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AUTARQUIA ASSOCIADA UNIVERSIDADE DE SO PAULO
AO DA RADIAO IONIZANTE SOBRE HEMCIAS
HUMANAS E SUAS PROTENAS DE MEMBRANA
FRANCISCO FERNANDES AMNCIO
Tese apresentada como parte dos requisitos para obteno do Grau de Doutor em Cincias na rea de Tecnologia Nuclear - Aplicaes
Orientador: Prof. Dr. Heitor Franco de Andrade Jnior
5 :
So Paulo
1998
INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES
AUTARQUIA ASSOCIADA UNIVERSIDADE DE SO PAULO
AO DA RADIAO IONIZANTE SOBRE HEMCIAS
HUMANAS E SUAS PROTENAS DE MEMBRANA
FRANCISCO FERNANDES AMNCIO I ^\ mdl^S
Tese apresentada como parte dos requisitos
para obteno do grau de Doutor em Cincias
na rea de Tecnologia Nuclear - Aplicaes.
Orientador:
Prof. Dr.Heitor Franco de Andrade Jnior
SAO PAULO
1998
DEDICATORIA
Dedicado
IVIaria,
Rafael
Paula e
Felipe.
( F A P / S P
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Aos meus pais, Jos Amncio Carlos (in memoriam) e
Maria Fernandes Amncio, mentores do nosso crescimento.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos a todos que direta ou indiretamente contriburam para o
desenvolvimento deste trabalho e, especialmente:
Ao Prof. Dr. Heitor Franco de Andrade Jnior, o Orientador, Conselheiro e
amigo de todas as horas.
Dra. Ana Maria Mendona de A. Melo, pela participao e incentivo.
Ao Prof. Dr. Paulo A. Silveira, pelas importantes sugestes durante os
exames de qualificao e seminrio de rea e pela franquia do seu laboratrio no
Hemocentro-do HC-FMUSP.
Ao Prof. Dr. Jos Roberto Rogero, pelas contribuies durante os exames
de qualificao e seminrio de rea e por haver me apresentado ao Prof. Heitor.
Ao pessoal do corpo tcnico, administrativo e auxiliares do IPEN-TBR-
TBM, pela substancial ajuda durante os primeiros passos.
s bibliotecrias da biblioteca Terezine A. Ferraz - Maria Tereza Zavitoski e
Doralice Lima Xavier, que foram nosso elo de ligao com o acervo.
Profa. Dra. Barbara Maria Rzyski,pela importante ajuda, quando foi
necessria a troca de irradiador, nos nossos experimentos.
Ao Eng Carios Gaia da Silveira pelo aporte tcnico especializado durante
as irradiaes.
Eng^ Elizabethe Sebastiana Ribeiro Somessari, pelo mesmo motivo.
Dra. Luiza Guglieimi, que gentilmente nos cedeu a cepa de mieloma
utilizada ma busca da produo de anticorpos monoclonais.
Ao Dr. Carlos Alberto Mayora Alta, pelo valioso assessoramento durante as
avaliaes de resposta imune, feitas por citometria de fluxo.
Sra.Katsue Yasumura, pelo apoio tcnico durante as avaliaes
citomtricas das hemcias irradiadas.
Srta.lara Keiko Yokomizo, pelo apoio tcnico recebido durante as
avaliaes de hemcias irradiadas por ectacitometria laser assistida.
Ao bilogo Luiz Roberto M. Mundel, pela valiosa ajuda durante a inoculao
de clulas em camundongos, bem como, durante a retirada de mielomas e
recuperao de lquido asctico
tcnica Roselaine P. A. Cardoso, pela dedicao e auxlio tcnico em
diferentes etapas do nosso trabalho.
biloga Isabel Cristina Alves, pelo suporte tcnico e dedicao no manejo
e manuteno dos animais experimentais.
Ao tcnico Almir Robson Ferreira, pelo suporte tcnico fotogrfico.
Ao doutorando Bruno A. Cardi, pelas discusses sugestes e ajuda em
diferentes etapas de nosso trabalho.
