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ALEXANDRE THOMAZ
Caracterização genotípica de Cryptosporidium spp. isolados de amostras fecais
de felinos, caninos e bovinos no Estado de São Paulo
São Paulo 2006
ALEXANDRE THOMAZ
Caracterização genotípica de Cryptosporidium spp. isolados de amostras fecais de felinos,
caninos e bovinos no estado de São Paulo
São Paulo 2006
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Epidemiologia Experimental e Aplicada às Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção de título de Mestre em Medicina Veterinária Departamento: Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal Área de Concentração: Epidemiologia Experimental e Aplicada às Zoonoses Orientadora: Profa. Dra. Solange Maria Gennari
Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO
(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)
T.1770 Thomaz, Alexandre FMVZ Caracterização genotípica de Cryptosporidium spp. isolados de
amostras fecais de felinos, caninos e bovinos no estado de São Paulo / Alexandre Thomaz. – São Paulo: A. Thomaz, 2006. 55 f. : il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, 2006. Programa de Pós-Graduação: Epidemiologia Experimental e Aplicada às Zoonoses. Área de concentração: Epidemiologia Experimental e Aplicada às Zoonoses. Orientadora Profa Dra Solange Maria Gennari.
1. Cryptosporidium. 2. Caracterização genotípica. 3. Cães. 4. Gatos. 5. Bovinos. I. Título.
FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome: THOMAZ, Alexandre Título: Caracterização genotípica de Cryptosporidium spp. isolados de amostras fecais de felinos,
caninos e bovinos no estado de São Paulo
DATA_____/_____/_____
Banca Examinadora
Prof. Dr. __________________________________ Instituição: _____________________ Assinatura: ________________________________ Julgamento: ____________________ Prof. Dr. __________________________________ Instituição: _____________________ Assinatura: ________________________________ Julgamento: ____________________ Prof. Dr. __________________________________ Instituição: _____________________ Assinatura: ________________________________ Julgamento: ____________________
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Epidemiologia Experimental e Aplicada às Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária
Dedico este trabalho ao meu irmão, que por também ter escolhido esta
importante e gloriosa profissão de Médico Veterinário conhece o árduo caminho do
conhecimento e do sucesso, por me confortar nos momentos difíceis e me direcionar
sempre na melhor direção na estrada da vida.
Não poderia esquecer meu grande amigo de adolescência Léo, que hoje está
olhando por nós lá do céu, junto a Deus, mas sua amizade, alegria e perseverança
estarão sempre ao nosso lado.
Dedico também a todos os animais, que expressam seus sentimentos com
olhares, sons, cheiros, movimentos, onde alguns iluminados conseguem interpretar
corretamente.
Agradecimentos Especiais • À Deus pois ele está em todos os lugares, antes de tudo. • À minha amável esposa, Emily Mullins Thomaz, pelo incentivo, paciência,
companheirismo e dedicação à família.
• Aos meus queridos pais pelo apoio, incentivo e ensinamentos que levarei por toda minha
vida.
• Ao meu irmão e sua família, companheiro de profissão, companheiro na vida, pelo apoio e
consideração.
• À minha querida irmã e sua família pelo respeito, consideração e grande exemplo de
batalha e sucesso na vida.
• Ao meu grande amigo canino Scan pelo conforto e amizade em todos os momentos.
Agradecimentos
• À Profa. Dra. Solange Maria Gennari pela amizade, ensinamentos e voto de confiança. • Ao Prof. Dr. Rodrigo Martins Soares pela amizade e valiosos ensinamentos.
• Ao Prof. Dr. Sílvio Arruda Vasconcelos pelo respeito, amizade, consideração e
ensinamentos.
• Ao Prof. Dr. Marcelo Vasconcelos Meireles pelos grandes ensinamentos, incentivo,
paciência e consideração.
• À Dra Hilda Fátima de Jesus Pena pela amizade, ensinamentos e colaboração na
elaboração do trabalho.
• À Profa. Dra. Maria Anete Lallo pelo incentivo e consideração. • Ao Prof. Msc. Marconi Rodrigues de Farias pela consideração, amizade, ensinamentos e
grande sabedoria.
• Ao Prof. Dr. Márcio Garcia Ribeiro pelo respeito e valiosos ensinamentos.
• Ao amigo e colega de profissão Eduardo Marrach pela amizade e consideração.
• Aos amigos Médicos Cláudio Esteves Tatsui, Marcel Vaccari, Jeisner de Ávila Godoi,
pelo apoio, estima e consideração.
• Agradeço a todos sem exceção do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e
Saúde Animal da Universidade de São Paulo, dentre eles, Professores, Pós-Graduandos,
Residentes, Estagiários, Funcionários e pessoal da Secretaria.
• Agradeço aos funcionários da biblioteca Virginie Buff D’ Ápice da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo pela grande ajuda na
normalização deste trabalho.
• Agradeço à FAPESP pela bolsa auxílio do projeto de pesquisa (Processo no 04/04982-3).
• Agradeço à CAPES demanda social pela bolsa auxílio individual. • Agradeço ao laboratório de Diagnóstico Veterinário Zoolab situado em Santo André-SP
por fornecer gentilmente amostras de cães e gatos para investigação parasitológica.
• Agradeço à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo
pela oportunidade.
“ Nós desejamos sugerir uma estrutura para o sal Deoxiribose
do Ácido Nucléico (D.N.A.). Esta estrutura tem características
inéditas que são de considerável interesse biológico.”
(1o parágrafo do artigo de Watson & Crick
descrevendo a estrutura molecular do Ácido
Nucléico. Nature, 25 de abril de 1953.)
RESUMO
THOMAZ, A. Caracterização genotípica de Cryptosporidium spp. isolados de amostras fecais de felinos, caninos e bovinos no estado de São Paulo. [Genotipic characterization of Cryptosporidium spp. isolates from fecal samples of felines, canines and bovines in the State of São Paulo]. 2006. 55 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.
Cryptosporidium é um coccídeo que acomete peixes, répteis, anfíbios, aves e mamíferos. O
papel dos animais na dinâmica de transmissão deste agente ao homem é pouco conhecido e a
ocorrência na população animal é motivo de preocupação para a saúde pública, devido ao
potencial zoonótico. O objetivo deste estudo foi obter informações de natureza
epidemiológica pela caracterização genotípica de isolados de gatos, cães e bovinos do Estado
de São Paulo e avaliar a diversidade nucleotídica das seqüências obtidas. Foi realizada a
extração de DNA dos oocistos e a amplificação destes pela reação em cadeia da polimerase
(Nested PCR) utilizando primers específicos para a amplificação de fragmentos do gene
codificador da subunidade 18S do RNA ribossômico e posterior sequenciamento. Através do
exame de fezes de 106 amostras de felinos, 119 de caninos e 123 de bovinos foi observada
positividade em três (2,8%), 15 (12,6%) e 21 (17,1%), respectivamente. Nas amostras
positivas de bovinos a análise morfológica revelou 16 (76,2%) como Cryptosporidium tipo
parvum e cinco (23,8%) como Cryptosporidium andersoni. Para a análise genotípica amostras
anteriormente obtidas, foram associadas, sendo analisadas sete amostras de gatos, nove de
cães e nove de bovinos. Das sete amostras de gatos a análise genotípica revelou, em todas,
Cryptosporidium felis, sendo estas as primeiras caracterizações genotípicas de isolados de
felinos domésticos no Brasil. Nas nove amostras de cães seqüenciadas revelou-se identidade
genotípica compatível com Cryptosporidium canis em todas as amostras, sugerindo que esta
espécie está conservada no Estado de São Paulo. A análise genotípica das amostras de
bovinos revelou Cryptosporidium parvum Eire I em duas amostras, Cryptosporidium parvum
genótipo bovino em seis amostras e Cryptosporidium bovis em outra amostra sendo, esta
última espécie, não zoonótica, e não relacionada a sintomas clínicos e sendo descrita pela
primeira vez no Brasil.
Palavras-Chave: Cryptosporidium. Caracterização genotípica. Gatos. Cães. Bovinos.
ABSTRACT
THOMAZ, A. Genotipic characterization of Cryptosporidium spp. isolates from fecal samples of felines, canines and bovines in the State of São Paulo. [Caracterização genotípica de Cryptosporidium spp. isolados de amostras fecais de felinos, caninos e bovinos no estado de São Paulo]. 2006. 55 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.
Cryptosporidium is a coccidia which contaminates fish, reptiles, amphibians, birds and
mammals. The animals role in the transmission dynamics of this protozoa to man is not well
known and its occurrence in the animal population is a cause for concern to public health due
to its zoonotic potential. The objective of this study was to obtain information of
epidemiological nature by genotypic characterization of isolates from dogs, cats and bovine
from the State of São Paulo and to evaluate nucleotidic diversity of the existing sequences.
The extraction of DNA from oocists was carried out and the amplification was made by the
polymerase chain reaction (Nested PCR) using specific primers for the amplification of
fragments from the code gene of subunit 18S of ribosomal RNA and post sequencing.
