perfil analítico das progestinas fecais nas fases de puberdade e … · 2009-06-18 · dÉbora...
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DÉBORA CATTARUZZI RODINI
Perfil analítico das progestinas fecais nas fases de puberdade e ciclicidade ovariana em Onça Pintada
(Panthera onca); gestação e lactação em Gato Mourisco (Puma yagouaroundi)
São Paulo 2008
DÉBORA CATTARUZZI RODINI
Perfil analítico das progestinas fecais nas fases de puberdade e ciclicidade ovariana em Onça Pintada
(Panthera onca); gestação e lactação em Gato Mourisco (Puma yagouaroundi)
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Reprodução Animal da
Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da Universidade de São Paulo
para obtenção do título de Doutor em
Medicina Veterinária
Departamento: Reprodução Animal
Área de concentração: Reprodução Animal
Orientador: Prof. Dr. Cláudio Alvarenga de Oliveira
São Paulo 2008
FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome do autor: RODINI, Débora Cattaruzzi Título:
Perfil analítico das progestinas fecais nas fases de puberdade e ciclicidade ovariana em Onça Pintada (Panthera onca); gestação e lactação em Gato Mourisco (Puma yagouaroundi)
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Medicina Veterinária
Data:___/___/___
Banca Examinadora
Prof. Dr. __________________________ Instituição: _____________________ Assinatura:________________________ Julgamento:____________________ Prof. Dr. __________________________ Instituição: _____________________ Assinatura:________________________ Julgamento:____________________ Prof. Dr. __________________________ Instituição: _____________________ Assinatura:________________________ Julgamento:____________________ Prof. Dr. __________________________ Instituição: _____________________ Assinatura:________________________ Julgamento:____________________ Prof. Dr. __________________________ Instituição: _____________________ Assinatura:________________________ Julgamento:____________________
À minha família maravilhosa! Minha mãe Zélia, meu pai Valdir, minha irmã Mônica, muito obrigada por tudo que vocês sempre fizeram e fazem por mim! Amo muito vocês!!!!!
Ao meu marido, melhor amigo e agora papai, Luís! Obrigada por tornar minha vida ainda mais feliz!!!! TE AMO!
À minha pequena Maria Fernanda!
Agradeço,
Ao meu orientador Prof. Dr. Cláudio Alvarenga de Oliveira pelos ensinamentos e orientação.
Obrigada pela confiança.
Ao Prof. Dr. Marcelo ABV Guimarães pelos ensinamentos desde a graduação, incentivo e ótimos
conselhos!
À Dra. Priscila Viau Furtado, uma grande amiga que sempre me incentivou! Sua colaboração foi
essencial para a realização deste trabalho, sempre com competência e entusiasmo! Obrigada também
por ceder as amostras de onça pintada para a realização deste projeto.
À CAPES pelo apoio através da bolsa de doutorado concedida durante o período de realização deste
trabalho.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio científico e
financeiro.
À M.V. M.S. Patrícia E. B. Berbare por ceder as amostras de gato mourisco para uso neste
trabalho.
Ao Prof. Dr. Juan Carlos Illera e Profa. Dra. Gema Silván, da Universidade Complutense de
Madrid que nos receberam para o treinamento técnico em enzimaimunoensaio.
Às minhas super amigas Thays e Andrezza!
Às amigas e “anjos” Lilian e Flaviana, vocês são muito especiais e nossos momentos de
rejuvenescimento inesquecíveis!
Aos veterinários Sady e Mariana do Zoológico Municipal de Piracicaba por permitir e apoiar a
realização do desafio de ACTH.
À Cecília Pessuti, bióloga chefe do Parque Zoológico Municipal “Quinzinho de Barros”, Sorocaba
por permitir e apoiar a realização do desafio de ACTH .
A toda minha família Cattaruzzi que sempre me apóia e me incentiva!
A minha sogra Francisca!
A todos os amigos da pós-graduação, especialmente Rodrigo, Marie, Manuela, Cristiane, Lilian K,
Cláudia, Tatiana, Marina, e Suzana.
Em especial as amigas que ajudaram muito no processamento das amostras deste trabalho Lilian K
e Clarissa.
Ao MV MS Marcílio Nichi pelo indispensável auxílio nas análises estatísticas.
Às secretárias e funcionários do Departamento de Reprodução Animal e da pós-graduação,
especialmente Thaís, Harumi, Alice e Dna Silvia.
Aos funcionários da biblioteca da FMVZ/USP.
RESUMO
RODINI, D. C. Perfil analítico das progestinas fecais nas fases de puberdade e ciclicidade ovariana em Onça Pintada (Panthera onca); gestação e lactação em Gato Mourisco (Puma yagouaroundi). Analytical profile of progestins during puberty and ovarian cyclicity in jaguar (Panthera onca); gestation and lactation in jaguarondi (Puma yagouaroundi). 2008. 74f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, 2008.
O presente estudo teve como objetivo utilizar a técnica de enzimaimunoensaio
(EIE) com o Ac monoclonal CL425 na dosagem de metabólitos de progestinas fecais
para caracterizar o perfil no início da atividade ovariana e durante o ciclo estral em
onça pintada (Panthera onca) e durante a gestação e lactação em gato mourisco
(Puma yagouaroundi). Foram estudadas três fêmeas de onça pintada em fases
distintas (pré-puberes n=2 e adulta n=1) e três fêmeas de gato mourisco em duas
fases distintas (gestantes n=2 e lactantes n=3). O protocolo empregado no EIE foi
validado para a mensuração de progestinas em fezes de onça pintada e gato
mourisco (r=0,98, p=0,0078; r=0,97, p=0,0130, respectivamente). Observou-se que
os animais pré-puberes apresentaram início da produção de progesterona nos
meses de setembro e novembro. As elevações das progestinas fecais na fêmea
adulta de onça pintada não se sustentaram, indicando que não ocorreu ovulação
espontânea nessa espécie. Houve diferença significativa entre as concentrações
médias de progestinas fecais (p<0,001) dos animais pré-púberes e adultos no grupo
das fêmeas de onça pintada. No grupo das fêmeas de gato mourisco, não foi
possível diferenciar as concentrações de progestinas fecais durante a gestação e
lactação.Obtivemos correlação entre as concentrações de progestinas fecais medida
pelos métodos de radioimunoensaio (RIE) e enzimaimunoensaio (r=0,98, p<0,0001).
Palavras-chave: Metabólitos. Esteróides. Enzimaimunoensaio. Felidae
ABSTRACT
RODINI, D. C. Analytical profile of progestins during puberty and ovarian cyclicity in jaguar (Panthera onca); gestation and lactation in jaguarondi (Puma yagouaroundi). Perfil analítico das progestinas fecais nas fases de puberdade e ciclicidade ovariana em Onça Pintada (Panthera onca); gestação e lactação em Gato Mourisco (Puma yagouaroundi). 2008. 74f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, 2008.
The present study had as objective to use the technique of enzyme
immunoassay (EIA) with monoclonal antibody CL425 in the dosage of faecal
progestin to characterize the profile during ovarian activity beginning and estral cycle
in jaguar (Panthera onca) and gestation and lactation in jaguarondi (Puma
yagouaroundi). Three female jaguars were studied in distinct phases (pre-pubertal
n=2 and adult n=1) and three female jaguarondi were studied during two distinct
phases (gestation n=2 and lactation n=3). The EIA used was validated for faecal
progestin measurement in jaguar and jaguarondi (r=0,98, p=0,0078; r=0,97,
p=0,0130, respectively). The beginning of progesterone production for pre-pubertal
animals was in September and November. Elevations of progestin in the adult jaguar
were not supported, showing that there was not spontaneous ovulation for this
specie. There was significant difference between medium progestin concentrations
(p<0,001) of pre-pubertal and adult jaguars. It was not possible to identify different
progestin concentrations during gestation and lactation in female jaguarondi. The
faecal progestin profiles measured by radioimmunoassay (RIA) and enzyme
immunoassay (EIA) corresponded well and were positively correlated (r=0,98,
p<0,0001).
