I

,Pflí- 0(

PC ~•",'

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E DO DESPORTOUNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO

DECANATO DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

ANAIS DA

XI JORNADA DE

INICIAÇÃO CIENTÍFICA

DA UFRRJ - 2001

27, 28 e 29 de novembro

TRABALHOS COMPLETOS

Editora da Universidade RuralSeropédica, RI

UFRR.I .. Dccunato de Pesquisa e Pós-Graduação

Rodovia BR 465. Krn 7

CEP: 2.'X()O-OOU - Seropédica/RJ

Tcl/F;lx: (OXX21 ) 26t;2-120 I

e-mail Jppg@ufrrj.br

PI~.

Pro] ft

co<l!Nh'!

IFrat.Man

Má,.,

NeidSara

FICHA CATALOGRÁFICA._----------------- ---------------

CO(

ComPro].

I'ro].

Pro].

l' rorPr(J(

l' r(l!"

Prof

PmfProlI'nl(

Pmf

"rorl'ro].

Pro].

Prof".

Pn!f".

Pn~f".

COIl1 i

!'ml"I)m/"

Prol"Pro], •

OOIA Jornada de Iniciação Cicnufica da UFRRJ (11 n. 2 : 200 I : Scropcdicu, R.lJ.

J82r

Anais da XI Jornada d\' lniciução Cicutíficu da UFRRJ - 2001. 27. 2X c 29

de novembro/ Univcrsidudc Federal Rural do Rio de Junciro. Dccanuto de Pesquisa

c PÚ,-Graduação. - Scropcdic.i, R.I ; Editora Universidade Rural. 2()() I.

x iv. :170 p.

Inclui índice.

I. Pesquisa cicnufic» -- Congressos. 2. Pesquisa cicntílira -.. Resumos.

I. Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Dccanuto de Pesquisa c Pós-

Graduação. 11. Título.

-------------------_._._--------_.

Participaram da elaboração desta publicação:

Organização: Neide FI",r!('/' de Carvalho Soares

Composiçâo: Múrci« da Si/n/ Ricardo de Agl/iar

Apoio Administrativo: /)c'!JOI'({ Cardoso Freirc GOIII({

Sarai Silva dos Scuitos

Anais da XI Jornada de Iniciação Cienlifica da UFRRJ

Estudo do comportamento de estirpes eficientes de rizóbio inoculado em caupifrente a população nativa de rizóbio da região semi-árida do nordeste do Brasil

Fernando Wagner Rangel', Lindete Míria V. Marfins", Gustavo R. Xavier", José Roberto A. Ribeiro",L. B. Morqado", Maria Cristina Prata Neves" & Norma Gouveia Rurnjanek?

1. Bolsisla PIBIC/Embrapa; 2. Embrapa Agrobiologia, BR 465. Km 7. Caixa Postal 74505. CEP 23890-000. Seropédica.RJ fwrangel@yahoo.com.br; 3. Embrapa Semi-Árido.

Palavras-chave: Caupi, ELlSA, Realividade Imunológica.

Abstract

Cowpea was cultivated during 2 following years in non-irrigated areas of the semi-arid region of Brazil. Duringthis period, inoculation was performed with previouslyselected strains for efficiently fixing nitrogen. At the endof the second cultivation year, soil samples were collectedfrom each parcel aiming the characterization of rhizobialpopulation. The results revealed that cowpea introductionin the area promoted àn increase in the sorogroupnumbers due to a stimulus on the growth of specificrhizobium populations. The inoculation during 2 followingyears were capable of increasing BR 3267 and BR 3269populations which has been used as inoculant indicatingthat this may represent a strategy to optimize theestablishment of efficient strains in soils of non-irrigatedareas.

Introdução

o feijão é uma das mais importantes fontes de proteínapara a população brasileira especialmente para a debaixa renda. O caupi (Vigna unguiculata (L) Walp.),também conhecido como feijão-de-corda, macassar efradinho, possui elevado valor nutritivo e adapta-se bemao clima da região semi-árida do pais, por ser umaespécie de reconhecida capacidade de se desenvolvere produzir satisfatoriamente em condições desfavoráveisde água e de solo, razão talvez, de sua ampla dispersãoem áreas consideradas agronomicamente marginais. Amaioria do cultivo é praticada em condições de sequeiro,e apesar dos baixos níveis de produtividade encontradosnestas regiões (500 a 700 kg.ha'), é uma cultura desubsistência importante para o sertanejo, garantindo umteor de proteína na dieta alimentar durante os mesesde seca, quando o clima carateriza-se por severosdéficits hidricos e temperaturas elevadas Apesar destaleguminosa ser capaz de fixar eficientemente onitrogênio quando associada ao rizóbio, estudos visandoa seleção e a identificação de associações caupi e

