análise histológica em tecido epitelial sadio de ratos wistar (in
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Daiane Müller de Bem
Análise Histológica em Tecido Epitelial Sadio deRatos Wistar (in vivo) Irradiados com Diferentes
Intensidades do Ultra-Som.
Dissertação de Mestrado Apresentada ao Pro-grama de Pós-Graduação Interunidades Bioen-genharia - Escola de Engenharia de São Carlos/Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto / Inti-tuto de Química de São Carlos da Universidadede São Paulo, como parte dos requisitos para aobtenção do título de mestre em Bioengenharia.
Orientador: Prof. Dr. Nivaldo Antonio Parizotto
São Carlos
2008
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Ficha catalográfica preparada pela Seção de Tratamento da Informação do Serviço de Biblioteca – EESC/USP
Bem, Daiane Müller de B455a Análise histológica em tecido epitelial sadio de ratos
wistar (in vivo) irradiados com diferentes intensidades do ultra-som / Daiane Müller de Bem ; orientador Nivaldo Antonio Pariozotto. –- São Carlos, 2008.
Dissertação (Mestrado-Programa de Pós-Graduação e Área
de Concentração : Bioengenharia) –- Escola de Engenharia de São Carlos/Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/Instituto de Química de São Carlos da Universidade de São Paulo, 2008.
1. Ultra-som terapêutico. 2. Dosimetria. 3. Lesão do
tecido biológico. I. Título.
Programa de Pós-Graduação Interunidades em Bioengenharia . EESe / FMRP / lose
DAIANE MULLER DE BEM MESTRADO EM BIOENGENHARIA
DISSERTAÇÃO APRESENTADA AO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO INTERUNIDADES BIOENGENHARIA EESC/FMRPIIOSC DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO PARA OBTENÇÃO DO TITULO DE MESTRE .
. O~· PROF. DR. ORIVALDO LOPES A SILVA Programa de Pós-Graduação Interunidades Bioengenharia/USP
AI'. Trabalhador São-carlense, 400 - Centro - São Carlos - SP - 13566-590 TelefonelFa't,' (16) 3373-9586 - E-maU: [email protected]
Dedicatória
"A vida é uma oportunidade...aproveite-a
A vida é beleza...admire-a
A vida é felicidade...deguste-a
A vida é um desafio...enfrente-o
A vida é um dever...cumpra-o
A vida é um jogo...jogue-o
A vida é preciosa...cuide dela
A vida é uma riqueza...conserve-a
A vida é amor...goze-o
A vida é um mistério...descubra-o
A vida é promessa... cumpra-a
A vida é um hino...cante-o
A vida é uma luta...aceite-a
A vida é uma aventura...arrisque-se
A vida é felicidade...mereça-a
A vida é a vida...defenda-a".
(Madre Tereza de Calcutá).
Agradecimentos
Gostaria de escrever aqui minha gratidão a todos que contribuíram, direta ou indireta-
mente, para elaboração deste trabalho: Em primeiro lugar ao grande mestre Deus que
consegui toda força para vencer todos os obstáculos; Aos meus pais pela força, confi-
ança, por tudo amo voces. Ao Prof Nivaldo Antonio Parizotto, nao tenho palavras para
agradecê-lo, pela disponibilidade que apresentou. O seu apoio profissional e disponibili-
dade que demonstrou foi de uma grande valia para a realização deste trabalho. À equipe
do laboratório de Nutrição e Metabolismo Aplicado ao Exercício da Universidade Fede-
ral de são carlos, pela atenção, ensinamentos (demosntração das técnicas necessárias),
total disponibilidade, em fim palavras nao traduzem todo empenho. Ao professor Luiz
Carlos Lopes (Cacau) da fisiologia, foi uma super ajuda no dia da retirada dos tecidos.
Aos profissionais José Antonio Sampaio Zuanon (cortes histológicos) e Carlos Benatti
Neto laboratório (análise patológica) do Laboratório de Odontologia da Universidade Es-
tadual de São Paulo (UNESP) em Araraquara. Ao Prof Orivaldo Lopes da Silva por
indicá-los. Ao Roberto do biotério da Universaidade Federal de São Carlos, pela atenção
e dedicação. À firma da BIOSET pelo empréstimo do aparelho de ultra-som, obrigada
pela confiança. Ao professor Dr. Jose Marcus pela Balança do Ultra-som. Aos técnicos
do laboratório da Hidrobiologia, Claudinei e Amabili, pela disponibilidade de mostrar o
processo para corar a lâminas. À Professora Marisa Narciso Fernandes do Laboratório
de Zoofisiologia e Bioquímoca Comparativa - (LZBC) por ter liberado o aparelho micró-
tomo digital para eu realizar os cortes e ao aluno Marcelo que passou as técnicas. Teve
um nome que gastou de tantas vezes que precisei chamar, era mais ou menos assim: O
VINÃO! Como faz aqui esta dando erro no latex, o vinão não esta compilando...É; e agora
aqui nestes agradecimentos eu digo; o Vinão valeu por tudo e vamos la na sorveteria bêju
comemorar!!! À Eugênia amiga (maravishosa, hermosa) sempre disposta e preocupada
me amparando nos momentos difíceis, dicas técnicas maravilhosas, ficarei para sempre
grata de coração. Para minha amiga Luciana Montanari (Luzão) que também nunca mediu
esforços, apelidei como solução para seus problemas, foram caronas mil, para busacas de
serragens, transporte de materiais e aparelhos, pelos desenhos, sem contar a aula particu-
lar de integral, isso tudo ela diz que é "bico". Quero agradecer a Regina Rios pelo carinho,
atenção e amizade que não mediu esforços para estar aqui.., valeu Re, suas dicas fizeram
a diferença.
Lista de Figuras
2.1 Mudança na Pressão pelo Tempo na Propagação da onda . . . . . . . . . . . . 14
2.2 Representação do Efeito Piezoelétrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.3 Comportamento do Campo Acústico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.4 Tecido Epitelial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
3.1 Amostras sem lesões do tecido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.2 Amostras apresentando lesões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.3 Dosímetro de Precisão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.4 Aferição das diferentes intensidades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.5 Cuba Anestésica e Guilhotina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.6 Quadro mostrando a seqüência metodológica utilizada. . . . . . . . . . . . . . 25
3.7 Animal sendo Anestesiado na Cuba. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.8 Processo de adaptação do animal com o transdutor . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.9 Região dorsal após a realização da tricotomia e local da área tratada . . . . . . 27
3.10 Retirada do Tecido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.11 Barra do programa image tool . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.1 Imagens dos cortes histológicos referentes a todos os grupos (I, II, III, IV e V)
com aumento de 200x . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.2 Gráfico das medidas da espessura da epidereme . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Sumário
Resumo
Abstract
1 Introdução 10
1.1 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2 Revisão de Literatura 13
2.1 Ultra-Som . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.2 Piezoeletricidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.3 Campo Acústico do Ultra-Som . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.4 Potência Acústica e Intensidade Acústica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.5 Atenuação do Feixe Ultrassônico no Tecido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.6 O Tegumento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3 Materiais e Métodos 20
3.1 Estudo Piloto in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
3.2 Materiais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.2.1 Animais de Experimentação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.2.2 Balança e Ultra-Som . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.2.3 Cuba Anestésica e Guilhotina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.3 Métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.3.1 Grupos Experimentais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.3.2 Manipulação dos Animais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.3.3 Análise das Imagens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
4 Resultados e Discussão 30
4.1 Resultados Qualitativos e Quantitativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4.1.1 Resultados Qualitativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4.1.2 Resultados Quantitativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
4.2 Discussão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
5 Conclusão 36
Referências Bibliográficas 37
6 Apêndice 40
6.1 Apêndice (A) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
6.2 Apêndice(B) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
7 Anexos 43
7.1 Anexo (A)Certificado do Comitê de Ética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
Resumo
DE BEM, D.M. Análise Histológica em Tecido Epitelial Sadio de Ratos Wistar (in vivo) Irradia-dos com Diferentes Intensidades do Ultra-Som. (2008) 43p. Dissertação (Mestrado) - Programade Pós-Graduação Interunidades Bioengenharia - Escola de Engenharia de São Carlos - Facul-dade de Medicina de Ribeirão Preto - Instituto de Química de São Carlos da Universidade deSão Paulo.