Ao doutorando Roberto Hiramoto, pelo mesmo motivo.
Ao bilogo Andrs Jimnez Galisteo Jr., pelo desvendar dos mistrios da
computao.
prof: Dra. Kaio OI
ABSTRACT
EFFECTS OF COBALT-60 IONIZING RADIATION ON HUMAN ERYTHROCYTE AND ITS MEMBRANE PROTEINS
Francisco Fernandes Amncio
Ionizing radiation has several uses, as sterilization and radiotherapy, by its
effects on living beings. Recently, it has been used, at relatively lower doses(25 Gy),
on blood for transfusions, mainly to eliminate undesirable graft vs host reactions, for
use in multi transfused or immunocompromized patients. Here, we study the effect of
larger doses of cobalt-60 ionizing radiation(25-1600 Gy) on human erythrocytes, by
citometric, physiologic, biochemical and immunological methods, looking for its effects
and its detection. The red cells presented a clear dose-dependent increase in its
volume, when irradiated in doses higher than 200 Gy, more significant in stored blood,
but without hemolysis. Osmotic fragility was increased only after irradiation of more
than 400 Gy. By ektacytometry, there was a lower deformability of irradiated red cells,
at low stress(0.3 Pa), similar to capillary flow, but without alteration in higher stress(3
Pa), found in cardiac chambers. By SDS-PAGE, it was demonstrated that irradiated
isolated erythrocyte membranes had aggregation of spectrin molecules, and decay of
bands with lower molecular mass. This effect could be attributed to the radiation-
induced hydroxyl radical, by specific scavenger studies. Those modifications were both
antigenic and immunogenic in experimental animals, and the induced antibodies
recognizes, by ELISA and immunoblot, both native or irradiated membrane proteins.
They recognize rather in-adiated whole erythrocyte than native ones, by
hemagglutination, indirect immunofluorescence or flow citometry assays. Our data
suggests that human red cells could be irradiated at higher doses than those usually
employed, with possible effect on other contaminant pathogens, without loss of viability
of its use in transfusions. After improvements, irradiation induced epitopes detection
could be a new tool in biological dosimetry.
RESUMO
AO DA RADIAO IONIZANTE DO COBALTO-60 SOBRE
HEMCIAS HUMANAS E SUAS PROTENAS DE SUPERFCIE
Francisco Fernandes Amncio
A radiao ionizante tem mltiplos usos, por seus efeitos sobre seres vivos,
como a esterilizao de materiais e radioterapia. Recentemente e em doses
relativamente baixas(25Gy), tem sido usada em sangue para transfuses, visando a
eliminao de reaes enxerto vs hospedeiro, em pacientes politransfundidos ou
imunosuprimidos. Aqui, estudamos os efeitos de doses maiores de radiao ionizante
do cobalto-60(25-1600Gy) sobre hemcias humanas, por mtodos citomtricos,
fisiolgicos, bioqumicos e imunolgicos, para determinao dos efeitos deste
processo e deteco de modificaes. Hemcias humanas A+ apresentaram um
aumento de volume dose-dependente, quando irradiadas acima de 200 Gy, mais
evidente nas obtidas de sangue estocado, sem hemlise significativa. Havia uma
maior fragilidade osmtica apenas em doses superiores a 400Gy. Por ectacitometria,
as hemcias irradiadas apresentavam uma menor deformabilidade em estresses (0,3
Pa) semelhantes ao fluxo capilar, embora inalterada em estresses maiores(3 Pa)
compatveis s cmaras cardacas. Por estudos de SDS-PAGE, foi possvel
demonstrar que haviam alteraes como agregaes de espectrina e
desaparecimento de bandas de massa molecular menor, em membranas purificadas
irradiadas. Estes efeitos estavam relacionados ao radical hidroxil, formado pela
radiao, demonstrado por captores especficos. Estas modificaes foram
antignicas e imunognicas em modelos de imunizaes em animais, tanto por ELISA
como por imunomarcao de protenas isoladas. Os anticorpos produzidos
reconheciam preferentemente hemcias integras irradiadas, por tcnicas de
hemaglutinao, imunofiuorescncia indireta e citometria de fluxo. Nossos dados
comprovam que as hemcias humanas podem ser irradiadas com doses superiores
aquelas usualmente utilizadas, com possvel efeito sobre patgenos contaminantes,
sem perda da viabilidade do material para uso em transfuses. Desde que aprimorada,
a deteco de eptopos modificados pela radiao pode oferecer uma nova ferramenta
dosimtrica.