rizóbio com maior potencial de obtenção de N atravésda FBN têm sido negligenciados há muitos anos. Istose deve ao caráter pouco especifico do macrossimbionteem relação à bactéria, resultando numa baixa eficiênciada inoculação por estirpes selecionadas. Na maioria doscasos, os nódulos são formados por estirpes nativasnão raramente ineficientes, adaptadas a condiçõesedafoclimáticas ao longo de sua história evolutiva. Autilização de inoculantes visando a otimização da fixaçãobiológica de nitrogênio (FBN) em caupi é uma dastécnicas capazes de proporcionar maior produtividadeà cultura e melhoria nas condições do solo das áreassecas. MARTINS (1996) avaliando a diversidade derizóbio de solos utilizando caupi como planta-isca nasregiões do estado de Pernambuco e Sergipe, encontroucerca de 76 grupos de rizóbios capazes de nodular estaleguminosa, baseados em características morfológicasda colônia e fisiológicas da associação. Dentro destegrupo foram encontradas estirpes com diferentes níveisde eficiência em relação à FBN em caupi emexperimentos de casa de vegetação. Uma dasdificuldades em se estudar o estabelecimento deinoculantes rizobianos tem sido a identificação de ummétodo adequado, que apresente sensibilidade,especificidade e praticidade que permita acaracterização de um número grande de amostras. Autilização de ELlSA (Enzyme Linked Immuno SorbentAssay), uma técnica baseada na reação imunológica(EVANS et aI. 1996) viabiliza a identificação de estirpesde rizóbio formadoras de nódulos. Soros policlonais sãocapazes de reconhecer a superfície das célulasbacterianas contendo antigenos variados e, não raro seobserva reatividade cruzada entre diferentes estirpes(VINCENT, 1982). Esta caracteristica permiteestabelecer a distância filogenética entre diferentesestirpes e pode ser uma ferramenta capaz de auxiliarna compreensão de um germoplasma especifico. Esteestudo teve por objetivo avaliar por meio do ELlSA operfil antigênico de estirpes de rizóbio em solo de áreaexperimental cultivada durante 2 anos consecutivos.

.'.'

. \;,r\o. .>4 ••••

~l':-~.,::'1

1 })..}

, h\. '.I ;j::.t.;

,."~'"'lji~'

,','< :;~'::jJ:~.~

l. 1',

1~I~!~..:~~

" .~!t.",~~,/

25 " 1/,11. 2.1" 15-18, ]1111/

Anais da XI Jornada de Iniciação Científica da UFRRJ

Material e Métodos

As análises foram realizadas num experimento de plantiode caupi após dois anos de cultivo consecutivos em áreade plantio de sequeiro no campo experimental daEmbrapa Semi-Árido em Petrolina (PE). O desenhoexperimental foi em blocos ao acaso com três repetiçõese dois fatores: estirpes e esquemas de inoculação:esquema I, inoculação no cultivo 1. esquema IIinoculação no cultivo 2 'e esquema 111inoculação 110S

dois cultivos. Foram utilizados 10 isolados de nódulosde caupi caracterizados previamente como eficientes etratamentos controle sem inoculação e controle comadubação nitrqgenada. além de urna parcela onde nãohouve o cultivo de caupi durante os 2 anos deexperimento. Após as análises de ocupação nodularforam selecionadas para a caraterização do perfilantigênico da população de rizóbio do solo apenas ostratamentos inoculados com as estirpes BR 3267 e BR3269 que apresentaram uma boa nodulação eprodutividade. Além destes tratamentos foram incluídosos tratamentos controle descritos. Sementes de caupidesinfestadas foram cultivadas em amostras de solocoletadas nestas parcelas em casa-de-vegetação. Após35 dias de cultívo, os nódulos foram coletados eestocados em sílíca-gel. ·Posteríormente foramselecionados ao acaso 4 nódulos por parcela, que foramre-hidratados, macerados em 1,7 ml de água destiladaem microtubos e armazenados a -15°C. A reativídadeimunológica dos extratos foi determinada por meio datécnica ELlSA utilizando-se os anti-soros produzidos emcoelhos jovens da raça Nova Zelândia após a inoculaçãocom as estirpes BR 3267, BR 3268, BR 3269, BR 3270,BR 3271, BR 3272, BR 3273, BR 3274, BR 3275, BR3276, BR 96, BR 33, 7-18, 9-5 e BR 2001. Os anti-soros foram submetidos a purificação em colunapreenchida com proteína A de Slaphylococcus aureusvisando eliminar imunoglobulinas não-especificas, IgMs.O ensaio utilizou um anti-corpo secundário conjugado àfosfatase alcalina que reconhece o substrato p-nitrofenilfosfato formando uma cor amarela que podeser quantíficada a 405 nrn (RIBEIRO, 1999).

