Agentes infecciosos e as respectivas técnicas de análise molecular qualitativa e quantitativa

A aplicação dos métodos de biologia molecular p/ a identificação e caracterização de agentes infecciosos tem apresentado rápida evolução nos últimos anos ,devido, em grande parte, ao desenvolvimento de novas

tecnologias de análise do DNA e do RNA e à maior disponibilidade do testes diagnósticos em laboratórios clínicos e epidemiológicos

Com os métodos atualmente em uso, é possível identificar e quantificar bactérias,vírus, fungos,protozoários em um prazo de poucas horasgarantindo sensibilidade e especificidade elevada.

maranhao@ensp.fiocruz.br emaranhao@hotmail.com E. Maranhão

Grupo do PAI/PNI na Ensp/FiocruzMaterial elaborado p/ o curso de especialização em investigação epidemiológica de campo- Dpto de

epidemiologia e métodos quantitativos em saúde- Ensp/Fiocruz-2009Fundação JPM

Técnicas de análise molecular qualitativa[1]e

agentes infecciosos

• Microorganismos métodos* materiais biológicos

• Papilomavírus humano Captura híbrida Raspado da lesão suspeita,• hibridização em situ raspado de colo de útero,• biópsia

• HIV-1 PCR,NASBA,TMA sangue

• Vírus da hepatite B(HBV) PCR,PCR em tempo real sangue

• Vírus da hepatite C(HCV) RT-PCR,TMA,PCR em tempo real sangue

• Chlamydia trachomatis PCR,LCR,captura híbrida,TMA Raspado de colo de útero,• urina, raspado ureteral

• Neisseria gonorrhoeae PCR,LCR,captura híbrida Raspado de colo de útero,• urina,raspado ureteral

• ESPM

Técnicas de análise molecular qualitativa[2]

• Microorganismos métodos* materiais biológicos

• Toxoplasma gondii PCR, PCR em tempo real sangue,liquido amniótico

• Micobactérias PCR, PCR em tempo real escarro, lavados, urina• TMA biópsia

• Citomegalovírus PCR,NASBA,PCR em tempo real sangue,urina,liquor

• Herpes simples tipos 1 e 2 PCR,PCR em tempo real sangue , liquor

• Vírus Epstein –Barr PCR,PCR em tempo real sangue

• Parvovírus B 19 PCR,hibridização sangue

• Eritrovírus B 19 PCR sangue, liquido • amniótico

• ESPM

Técnicas de análise molecular qualitativa[3]

• Microrganismo métodos* materiais biológicos

• HTLV-1 e HTLV-2 RT-PCR sangue,liquor, biópsia

• Vírus da dengue PCR,PCR em tempo real sangue

• Vírus da rubéola RT-PCR sangue

• Herpesvírus-8 PCR sangue

• Herpes vírus-6 PCR sangue, liquor

• Vírus JC PCR liquor

• Enterovírus PCR liquor,sangue

• Vírus da caxumba RT-PCR liquor

ESPM

Métodos *

Obs::Estas não são as única técnicas disponíveis, mas as + comumente empregadas p/ investigação de cada um dos microorganismos ::

PCR [polymerase chain reaction] ;

RT-PCR [reverse-transcribed polymerase chain reaction] ;

NASBA [nucleic acid sequence-based amplification] ;

LCR [ligase chain reaction] ;

TMA [transcription mediated amplificacion] .

• OBS:A metodologia do PCR e suas variantes(RT-PCR,PCR em tempo real) são as + amplamente utilizadas como método de detecção qualitativa

• ESPM

Técnicas de análise molecular quantitativa[1]

Agentes infecciosos

• Vírus métodos* materiais biológicos

• HIV-1 RT-PCR,b-DNA,NASBA sangue

• Vírus da hepatite B (HBV) PCR,b-DNA,PCR em tempo real sangue

• Vírus da hepatite C (HCV) RT-PCR,b-DNA,PCR em tempo real sangue

• Citomegalovírus PCR,NASBA,PCR em tempo real sangue, urina, liquor

• Vírus Epstein-Barr PCR,PCR em tempo real sangue,liquor

• Obs::• PCR [polymerase chain reaction] ;• RT-PCR [reverse-trancribed polylerase chain reaction] ;• B-DNA [branched-DNA]• NASBA [nucleic acid sequence-based amplification] . • ESPM

Glossário[1]

Polymerase Chain Reaction O método PCR consiste na amplificação de um segmento específico do DNA com a utilização de 2 oligonicleotídeos ( iniciadores ou primers) e da enzima DNA polimerase.

RT-PCRé um método de amplificação realizado a partir de moléculas de RNA.Após a extração do RNA,sintetiza-se cDNA (DNA complementar) empregando-se a enzima transcriptase reversa de origem viral. A partir do cDNA, emprega-se o método de PCR para amplificação.

PCR em Tempo RealO método do PCR em tempo real emprega os mesmos princípios do PCR convencional, mas com acompanhamento contínuo da reação, permitindo a quantificação precisa do material amplificado a cada ciclo de amplificação por meio da detecção de luz emitida por corantes fluorescentes. ** Obs:Atualmente o método do PCR em tempo real é considerado um dos métodos de escolha p/ testes moleculares quantitativos e qualitativos em decorrência de suas vantagens sobre o PCR convencional::

• + or rapidez de execução;

• +ores sensibilidade e reprodutibilidade;

• - or risco de contaminação de amostras no ambiente laboratorial,devido a ausência de manipulação das amostras após o processo de amplificação.

Glossário[2]

TMA e NASBAsão métodos de amplificação isotérmica.

Branched-DNAApós a extração do RNA, um conjunto de sondas é empregado p/ captura das moléculas de RNA em uma microplaca. Outros 2 conjuntos de sondas ligam-se então ao RNA capturado , e um substrato é adicionado p/ o complexo enzimático associado à sonda. A leitura dos resultados é feita por quimioluminescencia.

Captura hibrida é um método que tem sido utilizado largamente na detecção e subtipagem do papilomavírus humano.É um método de identificação direta do DNA.Como inúmeras moléculas do anticorpo conjugado se ligam a cada híbrido capturado, ocorre um “amplificação” do sinal, o que determina boa sensibilidade do método.

Sequenciamento do DNA é um método que permite definir a seqüência de bases de um segmento específico do DNA.Atualmente, é realizado por meio de equipamentos -sequenciadores de DNA-, que permitem a análise automatizada de grande número de segmentos em poucas horas. ESPM

Referência

• Burke W. Genetic Testing.New England Journal of Medicine 2002;347:1867-1875.

• Mauro S. Figueiredo.Fundamentos de Biologia Molecular e sua importância clínica.

• Connor J M, Fergunson-Smith M A . Essential Medical Genetics,#rd edition.Blackwell Scientific Publicatios,1991.