A energia ultra-sônica é um dos recursos físicos amplamente utilizado e pesquisado nos trata-mentos de fisioterapia e diagnósticos médicos. Sabe-se que diante de uma escassa literatura dosefeitos do ultra-som em tecidos sadios, muitos profissionais fisioterapeutas acabam realizandoaplicações infundadas de métodos e parâmetros. O objetivo desta pesquisa foi avaliar possíveisalterações do tecido sadio in vivo de ratos Wistar irradiados com diferentes intensidades, anal-isando a histologia e morfometria. Foram utilizados 30 ratos da linhagem Wistar, distribuídosaleatoriamente em 5 grupos de 6 animais cada. Foi escolhida a região dorsal do lado direito paratratamento com área de 4 cm2. O lado esquerdo serviu como controle em todos os grupos. Otratamento foi feito durante 4 dias com 2 minutos de irradiação. Para verificar a intensidade desaída, utilizou-se o dosímetro de precisão antes da aplicação do ultra-som em cada animal. Foirealizada uma análise histológica descritiva e morfometria por meio do software Image Tool.Como resultado pode-se observar um discreto infiltrado inflamatório e adelgaçamento das fibrasda derme, principalmente dos grupos irradiados com 1.5 e 2 W/cm2. Notou-se também um au-mento na espessura da epiderme nas amostras dos animais irradiados quando comparado com ocontrole. Para avaliar os resultados quantitativos, utilizou-se como análise estatística ANOVA"one way"e o teste "pos hoc"de Tukey com nível de significância p < 0,01. Em 120 medidas daespessura da epiderme obtiveram-se diferenças significativas do grupo controle com os gruposirradiados com (1.0, 1.5 e 2.0 W/cm2). Concluímos diante dos resultados que houve alteraçõesno tecido sob ação do US nas doses maiores, o que nos alerta para possíveis implicações do usodo US em estética.
Palavras Chave: Ultra-Som Terapêutico, Dosimetria, lesão do tecido biológico
Abstract
DE BEM, D.M. Histological analyses in healthy epithelium tissue irradiated with different ul-trasound intensities in Wistar rats in vivo. (2008) 43p. Dissertation (Master) - Programa dePós-Graduação Interunidades Bioengenharia - Escola de Engenharia de São Carlos - Faculdadede Medicina de Ribeirão Preto - Instituto de Química de São Carlos da Universidade de SãoPaulo.
The ultrasound (US) energy is one of the resources widely used and researched in both physio-therapist treatment and in medical diagnosis. In front of a scarce literature about the US effectsin healthy tissues, many professionals have carried out unfounded applications of methods andparameters. So, the aim of this research was evaluate, through the histology, possible alter-ations in healthy tissues of Wistar rats in vivo irradiated with different intensity, analyzing thequalitative and quantitative histological slides. We used 30 Wistar rats randomly distributed in5 groups of 6 animals each. The local chosen for receiving the treatment was the dorsal rightside, whose area was 4 cm2. The left side was used as control of the animal itself for all thegroups. The rats underwent the treatment during 4 days exposed to 2 minutes of irradiation.In order to check the energy output, the precision dosimeter was used before US application ineach animal. The histological slides were evaluated qualitatively in the microscope and quanti-tatively through the Image Tool software. The qualitative result shows a discrete inflammatoryprocess with infiltration and atrophy dermis fibers, mainly in the groups with higher US dosage.In the quantitative aspect, we found epidermis thickness increased in the 1.5 and 2 W/cm2ofUS, with statistical difference (ANOVA) compared to control. We conclude that US therapycan be dangerous with high dosage applied in the intact skin as applied in esthetics.
Key Words: Therapeutic ultrasound, dosimetry, side effects, tissue damage.
1 Introdução
As primeiras pesquisas sobre energia ultra-sônica de baixa intensidade tiveram início com
o Professor Luiz Romariz Duarte juntamente com sua equipe da Escola de Engenharia de São
Carlos/USP. Os resultados mostraram primeiramente grande eficácia quando aplicado em falhas
ósseas, nas peseudoartrose. Verificaram também, que o ultra-som de baixa intensidade acele-
rava a formação de osso primário e reparo de fraturas ósseas. Segundo Duarte (1997), relata
que o rápido processo de consolidação das fraturas atribui-se principalmnete ao mecanismo
piezoelétrico. Os estudos aumentaram cada vez mais e hoje pode-se observar que a energia
do ultra-som é um dos recursos físicos amplamente utilizado e pesquisado nos tratamentos de
fisioterapia, na estética e diagnósticos médicos (ABNT, 1998);(DYSON, 1987). Afim de com-
provar isso, Lindsay (1995), relata em uma pesquisa realizada nas clínicas do Canadá que 94%
dos profissionais fisioterapeutas utilizam o ultra-som. Sabe-se que há uma vasta literatura com
resultados concisos dos benefícios do ultra-som de baixa intensidade em acelerar a regeneração
de tecidos lesados, estimulando a atividade de síntese das estruturas que compõem a matriz
extracelular (proteoglicanas, fibras de colágeno tipo I, II e III). Um trabalho analisando esti-
mulação do ulta-som em células que produzem colágeno tipo I e II com diferentes intensidade
(0, 0.1, 0.5 e 1.0 W/cm2), comprovou um aumento significativo na síntese das mesmas quando
comparadas com o grupo controle, demosnstrando também, que de todas as intensidades uti-
lizadas a que apresentou maior síntese foi no grupo estimulado com 1.0 W/cm2 (TSAI et al.,
2006).
Em Iwashina (2006), também obteve resultados significativos na produção de proteogli-
canas nas células do disco intervertebral, quando comparado ao grupo controle. Os autores
usaram ultra-som irradiando diferentes intensidades de média espacial e temporal (0, 7.5, 15,
30, 60, 120 mW/cm2), apresentando uma maior síntese nos grupos irradiados com (7.5 e 15
mW/cm2). Um estudo semelhante foi demonstrou o aumento do conteúdo das proteoglicanas e
da síntese de colágeno do disco intervertebral em bovinos (MIYAMOTO et al., 2005).
Uma revisão bibliográfica sobre os efeitos do ultra-som no processo de cicatrização cutânea,
concluíram que o ultra-som melhora tanto a velocidade de cicatrização como também, a quali-
11
dade do tecido cicatrizado (FERREIRA; MENDONÇA, 2007).
Por outro lado, há uma escassa literatura referindo-se sobre os efeitos do ultra-som em teci-
dos sadios, condição básica dos tratamentos estéticos (DYSON; DOUGLAS, 1986). Diante
deste fator, muitos profissionais fisioterapeutas acabam seguindo métodos infundados para os
ajustes da intensidade e duração do tratamento. Essa exposição em alguns casos pode promover
danos aos tecidos biolólgicos. Além disso, sabe-se que ainda não conseguiram esclarecer exa-
tamente os mecanismos de ação e uma definição para seus parâmetros (HAAR, 2006). Isto
pode ser devido a vários fatores que estão envolvidos; grande número de variáveis, a intensi-
dade irradiada, o tempo de exposição, calibragem do aparelho e o estado fisiológico da amostra
(ARMEN, 1983);(LEIGHTON, 2007). A complexidade do seu campo próximo ser bastante
irregular, com presença de picos espaciais e temporais pode ser outro fator. Conforme Valen-
tini(2006), estudou a importância da conformidade dos equipamentos de ultra-som terapêutico
com a NBR-IEC 1689, obtendo alguns relatos de que os aparelhos de ultra-som no Brasil e no
mundo não atendem totalmente as especificações dos parâmetros pedidos pela norma NBR-IEC
1689.