Resultados e Discussão

De um modo geral, foi observada a presença dossorogrupos BR 3268, BR 3269, BR 3276 e com menorintensidade o BR 3274, nos nódulos do tratamento ondea cultura do caupi não foi cultivada (Figura 1). O cultivode caupi resultou em aumento no número dossorogrupos observados, aparecendo respostas nãomuito intensas aos antisoros BR 3270, BR 3271, BR 96e 7-18. Os sorogrupos BR 3269 e BR 3276 mantiveram-

se num nível semelhante ao observado no tratamentosem plantio. enquanto houve uma resposta maior aosorogrupo BR 3274 e uma redução do sorogrupoBR3268. Estes dados indicam que a introdução daleguminosa na área foi capaz de promover aumento nonúmero de sorogrupos através do estímulo nocrescimento de populações rizobianas específicas(WOOMER et ai,. 1988; TURK et ai, 1993). Estesresultados também foram encontrados por THURMAN& BRONFIELD (1988) e SANGINGA et ai, (1994) queressaltaram o fato de que a presença do hospedeirocorno integrante da vegetação natural ou o cultivofrequente da leguminosa, seleciona e aumenta acomunidade do rizóbio a ela homóloga. A Figura 1mostra que os sorogrupos BR3269 e BR 3276dominaram, nos solos com e sem cultivo de caupi. Poroutro lado, o cultivo de caupi em presença de adubaçãonitrogenada, acarretou numa dimínuição destessorogrupos (BR3269 e BR 3276), enquanto foiobservada a presença de sorogrupos que nãoapareceram nos outros tratamentos: BR3267, BR 3272,BR3273, BR 3275 e BR2001, o que indica a presençade estirpes tolerantes ao nitrogênío no solo. Ossorogrupos BR 3271 e 7-18 apresentaram uma respostamais intensa em presença do adubo nitrogenado o queprovavelmente também é uma indicação de tolerância.Alguns sorogrupos (BR3270, BR 3274, BR 3276 eBR96) diminuíram de intensidade ou mesmodesapareceram completamente com o tratamentonitrogenado, sugerindo a presença de estirpes sensíveisao adubo nitrogenado. Neste tratamento pode serobservado também que apesar de qrn número maiorde anti-soros ter respondido positivamente, não seobserva predominância de alguns grupos como foiobservado nos tratamentos anteriores. Solos'provenientes de áreas que foram inoculadas somenteno plantio 1 (Esquema I da Figura 2), revelaram que aintrodução do inoculante BR 3267 promoveu umdeslocamento dos sorogrupos BR 3269 e BR 3276 quesão dominantes nas áreas sem caupi e com caupi nãoinoculado. Não houve repetição destes resultados noesquema 11, onde estes sorogrupos ocuparam cerca de50% dos nódulos, sugerindo baixa competitividade doinoculante. O sorogrupo BR 3267 mostrou ocupaçãode 100% no esquema 111 da Figura 2, inoculado nos doisanos de cultivo e, 60% no tratamento inoculado noprimeiro cultivo somente, mostrando caracteristicas desobrevivência e estabelecimento, importantes para oestudo de ecologia microbiana. O aumento observadonos sorogrupos BR 3271, BR 3272 e BR 3274 podetambém estar relacionado ao estabelecimento doinoculante (BR 3267). RIBEIRO (1999) mostrou que estaestirpe é identificada por anti-soros produzidos contra

26

.:

--------_ .._." ~~~_~m .EQ-

Anais da XI Jomada de Iniciação Cientifica da UFRRJ

as estirpes BR 3271, BR 3272 e BR 3274, o quecaracteriza uma resposta cruzada. Em relação àintrodução do inoculante BR 3275 (Figura 3), observa-se um aumento da presença do sorogrupo respectivono solo. Aumento considerável foi observado após ainoculação durante 2 anos consecutivos. Foi identificadatambém a predominância dos sorogrupos dominantesnos solos estudados para os 3 esquemas de inoculação,com exceção da BR 3276, que no esquema deinoculação durante 2 anos consecutivos, foi observada

Solo s.m cultlyo d. Clupl

.\.111""'"

Solo com eumve d, c'upl

1 O O I'-. .. - - - -. -.- -..- -- ..- -- ;

I:~j~-~ti-=-a~~==1~ ~ ~ ~ ~ ã ~ ~ ~ ~ i i ~~~i~~~~~~~~~ ~

Solo com culll\lo d, c.upl m .1. NiI,oo'n/o

Ionh-50105

Figura 1. Ocupação nodular de 15 sorogruposrelacionados com tratamentos com e sem o cultivo decaupie com o cultivo de caupi adubado com nitrogênio.

uma redução na resposta a este sorogrupo. É possívelque neste esquema de inoculação, o aumento dapopulação da estirpe inoculante tenha deslocadoestirpes que respondem ao sorogrupo BR 3276.Observa-se também um aumento da resposta aosorogrupo BR3268 que de acordo com RIBEIRO (1999)não apresenta reação cruzada significativa com a estirpeBR 3275, sugerindo que a presença desta estirpe,estimulou a multiplicação de outras estirpes nativas.