Through a feces examination, in 106 cat samples, 119 dog samples and 123 bovine samples,
positivity was observed in three (2.8%), 15 (12.6%) and 21 (17.1%), respectively. In the
positive bovine samples the morphologic analysis revealed 16 (76.2%) as Cryptosporidium
type parvum and five (23.8%) as Cryptosporidium andersoni. For the purpose of genotypic
analyses, previously obtained samples, were associated, with analyses of seven cat samples,
nine dog samples and nine bovine samples. From the seven cat samples the genotypic
analyses, revealed Cryptosporidium felis in all. These were the first genotypic
characterizations of Cryptosporidium from domestic felines in Brazil. In nine sequenced
samples from dogs, genotypic identities compatible with Cryptosporidium canis, were
revealed in all samples, suggesting that this species is conserved in State of São Paulo. The
genotypic analysis in bovines revealed Cryptosporidium parvum Eire I in two samples,
Cryptosporidium parvum bovine genotype in six samples and Cryptosporidium bovis in
another sample, the last one being a non zoonotic species, not related to clinical symptoms
and described for the first time in Brazil.
Key Words: Cryptosporidium. Genotypic characterization. Cats. Dogs. Bovines.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 1 - Espécies de Cryptosporidium spp. descritas e validadas com base em estudos fenotípicos e genotípicos (Adaptado de ARAÚJO, 2004) ................ 18
Figura 1 - Ciclo Biológico de Cryptosporidium spp. ...................................................... 20 Foto 1 - Gel de agarose à 1,5% corado com brometo de etídio mostrando
produtos de Nested PCR de aproximadamente 815pb: 1- Ladder 100pb, 2- C. felis(Amostra-12), 3- C. canis(Amostra-41), 4- C. parvum genótipo bovino(Amostra-23), 5- C. bovis(Amostra-37), 6- Nulo, 7- C(+), 8- C(-) ................................................................................................... 35
Foto 2 - Gel de agarose à 1,5% corado com brometo de etídio mostrando
produtos de Nested PCR de aproximadamente 815pb: 1- C(+); 3- Amostra bovina; 5- Amostra canina; 9- C(-); 10- Amostra bov. 2,5µl DNA; 12- Amostra bov. 5,0µl DNA; 14- Amostra bov. 2,5µl DNA lavagem da lâmina; 16- Amostra bov. 5,0µl DNA lavagem da lâmina; 2,4,6,7,8,11,13,15- Nulo................................................................................. 39
Foto 3 - Gel de agarose à 1,5% corado com brometo de etídio mostrando
produtos de Nested PCR de aproximadamente 815pb, comparando quantidade de DNA utilizada e intensidade luminosa da banda gerada em amostra canina: 1- C(+); 2,3,4,5- Nulo; 6- Amostra can. 2,5µl DNA; 7- Amostra can. 5,0µl DNA; 8- C(-) ................................................... 40
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Prevalência de Cryptosporidium spp. em pacientes imuno
competentes e com HIV ............................................................................. 26 Tabela 2 - Ocorrência de oocistos de Cryptosporidium spp. em amostras fecais
de gatos, cães e bovinos no Estado de São Paulo no período de Junho de 2004 a Maio de 2006 .............................................................................. 34
Tabela 3 - Morfometria e localização dos oocistos de Cryptosporidium spp.
isolados de gatos, cães e bovinos no Estado de São Paulo de 2004 a 2006 ............................................................................................................. 36
Tabela 4 - Análise genotípica das seqüências obtidas de gatos, cães e Bovinos
utilizando-se o gene 18S rRNA dos isolados de Cryptosporidium spp. no Estado de São Paulo de 2004 a 2006 .............................................. 37
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 15
1.1 Classificação .......................................................................................................... 16
1.2 Ciclo Biológico ....................................................................................................... 18
1.3 Patogenia e Sintomas Clínicos .............................................................................. 20
1.4 Diagnóstico ............................................................................................................. 21
1.5 Epidemiologia ........................................................................................................ 22
2 OBJETIVOS .......................................................................................................... 28
3 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 29
3.1 Amostras de Fezes ................................................................................................. 29
3.1.1 Cães e Gatos ............................................................................................................ 29
3.1.2 Bovinos .................................................................................................................... 29
3.2 Análise Morfométrica............................................................................................ 30
3.3 Purificação das Amostras ..................................................................................... 30
3.4 Extração de DNA dos Oocistos............................................................................. 31
3.5 Reação de Amplificação da Subunidade 18S do gene do RNA ribossômico............................................................................................................. 32
3.6 Sequenciamento dos Fragmentos Amplificados ................................................. 32
3.7 Alinhamento e Tradução das Seqüências de Nucleotídeos ................................ 33
4 RESULTADOS ..................................................................................................... 34
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 38
6 CONCLUSÃO........................................................................................................ 43
REFERÊNCIAS ................................................................................................... 44
15
1 INTRODUÇÃO
Em 1907 Ernest Edward Tyzzer, um parasitologista americano, descreveu um parasita
protozoário que encontrou em glândulas gástricas de camundongos de laboratório, observou a
formação de esporos (oocistos) e descreveu a transmissão fecal dos oocistos em alimento
contaminado Tyzzer1 (1907 apud DUBEY et al., 1990, p. 2), demonstrando, já naquela época, a
transmissão fecal-oral do patógeno. Três anos mais tarde Tyzzer descreveu o mesmo organismo em
mais detalhes, propondo Cryptosporidium como um novo gênero e Cryptosporidium muris como
uma nova espécie Tyzzer2 (1910 apud DUBEY et al., 1990, p. 2).
Tyzzer em 1912 Tyzzer3 (1912 apud DUBEY et al., 1990, p. 2) nomeou Cryptosporidium
parvum como segunda espécie após seu encontro no intestino delgado de camundongos,
fornecendo novamente muitos detalhes morfológicos e distinguindo-a de C. muris através de
infecção experimental em camundongo, sendo o primeiro a relatar criptosporidiose acometendo
aves após encontrar todos os estágios de desenvolvimento no epitélio cecal de galinhas Tyzzer4
(1929 apud DUBEY et al., 1990, p. 2).
Uma nova espécie, Cryptosporidium meleagridis, foi descrita por Slavin (1955), causando
doença e morte em perus jovens, no entanto, o interesse veterinário pelo parasito se deu nos anos
70, quando Pansiera, Thomassen e Garner verificaram que Cryptosporidium estava associado à
doença diarréica em bezerros (FAYER et al., 1997). Hoje se sabe que Cryptosporidium ocorre em
diferentes animais vertebrados, dentre peixes, répteis, anfíbios, aves e mamíferos (DILLINGHAM,
2002; FAYER et al., 2000; GREEN et al., 2003; TZIPORI, WARD, 2002; MONIS, THOMPSON,
2003).
Há poucos relatos de infecção por Cryptosporidium em cães, com a maioria dos casos
envolvendo filhotes com menos de seis meses de idade. A primeira evidência de Cryptosporidium
spp. nessa espécie foi registrada em 1981 por Tzipori e Cambell que detectaram anticorpos em 16
de 20 amostras de soro. Associação do agente com processo de doença foi descrito em 1983
quando o parasita foi detectado em um cão com cinomose (WILSON et al., 1983), demonstrando
quadro imunossupressivo e o aparecimento da enfermidade parasitária.
1 Tyzzer, E.E., A sporozoan found in the peptic glands of the common mouse. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., v. 5, p. 12, 1907. 2 Tyzzer, E.E, An extracellular coccidium, Cryptosporidium muris (gen. et sp. nov.), of the gastric glands of the common mouse. J. Med. Res., v. 23, p. 487, 1910. 3 Tyzzer, E.E., Cryptosporidium parvum (sp. nov.), a coccidium found in the small intestine of the common mouse. Arch. Protistenkd., v. 26, p. 394, 1912. 4 Tyzzer, E.E., Coccidiosis in gallinaceous birds. Am. J. Hyg., v. 10, p. 269, 1929.
16
Em gatos, Cryptosporidium foi primeiramente relatado no Japão (ISEKI, 1979). Desde
então, o parasito foi descrito em gatos assintomáticos e sintomáticos com diarréia persistente,
anorexia e perda de peso (MONTICELLO et al., 1987). O potencial para transmissão zoonótica
entre gatos e humanos foi demonstrado seguindo a infecção de filhotes com seis semanas de vida,
inoculados oralmente com oocistos de Cryptosporidium obtidos de uma pessoa imunodeficiente
(CURRENT et al., 1983). O agente também foi encontrado em uma criança de oito anos de idade
que tornou-se infectada com Cryptosporidium após contato com um gato infectado (EGGER et al.,
1990). No entanto, o melhor caminho para se determinar uma transmissão zoonótica é comparar os
isolados de Cryptosporidium de diferentes hospedeiros usando métodos moleculares e
caracterização genética destes isolados (SARGENT et al., 1998).
No homem, a presença de Cryptosporidium foi registrada pela primeira vez em 1976, com a
descrição de dois diferentes casos clínicos: um de diarréia aguda auto-limitada envolvendo uma
criança imunocompetente (NIME et al., 1976) e outro de diarréia persistente acometendo um
indivíduo adulto submetido a tratamento imunossupressor (MEISEL et al., 1976). No início da
década de 80 foram relatados mais oito casos de criptosporidiose em humanos, sendo seis deles em
indivíduos comprovadamente imunocomprometidos, além de um surto envolvendo estudantes de
veterinária expostos a fezes diarréicas de bezerro (DILLINGHAN et al., 2002).
