardiography (ECG) recording and analysis were performed inuninfected mice and in acutely T. cruzi-infected mice (14 dpi) receiving DB1362and Bz therapy or not treated, as previously described (8). Briefly, mice wereplaced under stable sedation with diazepam (20 mg/kg, i.p.) and fixed in thesupine position, and an eight-lead ECG was recorded from 18-gauge needleelectrodes subcutaneously implanted in each limb and two electrodes at precor-dial position lead II. The electrocardiographic tracings were obtained with astandard lead (dipolar lead DII), recording with an amplitude set to give 2 mV/s.The ECG was recorded by using band-pass filtering (Bio Amp; AD Instruments,Hastings, United Kingdom) between 0.1 and 100 Hz. Supplementary ampli-fication and analog-digital conversion was performed with a Powerlab 16Sinstrument (AD Instruments). Digital recordings (16 bit, 4 kHz/channel) wereanalyzed with the Scope (version 3.6.10) program (AD Instruments). Thesignal-averaged ECG was calculated by using the mouse signal-averaged ECGextension (version 1.2) program (AD Instruments) and a template-matchingalgorithm. ECG parameters were evaluated using the following standard criteria:(i) the heart rate (beats/minute) was monitored, and (ii) the variation at P waveand the PQ, QRS, and QT intervals were measured in milliseconds.

Histopathological analysis. At 14 dpi, hearts were removed, cut longitudinally,rinsed in ice-cold PBS, and fixed in Millonig-Rosman solution (10% formalde-hyde in PBS). The tissues were dehydrated and embedded in paraffin. Sections(3 m) were stained with hematoxylin-eosin and were analyzed by light micros-copy. The number of amastigote nests and of inflammatory infiltrates (more than10 mononuclear cells) was determined in at least 30 fields (total magnification,40) for each slide. The mean number of amastigote nests or inflammatoryinfiltrates per field was obtained from at least three mice per group with threesections from each mouse.

Statistical analysis. Statistical analysis was carried out using an analysis ofvariance program with the level of significance set at a P value of 0.05. The dataare representative of two to four experiments run in duplicate.

All procedures were carried out in accordance with the guidelines establishedby the FIOCRUZ Committee of Ethics for the Use of Animals (CEUA 0099/01).

RESULTS

Treatment of bloodstream parasites with DB1362 for 24 h at4C in the presence of blood constituents resulted in an IC50 of7.07 M (Fig. 2A). Although treatment performed at 37Cshowed an IC50 of 6.6 M, about 90% of parasites died withthe dose of 32 M (Fig. 2B), while only 60% was with the samedose when mouse blood constituents were added (Fig. 2A).TEM studies showed that in untreated parasites typical or-ganelles, such as nuclei and mitochondria, could be easily iden-tified (Fig. 2C, inset). However, diamidine treatment inducedprofound alterations in the kinetoplast organization (Fig. 2D)and in the nucleus (Fig. 2D, inset). Due to the ultrastructuralfindings showing striking changes in the mitochondria, Rh123was further used as a probe of the mitochondrial membranepotential (MMP) (4). Incubation of bloodstream trypomastig-otes with the DB1362 caused an increase (P 0.06) in thenumber of parasites that displayed interference in the protonelectrochemical potential gradient of the mitochondrial mem-brane (Fig. 2F). Treatment reduced the MMP in 57% of thebloodstream forms exposed to DB1362 (Fig. 2F), in contrast towhat occurred in the untreated group, which displayed a 14%

FIG. 1. Chemical structure of DB1362.

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reduction (Fig. 2E). The latter value corresponds to the per-centage of bloodstream parasites that displayed apoptosis-likecharacteristics before drug incubation (4, 15).

Treatment with DB1362 resulted in considerable loss of

mammalian cell viability only when the cultures were incu-bated with 32 M or higher doses, showing 50% lethal doses of22.8 (Fig. 3A) and 20 (data not shown) M after 24 and 48 hof incubation, respectively. TEM analysis performed in the

FIG. 2. Effect of DB1362 on bloodstream trypomastigotes of T. cruzi (Y strain) in vitro. Activity was evaluated during treatment at 4C withthe drug diluted in whole mouse blood (A) and at 37C with the drug diluted in culture medium (B). The percentage of dead parasites was measuredafter 24 h of treatment. Asterisks indicate significant differences for DB1362-treated parasites in relation to the untreated samples (P 0.05). (Cto F) Transmission electron micrographs (C and D) and flow cytometry analysis (E and F) of trypomastigotes exposed to DB1362 for 24 h.Untreated parasites display typical mitochondria (C, inset) and nuclei (C), while DB1362-treated parasites show swelling mitochondria anddamaged kinetoplasts (D) and alterations in nuclear morphology (D, inset). Bars 2 m (C and D) and 10 m (insets). (E and F) Histogramsshowing results of a representative assay, displaying fluorescence intensities of untreated (E) and diamidine-treated parasites (F) after incubationwith Rh123. M1, high-fluorescence-intensity peaks; M2, low-fluorescence-intensity peaks, which represent decreased MMP. k, kinetoplast; n,nucleus.