Inocula "te BR 3261Esquema de Inoculaçio I

I; II II U •• Ii Ii II •• li •• " 1-11,.4 ti

!lll IIU nu :;'0 111.H17 lUl 1111 1I1! IIU IJ U 100.

Auti-scrus

Esquema de tn o e uta çã e 11

" I' .; .~ .•~ •• 'I (1 •I •• l' ••

';P IIU Ia, ,.,~ ,;. JlI' J:II 111' 111' 1111 11 fi

Esquema de Inoculaçlo 111

.\1111-"\.1'11:'

Figura 2. Ocupação nodular de 15 sorogrupos relacionadocom o tratamento inoculado com a BR 3267.

" /I, li. 1,1'. ]5-2S, ]IJ(I/

- ....------------_._-------- ._-------,.

ooeooiso

JE:o

dodedostatra

/.. Anais da XI Jornada de íniciaçào Cientlfica da UFRRJ

tn c c uta n te BR 3275

ê s e u e m a de +n c e ula ç à c I

lU0

.11I ._ ....

Esquema de tn o c u tn c ê o 11

100 ,

Anll-MI'"''

Esquema de ln c c uta ç ã c 111

l'~~rIi=~'~~_'-I·~I~~I~·.~·-Jjlw_...._'-"'_-,.... _~ll'~_II'!' II!~~~"

!1I1 111' I7H ~,,~ 111 IUJ H'J :11' 11I~ '111

Figura 3. Ocupação nodular de 15 sorogrupos

Conclusões

Os resultados mostram que as estirpes BR 3267 e BR3275 quando utilizadas como inoculante foram capazesde se eslabelecer no solo, sobrevivendo durante operíodo do experimento. Além disso, o estabelecimentodo inoculante é mais expressivo quando as plantas sãoinoculadas durante 2 anos consecutivos. Estesresultados apontam para que estudos visando a seleçãoe determinação de inoculantes devem ser realizadospor mais de um período de cultivo da leguminosa.

Agradecimentos e Auxílio Financeiro

A Embrapa Agrobiologia e ao CNPq pelo auxíliofinanceiro.

Referências Bibliográficas

EVANS, .J., GREGORY. A .. DOBROWOLKI, N,MORRIS. SG. O'CONNOR, GE, WALLACE,Nodulation of field-grown Pisum sativum and Vicia faba:competitivenes of inoculant strains of Rhizobium/eguminosarum bv. Viceae determined by na indirect,competitive ELlSA method. Soil Biology andBiochemistry v. 28. n. 2.1996. p.247-255.

MARTINS, L.M.V. Características ecológicas efisiológicas de caupi (Vigna unguicu/ata (L) Walp)isolados a partir de solos da região Nordeste do Brasil.1996.214 p. tese de mestrado.

RIBEIRO, J.R.A. Aplicação da técnica de ELlSA noestudo ecológico de Rhizobium sp. isolados de nódulosde caupi (Vigna unguicu/ata) originárias da regiãoNordeste brasileira. Rio de Janeiro: UFRJ. 1999. 121 p.Tese de Mestrado.

SANGINGA, N., DANSO, S.K.A, MULONGOY, K.,OJEIFO, A.A. Persistence and recovery of íntroducedRhizobium ten years after inoculation on Leucaena/eucocepha/a grown on na Alfisol ín SouthwesernNigéria. Plant and Soil. Dordrechl. v. 159. 1994. p. 199-204.

THURMAN, N.P., BRONFIELD, E.S.P. Effectofvariationwithin and between Medicarpo e Melilotus species onthe composition and dvnarnics of indiQenous ooou'atíonsof R. me/lia li. Sai I Biology and Bioc.hemistry. Oxford. v.20. 1988. p. 31·38.

TURK, D., KEYSER. H.H .. SINGLETON, P.W.Responce of tree legumes to rhizobial inoculation inrelation to the population density of indigenous rhizobía.Soil Biology end Bíochemistry. Oxford. v. 25. 1993. p.75-81.

VINCENT, J. M. The basic sorology of rhizobia. NitrogenFixation in Legumes, VINCENT, J.M. Academic PressAustralia. 1982. 188 p.

WOOMER, P.; SINGLETON, vv«, BOHLOOL, B.B.Ecological Indicators of Native Rhizobia in Tropical Soils.Applied and Environmental Microbiology. Washington,v. 54.1988. p. 1112-1116.

)

rrvc~c~C

il

.{ '. ·PiI""i.f"'·OO.6FM·WlA.ew. •••• iia.c -v . ,