1.1 Classificação
A taxonomia e a filogenética do Cryptosporidium está passando por grandes alterações e há
evidências de que este agente tenha mais afinidade com protozoários gregarina do que coccídea,
talvez o mais interessante aspecto de uma ligação entre Cryptosporidium e os gregarinos, sugerido
por filogenia, é que parasitas do gênero Cryptosporidium spp. parecem estar mais relacionados a
alguns dos mais antigos parasitas do filo Apicomplexa, os arquigregarinos. Similaridades entre os
dois grupos incluem um ciclo de vida monoxênico, oocistos com quatro esporozoitas, uma
localização usual dentro do trato gastrointestinal do hospedeiro e gamontes extracelulares ou
trofozoítas. (BARTA; THOMPSON, 2006; HIJJAWI et al., 2002).
Cryptosporidium spp. são classificados como organismos PROTISTAS pertencentes ao Filo
APICOMPLEXA, Classe ESPOROZOASIDA, Subclasse COCCIDIASIDA, Ordem
EUCOCCIDIA, Subordem EIMERIINA, Família CRYPTOSPORIIDAE (LEVINE, 1984).
17
Algumas características de Cryptosporidium as diferenciam de outros coccídeos: sua
ocorrência em diferentes espécies hospedeiras, a resistência a agentes microbicidas, a ocorrência de
auto-infecção do hospedeiro com o excistamento de oocistos de parede fina na luz intestinal e,
curiosamente, a sua localização intracelular e extracitoplasmática na célula hospedeira (TZIPORI;
WARD, 2002).
Diversas espécies de Cryptosporidium foram descritas e nomeadas segundo o hospedeiro
em que foram encontradas, mas estudos baseados em aspectos morfológicos dos parasitos e em
ensaios de transmissão cruzada entre diferentes hospedeiros levaram à invalidação de muitas delas,
tanto que de cerca de 20 espécies descritas até 1997, somente oito eram tidas como válidas
(FAYER et al., 1997; MORGAN et al., 1999c). Até 2000, considerando características fenotípicas,
genotípicas, patogênicas e epidemiológicas eram reconhecidas 10 espécies de Cryptosporidium
(FAYER et al., 2000). Após essa data foram propostas e aceitas mais três espécies (ALVAREZ-
PELLITERO; SITJÀ-BOBADILLA, 2002; FAYER et al., 2001; MORGAN-RYAN et al., 2002;
XIAO et al., 2004a) e recentemente está sendo validado um isolado de suíno denominado
Cryptosporidium suis (pig genotype) (CAMA et al., 2003; RYAN et al., 2004), sendo muito
provável que outras espécies existam (XIAO et al., 2002). No quadro 1 são mostradas as espécies
atualmente aceitas pela maioria dos autores.
18
Espécie Hospedeiro tipo Autor
Cryptosporidium bovis (I)
Cryptosporidium andersoni (A)**
Cryptosporidium baileyi (B,C)
Cryptosporidium canis (I)
Cryptosporidium felis (I)
Cryptosporidium galli (I)
Cryptosporidium hominis*** (I)
Cryptosporidium meleagridis (I)
Cryptosporidium scophthalmi (I,E)
Cryptosporidium molnari (I)
Cryptosporidium nasorum
Cryptosporidium muris (E)
Cryptosporidium parvum (I)
Cryptosporidium parvum (I)****
Cryptosporidium saurophilum (I)
Cryptosporidium serpentis (E)
Cryptosporidium wrairi (I)
Cryptosporidium varanii
Cryptosporidium suis (I)
Bos taurus (boi)
Bos taurus (boi)
Gallus gallus (galinha)
Canis familiaris (cão)
Felis catus (gato)
Várias espécies de aves
Homo sapiens (homem)
Meleagridis gallapavo (peru)
Scophthalmus maximus (peixes)
Sparus auratus e Dicentrarchus
labrax (peixes marinhos)
Naso literatus (peixes)
Mus musculus (camundongo)
Mus musculus (camundongo)
Bos taurus (boi)
Eumeces schneideri (lacertíleo)
Várias espécies de répteis
Cavia porcellus (cobaio)
Emerald monitor (lagarto)
Sus scrofa (porco)
Fayer et al. (2005)
Lindsay et al. (2000)
Current et al. (1986)
Fayer et al. (2001)
Iseki (1979)
Pavlasek (1999); Ryan (2003)
Morgan-Ryan et al. (2002)
Slavin (1955)
Alvarez-Pellitero et al. (2004)
Alvarez-Pellitero e
Sitja-Bobadilla (2002)
Hoover et al. (1981)
Tyzzer (1910)
Tyzzer (1912)
Casemore et al. (1997)
Koudela e Moudri (1998)
Levin (1980)
Vetterlin et al. (1997)
Pavlasek et al. (1995)
Ryan et al. (2004)
*Baseado em Fayer et al. (1997, 2000, 2004a, 2005, 2006a,b); Monis e Thompson (2003); Morgan et al. (1999a,b); Xiao et al. (2000a,c; 2004a,b)
** Principal localização do parasito no hospedeiro: A-abomaso; B-bursa; C-cloaca; E-estômago; I-intestino.
*** Espécie conhecida como Cryptosporidium parvum genótipo I ou H ****Espécie conhecida como Cryptosporidium parvum genótipo II ou B
Quadro 1 - Espécies de Cryptosporidium spp. descritas e validadas com base em estudos
fenotípicos e genotípicos* (Adaptado de ARAÚJO, 2004)
1.2 Ciclo Biológico
Estudos de epidemiologia molecular mostraram que há, pelo menos, dois ciclos de vida
distintos envolvendo humanos, e uma outra série de outros ciclos de transmissão envolvendo
espécies bem adaptadas a hospedeiros específicos (THOMPSON, 2003).
19
Após estudos realizados com genótipos humanos e bovinos de C. parvum (isolados
morfologicamente idênticos) associado a informações sobre a biologia, foi proposto um genótipo
humano denominado Cryptosporidium hominis (Genótipo I) (MORGAN-RYAN et al, 2002),
entretanto o genótipo de bovinos Cryptosporidium parvum (Genótipo II) também é capaz de
infectar os humanos e outros mamíferos (OLSON et al., 2004b). Assim são considerados dois
ciclos de transmissão da criptosporidiose: um antroponótico, com a circulação de C. hominis entre
humanos, e outro zoonótico, com a circulação de C. parvum entre homens e outras espécies
hospedeiras, participando, principalmente bovinos, mas com o possível envolvimento de outros
animais (ABE et al., 2003; PENG et al., 1997; WIDMER et al., 1998).
Uma grande variedade de isolados genotipicamente distinta entre si vem sendo ainda
classificada como C. parvum. Muitas destas variantes, entretanto parecem ser específicas de
determinados hospedeiros, podendo representar espécies diferentes (MORGAN et al., 1999c, 2000;
THOMPSON et al., 2003; XIAO et al., 1999a, 2000a).
O ciclo de vida do parasita (Figura 1) é semelhante ao de outros coccídeos com algumas
diferenças. Os oocistos esporulados no intestino delgado excistam com a liberação de quatro
esporozoítas que atingem as células epiteliais do lúmen (MOORE et al., 1988; PRESTWOOD,
1990). Os esporozoítas aderem-se às células epiteliais, são englobados por microvilosidades e se
localizam em um vacúolo parasitóforo. Após a fixação na célula, modificações ultraestruturais
ocorrem no ápice da célula hospedeira bem como no parasita, resultando na formação de uma
organela de nutrição ou de fixação. Esta localização é denominada de intracelular
extracitoplasmática (POLHENZ et al., 1978). Os esporozoítas então se diferenciam em trofozoíta
iniciando a multiplicação assexuada ou merogonia resultante da divisão nuclear. Dois tipos de
merontes são formados: o tipo I com número de merozoítas variando entre seis a oito, e o tipo II,
com quatro merozoítas. Os merozoítas tipo I podem dar origem a novos merozoítas iguais ou do
tipo II; já os merozoítas tipo II parecem dar origem à fase sexual do ciclo ou gametogonia com a
diferenciação em estádios masculinos (microgametas) e femininos (macrogametas). Após a
fertilização ocorre a formação de zigoto dando origem a oocistos autoinfectantes de parede delgada
que excistam na luz intestinal e são capazes de iniciar um novo ciclo dentro do mesmo hospedeiro e
oocistos de parede espessa, altamente resistentes às condições ambientais, são eliminados no meio
ambiente através das fezes. A esporulação ocorre “in sito” com o desenvolvimento de quatro
esporozoítas. As dimensões e o formato dos oocistos de diferentes espécies apresentam discreta
variação (BIRD; SMITH, 1980; DUBEY et al., 1990; FAYER; UNGAR, 1986; TZIPORI, 1988).
20
*United States Department of Agriculture
Figura 1 – Ciclo biológico do Cryptosporidium spp. (Adaptado de USDA*)
1.3 Patogenia e Sintomas Clínicos
Os animais domésticos geralmente se infectam entre a primeira e quarta semana de vida e a
duração da infecção é pequena, ao redor de duas semanas. Em bovinos o pico da infecção e
eliminação de oocistos ocorre ao redor dos 14 dias de vida (OLSON et al., 2004a).