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DB1362-treated mammalian cells did not reveal ultrastruc-tural damage in either nuclei or mitochondria of the hostcells (Fig. 3B).

Incubation of infected cultures with selected nontoxic doses(up to 10.6 M) of DB1362 significantly reduced both thepercentage of infected cells and the mean number of parasitesper infected cells (Fig. 3C and E to F). The endocytic index(Fig. 3C) showed IC50s of 10.6 M and 0.62 M after 24 and48 h of treatment, respectively.

In vivo studies were performed using different drug concen-trations and treatment schemes (doses up to 50 mg/kg/day, i.p.route) at doses which did not induce mortality in the controlgroup (data not shown). The infected and untreated grouppresented high parasitemia levels, peaking at 8 dpi (Fig. 4A

and B) and displayed 40 to 50% mortality at 60 dpi (Fig. 4C).As expected, T. cruzi infection caused loss of body weight (P 0.014) compared to uninfected animals (Fig. 4D). When a25-mg/kg/day dose of DB1362 was administered twice (at 5 dpiand 8 dpi), 100% survival was observed. However, only a 40%reduction (P 0.1) in the bloodstream parasitemia levelscompared to controls was noted. Furthermore, only a moder-ate improvement in the ponderal curve was observed (Fig. 4Ato D). Administration of 50 mg/kg/day, following the protocoldescribed above, resulted in a slight increase in both para-sitemia peak levels (P 0.15) and cumulative mortalitycompared to infected and untreated animals (Fig. 4A to D).The oral administration (gavage) of 100 mg/kg/day Bz (ref-erence drug) at 5 and 8 dpi reduced both the parasitemia

FIG. 3. Cytotoxicity analysis of DB1362 in mammalian host cells (A and B) and diamidine activity against T. cruzi-infected peritonealmacrophages after 24 (C) and 48 (C to F) h of treatment. The effect of DB1362 on mammalian host cells was evaluated by both trypan blueexclusion assays (A) and TEM (B). Loss of cellular viability was noticed only when the cultures were incubated with 32 M or higher doses (A).Ultrastructural analysis shows characteristic nuclei and mitochondria of the mammalian cell after exposure to the diamidine (B). N, nuclei; M,mitochondria. Bar 10 M. (C to F) DB1362 activity against intracellular amastigotes in T. cruzi-infected host cells. The activity of DB1362 after24 and 48 h of drug incubation is shown by the inhibition of the endocytic index (EI) (C). Asterisks indicate significant differences betweentreated-T. cruzi-infected peritoneal macrophages and untreated cultures (P 0.05). (D to F) Light microscopy of untreated (D) and T.cruzi-infected (E and F) host cells exposed to 0.39 M (E) and 1.18 M (F) DB1362 for 48 h. Arrows indicate intracellular parasites. Bars 1 m.

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FIG. 4. Parasitemia levels (A and E), parasitemia peak at 8 dpi (B and F), mortality rates (C), and mean weights at 21 dpi (D) of mice infected withthe Y strain of T. cruzi and treated with DB1362 or Bz at 5 and 8 dpi (A to D) and 3 to 12 dpi (E and F). The single asterisk indicates significant differencesbetween T. cruzi-infected mice and uninfected mice (P 0.05). Double asterisks indicate significant differences between T. cruzi-infected, treated miceand infected, untreated animals (P 0.05).

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peak levels (P 0.002) and mortality rates and led to apartial recovery of body weight compared to the uninfectedgroup (Fig. 4A to D).

Administration of 25 mg/kg/day of DB1362 at 3 dpi for 10

consecutive days did not abolish circulating parasitemia peaklevels (P 0.2), as was observed for the Bz group also treatedfor 10 consecutive days (P 0.0008) (Fig. 4E and F). However,DB1362 significantly decreased cardiac parasitism (P 0.02),

FIG. 5. Parasitism and inflammatory infiltrates in the heart (A) and ECG findings (B and C) for mice infected with T. cruzi and treated withDB1362 or Bz or left untreated. (A) Parasitism and inflammatory infiltration were decreased by diamidine and Bz treatment. (B) Mean cardiacfrequencies were determined by ECG analysis in uninfected, infected but untreated, Bz-treated, and DB1362-treated mice. The single asteriskindicates significant differences between T. cruzi-infected mice and uninfected mice (P 0.05). Double asterisks indicate significant differencesbetween T. cruzi-infected, treated mice and infected, untreated animals (P 0.05). (C) Representative electrocardiographic tracing of uninfected,infected but untreated, Bz-treated, and DB1362-treated mice. Note the normal patterns in uninfected mice and the variations in the heart rate(traced lines) for infected but untreated animals, which were partially recovered in both drug-treated groups.