Não obstante, das insuficientes comprovações científicas em estética, um estudo avaliando
o risco potencial da utilização do ultra-som vem somar negativamente, diante de uma pesquisa
realizada por Gonçalves, 2005 (GONÇALVES et al., 2005) em que utilizou ultra-som com
intensidade 1.0W/cm2, freqüência 3 MHz, afim de avaliar o risco potencial da utilização do
ultra-som em terapias dermatológicas e estéticas, como também, suas implcações no sistema
cardiovascular. Os autores conseguiram mostrar que alterou os parâmetros hemodinâmicos, os
níveis de lipídios e glicose séricos. Conforme Yamamoto (2002) um possível fator para a pre-
sença de riscos cardiovasculares poderia ser o fato da célula adiposa sintetizar angiotensina II, e
no momento da lipólise ocasionada pelo ultra-som esta substância seria liberada na circulação,
podendo causar aumento na pressão arterial. Diante destas hipóteses torna-se arriscado estas
aplicações para os pacientes, antes de ter-se resultados mais precisos.
Frente à estas dúvidas científicas e uma escassa literatura sobre o ultra-som em tecido sadio,
nos estimulou a realizar um estudo in vivo avaliando histologicamente possíveis alterações do
tecido sadio de ratos Wistar irradiados com diferentes intensidades (0.5, 1.0, 1.5 e 2.0 W/cm2).
12
1.1 Objetivos
O objetivo deste estudo foi investigar a atuação do ultra-som com diferentes intensidades
(0, 0.5, 1.0, 1.5 e 2.0 W/cm2) em tecido sadio de ratas wistar in vitro e posteriormente avaliar
histológicamente se ocorrerá alguma alteração das amostras do grupo irradiado em relação ao
grupo controle, analisando de forma qualitativa e quantitativa as imagens.
2 Revisão de Literatura
Neste capítulo estão descritos algumas características físicas do ultra-som, o comportamento
de seu campo acústico e uma revisão geral sobre o tecido tegumentar, suas funções e camadas
(epiderme e derme).
2.1 Ultra-Som
As ondas sonoras são de natureza mecânica que se propagam através de qualquer meio
sólido, líquido ou gasoso. O som se propaga com uma freqüência audível, abaixo de 20KHz.
A natureza da onda ultra-sônica difere apenas em suas vibrações mecânicas de alta freqüên-
cia, acima de 20kHz, tornando-se não audível pelo ser humano. A energia é transmitida
através das colisões moleculares do meio, envolvendo uma agitação molecular, alteração de
pressão e consequentemente mudança na densidade, ocorrendo assim a propagação da onda
(ZAGZEBSKI, 1996). A medida em que ocorre a propagação, as partículas do meio oscilam
em torno da posição de equilíbrio, ocorrendo uma perturbação, mas não o deslocamento da
matéria (HUMPHREY, 2007).
Devido às alterações de pressão, ocorre no meio regiões de alta concentração molecular,
consideradas regiões de alta pressão (maior compressão) e regiões de baixa concentração mo-
lecular (rarefação) (HEDRICK; HYKES; STARCHMAN, 2005). As vibrações mecânicas po-
dem ser transmitidas principalmente na forma de onda longitudinal ou transversal. No tecido
biológico, a forma de propagação predominante é a longitudinal, em que as partículas vibram
paralelamente à direção de propagação da onda, enquanto na forma transversal ocorre um deslo-
camento perpendicular à direção de propagação (LEIGHTON, 2007).
A onda ultra-sônica geralmente apresenta algumas características dos demais tipos de onda,
como , amplitude, período, freqüência, comprimento de onda e uma velocidade. A amplitude
(A) é a mudança na força física, este termo pode ser aplicado para uma pressão, densidade,
deslocamento ou velocidade das partículas no meio, como também para distância máxima que
uma partícula se desloca a partir de seu ponto de equilibrio, como na Fig.2.1. O período (T) é
14
definido como o tempo que uma partícula realiza um ciclo de movimento oscilatório, na Fig.2.1.
O comprimento de onda representado pelo símbolo (λ ), consiste entre a distância de dois picos,
Figura 2.1: A figura mostra a mudança na pressão pelo tempo em presença da onda sonora, e operíodo representado como (T). Fonte (ZAGZEBSKI, J. A. Fhysics of Diagnostic Ultrasound.Chapter 1. Ed. Mosby. p.4, 1996.)
vales ou outros pontos corespondentes da onda (ZAGZEBSKI, 1996).
A freqüência (f) é o número de vezes que um ciclo é repetido em cada segundo ou o número
de vezes que se repetem as zonas de compressão e rarefação por segundo. Um Hertz (Hz)
corresponde a um ciclo por segundo. Geralmente as freqüências usadas na fisioterapia ficam
em torno de 1 à 3 MHz. A velocidade de uma onda mecânica (c) que se propaga através do meio,
depende tanto da energia inercial deste meio afim de armazenar energia cinética, como também
da propriedade elástica para armazenar energia potencial. Quando uma onda sonora atravessa
um meio fluido ou mesmo o tecido biológico, a energia potencial fica sujeita às compressões e
rarefações periódicas dos pequenos elementos de volume do tecido. Desta forma, a velocidade
da onda ultra-sônica não depende da freqüência, mas sim das constantes elásticas do tecido, em
que tipo de material esta se propagando, da sua massa, força de atração entre as partículas
e da densidade deste meio. Quanto maior esta força de atração entre as partículas, menor
a velocidade de propagação (HALLIDAY; RESNICK; MERRILL, 1993). A velocidade de
propagação da onda sonora em tecidos moles apresenta uma média de 1540 ms(ZAGZEBSKI,
1996).
O módulo de compressão (B) é a propriedade que determina a extensão das mudanças no
volume do meio. Quando é aplicada uma pressão sobre ele ocorre um aumento ou uma redução
do volume (HALLIDAY; RESNICK; MERRILL, 1993). Cada tecido apresenta um fator de
15
compressibilidade, então (B) irá depender do material do meio.
2.2 Piezoeletricidade
Os cristais piezoelétricos deformam e vibram quando eletricamente estimulados, gerando
pulsos sonoros de freqüência referida. O centro de freqüência produzido pelo transdutor é
a freqüência ressonante do cristal, que dependerá da sua espessura (MIDDLETON; KURTZ;
HERTZBERG, 2004). O efeito piezoelétrico foi descoberto por Pierre e Jacques Currie em
1888. Segundo eles, uma cerâmica piezoelétrica consegue atuar como fonte e receptor, ou seja,
quando uma força é aplicada perpendicular à face do cristal, resulta em mudanças elétricas, que
podem ser detectadas e amplificadas produzindo um sinal elétrico e ao contrário também, se
uma corrente elétrica alternada for aplicada no cristal ele vibrará enviando oscilações mecânicas
para o meio (ZAGZEBSKI, 1996), como mostra a Fig.2.2.
Figura 2.2: (a)A partir de um campo elétrico o cristal converte em deformação mecânica;(b)Aplicação de uma pressão ou força no cristal resulta em um campo elétrico.Fonte (ZAGZEBSKI, J. A. Properties of Ultrasound Tranducers. Chapter 2. p.21, 1996)
16
2.3 Campo Acústico do Ultra-Som
O campo acústico de um disco piezoelétrico é considerado complexo, pois o feixe diverge
rapidamente pela face do cristal e as regiões de compressão e rarefação a medida que a onda
propaga pelas diferentes densidades do tecido biológico gerando um comportamento difícil de
medir com exatidão. Na região perto do transdutor, considerada campo próximo (zona Fresnel)
apresenta um feixe bem irregular, alterando a pressão acústica entre valores extremos de máxi-
mos e mínimos (zero), gerando picos de energia. À medida em que o feixe vai se afastando do
transdutor, seu padrão vai ficando mais uniforme, o que denominamos de campo distante (zona
Fraunhofer) (HEDRICK; HYKES; STARCHMAN, 2005), podemos ver na Fig.2.3.