Key words: Metabolites. Steroids. Enzyme immunoassay. Felidae
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................ 11
2 REVISÃO DE LITERATURA....................................................................... 14
2.1 Aspectos Biológicos e Reprodutivos dos Felinos Selvagens...................... 15
2.2 Métodos não invasivos................................................................................ 18
2.3 Metodologias Analíticas............................................................................... 19
2.3.1 Radioimunoensaio....................................................................................... 19
2.3.2 Enzimaimunoensaio..................................................................................... 21
2.4 Progestinas.................................................................................................. 25
3 OBJETIVOS................................................................................................ 29
4 MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................... 31
4.1 Onça Pintada............................................................................................... 32
4.1.1 Amostras - Onça Pintada............................................................................. 33
4.2 Gato Mourisco.............................................................................................. 33
4.2.1 Amostras – Gato Mourisco.......................................................................... 34
4.3 Preparação das Amostras......................................................................... 35
4.4 Transformação das Concentrações Determinadas por EIE........................ 36
4.5 Dosagens Hormonais.................................................................................. 36
4.5.1 Procedimento Enzimaimunoensaio............................................................. 37
4.5.1.1 Teste de Titulação....................................................................................... 37
4.5.1.2 Descrição do Enzimaimunoensaio............................................................... 38
4.6 Controle de Qualidade................................................................................. 43
4.7 Validação..................................................................................................... 43
4.8 Desafio de ACTH em Gato Mourisco........................................................... 44
4.9 Análise dos Resultados............................................................................... 46
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................. 47
5.1 Parâmetros de Qualidade dos Ensaios Hormonais..................................... 48
5.2 Teste de Titulação....................................................................................... 49
5.3 Validação..................................................................................................... 50
5.3.1 Validação Fisiológica................................................................................... 50
5.4 Perfis Hormonais – Gato Mourisco.............................................................. 52
5.5 Avaliação da estabilidade dos metabólitos de progesterona....................... 57
5.6 Perfis Hormonais – Onça Pintada................................................................ 58
6 CONCLUSÕES............................................................................................ 62
REFERÊNCIAS........................................................................................... 64
INTRODUÇÃO
12
1 INTRODUÇÃO
Importantes avanços têm sido obtidos na expansão do conhecimento a cerca da
reprodução de felinos selvagens, inicialmente através de estudos comparativos com
gatos domésticos como modelos para espécies de felinos ameaçados e também
através de pesquisas utilizando análises endócrinas, coletas periódicas de sêmen ou
laparoscopia em espécies não domésticas. Em especial, o uso da análise de
metabólitos de hormônios fecais como uma ferramenta de monitoramento não
invasivo para se acessar os aspectos reprodutivos e atividade adrenocortical tem
revolucionado a pesquisa com espécies ameaçadas (BROWN et al., 1996; BROWN;
WILDT, 1997; GRAHAM; BROWN, 1997).
A utilização de métodos não invasivos de mensuração de esteróides fecais
para se acessar o perfil endócrino de um animal se iniciou no final da década de 70
em trabalho desenvolvido em pássaros (CZEKALA; LASLEY, 1977) e na década de
80 em estudos com mamíferos (MOSTL, 1984), e tem se estabelecido durante as
duas últimas décadas em diversas espécies (PALME, 2005;
SCHWARZENBERGER, 2007).
Atualmente estas técnicas são amplamente utilizadas e suas vantagens são
bem conhecidas, eliminando a necessidade de contenção física ou química do
animal para um acompanhamento hormonal longitudinal (JOHNSON; GAY, 1981;
CLARKE; DOUGHTON, 1983; FULLER et al., 1984; BROWN, 2006).
Os estudos reprodutivos em espécies ameaçadas são de grande valia, pois
geram conhecimentos que poderão ser aplicados em programas de reprodução
natural e assistidos, com o intuito de maximizar a reprodução e manter a população
estável e geneticamente viável (BAMBERG et al., 1991; LASLEY; KIRKPATRICK,
1991; SCHWARZENBERGER et al., 1996).
13
Durante as duas últimas décadas, o monitoramento dos metabólitos de
estrógenos e progestinas nas fezes permitiu a caracterização efetiva do ciclo estral,
prenhez e padrões sazonais da reprodução de várias espécies de felinos (BROWN
et al.,1994, 1995, 1996, 1997, 2006; MOREIRA et al., 2001; VIAU et al., 2005;
GRAHAM et al., 2006). No entanto, para muitas espécies ainda é necessário o
desenvolvimento de novos trabalhos, gerando maior compreensão a respeito da
fisiologia reprodutiva destes animais.
Viau (2003) e Berbare (2004) trabalhando respectivamente com onça pintada
e gato mourisco observaram oscilações das progestinas que não se sustentaram,
não sendo possível estabelecer correlações com possíveis eventos biológicos.
Na gestação de gato mourisco as progestinas comportaram-se de maneira
diferente do relatado para gato doméstico e outros felinos, com níveis considerados
basais durante a gestação, apresentando elevação destes níveis no período da
lactação (BERBARE, 2004).
O presente estudo utilizou a técnica de enzimaimunoensaio na dosagem de
progestinas fecais em fezes de gato mourisco e onça pintada, buscando elucidar
conflitos relacionados ao perfil deste hormônio nas diferentes fases do ciclo
reprodutivo.
14
REVISÃO DE LITERATURA
15
2 REVISÃO DE LITERATURA
A revisão de literatura foi redigida em quatro tópicos visando facilitar a leitura.
2.1 Aspectos Biológicos e Reprodutivos dos Felinos Selvagens
A América Latina é composta por 21 países divididos em América do Norte,
Central e do Sul, compondo uma vasta área de aproximadamente 20.000.000 km2.
Dentro desta vasta região existem 10 espécies de felinos selvagens – onça pintada
(Panthera onca), onça parda (Puma concolor), jaguatirica (Leopardus pardalis), gato
maracajá (Leopardus wiedii), gato-do-mato-pequeno (Leopardus tigrinus), gato-do
mato-grande (Oncifelis geoffroyi), gato palheiro (Oncifelis colocolo), gato mourisco
(Puma yagouaroundi), gato dos andes (Leopardus jacobitus) e gato kodkod
(Oncifelis guigna), a maioria destas espécies encontra-se ameaçada devido à
extinção de todo ou parte do seu habitat natural. A conservação destes felinos,
contudo, é um grande desafio frente ao crescimento da população humana, ao
aumento do consumo de recursos, além de outras pressões sociais exercidas nos
habitats e em populações selvagens (SWANSON; BROWN, 2004).
No Brasil temos oito espécies: Puma yagouaroundi (Gato mourisco),
Leopardus wiedii (Gato maracajá), Leopardus pardalis (Jaguatirica), Leopardus
tigrinus (Gato-do-mato-pequeno), Oncifelis colocolo (Gato palheiro), Oncifelis
geoffroyi (Gato-do-mato-grande), Panthera onca (Onça pintada) e Puma concolor
(Onça parda) (OLIVEIRA, 1994).
O declínio da população de felinos está principalmente relacionado à
acelerada destruição dos habitats e a caça. Um importante aspecto na preservação
16
destas espécies está relacionado ao aumento de programas de reprodução de
zoológicos e parques, nos quais as populações são especialmente manejadas para
que se mantenham linhagens genéticas e biodiversidade. Embora, algumas
espécies de felinos em cativeiro apresentem sucesso reprodutivo, outras
apresentam dificuldades em se reproduzir. Geralmente os resultados são
dificultados pela falta de informações a respeito da fisiologia das espécies (WILDT et
al., 1986). Assim é extremamente importante que se desenvolvam estudos espécie-
específicos para avaliar precisamente a função endócrina e condições reprodutivas
em populações de felinos não domésticos (BRISTOL-GOULD; WOODURUFF,
2006).
A onça pintada é o maior felino das Américas, único representante atual do
gênero Panthera no Novo Mundo (GONYEA, 1976). Atualmente, ela pode ser
considerada quase extinta nos Estados Unidos, El Salvador, Uruguai, terras baixas
do México e regiões desenvolvidas do Brasil (SANDERSON et al., 2002). A
destruição de habitats associada à perseguição, faz com que a espécie esteja
classificada como vulnerável à extinção pela IUCN (União Internacional para
Conservação da Natureza) (IUCN, 2002), e encontre-se na categoria dos animais
vulneráveis da Lista das Espécies Ameaçadas de Extinção da Fauna Brasileira
(BIODIVERSITAS, 2006).
Com base em observações comportamentais, alguns autores sugerem que a
maturidade sexual ocorra entre 24 e 30 meses para fêmeas, e entre 36 e 40 meses
para machos (WILDT et al., 1979; MONDOLFI; HOOGESTEIJN, 1986;
RABINOWITZ; NOTTINGHAM, 1986). Em estudo da função ovariana de fêmeas
mantidas em cativeiro por meio de métodos não invasivos constatou-se que o início
17
da puberdade começa por volta dos 20 meses e o estro pode ocorrer durante 7 a 15
dias e o inter-estro de 28 a 31 dias (VIAU, 2003).
A gestação dura de 90 a 112 dias (EWER, 1973; RODRIGUES; AURICCHIO,
1994) e geralmente nascem dois filhotes (SEYMOUR, 1989). A amamentação finda
entre 5–6 meses, permanecendo com a mãe ainda por mais ou menos dois anos.
Uma fêmea pode produzir de 4 a 8 filhotes durante a vida, considerando uma
longevidade em vida livre de 11 anos, a idade da primeira cria de três a três anos e
meio e a produção de 1 a 2 filhotes a cada ano (OLIVEIRA, 1994).
O gato mourisco (Puma yagouaroundi) tem uma distribuição geográfica
semelhante aos outros felinos Neotropicais, sendo encontrado do sul do Texas, ao
leste e oeste do Mexico, através do vale do Peru, do sul do Brasil e Paraguai até as
cidades de Buenos Aires e Rio Negro na Argentina (CABRERA, 1957;
GUGGISBERG, 1975; HALL, 1981; TEWES; SCHMIDLY, 1987). O gato mourisco é
considerado o felino com mais características do ecossistema de cerrado e o
pequeno felino com a maior flexibilidade de habitat (OLIVEIRA, 1994). Dentro do
grupo dos felinos Neotropicais, somente as jaguatiricas (Leopardus pardalis) são
maiores que o gato mourisco. Este felino está classificado globalmente como
Apêndice II e como Apêndice I desde 1987 na América Central e do Norte (CITES,
2005); foi também classificado como vulnerável (OLIVEIRA, 1994; IUCN, 2002).