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reducing by 90% the number of parasite nests at 14 dpi com-pared to untreated animals (Fig. 5A). Histopathological anal-ysis of DB1362-treated animals also showed an important de-crease (P 0.0016) in cardiac inflammatory infiltration,reaching about 70% reduction, compared to nontreated mice(Fig. 5A). Cardiac parasitism and inflammation were com-pletely eliminated in the Bz group after 10 days of treatment(Fig. 5A).

The analysis of ECG showed that sinus bradycardia, de-tected by low heart rates, was the prevailing disorder found inuntreated mice compared to the uninfected group (Fig. 5B andC). At 14 dpi, infected mice displayed a 32% reduction in heartrate (P 0.000005) compared to uninfected animals (Fig. 5B).DB1362 treatment partially reversed (P 0.037) this ECGalteration, and diamidine-treated mice displayed rate reduc-tions of only 16% compared to uninfected mice (Fig. 5B andC). Treatment with Bz also blocked the ECG alteration,giving values similar to those for the counterpart uninfectedgroup (Fig. 5B and C).

DISCUSSION

In view of the long history of aromatic diamidines as anti-parasitic agents along with the promising activity of diamidinesand analogues against T. cruzi (5, 8, 23, 24), the present studyevaluated both in vitro and in vivo effects of DB1362 againstthis protozoan parasite. The present results show that DB1362displays a trypanocidal effect against both bloodstream trypo-mastigotes and amastigotes localized within host cells in vitro,corroborating previous data that showed good dose-dependentactivity of dicationic molecules against T. cruzi at noncytotoxicdoses (5). The effect of DB1362 against bloodstream forms inthe presence of mouse blood was reduced, possibly due to theassociation of the diamidine with serum components, as dem-onstrated with other drugs (22).

Ultrastructural analysis showed that the parasite mitochon-dria (kinetoplasts) were significantly affected by diamidinetreatment without similar alterations in the mammalian hostcells. This type of damage has been reported with otherdiamidines (3, 5, 9, 10, 12) and reversed amidines (24).Significantly, the flow cytometry studies corroborated theTEM results showing that DB1362 targeted the mitochon-drion-kinetoplast complex. The use of Rh123 suggested in-terference with the proton electrochemical potential gradi-ent of the mitochondrial membrane of T. cruzi similar tothat shown upon treatment of trypomastigotes with otherdiamidines and reversed amidines (6, 24). Additional bio-chemical, ultrastructural, and biophysical studies are neededto more fully understand the mechanism of action of suchdiamidines.

Due to the trypanocidal effect of DB1362 in vitro, we per-formed in vivo studies to evaluate the activity of this diamidineagainst T. cruzi infection in mice. Since preliminary datashowed that the intravenous dosing route resulted in highmortality rates, we opted for the i.p. route, using drug concen-trations (up to 50 mg/kg) that did not result in any animalmortality (data not shown). In these studies, we employeddifferent protocols for the administration of DB1362: 2 or 10consecutive injections before or at the onset of parasitemia,respectively. The best results were obtained when acutely in-

fected mice were treated with two doses of 25 mg/kg. DB1362resulted in animal protection against T. cruzi infection, with100% survival in this group, compared to 40 to 50% mortalityin the control group at 60 dpi. These trypanocidal data foraromatic diamidines against T. cruzi in vivo corroborate pre-vious studies in the same mouse model, which demonstratedthe protective role of the diamidine DB569 (7). Importantly,although a 10-dose regimen did not eliminate the circulatingparasites, histological analysis of heart samples at 14 dpi, cor-responding to the peak of both cardiac parasite load and in-flammation in our experimental model (7), showed a strikingstatistically significant decline of both of these factors in theDB1362 group compared to untreated mice. Similar resultswere found with DB569, which did not entirely reduce all ofthe circulating bloodstream trypomastigotes; however, it didclear cardiac parasitism and protected against heart rate alter-ations characteristic of T. cruzi infection (8).

This study shows that while displaying in vivo activity supe-rior to that of DB569 by resulting in 100% survival of mice, thediarylthiophene diamidine did not clear the circulating para-sites as did Bz. The latter fact may be attributed to parasiteburden in noncardiac tissues. Overall, the in vitro and in vivodata support further investigation of this class of compoundsagainst T. cruzi and other trypanosomatids.

ACKNOWLEDGMENTS

The present study was supported by grants from Fundacao CarlosChagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro(FAPERJ and Pensa Rio/FAPERJ), Conselho Nacional Desenvolvi-mento Cientfico e Tecnologico (CNPq), DECIT/SCTIE/MS and MCTby CNPq, and PAPES/FIOCRUZ. Funding to D.W.B. by the Bill andMelinda Gates Foundation is gratefully acknowledged.

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