A patogenia do Cryptosporidium resulta da invasão e destruição dos enterócitos pelos
parasitas, com atrofia das vilosidades em grau variado, hiperplasia das células da cripta intestinal,
infiltração de células inflamatórias na lâmina própria e diminuição dos microvilos (CLARK;
SEARS, 1996). Argenzio et al. (1990), utilizando leitões infectados com C. parvum, observaram
estar prejudicada a absorção de sódio e água estimulada pela glicose no jejuno e íleo, comprovando
diarréia por má-absorção e três anos mais tarde os mesmos autores (ARGENZIO et al., 1993)
revelaram um componente secretório, induzido pelo parasita, com aumento na secreção de cloro,
causando diminuição da digestão e transporte dos nutrientes e o aparecimento de diarréia, apatia,
anorexia e dor abdominal.
21
A diarréia é de cor amarelo citrino e geralmente com muco, pode ser branda ou severa e
durar até duas semanas, levando a letargia, desidratação e anorexia, podendo, em infecções severas,
haver a morte do animal por desidratação e colapso cardiovascular (OLSON et al., 2004a).
Alguns pacientes humanos com criptosporidiose desenvolvem uma profusa diarréia aquosa
(mais que 2 litros por dia) a qual assemelha-se a diarréia secretória induzida por toxina da cólera,
levantando a uma hipótese de que C. parvum pode elaborar uma enterotoxina. A diarréia pode ser
aguda, autolimitante em adultos imunocompetentes à crônica, debilitante e potencialmente fatal em
indivíduos imunocomprometidos como pacientes portadores do vírus HIV (CLARK; SEARS,
1996; HUNTER; NICHOLS, 2002).
Em bovinos a infecção severa por Cryptosporidium pode levar de quatro a seis semanas
para uma completa recuperação, podendo ter um impacto negativo na produtividade dos animais
acometidos. Outros agentes como Giardia duodenalis, Escherichia coli e rotavírus podem acometer
os animais nessa mesma idade e contribuem para uma maior severidade da infecção pelo
Cryptosporidium (RALSTON et al., 2003)
1.4 Diagnóstico
Métodos baseados em princípios imunológicos e moleculares para o diagnóstico do
Cryptosporidium spp. pelas fezes, embora disponíveis, apresentam custo elevado se comparados
aos métodos morfológicos, e isso limita seu emprego na rotina da maioria dos laboratórios clínicos.
Dentre esses métodos, têm sido os mais utilizados: o teste de imunofluorescência direta, com o
emprego de anticorpos monoclonais anti-Cryptosporidium (BIALEK et al., 2002; GARCIA et al.,
1997); o ensaio imunoenzimático (ELISA), para detecção de coproantígenos (GARCIA;
SHIMIZU, 1997; SILVA et al., 2003) e a reação em cadeia pela polimerase (PCR), utilizando
diferentes esquemas de extração e amplificação do DNA (BALATBAT et al., 1996; MORGAN et
al., 1998).
Dentre o filo Apicomplexa, os oocistos das espécies pertencentes ao gênero
Cryptosporidium estão entre os menores conhecidos. Oocistos de C. parvum são ovóides ou
esféricos com medida próxima de 4,85µm de comprimento por 4,39µm de largura e razão
(comprimento-largura) de 1,11. Oocistos de C. canis mediram 4,95 por 4,71µm e razão de 1,05
(FAYER et al., 2001; XIAO et al., 2004a) e isolados de gatos, propostos com Cryptosporidim felis,
apresentaram tamanho médio de 4,6 por 4,0µm baseados na medida de 40 oocistos (SARGENT et
22
al., 1998). Nesse sentido, o diagnóstico coproparasitológico diferencial entre espécies deste
gênero, se baseado apenas em características morfológicas observadas à microscopia óptica, pode
ser pouco discriminatório (MORGAN et al., 1999b).
Por outro lado, métodos baseados em técnicas moleculares como a PCR e sequenciamento
automático de ácidos nucléicos pode oferecer uma alternativa eficiente para a diferenciação de
organismos cujas características morfológicas são indistinguíveis.
Para inferências filogenéticas e esclarecimento de questões taxonômicas para o gênero
Cryptosporidium, diversos loci têm sido usados como o locus codificador da fração ribossomal
18S, gene codificador de proteína de choque térmico HSP70, gene codificador de acetyl-CoA
sintetase, gene codificador de proteína da parede do oocisto de Cryptosporidium (COWP) e região
espaçadora do rDNA (ITS) (MORGAN et al., 1999c; MORGAN-RYAN et al., 2002; RYAN et al.,
2003; XIAO et al., 1999b, 2000a).
Com efeito, a análise de seqüências codificadoras da fração 18S e da seqüência do gene
codificador de COWP permitem o reconhecimento diferencial das espécies de Cryptosporidium
atualmente aceitas pela maioria dos autores. Ainda, estas seqüências são marcadores moleculares
da extensa variabilidade nucleotídica observadas entre diversos genótipos pertencentes à espécie C.
parvum (MORGAN et al., 2000; SPANO et al., 1997, 1998; XIAO et al., 1999a, 1999b; XIAO et
al., 2000a).
1.5 Epidemiologia
O principal mecanismo de transmissão do Cryptosporidium está nas fezes depositadas no
chão expostas ao vento e sendo transportados pela água, principalmente da chuva, que carreia os
oocistos através do solo. Para iniciar a infecção, oocistos devem ser ingeridos com o alimento, água
de beber (transmissão fecal-oral) ou por contato íntimo com pessoas infectadas, animais ou
superfícies contaminadas (FAYER et al., 2000).
Estudos em países em desenvolvimento encontraram uma maior prevalência de infecção
nestes do que em países industrializados. Melhor saneamento e pureza da água de beber nos países
mais desenvolvidos sejam, provavelmente, os responsáveis por esta diferença. Dentro destas
grandes populações estão grupos específicos com maiores riscos de infecção incluindo crianças,
pessoas mal nutridas, e uma ampla taxa de indivíduos imunocomprometidos incluindo pacientes
23
com AIDS, receptores de transplantes, pacientes recebendo quimioterapia para o câncer e pacientes
com doenças imunossupressivas (FAYER et al., 2000).
Um dos episódios mais marcante na história da criptosporidiose foi a ocorrência de um
surto, em 1993, com transmissão do parasito por via hídrica, afetando 403.000 pessoas residentes
em Milwaukee, Wisconsin, EUA (DILLINGHAN et al., 2002; MACKENZIE et al., 1994).
Anteriormente a esse episódio já se havia documentado a ocorrência de surtos de diarréia por
Cryptosporidium naquele país, um deles em Santo Antonio, Texas, comprovando-se a etiologia
pelo encontro de oocistos nas fezes dos indivíduos acometidos e por teste sorológico (D’ANTONI
et al., 1985). Outro surto nos EUA ocorreu em Carrol County, Geórgia, detectando-se oocistos na
água tratada para abastecimento público (HAYES et al., 1989).
Cryptosporidium spp. tem distribuição cosmopolita e sua presença já foi registrada em mais
de 90 países, acometendo mamíferos, aves, répteis e peixes (FAYER et al., 1997, 2000; GREEN et
al., 2003). Dentre as espécies aceitas atualmente, C. hominis e C. parvum são as mais prevalentes
no homem e têm sido responsabilizadas pelos surtos que tiveram o genótipo do agente determinado
(MONIS; THOMPSON, 2003).
Como diferentes espécies de Cryptosporidium ou mesmo genótipos de C. parvum, próprios
de animais, já foram relatados no homem (PALMER et al., 2003; SARGENT et al., 1998; XIAO et
al., 2002;) é importante que se conheça a freqüência e os aspectos biológicos dessas espécies nos
seus hospedeiros habituais.
Nesse sentido, no Brasil, alguns estudos epidemiológicos ou experimentais foram realizados
com populações bubalina, bovina, canina, felina, caprina e suína (GARCIA; LIMA, 1993;
GENNARI et al., 1999; RIBEIRO et al., 2000) e também com animais silvestres (GILIOLI, 1999;
MEIRELES, 2005).
Em estudo da ocorrência de protozoários em amostras de fezes de cães e gatos na cidade de
São Paulo-SP, Gennari et al. (1999) encontraram uma freqüência de Cryptosporidium spp. em cães
de 2,83% em 353 amostras fecais analisadas e, em gatos 14,44% das 187 amostras examinadas. Em
estudo similar, Ragozo et al. (2002) encontraram uma ocorrência de C. tipo parvum de 1,45% em
amostras de fezes de gatos da cidade de São Paulo e Guarulhos.
Funada et al. (2006) realizaram levantamento parasitológico de amostras de fezes de cães e
gatos de janeiro de 2000 a dezembro de 2004 na cidade de São Paulo-SP. Encontraram 43 (2,4%)
amostras de cães positivas para Cryptosporidium spp. em 1755 amostras analisadas e dentre as
positivas 28 (65,1%) eram de cães com menos de um ano de idade e 15 (34,9%) de cães com um
ano ou mais. Encontraram 37 (11,3%) amostras de gatos positivas para Cryptosporidium spp. nas
24
327 examinadas sendo 30 (81,1%) de gatos com menos de um ano de idade e sete (18,9%) de gatos
com um ano ou mais.
Em Londrina-PR, no ano de 1997, Navarro et al. observaram uma ocorrência de
Cryptosporidium spp. em cães e gatos de 2,25% entre 133 animais amostrados, resultado similar foi
encontrado no Rio de Janeiro-RJ por Huber et al. (2005) com 2,41% de positividade em 166
amostras de fezes caninas analisadas.