Segundo Mellen (1993) o ciclo estral tem duração de 53-63 dias. A gestação
dura de 70 a 75 dias, nascendo em média 1,83 fihotes (MELLEN, 1993).
18
2.2 Métodos não invasivos
Os métodos convencionais para obtenção de dados sobre o perfil endócrino
em animais domésticos baseiam-se na análise de amostras de sangue coletadas
seqüencialmente. Esta abordagem é impossível para a maioria das espécies
selvagens, devido às dificuldades de manejo e a susceptibilidade destas espécies ao
estresse. Em comparação com esses métodos mais tradicionais de análise de
hormônios esteróides no sangue, os métodos não invasivos, como as dosagens
hormonais de metabólitos excretados em urina e fezes são alternativas importantes
(BAMBERG et al., 1991; LASLEY; KIRKPATRICK, 1991; BROWN et al., 1994;
DENHARD et al., 2001; GRAHAM et al., 2001; ZIEGLER, 2005). Apresentando como
principal vantagem o fato de não introduzir variáveis que podem alterar os resultados
das dosagens (SCHWARZENBERGER, 2007).
A análise de metabólitos fecais de progesterona tem sido utilizada com
sucesso para monitoramento da função do corpo lúteo e gestação, puberdade e
sazonalidade em uma vasta lista de espécies animais incluindo primatas (WASSER
et al., 1988; WASSER et al., 1991; HEISTERMANN et al., 1993; SHIDELER et al.,
1993; WASSER et al., 1993; WASSER et al., 1994; STAVISKY et al., 1995;
ZIEGLER et al., 1996); espécies bovinas (KIRKPATRICK et al., 1993;
SCHWARZENBERGER et al., 1996); rinocerontes (SCHWARZENBERGER et al.,
1996) e felídeos (CZEKALA et al., 1994; BROWN et al., 1994; BROWN et al., 1995;
GRAHAM et al., 1997; BORQUE et al., 2005).
Segundo Brown et al. (1994), a caracterização da normalidade endócrina é
essencial para que se tenha sucesso reprodutivo, identificando-se quais indivíduos
19
apresentam problemas relativos à fertilidade, e determinando-se o tipo de técnica
em reprodução assistida que melhor se aplica a cada espécie.
É importante lembrar que o metabolismo e excreção de esteróides diferem
entre espécies e desta maneira os métodos não invasivos devem ser rigorosamente
validados para cada espécie antes de sua utilização (PALME, 2005).
Animais mantidos em cativeiro são ideais para a realização deste tipo de
pesquisa, pois permitem uma coleta regular de amostras, facilitando a validação da
técnica. Uma vez estabelecidas, análises não-invasivas de hormônios podem ser
usadas em estudos que investiguem efeitos sociais e ecológicos dos animais de vida
livre (LASLEY; KIRKPATRICK, 1991; KIRKPATRICK et al., 1993; MONFORT, 2003;
SCHWARZENBERGER, 2007).
2.3 Metodologias Analíticas
2.3.1 Radioimunoensaio
Os princípios do radioimunoensaio (RIE) foram estabelecidos em 1960 por
Solomon Berson e Rosalyn Yalow, em Nova York, e por Roger Elkins, em Londres.
Os pesquisadores americanos chamaram o método de radioimunoensaio e o inglês
de análise de saturação. Ambos os métodos se baseiam no uso de um agente
ligante específico e de hormônios radioativos como traçadores, para medir a
concentração de substâncias até então não mensuráveis pelos métodos bioquímicos
disponíveis (THORELL; LARSON, 1978).
Segundo os princípios desses métodos, uma quantidade fixa de hormônio
radioativo compete com o hormônio a ser medido (idêntico ao radioativo) por um
20
número limitado (saturado) de sítios de ligação de um agente ligante de alta
afinidade e especificidade pelo hormônio em questão. A concentração de um
determinado hormônio pode ser determinada em amostras de fluídos e extratos
biológicos (THORELL; LARSON, 1978).
A maioria dos conjuntos diagnósticos comerciais disponíveis no mercado foi
desenvolvida para avaliação quantitativa de hormônios no soro humano, os
anticorpos de alta especificidade desses kits comerciais não são em sua maioria tão
eficientes na detecção dos metabólitos por apresentarem baixa porcentagem de
reação-cruzada com os principais metabólitos encontrados nos extratos de outras
matrizes biológicas. O conjunto diagnóstico comercial para dosagem de
progesterona tem apenas 12,4% de reação cruzada com seus metabólitos segundo
protocolo fornecido pelo fabricante (Siemens® Los Angeles, CA, USA).
O RIE utiliza material radioativo o que requer licenças especiais junto aos
órgãos reguladores como a Comissão Nacional de Energia Nuclear (CNEN). São
gerados rejeitos radioativos que devem permanecer armazenados no laboratório por
um período de no mínimo 60 dias para o decaimento da meia vida do 125I, para que
depois possam ser descartados como lixo hospitalar. O elevado custo por amostra
dosada, chega a custar em média 80% mais se comparado com outras
metodologias imunométricas, como o Elisa e a Quimiluminescência.
Com o desenvolvimento de programas de responsabilidade ambiental,
alternativas a esse método radioativo foram desenvolvidas para a quantificação
hormonal em soro humano, como o enzimaimunoensaio (EIE), a quimiluminescência
e a espectometria de massa. Para uso veterinário o radioimunoensaio ainda é
utilizado para quantificação de hormônios, embora os trabalhos publicados
recentemente apontem para uma substituição gradativa dessa metodologia, com
21
grande destaque para os projetos com animais silvestres (BORQUE et al., 2005;
PEREIRA et al., 2006; SONGSASEN et al., 2006; PETTITT et al., 2007).
2.3.2 Enzimaimunoensaio
As enzimas são os marcadores mais utilizados na atualidade, com as
vantagens de não apresentarem riscos associados à exposição de radioisótopos,
bem como a possibilidade da amplificação catalítica e da associação com outros
marcadores, como por exemplo, os quimioluminescentes e fluorescentes, resultando
em ensaios de baixo limite de detecção (TSUJI, 1989; JOHANNSSON, 1991).
O exemplo significativo de enzimaimunoensaios (EIE) heterogêneo é o
método que emprega anticorpos imobilizados em placa de poliestireno com número
variável de poços de ensaio. Em protocolo clássico o método é realizado em 8
etapas: 1-ativação da placa, 2-lavagem, 3-imobilização dos anticorpos, 4-lavagem,
5-incubação, 6-lavagem,7-adição de substrato cromogênico e 8-leitura óptica dos
poços. Este sistema de placas possibilita a realização do ensaio de maneira com
que garanta a uniformidade de todas as etapas tanto para amostras e referências,
condição essencial para confiabilidade dos dados. Outro ponto muito importante é
que devido à alta sensibilidade do método, o mesmo é feito em micro escala o que o
torna bastante econômico dado à reduzida quantidade de reagentes utilizados, além
da rapidez do método. (JOHANNSSON, 1991; ZIEGLER, 2005).
Os resultados apresentados por Graham et al. (2001) e por Moreira (2001)
demonstram que o EIE é uma alternativa prática e econômica ao RIE para o
monitoramento não invasivo da função ovariana via análise de progestinas e
22
estrógenos de amostras fecais de espécies não domésticas em cativeiro ou em vida
livre. Esse imunoensaio pode ser implementado com um custo mínimo de
equipamentos e com um custo baixo por análise. Acrescentam-se ainda outras
vantagens sobre o procedimento convencional de RIE; essas são: maior
sensibilidade, menos trabalho e economia de tempo, uso mais econômico do
anticorpo e utilização de equipamento de menor custo (MOREIRA, 2001).
Esse sistema de análise pode operar tanto de forma competitiva ou não
competitiva. Na versão competitiva, antígenos marcados com enzimas competem
com antígenos livres (analito) por número limitado de anticorpos imobilizados.
Atualmente utilizam-se, tanto para ensaios competitivos, quanto não-competitivos,
sistemas que fazem, além de leitura automatizada dos diferentes poços, diluições
em série e réplicas das amostras (JOHANNSSON, 1991).
A maioria dos EIE utiliza anticorpos específicos para hormônios esteróides
não metabolizados ou conjugados de esteróides metabolizados, o que os torna mais
aplicáveis para a mensuração de hormônios esteróides circulantes no sangue ou
metabólitos conjugados na urina, respectivamente. Entretanto, fezes são mais fáceis
de coletar do que soro ou urina, sendo a análise de esteróides fecais o método
preferencial para o monitoramento não invasivo da função ovariana em animais
selvagens de cativeiro ou de vida livre (LASLEY; KIRKPATRICK, 1991; MUNRO et
al., 1991; CZEKALA et al., 1994).
Para o desenvolvimento de ensaios espécie-específicos, a determinação da
maioria dos metabólitos de hormônios fecais através de estudos de
radiometabolismo (PALME et al., 1996, 2005) ou a identificação dos metabólitos de
esteróides fecais via espectometria de massa seriam as possibilidades analíticas. No
entanto, essas técnicas são de difícil aplicação na maioria das espécies selvagens e
23
a melhor alternativa é realizar o teste de diferentes ensaios com altas reações
cruzadas contra certos grupos de esteróides, obtendo-se assim ensaios grupo-
específicos (SCHWARZENBERGER, 2007).