Figura 2.3: A figura mostra o campo próximo bem irregular e a medida que se afasta dotransdutor começa a ficar mais regular. Fonte (ZAGZEBSKI, J. A. Properties of UltrasoundTranducers. Chapter 2. p.31, 1996)
Devido à grande irregularidade do campo próximo, faz-se necessário caracterizar os picos
de intensidade no campo acústico, pois ao realizar-se apenas as intensidades de média tem-
poral e espacial, sem considerar também os picos de pressão, corre-se o risco de lesões nos
tecidos biológicos. Estas medidas podem ser feitas através do Hidrofone, aparelho que faz a
varredura do campo acústico, conseguindo marcar o valor instantâneo de cada ponto de pressão
que o feixe apresentar (INCHEM, 1982). Além do campo acústico apresentar picos variáveis de
pressão mais especificamente no seu campo próximo, apresenta outros motivos que dificultam
a fidedignidade nos trabalhos de pesquisas que são referentes aos mecanismos de ação (HAAR,
17
2006), e a complexa composição heterogênea do tecido biológico, pois quando a onda entra em
contato com o tecido biológico apresenta um comportamento não-linear difícil de medir.
2.4 Potência Acústica e Intensidade Acústica.
Potência é uma taxa de energia transmitida do transdutor para dentro do meio, ou a quanti-
dade de energia gerada em um intervalo de tempo. No aparelho de ultra-som é a enegia total do
feixe por unidade de tempo, representada pela medida (W).
P =E4t
(2.1)
Onde:
P=Potência
E=Energia
4t=Variação no Tempo
Assim como a potência está relacionada com o tempo, a intensidade está com a área, ou
seja, razão média por unidade de área, ou a energia que atravessa uma unidade de área em um
certo tempo, representada por W/cm2 (ZAGZEBSKI, 1996). Em relação a intensidade acústica,
em termos de tecido biológico é preciso tomar cuidado, uma vez que, está associada com a área,
pode-se danificar o tecido ao aplicar em área muito pequena.
I =PA
(2.2)
Em que:
I=Intensidade
P=Pressão
A=Área
Sabe-se que ao medir as intensidades de média espacial e média temporal os picos e pressão
presentes no campo acústico não estão sendo calculados. Sendo assim é importante caracterizar
no campo acústico as intensidades de pico espacial e temporal, que são estes picos de inten-
sidades muito altos que podem lesionar o tecido. Conforme os métodos sugeridos pela NBR-
IEC1689, através da varredura por hidrofone, tem-se condições de localizar estes pontos de
intensidade de pico espacial e temporal (VALENTINI; MACIEL; PARIZOTTO., 2006).
18
2.5 Atenuação do Feixe Ultrassônico no Tecido
A medida que a onda sonora se propaga no tecido atingindo camadas mais profundas e
com diferentes densidades, acaba sofrendo algumas fontes que causam a atenuação da energia.
Pode-se considerar como principais fontes de atenuação a reflexão, difração e espalhamento.
Geralmente é expressada como sendo uma mudança na intensidade através do meio em que
está propagando. Decibéis (dB) são usados para expressar as diferenças entre as intensidades
do ultra-som, fornecendo a comparação de dois sinais, podendo ser para duas amplitudes ou
duas intensidades. A metade da atenuação pode ser chamada de coeficiente de atenuação.
A atenuação do feixe sonoro no tecido é representado em decibéis por centímetro (dB/cm)
(ZAGZEBSKI, 1996).
A impedância acústica representada por (Z) e sua unidade expressa em rayls esta rela-
cionada com a resistência ou dificuldade do meio a passagem do som. Corresponde ao produto
da densidade do material pela velocidade do som no mesmo. Quando o feixe sonoro atravessa
uma interface entre dois meios com a mesma impedância acústica, não há reflexão e a onda é
toda transmitida ao segundo meio (ZAGZEBSKI, 1996).
2.6 O Tegumento
A pele constitui o revestimento completo externo do corpo. O sistema tegumentar é for-
mado pela epiderme, derme e tecido subcutâneo ou hipoderme. A espessura da pele conforme
(GUIRRO; GUIRRO., 2002), fica entre 0,5 à 4 mm e a derme atinge em média 2 mm de es-
pessura. Sabe-se que as camadas da pele são avasculares, com isso, a única forma de nutrição
é feita por difusão através dos leitos capilares da derme, que apresenta-se bem vascularizada.
Este método é suficiente para as células mais próximas da derme, mas na medida em que as
células se dividem e são empurradas para as camadas mais externas, vão ficando mais longe
da fonte de alimento até que o citoplasma vai sendo gradualmente substituído por queratina e
morrem, formando assim, a estrutura típica das camadas mais externas da epidereme, como a
camada córnea (SPENCE, 1991). A camada córnea é a mais externa, constituída por células
anucleadas e achatadas chamadas de corneócitos. A membrana dos corneócitos apresentam um
revestimento de lipídios e uma resistência muito acentuada, oferecendo grande resistência a esta
camada, que envolve todo o nosso corpo exteriormente (GARTNER; HIATT, 1998). A camada
córnea apresenta uma espessura por volta de 15 µm e a sua dupla camada lipídica oferece uma
baixa permiabilidade gerando proteção à pele (KARANDE; JAIN; MITRAGOTRI., 2005).
A pele apresenta várias funções as quais podem ser agrupadas nas seguintes categorias:
19
proteção, regulação da temperatura do corpo, excreção, sensação e produção da vitamina D.
Devido a estas funções, a pele consegue desenvolver uma importante função na homeostase
corporal, assegurando uma atividade normal das próprias células (SPENCE, 1991).
A função de proteção ocorre principalmente pelo processo de crescimento e diferenciação
dos queratinócitos. Estes apresentam-se de 10-20 camadas e durante sua maturação podem
ser distingüidos em quatro estágios conhecidos como; basal, granular, espinhosa e córnea
(DUNITZ, 2001).
Na camada basal ocorre uma constante renovação celular, com intensa atividade mitótica.
Estas células são empurradas para a camada espinhosa e lúcida, onde fabricam células ima-
turas de queratina, apresentando de 4 a 6 camadas sobrepostas de queratinócitos, dando uma
capacidade de resistência mecânica à epiderme. Na camada granular estas células sintetizam
substâncias que asseguram a coesão ao estrato córeno.
A parte inferior da camada basal prende-se no início da derme. Esta é formada por duas
camadas: papilar e reticular. A camada papilar é constituída por tecido conjuntivo frouxo e na
reticular por tecido conjuntivo denso. Logo abaixo da derme apresenta-se a hipoderme ou tecido
subcutâneo, formado pelo tecido adiposo lobular, com uma intensa vascularização e inervação
(GARTNER; HIATT, 1998), Fig.2.4 mostra as camadas da epiderme.
Figura 2.4: A figura mostra o tecido epitelial do corte histológico controle. Ao lado suas ca-madas nomeadas conforme os números; 1-Camada Córnea, 2-Camada Lúcida, 3-Camada Gra-nulosa, 4-Camada Espinhosa, 5-Camada Basal. Fonte: www.faceparlour.com/laurensnotebook/
3 Materiais e Métodos
Neste capítulo primeiramente será relatado um estudo piloto in vitro realizado em tecido
de suínos que foi irradiados com diferentes intensidades do ultra-som. Posteriormente serão
descritos os materiais e métodos utilizados no presente estudo.
3.1 Estudo Piloto in vitro
Antes de dar início ao tratamento do presente trabalho, foi realizado um experimento in vitro
com suínos avaliando 8 diferentes intensidades (150 mW/cm2, 500 mW/cm2, 750 mW/cm2, 1.0
W/cm2, 1.5 W/cm2, 2.0 W/cm2, 2.5 W/cm2 e 3.0 W/cm2), apresentando como objetivo analisar
algum tipo de alteração na estrutura do tecido biológico em diferentes níveis de intensidades e
comparar com o grupo que nao recebeu irradiação.