Dentre as várias espécies de animais domésticos acometidos, sem dúvida a espécie de maior
importância clínica e epidemiológica é a bovina. Os resultados dos inquéritos epidemiológicos são
muito variáveis, Kirkpatrick (1985) e Tzipori (1985) relataram que a morbidade gira de 10,0 a
85,0%, com uma ocorrência média de 25,0% de bezerros com criptosporidiose. Ortolani (1988)
demonstrou que Cryptosporidium exerce papel de destaque na etiologia de diarréia em bezerros de
rebanhos leiteiros do Estado de São Paulo.
Souza e Lopes (1995) notificaram Cryptosporidium spp. em 88 bovinos de exploração
leiteira da bacia sul fluminense, com e sem manifestação diarréica, destacando a maior ocorrência
em bezerros diarréicos com até 30 dias de idade. Caldasso et al. (1996), no município de Cristal no
Rio Grande do Sul, fazem referência à identificação do Cryptosporidium spp. em bezerros búfalos
jovens, destinados à exploração de corte.
Estudo realizado no Vale do Ribeira-SP, avaliando a etiologia e dinâmica da infecção por
enteropatógenos causadores de diarréia em bezerros búfalos encontrou-se uma freqüência de
ocorrência de C. parvum de 9,4% em 106 amostras analisadas. Dentre as positivas, nove eram
provenientes de animais sem diarréia e apenas uma de fezes diarréicas (RIBEIRO et al., 2000).
Estes achados discordaram das observações de outros autores, que, em bubalinos, correlacionaram
a presença do agente a casos de diarréia (DUBEY et al., 1992; ISKANDER et al., 1987;).
Langoni et al. (2004), na região de Botucatu-SP, encontraram prevalência de 21,2% em 203
amostras diarréicas de bezerros com menos de 30 dias para Cryptosporidium spp. Em estudo
similar realizado na região de Araçatuba-SP analisou-se 459 amostras fecais de bezerros com até
30 dias de idade encontrando prevalência de 10,26% pela técnica de ELISA e de 12,4% pelo exame
de fezes em solução de Sheater (FEITOSA et al., 2004).
Fayer et al. (2006a) estudaram a prevalência de espécies e genótipos de Cryptosporidium
encontrados no gado leiteiro de um a dois anos de idade no leste dos EUA. C. parvum foi detectado
em somente quatro (0,7%) das 571 novilhas examinadas e foi a única espécie encontrada em
bezerros de uma a duas semanas de idade, representando 85% das espécimes encontradas nos
bezerros pré-desmame. Na Nova Zelândia, Grinberg et al. (2005) encontraram 33 (21,2%) amostras
25
positivas para Cryptosporidium em 156 examinadas, provenientes de bezerros de 10 (42%) das 24
fazendas do estudo.
Sabe-se que animais silvestres como cervídeo e bisão são reservatórios potenciais do agente
na natureza, em especial para os ruminantes, e estes últimos também podem agir como fonte de
infecção para os animais silvestres, sendo este aspecto merecedor de maiores estudos (HAMNES et
al., 2006; OLSON et al., 2004a).
Os oocistos deste protozoário estão amplamente distribuídos na água, podendo ser
encontrados em até 100% das amostras de água de superfície e de esgotos e em até 37,0% das
amostras de água para consumo. Cryptosporidium já foi isolado de água utilizada para irrigação,
bem como de verduras e frutas (ROBERTSON; GJERDE, 2001; THURSTON-ENRIQUEZ et al.,
2002). Um fator limitante na transmissão é a sobrevivência dos oocistos no ambiente, que é afetada
por altas temperaturas e dessecação (OLSON et al., 2004a).
Com o advento de técnicas moleculares de diagnósticos como a PCR, foi possível a
diferenciação entre diferentes espécies e/ou genótipos de Cryptosporidium. Os bovinos foram
pouco identificados como fonte de infecção em surtos que ocorreram nos EUA e Canadá
transmitidos pela água, sendo exceção um surto no Canadá onde oocistos do genótipo bovino foram
identificados (FAYER et al., 2000).
Em estudos epidemiológicos da criptosporidiose é de importância a identificação genotípica
da espécie detectada, tanto em hospedeiros quanto no ambiente. Recomenda-se hoje que o
diagnóstico seja realizado por meio de técnicas moleculares e não somente por critérios
morfológicos, já que os elementos presentes nas fezes ou no ambiente e empregados na
identificação, os oocistos, são praticamente idênticos de uma espécie para outra. Além disso, a
genotipagem permite melhor entendimento da importância das várias espécies para a saúde pública,
sua dinâmica de transmissão e potencial zoonótico, além da relação hospedeiro-parasita (FALL et
al., 2003; FAYER et al., 2000; MONIS, THOMPSON, 2003; MORGAN et al., 1999b).
Apesar do C. parvum (genótipo bovino) ser a mais comum espécie zoonótica, outras
espécies de Cryptosporidium foram identificadas no homem incluindo: C. meleagridis, C. canis, C.
felis, C. pig genótipo e C. muris (CAMA et al., 2003; ENEMARK et al., 2002; GATEI et al., 2002,
2003; GOUOT et al., 2001; LEARMONTH et al., 2003; LOWERY et al., 2001; MCLAUCHLIN et
al., 2000; MORGAN et al., 2000; PIENIAZEK et al., 1999; TIANGTIP et al., 2002; XIAO et al.,
2001), entretanto C. andersoni, espécie que habita o abomaso de bovinos, nunca foi encontrada em
humanos sejam imunocompetentes ou imunodeprimidos.
A tabela 1 apresenta resultados de estudos de epidemiologia molecular realizados com
isolados de Cryptosporidium humano e foi extraído de Olson et al. (2004a).
26
Tabela 1 – Prevalência de Cryptosporidium spp. em pacientes imunocompetentes e com HIV Fonte: Olson et al. (2004a)
Cama et al. (2003) genotiparam oocistos de amostras fecais em 299 episódios de infecção
por Cryptosporidium em pacientes HIV positivos em Lima, no Peru, e encontraram C. hominis em
204 (67,5%) episódios, C. meleagridis em 38 (12,6%), C. parvum em 34 (11,3%), C. canis em 12
(4,0%), C. felis em 10 (3,3%) e C. pig genótipo em um (0,3%) episódio, observando diferenças
geográficas na distribuição da infecção por Cryptosporidium.
Estudo com crianças e adultos no Distrito de Vhembe, África do Sul, mostrou 44 amostras
positivas para Cryptosporidium, sendo oito (18%) como C. parvun e 36 (82%) como C. hominis.
As amostras de crianças tanto HIV negativas como positivas deram genótipo C. hominis, dos
pacientes HIV positivos revelou-se uma (25%) como C. parvum e três (75%) como C. hominis e
dos HIV negativos sete amostras deram C. parvum e 33 deram genótipo C. hominis (SAMIE et al.,
2006).
A genotipagem do Cryptosporidium em humanos tem revelado algumas diferenças
interessantes. Em estudos realizados na Austrália e América do Norte a maioria dos casos tem
Localização Número de
Prevalência (%)
Amostras C. hominis C. parvum C. meleagridis C. canis C. felis C.muris
USA (HIV) 10 5 (50) 1 (10,0) 0 1 (10) 3 (30) 0
Vários (HIV) 22 7 (31,8) 8 (36,4) 2 (9,1) 0 5 (22,7) 0
Peru 85 67 (78,8) 8 (9,4) 7 (8,2) 2 (2,3) 1 (1,2) 0
Reino Unido 1711 651 (38,0) 1055 (61,7) 5 (0,3) 0 0 0
Tailândia (HIV) 29 24 (82,7) 0 3 (10,3) 0 1 (3,5) 1 (3,5)
Irlanda do Norte 39 5 (12,8) 34 (87,2) 0 0 0 0
França 57 18 (31,6) 29 (50,9) 3 (5,3) 0 6 (10,5) 1 (1,7)
Dinamarca 44 25 (56,8) 18 (40,9) 1 (2,3) 0 0 0
Tailândia (HIV) 34 17 (50,0) 5 (14,7) 7 (20,6) 2 (5,9) 3 (8,8) 0
Nova Zelândia 66 1 (1,5) 65 (98,5) 0 0 0 0
Vários (HIV) 63 47 (74,6) 14 (22,2) 1 (1,6) 0 0 1 (1,6)
Canadá 35 19 (54,3) 14 (40,0) 2 (5,7) 0 0 0
27
indicado origem humana, enquanto a maioria dos estudos realizados na Europa tem mostrado uma
origem zoonótica (THOMPSON, 2003).
No Brasil, são escassos os registros de genotipagem de Cryptosporidium spp.
Cryptosporidium parvum detectado em pacientes residentes em áreas peri-urbanas e C. hominis,
entre pacientes de áreas estritamente urbanas indicam a ocorrência dos ciclos zoonótico e
antroponótico de transmissão da doença no Brasil (ARAÚJO, 2004; BRANTLEY, 2003). Ainda, a
única descrição de C. meleagridis no Brasil foi registrada por Araújo (2004), em pacientes
humanos portadores do vírus HIV. No mesmo estudo, isolados de origem animal da região de
Taubaté-SP, revelaram identidade genética compatível com C. parvum tanto na amostra da espécie
bovina quanto na da espécie canina, genotipando apenas uma amostra por espécie.