Enzimaimunoensaios para progestinas foram usados com sucesso no
monitoramento não invasivo da função endócrina durante o ciclo estral, gestação, e
período pós-parto de veados (Mazama guazoubira) (PEREIRA et al., 2006)
Os resultados obtidos por Songsasen (2006) no monitoramento da função
gonadal através da quantificação de metabólitos fecais por EIE em fêmeas de lobo
guará (Chrysocyon brachyurus) foram similares ao observado por Velloso et al.
(1998) usando o RIE.
O trabalho desenvolvido por Gudermuth (1998) indica que os eventos
hormonais ocorridos durante o ciclo reprodutivo do cão doméstico (Canis familiares)
apresentam reflexos nas concentrações de esteróides fecais, resultados estes
obtidos através da técnica de EIE.
A quantificação de 17β-estradiol e progesterona em soro canino utilizando EIE
apresentou boa correlação (r=0,91, p<0,001) com os resultados obtidos por RIE
(VERVERIDIS et al., 2002).
Esses ensaios enzimáticos têm sido usados com sucesso para quantificação
de metabólitos de progesterona em fezes de animais de produção como vacas de
corte, com o objetivo de facilitar o manejo e permitir o monitoramento do ciclo
ovariano. Isobe et al. (2005) conclui que o EIE é um ótimo método para a
mensuração de progesterona fecal em gado de corte. Este tipo de ensaio permite
um resultado rápido, sensível a concentrações de progesterona plasmática inferiores
a 1.0ng/mL, é relativamente mais barato e pode ser realizado com maior facilidade,
até mesmo em trabalhos a campo (SINGER et al., 2004).
24
Ensaios que apresentam alta reação cruzada com um grupo de
pregnanedionas e hidroxe-pregnanes têm sido utilizados com sucesso para
quantificar metabólitos de progesterona em fezes de diversas espécies incluindo
carnívoros (BROWN, 2006).
Diversos trabalhos com EIE avaliaram a função ovariana por meio da
quantificação dos metabólitos de estrógenos e progestinas em diversas espécies
utilizando respectivamente os anticorpos policlonal R522-2 e monoclonal CL425
obtidos de Coralie Munro (Universidade da Califórnia, Davis, CA, EUA). Estes
anticorpos mostraram-se eficientes, permitindo a identificação de diferentes
momentos fisiológicos como gestação, puberdade, ciclo estral e ovulação em
espécies como lobo guará (Crysocyon brachyurus), elefantes africanos (Loxodonta
africana), rinocerontes negros (Diceros bicornis) e brancos (Ceratotherium simum),
hipopótamos (Hipopotamus amphibius), okapis (Okapia johnstoni) (GRAHAM et al.,
2001; SONGSASEN et al., 2006) e esquilo (Xerus inauris) (PETTITT et al., 2007).
Trabalhos realizados com felídeos selvagens (BROWN et al.,1994, 1995,
1996; GRAHAM et al., 2001; MOREIRA et al., 2001; GRAHAM et al., 2006)
utilizaram para detecção das progestinas um anticorpo monoclonal que reage 100%
com progesterona, 96% com 5-α-pregnane-3β-ol-20-ona, 36% com 5α-pregnane-3α-
ol-20-ona, 15% com 5β-pregnane-3β-ol-ona, 15% com 17β-hidroxiprogesterona,
13% com pregnanolona, 5% com 5β-pregnane-3α-ol-20-ona, 5% com 5β-pregnane-
3α, 17α-diol, 20α-ona e menos que 1% com androstenediona, testosterona,
estradiol, estriol e cortisol. Os principais metabólitos fecais de progesterona para
esse táxon foram determinados por HPLC por Brown et al., 1994. São eles 5β-
pregnane-3β-ol-ona (61,8%), 5β-pregnane-3α-ol-20-ona (22,3%), 5α-pregnane-3α-ol-
20-ona (13,9%), 5-α-pregnane-3β-ol-20-ona (3,2%).
25
2.4 Progestinas
A concentração de progesterona no soro aumenta após ovulação espontânea
ou induzida e deve estar presente para que a gestação seja mantida. Foi
demonstrado em um estudo com gato doméstico que as enzimas necessárias para a
produção de progesterona estão presentes na placenta, sugerindo que a unidade
feto-placental seja uma fonte de progesterona gestacional (KUSTRITZ, 2006).
Progesterona é metabolizada em pregnanedionas e pregnanes hidroxilados
antes de sua excreção nas fezes. Então, o uso de anticorpos de progesterona
subestima as concentrações de metabólitos fecais. Para melhorar a metodologia de
análise não invasiva de metabólitos de progesterona nas fezes,
enzimaimunoensaios utilizando um grupo específico de anticorpos são indicados
(SCHWARZENBERGER et al., 1996).
O mecanismo da ovulação parece variar entre as diferentes espécies de
felinos. Estudos que utilizaram dosagens hormonais séricas ou plasmáticas
confirmam que alguns felinos selvagens como tigresas - Panthera tigris (SEAL et al.,
1985), leopardo das neves - Panthera uncia (SCHIMIDT et al., 1993), e suçuaranas -
Puma concolor (BONNEY et al., 1981), possuem mecanismo de ovulação induzida,
assim como a gata doméstica - Felis catus (SHILLE et al., 1979; JOHNSTON et al.,
1996). No entanto, alguns trabalhos observaram altas concentrações de
progesterona sérica e a presença de corpo lúteo em gatas que não tiveram contato
físico com machos, sugerindo que a ovulação pode ter ocorrido espontaneamente
ou por outro estímulo que não a cópula (LAWLER et al., 1993; GUDDERMUTH et
al., 1997).
26
Alguns trabalhos sugerem também, a ocorrência de ovulação espontânea em
algumas espécies de felinos silvestres. Fêmeas de leopardos – (Panthera pardus)
apresentaram os dois mecanismos de ovulação em duas diferentes situações.
Quando mantidas isoladas, mostraram perfil hormonal típico de ovuladoras reflexas,
porém, quando alojadas em duplas de fêmeas, ovularam, provavelmente
estimuladas pelo contato físico entre elas (SCHMIDT et al., 1988). Leoas (P. leo)
isoladas de machos mostraram um padrão distinto dos demais felinos relatados.
Schmidt et al. (1979) comprovaram por dosagens hormonais séricas e visualização
do corpo lúteo, que esta espécie apresenta ovulação espontânea com freqüência
superior a outros felinos já descritos na literatura. Moreira et al. (2001)
acompanharam o perfil longitudinal, através da dosagem hormonal dos estrógenos e
progestinas fecais de três espécies da linhagem das jaguatiricas, e observaram que
a jaguatirica (Leopardus pardalis) e gato-do-mato (Leopardus tigrinus) apresentaram
ovulação reflexa, enquanto o gato-maracajá (Leopardus wiedii) apresentou ovulação
espontânea.
Segundo Wildt et al. (1979), a ovulação da onça-pintada assemelha-se a do
gato doméstico, sugerindo que muito provavelmente estes animais apresentem
ovulação não espontânea.
Em algumas espécies (jaguatirica, lince e onça-pintada) observou-se que as
progestinas estão aumentadas durante a elevação do estradiol. Entretanto, isto não
é observado em todas as espécies e a significância desta co-variação não é
conhecida. As progestinas são provavelmente de origem folicular, porque as
concentrações são apenas uma fração daquelas observadas pós ovulação
(BROWN, 2006).
27
Viau (2003) não observou variação significativa das concentrações de
metabólitos de progesterona nos períodos de estro e inter estro em fezes de onça
pintada.
Berbare (2004) observou elevações dos metabólitos de progesterona nas
fezes de gato mourisco, mas estas elevações apresentaram-se irregulares e
inconsistentes, não sendo possível concluir que essas elevações tenham refletido
uma atividade luteínica, fato que caracterizaria uma ovulação espontânea.
Alterações hormonais durante o período de diestro pós-cópula no gato
doméstico estão bem caracterizadas. Inicia-se de 1 a 2 dias pós ovulação, a
secreção de progesterona do corpo lúteo aumentando e permanecendo elevada de
64 a 67 dias nas gatas gestantes, e aproximadamente a metade deste período nas
não gestantes (WILDT, 1981; TSUITSUI, 1993). Após a ovulação, 17β Estradiol
sérico flutua acima dos níveis basais, indicando atividade esteroidogênica mesmo
durante a gestação. Estrógenos aumentam significativamente durante a última
metade da gestação, com uma elevação ocorrendo cerca de uma semana antes do
parto (ROTH et al., 1995).
O diagnóstico de gestação baseado na análise de progesterona durante a
primeira metade da gestação não é possível devido aos níveis de concentração da
fase luteal não apresentarem significativa variação. Entretanto, como a fase luteal é
mais curta é possível se detectar a gestação se a progesterona continua elevada
após 40 dias da cópula (BROWN, 2006). Em tigres podem-se utilizar as
concentrações de progestinas fecais para o diagnóstico da gestação após 35 dias da
cópula (GRAHAM et al., 2006).
Em diversas espécies de felinos selvagens, leão (SCHIMDT et al., 1979),
puma (BOONEY et al., 1981), leopardo das neves, guepardos e tigres (BROWN,
28
1994, 1996) observou-se que a duração da fase luteal gestante é cerca de um terço
a metade da gestação.