As amostras foram coletadas em um frigorífico na cidade de São Carlos, no mesmo dia
em que o animal foi sacrificado, mantidas resfriadas em 4 0C até a hora da coleta. Foi uti-
lizada a parte da região abdominal abrangendo a epiderme, derme e músculo. O tamanho de
cada amostra apresentava 16 cm2 com um tempo de aplicação em cada amostra de 5 minu-
tos. O aparelho de ultra-som utilizado era da marca Sono Plus, com 1MHz de freqüência no
modo contínuo, contendo uma área de radiação efetiva (ERA) de 3.5 cm2. A cada intensidade
aplicada era feito a medida no dosímetro de precisão ULTRASOUND POWER METER UPT-1
MODEL. O preparo das lâminas histológicas foram realizadas na Universidade Estadual de São
Paulo (UNESP) no departamento de Fisiologia e Patologia do Curso de Odontologia. Pode-se
sugerir qualitativamente alterações no tecido a partir de 750 mW/cm2. Estas alterações foram
identificadas como queimaduras e conforme as intensidades aumentavam, tornava-se visível
maiores áreas de lesões principalmente na epiderme e derme. A Fig.3.1. mostra os cortes
histológicos sem lesões. Na Fig.3.2 observa-se que as células das amostras apresentam-se au-
mentadas devido ao processo inflamatório, conforme indicado nas setas (regiões mais escuras)
principalmente nos grupos irradiados com intensidades mais elevadas de 2.5 e 3.0 W/cm2.
Considerando que o experimento realizado foi in vitro, sabemos que existem muitos fatores
21
(a) (b) (c)
Figura 3.1: As figuras (a), (b) e (c) mostram um epitélio normal sem alteração. A figura (a) representa aamostra controle; a figura (b) amostra que foi irradiada com 500mW/cm2e a figura (c) amostra irradiadacom 750mW/cm2, todas com um aumento de 100x
(d) (e) (f)
Figura 3.2: As setas na Fig.3.3 mostram lesão do epitélio, percebe-se que as células apresentam-seaumentadas pelo processo inflamatório principalmente nas figuras (e) e (f). A figura (d) representa ocorte histológico da amostra irradiada com 1,5W/cm2; na figura (e) refernete a amostra irradiada com2,5W/cm2e na figura (f) mostra o corte histológico da amostra irradiada com 3,0W/cm2, todas com umaumento 100x
desfavoráveis, principalmente pelas condiçõoes das amostras não serem in vivo, o que ocorre
ausência de circulação durante a irradiação, como também, o processo de limpeza que a amostra
utilizada sofreu até chegar ao frigorífico. Estes eventos acabam causando a perda da fidedig-
nidade da pesquisa. Por outro lado, as amostras irradiadas com diferentes intensidades foram
camparadas ao grupo controle que não apresentaram as alterações das amostras irradiadas acima
de 750mW/cm2, justamente por isso que foi utilizado um grupo controle.
22
3.2 Materiais
3.2.1 Animais de Experimentação
O projeto do presente trabalho foi aprovado pelo comitê de ética na Universidade Federal de
São Carlos (UFSCar) na Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa. O modelo animal utilizado
foi rato da linhagem Wistar, macho, com uma massa corporal (195,06 ±20,9), proveniente do
biotério central da (UFSCar), mantido em uma temperatura entre 24 até 26 0C. Durante todo
o processo de tratamento os animais permaneceram no Laboratório de Nutrição Aplicada ao
Exercício da (UFSCar). A alimentação era de livre acesso à comida (ração primor) e água,
alojados em gaiolas de polipropileno forradas com serragem, sob condições de higiene. Os
machos foram pesados e distribuídos aleatoriamente em 5 grupos com um total de 6 animais
por grupo. Permaneciam 3 animais por gaiola.
3.2.2 Balança e Ultra-Som
Para verificar a intensidade de saída, foi utilizado o dosímetro de precisão, como mostra a
Fig.3.3. Através da balança é possível determinar a intensidade média espaço-temporal.
Figura 3.3: Dosímetro de Precisão, Modelo-UPT-1, ULTRASOUND POWER METER.
23
O aparelho de ultra-som utilizado foi da marca BIOSET, Sonacel Expert com frequência
de 3MHz. A medida da potência de radiação foi feita para as diferentes intensidades utilizadas
no trabalho para fins de maior precisão. A Fig.3.4. mostra a aferição que foi realizada para as
diferentes intensidades de cada grupo.
Figura 3.4: Testes de aferição das diferentes intensidades utilizadas em cada grupo.
3.2.3 Cuba Anestésica e Guilhotina
Foi utilizada uma cuba para a indução anestésica por agentes inalantes, a Fig.3.5(a) a seta
indica um algodão envolto por gaze embebido em éter etílico no centro da cuba. A Fig.3.5(b)
mostra a guilhotina que foi utilizda para decapitar os animais, que ainda encontravam-se anes-
tesiados, após o procedimento da coleta do material. A guilhotina foi manipulada somente pelo
técnico, pessoa com experiência e treinada a realizar o devido procedimento, de acordo com os
critérios de bioética.
24
(a) (b)
Figura 3.5: A figura(a) mostra o local da indução anestésica por agentes inalantes; a figura(b) mostra oaparelho utilizado na decapitação;
3.3 Métodos
3.3.1 Grupos Experimentais
Para a análise das diferentes intensidades no tecido biológico sadio de ratos Wistar foram
utilizados um total de 30 ratos. Estes foram divididos em 5 grupos com as seguintes intensidades
(0.5, 1.0, 1.5 e 2.0 W/cm2) mantendo a mesma freqüência de 3 MHz. O local de aplicação do
ultra-som foi escolhido na região dorsal, levando-se em consideração dois fatores principais;
apresentar uma dificuldade para o animal coçar e evitar contato do epitélio na maravalha. As
amostras foram divididas em duas partes na região dorsal, o Lado Esquerdo (LE) que foi sempre
controle e o Lado Direito (LD) experimntal, a tabela 3.1 mostra uma síntese das divisões dos
grupos utilizados no experimento e suas respectivas intensidades.
GRUPO LADO ESQUERDO LADO DIREITO INTENSIDADES W/cm2
I Controle Placebo 0,0II Controle Experimental 0,5III Controle Experimental 1,0IV Controle Experimental 1,5V Controle Experimental 2,0
Tabela 3.1: A tabela mostra como foi separado os grupos para realização do experimento e suasrespectivas intensidades.
25
3.3.2 Manipulação dos Animais
Sabe-se que os animais são extremamente sensíveis e reagem diferentemente aos estímu-
los externos, o que torna-se de suma importância um determinado período para adaptarem-
se. Neste processo de adaptação ocorrem níveis de estresse elevados, levando a alterações no
metabolismo do animal para compensar as variações do meio, podendo com isso influenciar
os dados da pesquisa. Um dos fatores que influenciam, segundo (ANDERSEN et al., 2004), a
maioria das espécies animais apresentarem o sentido da audição bem desenvolvidos. Os sons
produzidos pelos animais, como cortejo, cuidado materno, agressão e defesa são necessários
para sua comunicação, que pode ser frustrada pelo nível de ruídos no ambiente. Desta forma,
além das instalações apropriadas, torna-se relevante realizar o processo adaptativo do animal
com o pesquisador e também com os procedimentos a serem desenvolvidos na pesquisa.
Prezando-se todos os fatores externos de temperatura adequada, ventilação, ausência de
ruídos e adaptação, o pesquisador está assegurando o bem estar do animal e uma confiabilidade
nos seus resultados. Diante disso, a seqüência desta pesquisa apresenta-se em tópicos na Fig.3.6.
e posteriormente uma explicação mais detalhada de cada ítem.