SUMRIO
1 - INTRODUO
2-OBJETIVOS
3 - MATERIAIS E MTODOS
3.1 MATERIAIS
3.1.1 Fontes de irradiao
3.1.2 Sangue
3.1.3 Animais
3.1.4 Reagentes
3.1.5 Meios de cultura de clula
3.2 MTODO
3.2.1 Purificao e in-adiao de hemcias humanas
3.2.2 Estudos citomtricos
3.2.3 Estudos de hemlise isosmtica e de resistncia globular
ao choque osmtico
3.2.4 Estudos da deformidade celular ao "stress" rotacional
3.2.5 Purificao de "ghosts"
3.2.6 In-adiao de "ghosts"
3.2.7 Irradiao na presena de captores especficos
(scavengers) para classe de radicais livres induzidos pela
radiao
3.2.8 Anlise de protenas (SDS-PAGE)
3.2.9 Produo de anticorpos
3.2.9.1 Policlonais
3.2.9.2 Monoclonais
3.2.10 Deteco de especificidade de anticorpos policlonais
produzidos contra "ghost" de hemcias irradiadas
3.2.10.1 Elisa
3.2.10.2 Western blot
3.2.10.3 Hemaglutinao
3.2.10.4 Reao de imunofluorescncia indireta (IFI)
Pgina
1
12
13
13
13
13
13
13
14
14
14
15
15
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16
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17
17
18
18
19
20
20
21
21
22
3.2.10.5 Citometria de fluxo 22
4 - RESULTADOS 24
4.1 Radiao de hemcias 24
4.2 Estudos citomtricos 24
4.3 Fragilidade osmtica 26
4.4 Purificao e irradiao de "ghosts" 28
4.5 Produo de anticorpos anti-"ghosts" de hemcias irradiadas 30
4.5.1 Imunizao de coelhos e camundongos 30
4.5.2 Deteco de anticorpos por hemaglutinao de hemcias
irradiadas 30
4.5.3 Deteco de anticorpos anti-ghosts de hemcias irradiadas
por ensaio imunoenzimtico(ELISA) 31
4.5.4 Deteco de anticorpos em hemcias integras por
imunofluorescncia indireta 32
4.5.5 Identificao de anticorpos em protenas separadas em
SDS-PAGE(Western-Blot) 34
4.6 Citometria de fluxo 35
4.6.1 Ensaio de citometria de fluxo com absoro prvia de
anticorpos. 37
5- DISCUSSO 39
6 - CONCLUSES 48
7 - BIBLIOGRAFIA 50
1 - INTRODUO
As radiaes e seus usos
A relao entre radiao e seres vivos sugere um pacto bem estabelecido
e antigo que foi se consolidando ao longo do tempo pelos diferentes mecanismos
da evoluo. Por este caminho podemos tentar compreender a estreita relao
existente entre radiao da luz visvel e fotossntese, Ultra Violeta e sntese de
vitaminas na pele dos mamferos(Kagan, et.al.1992) e at a bioluminescncia dos
microorganismos. Essa relao, no entanto, no sempre harmnica, pois a luz
visvel pode causar danos em maior ou menor grau quando associada a
substncias que potenciam os efeitos da luz como as furocumarinas e psoralen
(Kayagova, et. al.1997) por outro lado o homem por diferentes caminhos vem
quebrando o pacto inicial e favorecendo uma ao mais intensa dos componentes
do Ultra Violeta, reconhecidamente mutagnicos.