Em trabalho realizado com fêmeas de gato mourisco (Puma yagouaroundi)
prenhes as progestinas comportaram-se de maneira diferente do relatado para gato
doméstico e outros felinos, com níveis considerados basais durante a gestação,
apresentando elevação destes níveis no período da lactação (BERBARE, 2004).
Variações na concentração de progesterona podem também estar associadas
a situações estressantes. Encontramos na literatura diversos trabalhos que utilizam
dosagens de cortisol e progesterona como um parâmetro para se avaliar a resposta
do córtex adrenal ao stress em diversas espécies animais como vacas (ESSAWY et
al., 1989), cães (PRITTIE et al., 2002) e gatos SMITH et al.,1999; CHATDARONG et
al., 2006).
CHATDARONG et al., 2006 observou que variações de ambiente e
manipulações podem agir como agentes estressores induzindo a secreção de
cortisol e progesterona pela adrenal em gatos domésticos com a mesma magnitude
que a administração de ACTH.
29
OBJETIVOS
30
3 OBJETIVOS
- Caracterizar o perfil das progestinas fecais no início da atividade ovariana e
durante o ciclo estral em fêmeas de onça pintada.
- Caracterizar a atividade luteal durante a gestação e lactação em fêmeas de gato
mourisco.
- Demonstrar a aplicabilidade da técnica de enzimaimunoensaio (EIE) para
quantificar progestinas fecais utilizando amostras previamente dosadas por
radioimunoensaio (RIE).
31
MATERIAIS E MÉTODOS
32
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Neste estudo utilizamos amostras oriundas dos seguintes projetos de
pesquisa: “Determinação das concentrações de estrógenos e progestinas em
extratos fecais de fêmeas de onça pintada (Panthera onca)” e “Metabólitos fecais de
hormônios esteróides sexuais do gato-mourisco (Herpailurus yagouaroundi)”, nível
mestrado, fomentados pela FAPESP, nº 00/14352-6 e 01/10930-8, respectivamente,
Desta maneira os subitens “4.1 Onça Pintada” e “4.2 Gato Mourisco” seguem o que
foi previamente descrito por Viau (2003) e Berbare (2004).
4.1 Onça Pintada
Foram utilizadas três fêmeas de onça-pintada (Panthera onca), sendo uma
adulta e duas pré-púberes. Os animais foram divididos em dois grupos: animais
adultos (grupo AA) e animais pré-púberes (grupo PP). O animal adulto era de
procedência desconhecida e mantido na Fundação Parque Zoológico de São Paulo
– FPZSP (AA-01), em recinto individual no setor extra, porém com contato olfativo
e/ou visual com machos e fêmeas da mesma e de outras espécies.
No grupo PP, uma fêmea (PP 01) era procedente da Região do Rio Negro –
Pantanal pertencente ao Parque Zoológico Municipal “Quinzinho de Barros”–
Sorocaba/SP. A idade média estimada dessa fêmea era de 11 meses no início do
experimento. A segunda fêmea era procedente de Anaurilândia – MS, e mantida no
Centro de Conservação da Fauna Silvestre de Ilha Solteira – CESP/SP (PP02),
tendo contato visual e olfativo com um macho da mesma ninhada. A idade média
estimada para esta fêmea foi de 15 meses, no início do experimento.
33
Todos os animais estiveram expostos ao ambiente (fotoperíodo, temperatura
e umidade do ar), tinham acesso livre à água e a dieta alimentar era oferecida à
tarde conforme rotina empregada pelas instituições.
No quadro 1 encontram-se os dados de cada animal.
animal Idade Procedência Histórico
Reprodutivo AA-01 Adulta FPZSP - SP 1 gestação PP-01 11 meses PZMQB – Sorocaba/SP - PP-02 15 meses CCFS/ CESP- Ilha Solteira/SP -
FPZSP=Fundação Parque Zoológico de São Paulo PZMQB= Parque Zoológico Municipal “Quinzinho de Barros” CCFS=Centro de Conservação da Fauna Silvestre
Quadro1- Identificação, idade, procedência e histórico reprodutivo das fêmeas de onça pintada (Panthera onca) utilizadas no presente estudo
4.1.1 Amostras Onça Pintada
As amostras fecais foram colhidas de 2 a 7 vezes por semana, logo após os
animais defecarem no período da manhã. A colheita das amostras de onça pintada
do grupo AA foi realizada durante aproximadamente 18 meses, e do grupo PP
durante aproximadamente 16 meses.
4.2 Gato Mourisco
Foram utilizadas no estudo três fêmeas de gato-mourisco (Puma
yagouaroundi), com idade variando de 2 à 10 anos, que encontravam-se alojadas na
Fundação Parque Zoológico de São Paulo, no bairro da Água Funda em São Paulo,
34
fora do setor de exposição. Todos os animais estavam submetidos à fotoperíodo
natural, e havia contato visual e olfativo com machos da espécie.
Os animais foram submetidos à avaliação clínica e reprodutiva. Todos os
animais encontravam-se sadios ao exame clínico e sem alterações patológicas no
sistema reprodutivo.
As fêmeas G2 e G5 estavam prenhes com tempo de gestação estimado pelo
exame ultrassonográfico em 40 a 45 dias e fase final (±60 dias), respectivamente. O
animal G5 pariu dois filhotes no dia 25/02 e o animal G2 um filhote no dia 16/03. O
animal G6 pariu 3 filhotes três dias após o início do experimento.
No quadro 2 encontram-se os dados de cada animal.
Animal Idade Procedência Histórico Reprodutivo G2 (20762) 10 anos FPZSP-SP 7 gestações G5 (25244) 2 anos FPZSP-SP 2 gestações G6 (23120) 6 anos FPZSP-SP 2 gestações
FPZSP= Fundação Parque Zoológico de São Paulo
Quadro 2 - Identificação, idade, procedência e histórico reprodutivo das fêmeas de gato-mourisco (Puma yagouaroundi) utilizadas no presente estudo
4.2.1 Amostras Gato Mourisco
As amostras de fezes de gato mourisco foram colhidas cinco vezes por
semana durante um período total de 9 meses (14/01/2003 a 03/10/2003). No período
da manhã, entre 7:00h e 8:00h, foram colhidas amostras fecais recentes com o
auxílio de espátula de madeira. Todo material colhido foi acondicionado em tubos
plásticos devidamente identificados quanto ao cadastro do animal e datas, e
35
congelado em um prazo máximo de 12 horas após a colheita a uma temperatura de
–20ºC, pois segundo Cockrem e Rounce (1994), dentro desse período não há o
risco de se ter uma degradação hormonal significativa. As amostras ficaram
armazenadas no Laboratório de Dosagens Hormonais (LDH) / FMVZ-USP, em
freezer a - 20°C, até o descongelamento para realização do processo de extração
hormonal.
4.3 Preparação das amostras
Todas as amostras foram liofilizadas durante 24h com o auxílio do aparelho
evaporador giratório tipo Speed vac (Speed vac – Sc110, Savant®). A liofilização de
cada amostra colhida garante a ausência de ação bacteriana, uma vez que estas
necessitam de água, e também a padronização do peso do material fecal utilizado.
A metodologia empregada na extração dos metabólitos fecais foi de acordo
com a técnica descrita por Graham et al. (2001). Alíquotas de 0,2g de fezes
liofilizadas foram colocadas em tubos de 15mL e adicionados 5mL de etanol (Etanol,
P.A. - Merck®) a 80% (80% etanol, 20% água destilada). Os tubos foram fechados e
agitados suavemente em um homogeneizador de sangue (AP22, Phoenix,
Araraquara, Brasil) por 15 horas. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a
1500g por 15 minutos (Centrífuga Excelsa II, modelo 206 MP - Fanem®) e o
sobrenadante transferido para tubos de polipropileno e conservado a -20ºC até a
realização dos ensaios hormonais. Para esta etapa, as amostras foram diluídas em
tampão gelatina [NaPO4 (13,8g), NaCl (9,0g), azida sódica (1,0g) e água destilada
(1000ml), pH 7,0], na proporção de 1/100.
36
4.4 Transformação das concentrações determinadas por EIE
As concentrações determinadas por EIE foram expressas para progesterona
em pg/poço, sendo necessária a adequação dos resultados para ng/g de fezes
secas. Para essa adequação utilizamos a seguinte equação:
C x Vfe x D CF= Pi x Vext.
CF = concentração final;
C = concentração fornecida pelo EIE;
Vfe = volume das fezes ao final da etapa de extração;
D = diluição empregada;
Pi = peso inicial
Vext = volume do extrato utilizado
4.5 Dosagens Hormonais
Os metabólitos fecais foram quantificados por enzimaimunoensaio (EIE) de
acordo com os procedimentos descritos para outros mamíferos (MUNRO;
STABENFELDT, 1984; ILLERA et al., 2003; PEREZ, G.C. et al. 2004). O anticorpo
(Ac) monoclonal anti-progesterona clone 425 (CL 425) e a progesterona conjugada
3-O-carboxymetiloxime (HRP) foram fornecidos pela Dra Coralie Munro
(Universidade da Califórnia, Davis, Califórnia, USA). As reações-cruzadas deste
37
anticorpo foram previamente descritas e são apresentadas na tabela 1 (GRAHAM et
al., 2001).