28
2 OBJETIVOS
O objetivo deste estudo foi determinar a ocorrência de Cryptosporidium spp. em amostras
fecais de animais domésticos (espécie felina, canina e bovina) provenientes do Estado de São
Paulo, diarréicas e não diarréicas, e caracterizar genotipicamente os isolados de Cryptosporidium
spp. encontrados na população-alvo, avaliando a diversidade nucleotídica das seqüências obtidas e
as possíveis correlações com eventos de natureza epidemiológica.
29
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Amostras de Fezes
As amostras de fezes de cães e gatos e bovinos foram processadas no Laboratório de
Doenças Parasitárias do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal (VPS)
da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (FMVZ – USP)
utilizando-se a técnica de Centrífugo-Flutuação em solução de sacarose, com densidade de
1,205g/cm³ (OGASSAWARA; BENASSI, 1980).
3.1.1 Cães e Gatos
As amostras de fezes de cães foram obtidas através da rotina do laboratório, em especial de
amostras encaminhadas pelo Hospital Veterinário da FMVZ – USP (HOVET-USP) para pesquisa
coproparasitológica. Amostras também foram obtidas de clínicas particulares nos Municípios de
Santo André, São Bernardo do Campo e São Caetano do Sul no ABC Paulista, além dos
Municípios de Ribeirão Pires, Bauru, Jundiaí e Taubaté.
As amostras de fezes de gatos também foram, em sua maioria, encaminhadas pelo HOVET-
USP para pesquisa coproparasitológica e amostras também foram obtidas de um abrigo de gatos
localizado na Vila Madalena na capital paulista e de clínicas particulares nos Município de Santo
André, São Bernardo do Campo e São Caetano do Sul, no ABC Paulista.
Tanto as amostras de cães como as de gatos eram de animais com e sem diarréia e de
diferentes faixas etárias.
3.1.2 Bovinos
As amostras de fezes de bovinos foram obtidas na fazenda do Campus Administrativo da
USP em Pirassununga-SP e de propriedades rurais dos Municípios de Botucatu, Araçatuba,
30
Presidente Epitácio, Morungaba, Piracaia e Piracicaba. As amostras que foram diagnosticadas
morfologicamente como sendo positivas para Cryptosporidium andersoni foram retiradas do
experimento por não serem consideradas espécie zoonótica (XIAO et al., 2004a) e somente as
positivas para Cryptosporidium tipo parvum foram selecionadas para este estudo.
As amostras foram coletadas de animais com e sem diarréia e dentro da faixa etária de oito
dias até no máximo cinco meses.
3.2 Análise Morfométrica
Oocistos foram submetidos a procedimento convencional de Centrífugo-Flutuação em solução
de sacarose, sendo medidos com a utilização de uma lente ocular graduada e com objetiva de 40x,
totalizando aumento de 400x, em microscópio de luz.
Em média quatro oocistos por amostra foram mensurados e realizado média final, todas as
medições foram realizadas pela mesma pessoa usando o mesmo equipamento microscópico
(Olympus® - CH20 - Japan).
3.3 Purificação das Amostras
As amostras de fezes foram submetidas à técnica de Centrífugo-Flutuação em solução de
sacarose (OGASSAWARA; BENASSI, 1980) e quando positivas para Cryptosporidium spp. foram
armazenadas em solução de dicromato de potássio a 2,0 % e refrigeradas a 4ºC. Para a
concentração de oocistos as amostras foram submetidas novamente à técnica de Centífugo-
Flutuação em sacarose utilizando material descartável e o material fecal resultante do diagnóstico
foi lavado da lâmina e lamínula com 1ml de TE (Tris-EDTA pH 8,0), em placa de Petri
descartável, e colocadas em microtubo de 1,5ml e posteriormente submetidas a extração de DNA.
31
3.4 Extração de DNA dos Oocistos
Os oocistos purificados foram submetidos à centrifugação a 12.000g por 5 minutos, o
sobrenadante foi descartado e ao pequeno pellet que se formou foi adicionado 200µl de TE + 20µl
de SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) 10% e seguido de agitação em vortex. A amostra foi submetida
a congelamento (Nitrogênio líquido) por 1 minuto e descongelamento (termomixer) por 2 minutos
a 65ºC por cinco vezes e no final foi adicionado 10µl de proteinase K, novamente agitado em
vórtex e deixado no termomixer digital, com agitação periódica por 1 hora a 56ºC. Após este
período, o material foi centrifugado a 12.000g por 5 minutos e ao sobrenadante foi adicionado
200µl de fenol + 200µl de solução de clorofórmio + álcool isoamílico (24:1) e agitado em vórtex,
centrifugado novamente a 12.000g por 10' e adicionado ao sobrenadante 350µl (1V) da solução de
clorofórmio + álcool isoamílico, centrifugado novamente a 12.000g por 10 minutos e ao
sobrenadante foi adicionado 1V de isopropanol e deixado a -20ºC overnight ou durante 2 horas no
congelador.
Posteriormente a amostra foi centrifugada a 12.000g por 25 minutos a 4ºC e descartado o
isopropanol (inversão) e adicionado 1ml de etanol 70% e homogeneizado na mão, centrifugado
novamente por 12.000g por 10 minutos a 4ºC e descartado o etanol (inversão). Depois a amostra foi
colocada no termomixer por 10 minutos a 56ºC e deixado em cima de papel toalha até secar por
completo e finalmente adicionado 50µl de água mili Q, homogeneizado e deixado no termomixer
por mais 10 minutos a 56ºC, sendo congelada para posterior reação de amplificação
(MCLAUCHLIN et al., 2000).
O DNA obtido de amostras puras de Cryptosporidium tipo parvum BR-01 (bovinos-Brasil)
e Cryptosporidium spp. isolado de avestruzes no Brasil (MEIRELES, 2005) foram utilizados como
controle positivo e água milli Q para controle negativo em todas as reações de PCR e Nested PCR.
32
3.5 Reação de Amplificação da Subunidade 18S do Gene do RNA Ribossômico
Para amplificação da subunidade 18s do RNA ribossômico foi utilizada a técnica de
Nested PCR com os seguintes primers da Reação
Primária: 5' – TTC TAG AGC TAA TAC ATG CG – 3'
5' – CCC ATT TCC TTC GAA ACA GGA – 3',
resultando em um produto de 1325 pb e com os seguintes primers da Reação
Secundária: 5' – GGA AGG GTT GTA TTT ATT AGA TAA AG – 3'
5' – AAG GAG TAA GGA ACA ACC TCC A – 3'
resultando em um produto de 826 – 864 pb, dependendo da espécie (XIAO et al., 1999a, 2000b).
Foram utilizadas as seguintes condições de reação primária: preparação de 50µl de solução
contendo: 2,5 e 5µl da solução de DNA; solução contendo 5,0µl de tampão para PCR 1x (20mM
de Tris – HCl pH 8,4 e 50mM de KCl); 2,0mM de MgCl2; 0,25mM de cada base (dNTP); 30 pmol
de cada primer da reação primária e 1,25U de taq DNA polimerase (Invitrogem Life Technologies,
Cat # 18038-42).
As condições da reação secundária foram as mesmas da primária, porém com 2,5µl da
solução da reação primária (material amplificado) e com os primers da reação secundária. As
amostras foram submetidas à desnaturação inicial a 94ºC por 3 minutos, seguida por 35 ciclos de
desnaturação a 94ºC por 45 segundos, anelamento a 55ºC por 45 segundos e extensão a 72ºC por
60 segundos, com extensão final a 72ºC por 7 minutos.
3.6 Sequenciamento dos Fragmentos Amplificados
Os produtos amplificados por Nested PCR do gene codificador para 18s do RNA
ribossômico foram purificados utilizando-se o kit de purificação de DNA "GFX PCR DNA band
purification" (Pharmacia®) submetidos a reações de sequenciamento automático; a partir dos
primers da Reação secundária, com o dideoxi terminator BigDye™ (Applied Biosystems, US) no
seqüenciador automático ABI Prism 377 DNA (Applied Biosystems, US).
33
3.7 Alinhamento e Tradução das Seqüências de Nucleotídeos
Após a obtenção das seqüências de nucleotídeos dos fragmentos amplificados por Nested
PCR as mesmas foram alinhadas manualmente com o auxílio dos programas clustal W
(THOMPSON et al., 1997) e BioEdit Sequence Alignment Editor (HALL, 1999), sendo
comparadas com informações disponíveis no GenBank.
34
4 RESULTADOS
Foram examinadas 106 amostras fecais de gatos com idade variando de 40 dias à 10 anos
no período de 16/09/2004 até 24/01/2006 encontrando três (2,8%) amostras positivas para
Cryptosporidium tipo parvum em animais com aproximadamente um ano e meio de idade.
Das 120 amostras fecais de cães com idade variando de sete dias a 16 anos, examinadas no
período de 29/06/2004 a 19/05/2006, encontrou-se 15 (12,5%) amostras positivas para C. tipo
parvum.
Nas amostras fecais de bovinos de oito dias a cinco meses de vida, examinadas para
Cryptosporidium spp. no período de 06/08/2004 até 24/02/2006, encontrou-se 21 (17,1%) amostras
positivas das 123 examinadas (Tabela 2).