Figura 3.6: Seqüência Metodológica
26
O processo adaptativo homem x animal teve uma duração de uma semana, em que notou-se
a diferença do primeiro em relação ao último dia de adaptação. No primeiro contato os animais
se refugiavam nos cantos da gaiola quando colocava-se a mão, no terceiro dia, foi perceptível a
diferença, era possível passar a mão calmamente e no sétimo dia estavam tão bem adaptados que
não urinavam-se e subiam na mão tranqüilamente para cheirar. Após este processo, os animais
foram colocados na cuba com anestésico inalante de éter etílico, na Fig.3.7 Verificaram-se os
Figura 3.7: Animal sendo anestesiado para realização da tricotomia digital
reflexos dos animais, para ter certeza que estavam anestesiados e realizou-se a tricotomia digital
na região dorsal do animal. Após tricotomizados, os animais passaram pelo segundo processo
de adaptação, com o transdutor do ultra-som e o animal na Fig.3.8, com uma duração de dois
dias. Percebeu-se a necessidade de colocar o frasco com gel acoplador em água quente para
ficar em uma temperatura morna e não dar um choque térmico no animal, pois a região tratada
apresentava um desconforto maior por estar sem pelos.
27
(a) (b)
Figura 3.8: A figura (a) mostra antes da adaptação do animal com o transdutor do ultra-som; a figura(b) mostra o animal já adaptado ao transdutor, apenas apoiando-se na mão;
O tratamento foi realizado durante 4 dias consecutivos, com duração de 2 minutos em uma
área de 4 cm2. Pelo fato da epiderme possuir a camada basal com intensa atividade mitótica e
a duração do ciclo da mitose ser em torno de 2h, estipulou-se 4 dias de tratamento, levando-se
em consideração a atividade mitótica.
(a) (b)
Figura 3.9: A figura(a) mostra a região dorsal após realizada a tricotomia digital e também a área dotecido que foi retirada, do lado esquerdo; A figura (b)mostra a área da região dorsal do lado direito emque foi aplicado o aparelho de ultra-som, 4cm2;
28
No quarto dia, uma hora após a última aplicação, foi realizada a coleta das amostras. Os
animais foram anestesiados através da combinação de Ketamina r (35mg/Kg) e xilazina r
(4mg/Kg), injetada de forma intramuscular na coxa, utilizando uma seringa de insulina simples
de 50 unidades. Após a aplicação da anestesia, deu-se início na retirada do tecido da região
dorsal , epiderme e derme, ilustrado na Fig.3.10. Foram retiradas duas amostras, utilizou-se
o lado direito do dorso como antímero experimental, e o lado esquerdo serviu de controle do
próprio animal.
Figura 3.10: A Fig.3.10, ilustra o momento da coleta do material, epiderme e derme.
Logo após a retirada de cada tecido, foram colocadas nos cassetes com papel filtro e mer-
gulhadas em formoldeído 10% (para cada 90ml de água destilada foi colocado 10ml de formol).
Após a coleta do material, os animais foram decapitados ainda anestesiados.
3.3.3 Análise das Imagens
A análise das imagens foram realizadas de forma qualitativa juntamente com o patolo-
gista Prof Dr. Carlos Benatti Neto do laboratório de Odontologia de Fisiologia e Patolo-
gia da Universidade Estatual de São Paulo, (UNESP) de Araraquara. Conforme os resul-
tados das análises por microscopia, apresentaram-se algumas modificações no tecido. Afim
de tornar a análise mais precisa, viu-se a necessidade de realizar análise quantitativa através
de um programa analisador de imagens Image Tool como mostra a Fig.3.11, retirado do site
http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html. Com este software foram realizadas medidas da espes-
sura da epiderme, com a finalidade de constatar se realmente as amostras irradiadas apresentavam-
se mais espessas.
Foram realizadas medidas morfométricas da epiderme através das fotos dos cortes histológi-
29
Figura 3.11: A figura ilustra a barra do programa image tool utilizada para realizar as medidasda espessura da epidereme e calibrar as imagens.
cos, comparando as amostras do lado esquerdo e as do lado direito que receberam tratamento.
As fotografias foram obtidas sob microscopia de luz com aumento de 200x. O microscópio
utilizado foi um Olympus BX51 e a câmera digital da marca Olympus Camedia C-5060, 5.1
mega pixels. As imagens foram calibradas conforme a régua do microscópio utilizado. Para
obtenção das medidas da espessura da epiderme de cada uma das amostras foi realizada uma
análise quantitativa das imagens dos cortes histológicos, utilizando o software Image Tool. O
software foi calibrado, utilizando-se a imagem de uma régua fotografada no mesmo aumento
e todas as imagens foram analisadas mediante esta calibração. Foram realizadas 4 medidas da
espessura da epiderme em regiões aleatórias. Este procedimento foi feito nas 6 amostras de
cada grupo, obtendo 120 medidas para cada lado (LE e LD). Os resultados de cada grupo foram
submetidas à análise estatística por meio do teste de variância ANOVA "one way"com nível
de significância de 1% e complementado com o post hoc de Tukey, para verificar a existência
de diferenças significantes entre as médias dos grupos. A análise dos dados quantitativos foi
realizado com a biblioteca de estatística do Excel e o programa Bioestat 3.0.
4 Resultados e Discussão
4.1 Resultados Qualitativos e Quantitativos
4.1.1 Resultados Qualitativos
Os dados do estudo form analisados de forma qualitativa, comparando as amostras do lado
esquerdo (controle) com as do lado direito (experimental). As lâminas foram analisadas pelo
patologista Dr. Prof. Carlos Benatti Neto do laboratório de Odontologia de Fisiologia e Pa-
tologia da Universidade Estatual de São Paulo, (UNESP) da cidade de Araraquara. Segue-se
a seqüência das fotos histológicas, com a finalidade de demonstrar os resultados das análises
qualitativas. Pode-se observar na Fig.4.1. (A) o corte histológico controle do grupo I, os de-
mais representam os grupos experimentais irradiados com 0,5 até 2,0 W/cm2. Os cortes foram
fotografados com aumento de 200x.
31
(A) (B)
(C) (D)
(E) (F)
Figura 4.1: A figura(A) representa o corte histológico do grupo I da amostra do lado esquerdo quenao recebeu irradiação, referencial para comparar os outros cortes que receberam irradiação; a figura(B)mostra o corte histológico da amostra coletada do lado direito, que foi aplicado ultra-som desligado(placebo); a figura (C) referente ao grupo II irradiado com 0,5W/cm2; a figura (D) amostra do grupo IIIirradiada com 1,0W/cm2; o corte da figura (E) do grupo IV irradiada com 1,5 W/cm2e o corte histológicoda figura (F) do grupo V irradiada com 2,0 W/cm2; Obserava-se nas figuras (D, E e F) dos cortes his-tológicos que ocorre um aumento na espessura da epiderme quando comparadas com as figura (A e B),controle e placebo, representado pelas flechas pretas. Os triângulos mostram a alteração nas fibras decolágeno da derme das figuras (D, E e F) quando comparadas com as figuras (A e B). As setas inteirasabaixo da epiderme indicam um discreto infiltrado inflamatório principlmente a partir das figuras (E e F)
32
4.1.2 Resultados Quantitativos
A análise dos dados quantitativos foi realizada com a biblioteca de estatística do Excel do
Excel e com o programa Bioestat 3.0. Os testes realizados procuraram diferenciar os exper-
imentos, indicando possíveis alterações do tecido biológico. Para isso foi realizada a análise
de variância ANOVA e o teste "pos hoc"de Tukey aplicados entre os grupos. Ambos testes
indicaram que o grupo I possui a menor média na espessura da epiderme (29,25 µm ±6,53),
quando comparado com os grupos III (40,62 µm ±9,49), IV (45,32 µm ±9,43) e V (43,91 µm
±9,55) e as diferenças significativas (p < 0,01). Estes dados mostram que os grupos irradiados
com intensidades mais elevadas apresentaram as maiores médias.
Figura 4.2: O gráfico ilustra as duas medidas realizadas separadamente do lado direito e es-querdo das amostras.