Tabela 1 – Percentual de reações cruzadas do clone nº 425 do anticorpo para progesterona e seus metabólitos segundo descrito por Graham et al., 2001
Metabólitos de progesterona Nome comum Reação cruzada (%) 4- Pregnan-3,20-diona Progesterona 100
4- Pregnan-3α-ol-20-ona 188 4- Pregnan -3β-ol-20-ona 172
4-Pregenan - 11α-ol-3,20-diona 147 5α-Pregnan-3β-ol-20-ona 94 5α-Pregnan-3α-ol-20-ona 64 5α-Pregnan-3,20-diona 55
5β- Pregnan-3β-ol-20-ona 12,5 5β-Pregnan-3,20-diona 8,0
4- Pregnan-11β-ol-3,20-diona 2,7 5β-Pregnan-3α-ol-20-ona 2,5 5β-Pregnan-3α,20α-diol Pregnanediol <0,1 5α-Pregnan-3α,20β-diol <0,1 5β-Pregnan-3,17-diona Androstenediona <0,1
5β-Pregnan-11β,21-diol-3,20-diona Corticosterona <0,1
4.5.1 Procedimento enzimaimunoensaio
4.5.1.1 Teste de titulação
A primeira etapa na realização do enzimaimunoensaio consistiu na realização
de um Teste de Titulação, para que se estabelecesse a melhor relação Ac x HRP.
Neste teste foram confrontadas diferentes diluições de Ac com diferentes diluições
de conjugado conforme modelo a seguir (Figura 1):
38
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Br STD1 STD3 STD5 B0 STD2 STD4 B0 STD2 STD4
B B0 STD1 STD3 STD5 B0 STD2 STD4 B0 STD2 STD4
C B0 STD2 STD4 STD6 STD1 STD3 STD5 STD1 STD3 STD5
D B0 STD2 STD4 STD6 STD1 STD3 STD5 STD1 STD3 STD5
E B0 STD1 STD3 STD5 B0 STD2 STD4 B0 STD2 STD4
F B0 STD1 STD3 STD5 B0 STD2 STD4 B0 STD2 STD4
G B0 STD2 STD4 STD6 STD1 STD3 STD5 STD1 STD3 STD5
H B0 STD2 STD4 STD6
STD1 STD3 STD5
STD1 STD3 STD5
As colunas 5 e 9 não foram utilizadas nesse ensaio Br = branco B0= máxima ligação entre o Ac e o conjugado STD 1= 0,1pg/poço STD 2= 1,0pg/poço STD 3= 10,0pg/poço STD 4= 100,0pg/poço STD 5= 1000,0pg/poço STD 6= 10000,0pg/poço
Figura 1- Modelo placa utilizada no Teste de Titulação 4.5.1.2 Descrição do enzimaimunoensaio
O enzimaimunoensaio para progesterona foi realizado com base no protocolo
descrito por Illera et al. (2003). A técnica consiste na marcação de placas (NUNC®
Maxisorb) de 96 poços com 50µl de uma solução de anticorpo purificado (Cl
425,1/8.000) em uma solução de coating (coating buffer; Na2CO3, NaHCO3, H2O,
pH9,6) exceto o primeiro poço que foi utilizado como branco (Br). As placas foram
cobertas com selador plástico (SARSTEDT) e incubadas a 4ºC por 16 horas (Figura
2). Os anticorpos não aderidos a placa foram removidos através de três lavagens em
HRP
1/80000
1/160000
Ac 1/4000 1/8000 1/10000
39
lavadora automática (Modelo: Fluido 96-2, Asys Hitech- Anthos®) com uma solução
de lavagem (NaCl 1,5M, 0,05% Tween 20) (Figura 3).
A placa foi coberta com os padrões e amostra (Figura 4). As soluções
padrões foram mantidas dissolvidas em etanol a -20ºC. Foram utilizados os padrões
nas diluições: 0,1,1,10,100,1000 e 10000 pg/poço. O etanol foi evaporado em um
fluxo de ar comprimido (60ºC) e os padrões ressuspendidos em uma solução
1/160.000 de progesterona HRP-conjugado em uma solução de ensaio (EIA Buffer,
Na2HPO4 0.1M; NaH2PO4 0.1M; NaCl 0.15M cm 0,1% BSA, pH7,0).
As amostras finais foram preparadas com 25µl de extrato fecal, os tubos
deixados para secagem em capela “overnight” e ressuspendidos em 150µl de
solução 1/160.000 do conjugado HRP. Padrões e amostras foram analisados em
duplicata. Os poços da primeira coluna foram denominados B0 (máxima ligação
entre o anticorpo e o conjugado). Para a curva padrão 50µl de EIA buffer seguido de
50µl de cada padrão foram pipetados nos poços das colunas 1 e 2. Para as
amostras de extratos fecais 50µl de EIA buffer seguido de 50µl de amostra foram
pipetados no poços das colunas 3 a 12. Após incubação em temperatura ambiente
por 2 horas, as placas foram lavadas novamente e 100µl de solução de substrato
(Enhanced K-Blue® TMB Substrate, Neogen Corporation) foi adicionada a cada
poço (Figura 5). Após 15-20 minutos a reação foi parada com 100µl de solução de
10% de H2SO4 (Figura 6), seguida da leitura em um leitor automático (Modelo Multi
Detector DTX 800, Beckman Coulter®) com um filtro de 450nm (Figura 7).
40
Figura 2 – Adsorção dos anticorpos, incubação
por 16 horas em geladeira
Figura 3 - Lavagem das placas
41
Figura 4 - Adição das amostras, padrões e
conjugado
Figura 5 - Adição do substrato
42
Figura 6 – Adição de solução de parada
Figura 7 – Leitura da placa, processamento dos resultados
43
4.6 Controle de qualidade
Todos os parâmetros de controle de qualidade dos ensaios hormonais foram
analisados conforme rotina e empregada no LDH, ou seja, foram calculados o
coeficiente de variação intra e inter-ensaio, utilizando valores altos e baixos, no início
e fim de cada ensaio. Analisamos a porcentagem de ligação B/B0, sensibilidade e
linearidade.
4.7 Validação
Realizou-se a validação laboratorial e biológica do enzimaimunoensaio para o
uso em extrato de fezes de onça pintada e gato-mourisco, utilizando-se os métodos
de paralelismo e validação fisiológica.
Paralelismo utilizando matriz íntegra: Indica se o material utilizado está interferindo
na ligação antígeno-anticorpo. Foi utilizado um “pool” de amostras de alta
concentração hormonal (valores próximos aos limites superiores da curva-padrão).
Estas amostras foram diluídas com o mesmo fator da curva padrão.
Validação fisiológica: Indica se as concentrações de metabólitos de esteróides
encontradas refletem a função gonadal ou adrenal. Para o gato mourisco foi
realizada a validação fisiológica através de um desafio de ACTH e a análise
comparativa dos resultados das dosagens de corticosteróides e progestinas fecais
dosadas por RIE e por EIE. Para a onça pintada foi realizada a validação fisiológica
através da comparação dos resultados de progestinas fecais obtidos nos animais
44
pré-púberes (antes do início da atividade ovariana) com os resultados do animal
adulto.
4.8 Desafio de ACTH em gato mourisco (Puma yagouaroundi).
Foi realizado um protocolo experimental durante dez dias (D-3 a D6) em uma
fêmea de gato mourisco (Puma yagouaroundi) (Figura 8), mantida em cativeiro no
setor extra do Parque Zoológico Municipal “Quinzinho de Barros” em Sorocaba, São
Paulo. O objetivo deste experimento foi verificar a resposta da glândula adrenal após
estímulo com ACTH exógeno.
No D0 o animal recebeu uma injeção intramuscular 250UI de tetracosídeo
ACTH (Synacthene® Depot-Novartis- uso humano, 800UI/mg, 1mg, 1ml) (Figura 9).
Amostras de fezes foram coletadas diariamente no período da manhã e mantidas a -
20°C até o processamento. As etapas de liofilização, extração (segundo GRAHAM et
al., 2001) e ensaios hormonais foram realizadas no Laboratório de Dosagens
Hormonais da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP. Os
metabólitos de corticosterona foram quantificados pela técnica de radioimunoensaio
(RIE) utilizando-se o conjunto diagnóstico comercial de duplo anticorpo (MP
BIOMEDICALS; INC, CA-USA) e as progestinas fecais por enzimaimunoensaio (EIE)
e por radioimunoensaio (RIE), utilizando-se o anticorpo monoclonal CL425 e o
conjunto diagnóstico comercial em fase sólida (Siemens®, antiga DPC, Los Angeles,
CA, USA), respectivamente.
45
Figura 8 - Fêmea de gato mourisco (Puma yagouaroundi) mantida em
cativeiro no PZMQB Sorocaba
Figura 9 - Contenção física e aplicação da injeção de ACTH (Parque
Zoológico Municipal “Quinzinho de Barros”, Sorocaba)
46
4.9 Análise dos Resultados
Todos os resultados foram expressos de acordo com suas médias e erro padrão
das médias. As variáveis foram primeiramente analisadas quanto à sua distribuição
pelo teste de Kolmogorov – Smirnov (teste KS), para verificação de normalidade, e
pelo teste de Bartett para verificação de homogenidade de variâncias.