Tabela 2 – Ocorrência de oocistos de Cryptosporidium spp. em amostras fecais de gatos, cães e bovinos no Estado de São Paulo no período de junho de 2004 à maio
de 2006
Das 21 amostras positivas de bovinos foram caracterizadas morfologicamente 16 (76,2%)
como sendo C. tipo parvum e cinco (23,8%) como sendo C. andersoni.
Além dos três isolados de gatos, 15 de cães e 16 de bovinos, caracterizados
morfologicamente como Cryptosporidium tipo parvum, outras oito, nove e cinco isolados de C.
tipo parvum, respectivamente de gatos, cães e bovinos anteriormente obtidos no Laboratório de
No Amostras
Espécie --------------------------------------------------------------------
Examinadas Positivas %
Gatos 106 03 2,8
Cães 119 15 12,6
Bovinos 123 21 17,1
Total 348 39 11,2
35
Doenças Parasitárias da FMVZ – USP foram encaminhados para extração, amplificação e
sequenciamento do DNA, totalizando 11 amostras de gatos, 24 amostras de cães e 21 amostras de
bovinos.
Do número total de isolados obtidos, foram amplificadas e seqüenciadas com sucesso sete
amostras de gatos, nove de cães e nove de bovinos. A tabela 3 apresenta a morfometria dos oocistos
dos isolados que foram encaminhados para análise genotípica, por espécie animal e localidade de
origem da amostra.
As amostras de DNA de Cryptosporidium spp. extraídas das espécies felina, canina e
bovina foram amplificadas na Nested PCR utilizando primers específicos para amplificar
fragmentos do gene codificador da subunidade 18S do RNA ribossômico (Foto 1), salvo algumas
amostras que continham número muito pequeno de oocistos (menos que 1 oocisto por campo
microscópico). Amostras que estavam armazenadas há mais de cinco anos à 4ºC em dicromato de
potássio a 2% e continham um ou mais oocistos por campo microscópico foram amplificadas com
sucesso.
Foto 1 – Gel de agarose à 1,5% corado com brometo de etídeo mostrando produtos de Nested PCR de aproximadamente 815pb: 1- Ladder 100pb, 2- C. felis (Amostra-12), 3- C. canis (Amostra-41), 4- C. parvum genótipo bovino (Amostra 23), 5- C. bovis (Amostra-37), 6- Nulo, 7- Controle (+), 8- Controle (-)
815pb
36
Dos isolados de gatos sete amostras foram seqüenciadas e analisadas no genbank com
sucesso e todas as amostras revelaram identidade genotípica compatível com Cryptosporidium
felis, destas sete amostras cinco foram de animais encaminhadas do HOVET – USP e duas foram
do abrigo de gatos da capital paulista.
As amostras de cães revelaram Cryptosporidium canis na análise genotípica, dentre as nove
amostras seqüenciadas três foram do HOVET – USP, duas de São Bernardo do Campo, uma de
Santo André, uma de Taubaté, uma de Jundiaí e uma de Araçatuba.
Dentre as nove amostras seqüenciadas de bovinos duas revelaram identidade genotípica
como C. parvum Eire I, seis amostras revelaram C. parvum genótipo bovino e uma amostra revelou
genótipo C. bovis. Do total das amostras de bovinos três foram provenientes de Pirassununga,
quatro de Araçatuba e duas de Piracaia (Tabela 3). Tabela 3 – Morfometria e localização dos oocistos de Cryptosporidium spp. isolados de gatos, cães e
bovinos no Estado de São Paulo de 2004 a 2006 No da Amostra Hospedeiro Oocisto (LxC)a Idade Localidade
12 gato - - HOVET-USP* 19 gato 5,0x5,0µm 3 meses HOVET-USP 28 gato 5,0x5,0µm - HOVET-USP 29 gato 5,0x5,0µm 5 anos HOVET-USP 65 gato 4,75x5,0µm 1,5 anos Vl. Madalena-SP 64 gato 5,0x5,0µm 1,5 anos Vl. Madalena-SP 03 gato 5,0x4,5µm - HOVET-USP 30 cão 5,0x5,0µm 33 dias SBC-SP** 31 cão 5,0x5,25µm 33 dias SBC-SP 73 cão 5,0x5,0µm - HOVET-USP 48 cão 4,75x5,0µm 7 meses HOVET-USP 43 cão - 1 ano HOVET-USP 42 cão 5,0x4,75µm 4 anos Jundiaí-SP 41 cão - 6 meses SA-SP*** 36 cão 6,25x5,0µm - Taubaté-SP 58 cão - 2 meses Araçatuba-SP 71 bovino - - Araçatuba-SP 23 bovino 5,0x5,0µm - Pirassununga-SP 69 bovino - - Araçatuba-SP 51 bovino 5,0x5,0µm 25 dias Piracaia-SP 50 bovino 5,0x5,0µm 8 dias Piracaia-SP 67 bovino - - Araçatuba-SP 66 bovino - - Araçatuba-SP 17 bovino 5,0x4,75µm - Pirassununga-SP 37 bovino 4,25x5,0µm 2meses Pirassununga-SP *Hospital Veterinário da Universidade de São Paulo - Brasil **São Bernardo do Campo *** Santo André a - Largura x Comprimento
37
As seqüências obtidas foram analisadas e comparadas com seqüências que estão
depositadas no Genbank, para isto utilizou-se programas de bioinformática e os resultados da
análise genotípica utilizando-se o gene que codifica as proteínas da subunidade 18S do RNA
ribossômico estão demonstradas na tabela 4.
Tabela 4 – Análise genotípica das seqüências obtidas de gatos, cães e bovinos utilizando-se o gene
18SrRNA dos isolados de Cryptosporidium spp. no Estado de São Paulo de 2004 a 2006.
No Amostra Hospedeiro No de Nucleotídeos Identificação Moleculara
sequenciados
12 gato 749 99,7% de id. com C. felis (AF112575) e uma inserção(T) 19 gato 761 100% de id. com C. felis (AF112575) 28 gato 757 100% de id. com C. felis (AF112575) 29 gato 759 100% de id. com C. felis (AF112575) 65 gato 302 100% de id. com C. felis (AF112575) 64 gato 755 100% de id. com C. felis (AF112575) 03 gato 428 99,5% de id. com C. felis (AF112575) e uma inserção(G) 30 cão 719 100% de id. com C. canis (AB210854) 31 cão 719 100% de id. com C. canis (AB210854) 73 cão 730 100% de id. com C. canis (AB210854) 48 cão 724 100% de id. com C. canis (AB210854) 43 cão 731 100% de id. com C. canis (AB210854) 42 cão 729 100% de id. com C. canis (AB210854) 41 cão 548 100% de id. com C. canis (AB210854) e uma inserção(T) 36 cão 722 100% de id. com C. canis (AB210854) 58 cão 511 100% de id. com C. canis (AB210854) 71 bovino 679 100% de id. com C. parvum gen. bov. (AF093490) 23 bovino 646 100% de id. com C. parvum gen. bov. (AF093490) 69 bovino 722 98% de id. com C. parvum Eire Ib (DQ833277) 51 bovino 729 100% de id. com C. parvum gen. bov. (AF093490) 50 bovino 728 100% de id. com C. parvum gen. bov. (AF093490) 67 bovino 717 100% de id. com C. parvum gen. bov. (AF093490) 66 bovino 733 100% de id. com C. parvum gen. bov. (AF093490) 17 bovino 325 100% de id. com C. parvum Eire I (DQ833277) 37 bovino 713 100% de id. com C. bovis (AY741305) a - Identificação molecular realizada por meio de análise de identidade (id) molecular com alinhamento manual com o auxílio do
programa BioEdit® Sequence Alignment Editor. b - Amostra isolada na espécie bovina (Bos taurus).
38
5 DISCUSSÃO Nas amostras fecais de gatos encontrou-se ocorrência de 2,8% para oocistos de
Cryptosporidium spp., resultado superior ao encontrado por Sargent et al. (1998) no oeste da
Austrália, que analisaram 162 amostras fecais de gatos e encontraram somente dois (1,2%) animais
eliminando oocistos.
Foi encontrado ocorrência de 12,5% nas amostras dos cães, superior aos achados de Lallo
(1993) que analisou 650 amostras de fezes de cães provenientes da grande São Paulo e encontrou
3,1% de positividade, sendo também superior aos achados de Gennari et al. (1999) que
encontraram uma freqüência de Cryptosporidium spp. em cães de 2,83% em 353 amostras também
da cidade de São Paulo.
Referente às amostras de bovinos foi encontrado 17,1% de ocorrência entre animais de oito
dias até cinco meses de vida, similaridade foi encontrada por Olsen et al. (1997) em British
Columbia, Canadá, com valores de 15% em 386 bezerros leiteros do nascimento aos seis meses de
idade. Langoni et al. (2004), em Botucatu-SP, encontraram prevalência de 21,2% em 203 amostras
de bezerros, sendo estes achados superiores aos aqui relatados, provavelmente pela faixa etária
estudada (bezerros com menos de 30 dias) e com quadro diarréico.