4.2 Discussão
As altas intensidades utilizadas em tratamentos estéticos é uma das principais preocupações
deste estudo. Sabe-se que o ultra-som é utilizado com muita freqüência nas clínicas, para fins
terapêuticos e estético. Entretanto, pesquisas revelam dados infundados referentes à intensi-
dade, tempo de exposição e as condições de calibragem dos aparelhos de ultra-som (SPEED,
2001). Observa-se na prática clínica que há uma dificuldade de programar uma dosimetria de
ultra-som adequada aos diferentes casos por parte dos profissionais. Verifica-se esta dificul-
dade no estudo de (STUART; JOAN, 2002) sobre o uso e dosagem do ultra-som na fisioterapia
33
disportiva. O objetivo dos autores foi investigar o uso e a dosagem do ultra-som terapêutico
utilizada pelos fisioterapeutas australianos com interesse direcionado para as lesões no esporte.
Distribuíram 355 questionários, divididos em quatro sessões: características terapêuticas, uso
do ultra-som, dose do ultra-som e questões finais. Os autores concluíram que apesar da grande
freqüência de uso do aparelho nas clínicas, existem poucas diretrizes adequadas sobre o uso e a
dose do ultra-som terapêutico na prática clínica.
Percebe-se também, grandes problemas metodológicos dos estudos sobre ultra-som tera-
pêutico. Em uma pesquisa investigando 35 artigos, entre 1975 e 1999, sobre os efeito do ultra-
som terapêutico baseada em testes controlados randomizados apenas 10 estavam nos padrões
metodológicos aceito (BAKER; ROBERTSON., 2001).
Outro fator que dificulta a exatidão das pesquisas esta realcionado com o fator da calibração
do aparelho. (GUIRRO et al., 1997) pesquisou a intensidade acústica média temporal e média
espacial dos aparelhos de ultra-som utilizados nas clínicas da cidade de Piracicaba, com o ob-
jetivo de analisar se haveria alguma diferença entre a intensidade que o painel do equipamento
registra com a intensidade distribuída do transdutor. Mostrou que a maioria dos equipamentos
emitiam energia acima de 30%, ultrapassando o valor das especificações propostas pela norma.
Outro estudo com objetivo de avaliar a calibragem dos equipamentos de ultra-som utilizados
nas clínicas, pesquisando nas diferentes intensidades (0.5, 1.0 1.5 e 2.0 W/cm2). Os autores
concluíram que dos 83 aparelhos aferidos, um terço estava fora dos padrões medidos, sendo
necessário melhorias nas condições de funcionamento dos aparelhos de US para se ter confia-
bilidade na aplicação e nos resultados (ARTHO et al., 2002).
Pode-se observar o quanto é preocupante as altas intensidades, conforme o estudo de (ARA-
UJO et al., 2003) sobre o efeito do ultra-som na veia auricular de coelhos, que apresentou como
objetivo avaliar o risco potencial do ultra-som no sistema venoso. Foi constatado que com in-
tensidade de 3 W/cm2no modo contínuo houve a indução de trombose venosa e um aumento
dos linfócitos de forma significativa, podendo ser observada macroscopicamente por apresen-
tar edema, eritema e calor. As imagens do trabalho evidenciam lesão na parede vascular com
extravasamento de células.
Por outro lado, em certos tratamentos as intensidades mais altas são eficazes. Como no
estudo de (NG et al., 2003), que avaliaram os efeitos do ultra-som terapêutico nas propriedades
estruturais e funcionais na cicatrização do tendão de aquiles. Foram divididos em 3 grupos:
Controle, grupo de baixa dose irradiados com intensidade de 1.0W/cm2 e grupo de alta dose
utilizando 2.0W/cm2. Os autores concluíram que houve um aumento significativo das pro-
priedades estruturais e funcionais do tendão dos grupos irradiados quando comparados com o
34
grupo controle. Consideraram que baixas doses e altas doses do ultra-som terapêutico aceleram
o processo de cicatrização do rompimento de tendão. Diante destes resultados torna-se impor-
tante salientar que não foram avaliados os tecidos mais superficiais como epiderme e derme.
Neste sentido, resultados obtidos por (CUNHA; PARIZOTTO; VIDAL, 2001) demon-
straram que na comparção de ultra-som contínuo e pulsado em baixa intensidade, o primeiro
provocou no tendão pioras na reparação tendínea, enquanto na forma pulsada, houve uma ace-
leração na fibrilogênese cerca de 90% superior ao controle. Isso mostra os riscos de se utilizar
doses elevadas na forma contínua de ultra-som para tratamento em tecidos profundos. Pode-
se imaginar que na trajetória da onda sonora possa ter havido alterações teciduais também,
porém não foram avaliados neste trabalho. Os trabalhos (DYSON; POND; WARICK., 1968)
e (DYSON, 1987) mostram que uma cicatrização de melhor qualidade e em condições mais
adequadas para os tecidos com doses baixas do ultra-som, onde se reduzem os efeitos térmicos
mais pronunciados. Os autores sugerem doses abaixo de 0,5 W/cm2.
Diante dos resultados obtidos no presente estudo, sugere-se que a aplicação do ultra-som
também gerou alterações no tecido epitelial sadio de ratos Wistar. Obteve-se um notório au-
mento na espessura da epiderme conforme a figura 4.1 (C, D, E e F). Isso provavelmente ocorreu
por estímulo na mitose das células da camada basal da epiderme. As evidências encontradas nos
resultados apresentam uma relação com o trabalho realizado por (SILVA, 2007), que avaliou o
efeito do ultra-som pulsado na atividade mitótica androgênica das células de Leydig, levando a
um aumento na velocidade do ciclo celular. Estas evidências mostram o papel da camada proli-
ferativa da epiderme no processo de renovação celular, que mostrou ser susceptível à influênica
da energia do ulta-som.
No estudo de (BOUCAUD et al., 2001) os autores também encontraram alterações no tecido
epitelial. Eles pesquisaram o efeito biológico que o ultra-som pode causar com a fonoforese.
As amostras de pele in vitro, que foram irradiadas acima de 2,5 W/cm2apresentaram lesão.
Realizaram também, em tecido epitelial de ratos in vivo e constataram lesões mais profundas,
entre as quais necrose capilar e muscular. Tais dados corroboram os achados deste trabalho.
Conforme a análise histológica do presente estudo, também observou-se alterações das fi-
bras localizadas na região da derme. Na figura 4.1 (D, E e F) pode ser observada a ocorrência do
seu adelgaçamento, podendo indicar uma perda da resistência mecânica da pele. Este adelgaça-
mento pode de certa forma gerar uma desorganização das fibras. Resultados parecidos foram
constatados no trabalho realizado por (VISNARDI., 2007), que pesquisou o efeito do ultra-
som de baixa intensidade em colágeno da pele sadia de ratos e mostrou por meio da análise de
birrefringência textural (intrínsica), que houve uma desorganização das fibras colágenas, prin-
35
cipalmente na camada mais profunda da derme.
Outra alteração presente neste estudo foi a observação de um discreto infiltrado inflamatório
abaixo da epiderme das amostras irradiadas acima de 1 W/cm2, o que pode estar relacionado
com o aumento da temperatura tecidual local. Este aumento de temperatura pode se relacionar
ao comportamento do campo acústico do ultra-som que apresenta-se de forma irregular. Devido
a isso, pode acontecer picos de intensidade gerando maior aquecimento em algumas regiões do
tecido.
Neste trabalho, a coleta do material foi realizada no mesmo dia após a última aplicação
do US. Com isso pode-se considerar que as alterações obtidas no tecido epitelial sejam de
um caráter mais agudo. No entanto é importante salientar que estas alterações ocorreram com
apenas 4 dias de aplicação. Já nos tratamentos estéticos, geralmente são realizados mais de 20
sesssões com intensidades bastante altas (nas faixas entre 2.5 à 3.0 W/cm2), maiores do que as
utilizadas neste trabalho.