Os demais resultados comparativos foram analisados, na dependência das
análises anteriormente descritas, segundo métodos paramétricos ou não-
paramétricos. Na hipótese dos dados apontarem para uma metodologia paramétrica,
a análise de variância (ANOVA) e os testes de comparação entre médias daí
decorrentes foram preferencialmente empregados. Caso contrário deu-se
preferência à análise de variância não-paramétrica para correlação de amostras
relacionadas.
Para verificação de paralelismo nos métodos empregados na validação dos
enzimaimunoensaios, foi realizada uma análise de regressão simples e o índice de
correlação adotado superior a 0,95 (GRAHAM, 2001).
Os dados foram analisados através do programa SAS System for Windows (SAS,
Institute Inc, Cary, NC, USA, 2000)
47
RESULTADOS E DISCUSSÃO
48
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A seguir serão apresentados resultados e discussão deste trabalho.
5.1 Parâmetros de Qualidade dos Ensaios Hormonais
A sensibilidade mínima detectada pela técnica de EIE para dosagem das
progestinas fecais foi de 0,14pg/poço. A porcentagem de ligação (B/B0) foi de
59% (Tabela 2).
Tabela 2 – Tabela com os coeficientes de variação intra-ensaio e inter-ensaio de concentrações baixa e alta obtidos nos ensaios da dosagem de progestinas fecais - São Paulo - 2008
Fezes Intra-ensaio (%) Inter-ensaio (%)
10pg/poço 1,96 3,20
100pg/poço 8,93 10,11
A sensibilidade mínima detectada pela técnica de RIE para dosagem das
progestinas fecais foi de 0,01ng/mL. O coeficiente de variação intra-ensaio baixo
foi de 1,89% e intra-ensaio alto foi de 3,53%.
Para o ensaio de corticosterona, a sensibilidade mínima detectada foi de 1,46
ng/mL. Os coeficientes de variação intra-ensaio baixo e alto foram 6,09% e
7,41%, respectivamente.
49
5.2 Teste de titulação
A figura 10 representa o gráfico obtido no teste de titulação determinada pelo
EIE, o eixo X representa os pontos de concentração da curva padrão e o eixo Y a
densidade óptica. Na análise dos resultados, a melhor curva obtida foi aquela em
que utilizamos o Ac diluído 1/8000 e o HRP 1/160000.
Figura 10 - Representação gráfica obtida pelo programa de software acoplado a
leitora automática (MOD 800DTX, Beckman Coulter) o eixo Y representa os dados obtidos com a leitura da densidade óptica (OD) e o eixo X representa as concentrações em pg/poço
50
5.3 Validação
Houve paralelismo entre a curva padrão do ensaio hormonal para a
progesterona e a curva de diluição da matriz estudada. Podemos observar que em
todos os testes realizados obtivemos uma alta regressão linear conforme
demonstrado na tabela 3.
Tabela 3 – Resultado de r=R quadrado e os valores de significância obtidos na validação da dosagem hormonal das progestinas (EIE) da matriz fecal para as espécies estudadas - São Paulo - 2008
Hormônio/matriz/espécie Valor de r Valor de p
P4/fezes/onça pintada 0,984 0,0078
P4/fezes/gato mourisco 0,974 0,0130
Os resultados mostraram boa linearidade nos ensaios de progesterona para a
matriz fecal de onça pintada e gato mourisco (r=0,99 e r=0,98), respectivamente, nas
faixas das concentrações estudadas. Podemos então inferir com base nestes
resultados que esse ensaio foi validado laboratorialmente.
5.3.1 Validação Fisiológica
Gato Mourisco
A média (±EPM) das concentrações de metabólitos de corticosteróides fecais
dosadas por radioimunoensaio (RIE) foi de 492,96 ± 0,86µg/g de fezes secas, sendo
o valor do pico de 1005,06µg/g de fezes secas. A média (±EPM) das concentrações
51
de progestinas fecais dosadas por enzimaimunoensaio (EIE) foi de 922,78
±63,18ng/g de fezes secas, sendo o valor do pico de 13,81ng/g de fezes secas
(Figura 11).
Figura 11 - Perfil das concentrações de corticosteróides fecais obtidas por RIE e de progestinas fecais obtidas por RIE e EIE pré e pós-estimulação com ACTH em uma fêmea de gato mourisco (Puma yagouaroundi) - São Paulo – 2008
Obtivemos correlação significante positiva entre as concentrações de
corticosteróides fecais determinadas por RIE e de progestinas fecais determinadas
por EIE e por RIE (r=0,98, p<0,0001).
Onça Pintada
As médias das concentrações de progestinas fecais são apresentadas na
tabela 4. Houve diferença significativa entre as concentrações médias de
progestinas fecais (p<0,001) dos animais pré-púberes e adulto.
*D0 – aplicação injeção ACTH
52
Tabela 4 - Concentração média das progestinas fecais (ng/g de fezes secas) obtidas por EIE dos animais pré-púberes (n=2) comparada com a média das concentrações da fêmea adulta (n=1) - São Paulo - 2008
Progestinas fecais (ng/g fezes secas) Animal Média (±EPM) Min-Máx
PP (n=72)
157,25 ± 11,57a 2,88 – 445,10
AA
(n=168) 937,87 ± 113,40b 169,72 – 12,18
a, b Valores com diferentes sobrescritos diferem significativamente (p<0,001)
Nossos resultados demonstraram que houve variação biológica significativa
nos testes realizados, sendo o enzimaimunoensaio utilizado validado
fisiologicamente para a mensuração de progestinas em fezes de gato mourisco e
onça pintada.
5.4 Perfis Hormonais - Gato Mourisco
Foram realizadas as dosagens de progestinas fecais durante gestação
(animais G2 e G5) e lactação (animais G2, G5 e G6). O período de gestação foi
dividido em duas fases distintas, a primeira até o 45° dia de gestação (Fase 1), na
qual foram observadas altas concentrações de progestinas fecais e a segunda do
46° dia até a data do parto (Fase 2), com baixas concentrações de progestinas
fecais. A partir da data do parto foi considerado como fase de lactação o período de
60 dias em que as três fêmeas permaneceram com seus filhotes.
53
Comparando-se as concentrações médias de progestinas fecais nas
diferentes fases de gestação (Fase 1 e 2) para os animais G2 e G5 observamos que
houve diferença significativa entre as fases estudadas (Tabela 5).
Tabela 5 - Concentrações médias (±EPM) de progestinas fecais dos animais G2 e G5 durante as fases 1 e 2 da gestação e G2, G5 e G6 durante os 60 dias de lactação - São Paulo – 2008
Progestinas (ng/g de fezes secas)
(x ±EPM)
Fase 1 Fase 2 Lactação (60 dias)
G2
1390 ±209 a
(n=22) 467 ±58 b
(n=15) 2729 ±263c
(n=46)
G5 818 ±123 a
(n=17) 333 ±39 b
(n=20)
967 ±130a
(n=40) G6 - - 16399 ±2463
(n=26) a,b,c Valores com diferentes sobrescritos na mesma linha diferem significativamente (p< 0,05)
Observou-se uma semelhança no perfil das progestinas fecais durante a
gestação dos dois animais estudados; G2 e G5 apresentaram uma acentuada queda
nas concentrações de progestinas fecais na segunda fase da gestação, em torno do
45º dia para a G2 e do 40º dia para G5. Esta queda também foi observada em
trabalhos que dosaram progesterona em soro de gato doméstico ao longo da
gestação, ocorrendo elevação até o trigésimo dia de gestação e a partir daí queda
até o parto (SCHMIDT et al., 1983; TSUITSUI; STABENFELDT, 1993).
Schmidt et al. (1983) estudando gestação em 12 gatos domésticos constatou
que houve grande variação individual no perfil de progesterona sérica destes
animais, cinco dos doze animais apresentaram queda da progesterona sérica após
54
os 26-40 dias da gestação e essas concentrações foram mantidas constantes e
baixas até o parto.
0
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10/10
/07
datas das coletas
prog
estin
as (n
g/g
de fe
zes
seca
s)
indica o dia do parto Figura 12 - Perfil das concentrações médias (±EPM) das progestinas fecais em
gato mourisco (Puma yagouaroundi) - animal G2, diferenciando-se as fases de gestação e lactação - São Paulo - 2008
Gestação
Lactação
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28/3/
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07
21/4/
07
25/4/
07
30/4/
07
datas das coletas
prog
estin
as (n
g/g
de fe
zes
seca
s)
indica o dia do parto Figura 13 – Perfil das concentrações médias (±EPM) das progestinas fecais em
gato mourisco (Puma yagouaroundi) - animal G5, diferenciando-se as fases de gestação e lactação - São Paulo - 2008
Em estudo realizado com gato doméstico observou-se que as concentrações
de progesterona sérica na fase final da gestação foram semelhantes às
concentrações obtidas durante a fase pré ovulatória (SCHMIDT et al., 1983). Nossos
dados sugerem o mesmo perfil para o gato mourisco nas dosagens de progestinas
fecais por enzimaimunoensaio. Não foi observada diferença significativa entre a fase
final da gestação e a fase de retorno da atividade ovariana, não sendo possível,
através da dosagem de progestinas fecais, a diferenciação destas fases para esta
espécie.