Das 21 amostras positivas de bovinos, 16 (76,2%) foram caracterizadas morfologicamente
como sendo C. tipo parvum e cinco (23,8%) como C. andersoni, estes resultados estão de acordo
com a literatura que cita o encontro de C. parvum predominantemente em bezerros de até dois
meses de idade e que C. parvum constitui até 85% de espécimes positivas associadas com bezerros
em fase de aleitamento (SANTÍN et al., 2004). Na purificação dos oocistos inicialmente utilizou-se a técnica de Centrífugo-Flutuação em
sacarose, mas observou-se uma grande perda de oocistos e conseqüentemente as bandas ficavam
fracas na eletroforese. Quando foi utilizado o procedimento de lavagem da lâmina e lamínula em
placa de Petri observou-se que o material obtido resultava em menor perda, e as bandas ficavam
mais fortes, mostrando maior quantidade de oocistos. Por este motivo, foi adotado este método para
obtenção e purificação de oocistos e para posterior extração e amplificação do DNA (Foto 2).
39
Foi observado que as amostras que continham poucos oocistos, geralmente de cães e gatos,
na amplificação e posterior leitura na eletroforese havia a formação de banda de baixa intensidade
luminosa à luz ultravioleta (fraca). Comparando-se a quantidade de DNA utilizado para as reações
de PCR observou-se que com 2,5µl as bandas ficavam mais forte do que com 5,0µl de DNA,
possivelmente devido a maior quantidade de inibidores da reação contidos nas fezes (Foto 3).
Estudos têm mostrado que amostras orgânicas, tal como fezes e solo, contém inibidores os quais
podem reduzir a sensibilidade da PCR por até 1000 vezes (WARD; WANG, 2001).
815pb
815pb
9 10 11 12 13 14 15 16
1 2 3 4 5 6 7 8
Foto 2 – Gel de agarose à 1,5% corado com brometo de etídio mostrando produtos de Nested PCR de aproximadamente 815pb: 1- Controle (+); 3- Amostra bovina; 5- Amostra canina; 9- Controle (-); 10- Amostra bov. 2,5µl DNA; 12- Amostra bov. 5,0µl DNA; 14- Amostra bov. 2,5µl DNA lavagem da lâmina; 16-Amostra bov. 5,0µl DNA lavagem da lâmina; 2,4,6,7,8,11,13,15- Nulo
40
1 2 3 4 5 6 7 8
Foto 3 – Gel de agarose à 1,5% corado com brometo de etídio mostrando produtos de Nested PCR de aproximadamente 815pb, comparando quantidade de DNA utilizada e intensidade luminosa da banda gerada em amostra canina: 1- C(+); 2, 3, 4, 5- Nulo; 6- Amostra can. 2,5µl DNA; 7- Amostra can. 5,0µl DNA; 8- C(-)
A análise genotípica das amostras de gatos revelou Cryptosporidium felis em todas,
evidenciando assim a circulação desta espécie na capital paulista e seu potencial risco zoonótico,
pois esta já foi encontrada em humanos adultos imunocompetentes, em infectados com o HIV e em
crianças imunocompetentes em Lima no Peru (ALVEZ et al., 2003; CAMA et al., 2003; XIAO et
al., 2001).
Estas são as primeiras amostras de Cryptosporidium felis seqüenciadas no Brasil e as
dimensões dos oocistos são similares à primeira descrição de C. felis feita por Iseki (1979) que
mediu 5,0 x 4,5µm.
As amostras de Cryptosporidium felis obtidas dos gatos do abrigo possivelmente estão
circulando entre estes animais, uma vez que eles não têm acesso à rua. Estes achados apresentam
similaridade aos de Fayer et al. (2006b) que detectaram C. felis em gatos de abrigos nos EUA,
utilizando o mesmo gene (SSUrRNA) deste estudo e os oocistos mediram 4,6 x 4,2µm, dimensão
esta um pouco menor que as encontradas na descrição original de Cryptosporidium felis por Iseki e
as observadas neste estudo. Vale resaltar que, devido ao reduzido número de oocistos nas amostras
815pb
41
de gatos e cães do presente estudo, as medições foram feitas em um número pequeno de oocistos,
sendo necessárias futuras medições com maior quantidade para afirmativas sobre a morfometria
dos isolados paulistas.
A identidade genotípica das amostras seqüenciadas de cães no Estado de São Paulo
caracterizou todas como Cryptosporidium canis sugerindo que esta espécie está conservada através
desta área geográfica. Este achado tem grande importância em saúde pública pois C. canis já foi
genotipado em amostras fecais de adultos e crianças em Lima no Peru e também nos EUA e na
Tailândia em pacientes portadores do HIV (CAMA et al., 2003; OLSON et al., 2004a; XIAO et al.,
2001).
A morfometria dos oocistos encontrados nos cães de São Paulo foi de 5,0 x 5,0µm e razão
1,0µm sendo similar a oocistos encontrados em cão que mediu 4,95 x 4,71µm e razão de 1,05µm
(FAYER et al., 2001; XIAO et al., 2004a).
Satoh et al. (2006) genotiparam uma amostra de cão no Japão, utilizaram o gene 18SrRNA,
encontrando o genótipo C. canis. O tamanho médio dos oocistos foi 4,4 x 3,2µm com razão de
1,34µm indicando que o isolado tinha formato elíptico e o mesmo sugeriu a existência de
diversidade morfológica considerando a forma e o tamanho de oocistos em Cryptosporidium canis.
Estas são as primeiras amostras de Cryptosporidium canis seqüenciadas no Brasil. Araújo,
em 2004, analisou uma amostra de Cryptosporidium spp. de cão do município de Taubaté
utilizando Nested PCR direcionada para o gene COWP (Cryptosporidium Oocist Wall Protein) e
submetendo a amostra a digestão enzimática Afa I (RsaI) encontrou identidade genética compatível
com C. parvum. No presente estudo a amostra de cão do mesmo município revelou C. canis como
identidade genotípica, sendo ambas consideradas espécies zoonóticas.
A amostra obtida na região de Jundiaí de um cão de quatro anos de idade, com fezes
pastosas proveniente de um abrigo revelou o genótipo Cryptosporidium canis. Amostra de fezes do
mesmo animal, também pastosas, e colhida após oito semanas revelou-se negativa pela PCR, bem
como amostra de fezes do cão da baia ao lado, indicando possível melhora na imunidade do
hospedeiro, com redução na eliminação de oocistos, apesar das fezes ainda não se apresentarem
normais.
O resultado da análise das seqüências obtidas de bovinos com menos de 30 dias de vida,
revelou Cryptosporidium parvum Eire I em duas amostras e C. parvum genótipo bovino em seis
amostras da região de Pirassununga, Piracaia e Araçatuba. Estes resultados estão de acordo com
Geurdem et al. (2006) que genotiparam C. parvum proveniente de 22 bezerros com menos de 30
dias de idade no Zâmbia e são similares aos achados de Fayer et al. (2006a) no EUA, onde C.
parvum foi a única espécie obtida em bezerros de sete à 14 dias de idade e constituiu-se em 85%
42
dos espécimes associados com todos os bezerros em fase de aleitamento. Estes achados tem grande
importância e implicações para saúde pública, pois C. parvum é a espécie zoonótica conhecida por
infectar principalmente ruminantes (bovinos, ovelhas, cabras e cervídeos) e também humanos
(CAMA et al., 2003; XIAO et al., 2004b).
Outra amostra não diarréica, genotipada de bezerro de dois meses de idade na região de
Pirassununga, revelou identidade genética com Cryptosporidium bovis, sendo este o primeiro relato
de C. bovis no Brasil, com resultado da morfometria similar ao descrito na literatura (4,89 x
4,63µm) e encontrado predominantemente em bezerros acima de dois meses de idade e
assintomáticos (DE GRAAF et al., 1999; FAYER et al., 2005). Esta espécie nunca foi descrita no
homem e considera-se, até o momento, não zoonótica. Também ainda não foi relacionada com
doença clínica em bovinos exemplificando a complexa epidemiologia associada ao gênero
Cryptosporidium (FAYER et al., 2005).
43
6 CONCLUSÃO
Gatos, cães e bovinos do estado de São Paulo podem apresentar infecção por
Cryptosporidium spp.
Dentre os bovinos de oito dias até cinco meses o Cryptosporidium tipo parvum apresentou
maior ocorrência que o Cryptosporidium andersoni.
Para a obtenção de oocistos de Cryptosporidium para a realização da PCR a lavagem das
lâminas após diagnóstico morfológico resultou em melhor resolução que a utilização da técnica
convencional de Centrífugo-Flutuação em sacarose.
Maior quantidade de DNA (5,0µl) de Cryptosporidium para a PCR, resultou em inibição
quando comparou-se a menor quantidade (2,5µl), provavelmente pela maior quantidade de
inibidores presentes no DNA de origem fecal.
Cryptosporidium de gatos da capital paulista revelaram identidade genotípica compatível
com Cryptosporidium felis.
Cryptosporidium de cães do estado de São Paulo revelaram Cryptosporidium canis na
caracterização genotípica.
Na análise genotípica de Cryptosporidium spp. de bezerros de um a 30 dias de idade, do
Estado de São Paulo, revelou-se Cryptosporidium parvum genótipo bovino e Cryptosporidium
parvum Eire I.
Os genótipos Cryptosporidium felis, Cryptosporidium canis e Cryptosporidium parvum
genótipo bovino, comprovadamente zoonóticos, foram isolados respectivamente dos gatos, cães e
bovinos do estado de São Paulo.
O genótipo Cryptosporidium bovis, não zoonótico, foi isolado de bovino do estado de São
Paulo.
44
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