Conforme os resultados morfométricos apresentados na figura 4.2, observou-se um aumento
linear em relação às medidas da espessura da epiderme até a intensidade de 1.0 W/cm2. Nos
grupos irradiados com 1.5 e 2.0 W/cm2, este aumento foi mantido. Aparentemente houve uma
resposta máxima de mitose nas células da camada basal, resultando em espessuras semelhantes
ao final dos 4 dias de tratamento. Em um trabalho de revisão de literatura sobre dosimetria do
ultra-som (BLUME et al., 2005), relatam que as altas dosagens como 1.5 e 2.0 W/cm2, podem
ser menos efetivas do que as doses baixas. Além disso, os autores chamam a atenção que nas
aplicações clínicas se observa evidências de que as altas intensidades não são tão eficientes.
Diante disso, sugerem que os profissionais preferencialmente utilizem subdoses do que super-
doses, por serem mais efetivas e correrem menor risco de lesão.
Além de apresentar uma escassa literatura sobre efeitos do ultra-som no tecido sadio, faz-se
necessário mais estudos clínicos dos efeitos biofísicos do ultra-som (BAKER; ROBBERTSON;
., 2001). Portanto, sugere-se com os resultados deste estudo, que haja uma grande precaução
no uso do ultra-som, especialmente nos tratamentos estéticos, cujas doses são elevadas, o que
pode ocasionar lesões, algumas delas internas, que só deverão aparecer as consequências algum
tempo depois.
5 Conclusão
Os resultados obtidos neste estudo indicaram que o ultra-som em tecido sadio de ratos al-
tera as estruturas do tecido epitelial. Foi observado que houve um aumento na espessura da
epiderme. Isso pode estar relacionado com o estímulo da mitose das células da camada basal
localizadas na epiderme. O discreto processo inflamatório observado abaixo da epiderme, pode
ter sido pelo comportamento irregular do feixe do campo próximo do ultra-som, isso pode
gerar picos de intensidades levando a um aumento da temperatura local. Mostrou-se também,
um adelgaçamento das fibras podendo indicar uma redução da resistência da pele. Em re-
lação às intensidades aplicadas em cada grupo, constatou-se que a partir de 1 W/cm2houve uma
manutenção da grande espessura da epiderme evidenciado já com doses inferiores. Isso pode
indicar o limite de exposição a ser utilizado, evitando aplicações com intensidades maiores,
pois poderia causar lesões importantes nos tecidos profundos. Sugere-se estudos que observem
os efeitos de longo prazo das aplicações de ultra-som, a fim de verificar as alterações per-
manecerão e como ocorre o processo de reparo destas lesões mais cronicamente determinadas.
Diante disto, torna-se relevante maiores estudos do ultra-som nos tecidos sadios, avaliando estas
alterações morfológicas e bioquímicas, e principalmente os mecanismos de ação que geram tais
modificações, por meio de técnicas de biologia molecular, antes de ser aplicado amplamente
nos tratamentos estéticos, como hoje acontece.
37
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6 Apêndice
6.1 Apêndice (A)
Rotina Histológica e Coloração
As amostras saem do formal 10% e são lavadas durante 24h em água corrente. São então
mantidaas em álcool 70%. Para se realizar a inclusão em parafina as peças são desidratadas em
uma seqüência de banhos em álcool. Alguns protocolos costumam passar por um banho de 1
hora em álcool 80%, outros de 1 hora em álcool 90% e depois uma seqüência de banhos em
álcool absoluto. Nas amostras foram utilizadas álcool 70% para o absoluto diretamente. Foram
feitos de 7 a 8 banhos de 1 hora cada em álcool absoluto, posteriormente mais 1 hora em álcool
(xilol), mais 1 hora no primeiro banho de xilol e um absoluto finalmente um último banho em
xilol por mais 1h.
Retira-se o excesso de xilol das peças com a ajuda de papel absorvente e imediatamente as
peças são colocadas no primeiro banho de parafina derretida 60o C. As peças permaneceram
nesse banho por pelo menos 2 horas, depois foram transferidas para um segundo banho em
parafina de boa qualidade e colocadas numa estufa a vácuo por mais 2 horas. Só então foram
confeccionados os blocos. Depois de solidificada e fria estão prontos para se obter os cortes.
Os cortes histológicos foram realizados na Universidade Federal de São Carlos (UFSCar),
no departamento de Fisiologia e a coloração das lâminas em heosina e hematoxilina foi realizada
no departamento de hidrobiologia. As lâminas foram avaliadas pelo patologista da Universidade
Estadual de São Paulo (UNESP).
41
6.2 Apêndice(B)
Tabelas com as medidas da espessura da epiderme do lado esquerdo e direito das amostras.
Medidas Epiderme (LE)(GI) (GII) (GIII) (GIV) (GV)14,27 7,07 14,13 9,51 12,3712,49 9,01 12,37 14,57 12,7416,00 8,83 15,9 12,86 14,2414,3 9,99 14,29 12,49 11,8512,86 11,31 8,83 12,57 19,4317,87 12,37 14,57 17,67 15,216,29 10,6 18,02 15,2 15,216 11,85 17,67 14,24 21,2712,86 10,6 17,67 7,07 12,3711,31 5,30 18,45 9,01 19,5110,6 9,51 22,97 9,01 1612,49 10,6 10,6 10,3 15,812,37 7,07 19,75 14,13 14,5710,6 8,83 14,13 14,24 17,7610,6 9,51 17,67 16 13,88,83 10,6 16 15,9 17,412,49 9,51 10,6 12,49 22,9712,37 7,07 10,6 10,3 19,4313,8 8,83 10,6 12,74 22,5912,37 10,6 12,49 10,6 18,0212,49 10,6 14,24 18,45 17,769,01 12,37 11,31 15,1 16,2912,74 12,49 13,84 10,75 15,814,13 9,51 16,29 12,37 15,8
Média 12,88 9,68 14,70 12,9 16,6Desvio Padrão 2,21 1,82 3,47 2,9 3,12
Tabela 6.1: A tabela, demonstra as 4 medidas em micrômetro realizadas em todas as amostrasna epiderme de cada grupo do lado esquerdo e também a média e desvio padrão de cada uma
42
Medidas Epiderme (LD)(GI) (GII) (GIII) (GIV) (GV)38,91 38,91 60,48 44,6 44,1731,85 33,75 43,74 40,64 58,3317,76 39,03 46,07 49,47 37,1423,04 31,46 34,12 35,51 44,4732,16 34,98 37,14 37,48 64,2121,27 35,8 28,27 54,8 55,8736,38 29,98 29,25 53,27 55,633,19 26,06 31,85 42,64 55,5630,09 28,32 40,30 37,1 32,5826,5 32,58 42,28 54,77 41,0930,03 33,19 48,09 35,38 35,226,91 36,25 41,02 42,73 34,334,12 39,98 36,76 29,91 30,0342,73 32,58 53,03 33,75 33,5726,5 42,4 52,71 39,7 39,731,46 36,38 47,83 34,71 56,1517,67 40,29 33,75 56,54 38,1429,25 40,67 26,5 47,74 50,5926,56 23,7 53,03 47,83 31,8538,91 37,81 42,48 57,03 44,230,03 44,7 46,64 46,38 39,2319,43 40,98 42,44 40,64 44,4930,86 32 22,86 59,78 44,226,5 30,09 34,3 65,39 43,31
Média 29,25 34,87 40,62 45,37 43,91Desvio Padrão 6,53 5,62 9,49 9,42 9,55
Tabela 6.2: A tabela, demonstra as 4 medidas em micrômetro refrentes a espessura da epi-derme com os vlores de cada grupo juntamente com a média e desvio padrão de cada uma.GI(Placebo),GII(0.5W/cm2), GIII(1.0W/cm2), GIV(1.5W/cm2) e GV(2.0W/cm2).
7 Anexos
7.1 Anexo (A)Certificado do Comitê de Ética