Berbare (2004) utilizando a técnica de radioimunoensaio para dosagem de
metabólitos de progesterona em fezes de gato mourisco detectou uma elevação
Gestação Lactação
56
sustentada de progestinas até o 40º dia de gestação com acentuada queda na fase
final até o parto. Durante o período de lactação as concentrações foram similares à
gestação, não sendo encontrada diferença significativa.
Os resultados obtidos neste trabalho utilizando a técnica de
enzimaimunoensaio demonstraram variações semelhantes no período de gestação e
lactação com o mesmo perfil hormonal (Figuras 12 e 13). Este mesmo perfil não foi
observado em outras espécies de pequenos felinos como gato-maracajá (Leopardus
wiedii) e gato-do-mato-pequeno (Leopardus tigrinus) (Moreira, 2001). Em estudo
realizado com estas espécies os níveis de progestinas fecais decresceram com a
proximidade do parto e permaneceram em níveis basais durante o período pós-
parto.
Acreditamos que este aumento das concentrações de progestinas fecais
detectado em nosso estudo durante a lactação possa estar relacionado a fatores
estressantes e que estes metabólitos detectados seriam de origem adrenal.
Para que se pudesse identificar a resposta da adrenal a um estímulo
estressor através do aumento da produção de progestinas foi realizado um desafio
de ACTH em uma fêmea de gato mourisco (Figura 11).
O resultado obtido com o desafio de ACTH demonstra que a adrenal
respondeu a um estímulo estressor através do aumento da produção de
corticosterona e progesterona e que o enzimaimunoensaio utilizado foi capaz de
detectar um aumento de progestinas.
As concentrações dos metabólitos de corticosterona obtidas em nosso
experimento apresentaram uma segunda elevação que não está relacionada ao
estímulo do ACTH, mas que pode ter sido causada por agentes estressores diversos
57
e que não puderam ser identificados. No entanto, é importante observarmos que as
concentrações de progestinas fecais acompanharam esta elevação.
Este resultado está de acordo com o que havia sido observado em estudo
realizado por Chatdarong et al. (2006) utilizando 5 fêmeas de gato doméstico como
modelo experimental para felinos selvagens e que foram submetidas a um estímulo
com ACTH apresentando um aumento concomitante nas concentrações séricas de
cortisol e de progesterona.
Em estudo realizado em fêmeas de jaguatirica (Leopardus pardalis) observou-
se que estes animais apresentaram uma tendência a apresentar picos de
progestinas após estimulação com ACTH (DIAS, 2006).
Dessa maneira acreditamos que a lactação e a convivência com os filhotes
possam ter representado um agente estressor para os animais durante o período
analisado, provocando um aumento na produção de progesterona pela adrenal.
Cada animal respondeu em graus diferentes a este possível estímulo, o animal G1
apresentou forte resposta, enquanto G2 não respondeu da mesma maneira. Para o
animal G6 observamos elevadas concentrações de progestinas fecais durante a
lactação, no entanto não temos o período de gestação para comparação.
Devido a estas possíveis interferências não conseguimos diferenciar através
da dosagem de progestinas fecais as fases de gestação e lactação.
5.5 Avaliação da estabilidade dos metabólitos de progesterona ao longo do
tempo em fezes de onça pintada (Panthera onca).
Foi realizado um piloto para se avaliar a estabilidade dos metabólitos de
progesterona em fezes de onça pintada (Panthera onca). As amostras foram
58
liofilizadas e mantidas congeladas no Laboratório de Dosagens Hormonais, FMVZ-
USP armazenadas sob refrigeração por 8 anos.
Foram selecionadas aleatoriamente 20 amostras que voltaram a ser
processadas seguindo-se os mesmos protocolos. Para a extração utilizou-se o
protocolo descrito por BROWN et al. (1994) e para a dosagem das progestinas a
técnica de radioimunoensaio (RIE) em fase sólida, utilizando-se conjuntos
diagnósticos comerciais (Siemens®, Los Angeles, CA, USA).
Os resultados obtidos em 2000 e em 2008 foram comparados e obteve-se
uma correlação significante positiva (r=0,98, p<0,001).
5.6 Perfis Hormonais - Onça Pintada
Os resultados obtidos (Figuras 14 e 15) nos permitem caracterizar o perfil das
progestinas fecais no início da atividade ovariana dos animais PP01 e PP02.
Observou-se que estes animais apresentaram um início na produção de
progesterona nos meses de novembro para PP01 e setembro para PP02. Estes
resultados estão de acordo com o descrito para estes mesmos animais em estudo
realizado por Viau, 2003, que identificou como período de início da atividade
ovariana o bimestre agosto-setembro através da dosagem de estrógenos fecais por
radioimunoensaio. O animal PP02 apresentou um início da produção de
progesterona que acompanhou o início da produção de estradiol enquanto que o
animal PP01 apresentou um início desta produção cerca de dois meses após.
59
0
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27/8/
99
datas das coletas
prog
estin
as (n
g/g
de fe
zes
seca
s)
Indica o início da atividade ovariana observado por Viau, 2003 utilizando RIE para a dosagem de metabólitos de estradiol.
Figura 14- Perfil das concentrações médias (±EPM) das progestinas fecais em fêmea pré-púbere de onça pintada (Panthera onca) animal PP 01 - São Paulo – 2008
0
500
1000
1500
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01
22/5/
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017/8
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01
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/01
4/11/0
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7/12/0
1
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027/2
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26/3/
02
15/4/
02
28/4/
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13/5/
02
29/5/
02
10/6/
02
24/6/
026/7
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20/7/
02
datas das coletas
prog
estin
as (n
g/g
de fe
zes
seca
s)
Indica o início da atividade ovariana observado por Viau, 2003 utilizando RIE para a dosagem de metabólitos de estradiol.
Figura 15 - Perfil das concentrações médias (±EPM) das progestinas fecais em fêmea pré-púbere de onça pintada (Panthera onca) animal PP 02 - São Paulo – 2008
60
Os resultados das concentrações de progestinas fecais do animal adulto AA
01 são apresentados na figura 14. Foi analisado o período em que este animal
apresentava atividade ovariana, com base no resultados das dosagens de
estrógenos fecais, de acordo com o descrito por Viau (2003).
0
2000
4000
6000
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12000
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21/7/
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8
8/12/9
8
15/1/
993/2
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18/2/
99
18/3/
995/4
/99
26/4/
99
27/5/
99
18/6/
99
20/7/
99
30/8/
99
25/9/
99
25/11
/99
datas das coletas
prog
estin
as (n
g/g
de fe
zes
seca
s)
Figura 16 - Perfil das concentrações médias (±EPM) das progestinas fecais em fêmea adulta de onça pintada (Panthera onca) animal AA 01 -São Paulo – 2008
Observamos elevações das progestinas fecais que não se sustentaram não
caracterizando ocorrência de ovulação. Este resultado confirma o que havia sido
observado por Viau (2003) em trabalho realizado com estas mesmas amostras, mas
com um anticorpo e metodologia diferente (RIE).
Ambos os resultados são compatíveis com o descrito para gatos domésticos,
que são considerados tradicionalmente como ovuladores induzidos (SHILLE;
LUNDSTROM; STABENFELDT, 1979), assim como outras espécies de felinos
selvagens: jaguatirica (Leopardus pardalis), gato-do-mato-pequeno (Leopardus
61
tigrinus) (SWANSON; BROWN, 2004), tigre (SEAL et al., 1985), onça parda
(BOONEY, 1981), leopardo das neves (SCHIMIDT et al., 1993) e guepardo (BROWN
et al., 1996).
Embora os resultados obtidos por enzimaimunoensaio estejam de acordo com
o que havia sido descrito através da técnica de radioimunoensaio (BERBARE, 2004;
VIAU, 2003), sugerimos que o EIE seja preferencialmente empregado na dosagem
de progestinas fecais por não envolver materiais radioativos, não necessitando de
licenças especiais podendo ser utilizado em instituições como zoológicos e em
trabalhos a campo. Além disso, por significar importante redução de custos e
principalmente por utilizar um anticorpo com boa reação cruzada com os esteróides
pesquisados e que vêm sendo amplamente utilizado nos principais estudos
endócrinos com felinos selvagens.
62
CONCLUSÕES
63
6 CONCLUSÕES
Nas condições em que o experimento foi conduzido, podemos inferir que:
Não houve interferência da matriz fecal na ligação do hormônio estudado com o
respectivo anticorpo, sendo validada esta metodologia para a dosagem de
progestinas na matriz fecal para ambas as espécies estudadas.
A metodologia empregada permitiu a identificação do início da produção de
progestinas nas fêmeas de onça pintada pré-púberes.
O perfil das progestinas fecais ao longo do ciclo estral na fêmea adulta de onça
pintada caracterizou-se por apresentar flutuações que não se sustentaram,
indicando que não ocorreu ovulação espontânea nesse animal.
As concentrações de progestinas fecais durante a gestação e lactação em gato
mourisco apresentaram oscilações que não permitiram a diferenciação destas fases.
A técnica de enzimaimunoensaio empregada demonstrou-se eficiente para a
quantificação de progestinas fecais em fezes de gato mourisco e onça pintada.
64
REFERÊNCIAS
65
REFERÊNCIAS
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