Giovana Giacomini

Introdução

Trypanosoma cruzi

Doença de Chagas

10 milhões

Fase aguda

Fase indeterminada

Fase crônica

Introdução

Trypanosoma cruzi

• Grande diversidade genética classificação

• RAPD (random amplified polymorphic DNA)

• MLEE (multilocus enzyme eletrophoresis)

• DTU (discrete typing unit) conjuntos de unidades populacionais geneticamente mais relacionadas entre si do que qualquer com outra população

6 DTUs

Emergência de DTUs: recombinação IIa e IIc = I + IIbIId e IIe = IIb + IIc

TCITCII IIa, IIb, IIc, IId e IIe

Introdução

Identificação dos DTUs é de alta relevância para estudos clínicos e epidemiológicos

Exploração de possíveis ligações entre diversidade genética

X pleomorfismo na severidade e

sintomas

Rastreamento molecular de populações silvestres

Método discriminatório molecular simples e sensível

Objetivo

Aplicar a análise MLP à 12 loci gênicos

- Genes envolvidos na relação hospedeiro-parasita devido a possível propensão à polimorfismos como uma resposta adaptativa à pressão seletiva imune

- Comparação com resultados obtidos por RAPD (validação taxonômica) e MLEE (aplicações práticas)

- Prova de evidência para aplicabilidade

Materiais e Métodos

20 cepas de T. cruziAmostras de sangue: 10 humanas e 21 outros mamíferosAmostras do conteúdo intestinal: 19 Mepraia spinolai

Materiais e Métodos

12 genesGenBank: sequências correspondentesPrimer Premier

PCR

Avaliar a diferença nas sequências de DNA

PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment-Length Polymorfism)

Materiais e Métodos

Microchip (eletroforese

capilar)

Produto da PCRClivagem por enzimas

de restrição(Webcutter)

Separação dos fragmentos

Eletroforese em gel de agarose

Materiais e Métodos

1ª etapa: 6 cepas T. cruzi e T. cruzi marinkellei (“7-strain analysis”)Análise final: 1 enzima por marcador

Resultados

gp72(TaqI)

1f8(Alw21I)

genótipos heterozigotos

Sobreposição dos padrões dos supostos ancestrais

1ª etapa: 7-strain analysis2ª etapa: 20 cepas

Resultados

Fragmentos únicos DTUs específicos

Combinações de características únicas

Polimorfismos entre DTUs

Resultados

gp63(TaiI)

Polimorfismos intra-DTUs

Resultados

Aplicação do PCR-RFLP em amostras de hospedeiros

1f8/Alw21I

IIb IIb IIaIIc

IIdIIe+ IIb

IIdIIe+ I

IIdIIe+ I

IIaIIc+ I

Conclusões

- Concordância dos resultados encontrados com PCR-RFLP com a classificação baseada na MLEE e RAPD.

- Algoritmo para identificação de DTUs T. cruzi.

- Análise MLP representou uma nova alternativa aos métodos moleculares existente.

- Simples, discriminação em vários níveis, aplicado diretamente para amostras dos hospedeiros.

- Ferramenta importante para estudos epidemiológicos e ações de controle.

Fonte: Zingales et al., 2009

Segunda Reunião Satélite – XXXVI Reunião Anual em Pesquisa Básica sobre a Doença de Chagas (Búzio, RJ – 2009)

OBRIGADA!!!