Do ponto de vista das radiaes ionizantes, o grau de disperso com que
ocorrem os materiais radioativos na natureza, impe uma radiao de fundo,
cujas energias so perfeitamente compatveis com o desenvolvimento dos
sistemas biolgicos. O conhecimento da tecnologia das radiaes permitiu
concentrar essa radiao primitivamente dispersa, tornando disponvel uma
modalidade desta energia, cuja aplicabilidade, para fins pacficos se estende aos
mais diversificados ramos de atividade humana. Em face das suas caractersticas,
tais como poder de penetrao e capacidade de modificao da matria, as
radiaes ionizantes, do tipo gama, encontram aplicabilidade na agricultura,
indstria de laminados, conservao de alimentos(Osterholm & Potter,1997).
Alm disso, tambm auxiliam na produo de equipamentos de preciso, aferio
de soldas em poos de petrleo submarinos, dentre outros usos.
Os efeitos das radiaes sobre a matria dependem primordialmente da
absoro de energia. Essa interao pode ocon-er de forma direta, quando o fton
incidente absorvido pela matria, diretamente gerando a ionizao ou
energizao da molcula; ou de forma indireta, quando molculas do meio
absorvem a energia e sofrem modificaes fsicas que propiciam a gnese de
novas entidades qumicas reativas, de vida mdia mais longa, por vezes
biolgicamente nocivas(Riley, 1994). Da mesma forma, as radiaes ionizantes.
ao promoverem excitaes e ou ionizaes de molculas, direta ou indiretamente,
exercem um grande poder modificador sobre os seres vivos, podendo inclusive ter
auxiliado na gerao da vida(Draganic etal, 1985). As ionizaes promovidas, via
radiao gama ao serem absorvidas pela matria, so basicamente feitas
mediante interao com eltrons orbitais por um efeito fotoeltrico ou efeito
Compton. Para energias superiores a 1,02 MeV, podem ocorrer interaes com o
ncleo atmico, determinando a formao de pares(Seltzer, 1993).
Nos sistemas biolgicos, onde a gua um elemento preponderante, os
+efeitos da radiao so na sua maioria indiretos e devidos radilise da
gua(Schuessler & Shilling 1984) que forma radicais fortemente reativos capazes
de transferir a energia adquirida para molculas orgnicas(Hagen, 1989). A
espectrometria de massa da gua revela a presena das espcies qumicas HO^
HO , H2O e pequenas quantidades de H2 e O (Butler, Land & swailow. 1984). A
absoro da radiao ionizante por essas espcies qumicas pode promover
ionizaes, conduzindo a novos arranjos estruturais e originando espcies
primria em soluo, do tipo:
OH, e-aq,H , H202.H2,HO
Na interao desses radicais com as molculas orgnicas, os radicais
hidroxilas atuam como poderosos oxidantes, enquanto o eltron aquoso, funciona
como um poderoso agente redutor (Feldberg & Carew, J.A. 1981). Pela sua
prevalncia e reatividade a maioria dos efeitos biolgicos da radiao,
relacionados ao dano de protenas ou cidos nucleicos tem sido relacionada
ao deste radical livre( Butler et .al, 1984, Davies etal, 1987).
Na Biologia e na Medicina, as radiaes ionizantes encontram as mais
diversificadas aplicaes, pelos seus vrios efeitos. Materiais descartveis de uso
mdico, materiais cirrgicos(Grecz et al, 1987) e biolgico(Mair, 1988) so
mantidos em condies estreis pela irradiao com doses timas de radiao
ionizante, geralmente acima de 20kGy. A radiao X continua sendo um
excelente auxiliar em procedimentos diagnsticos, enquanto a radiao gama
encontra aplicabilidade no tratamento de carcinomas(cobaltoterapia). A
capacidade de induzir modificaes estruturais em protenas (Schuessier &
Shilling, 1984), lipdios (Bonnefont-Rousselot et al, 1993) e cidos
nucleicos(Seach et al, 1996), tem recomendado seu uso na inativao de
venenos para uso em imungenos(Nascimento et al 1996) ou no processamento
de antgenos (Edelman et al, 1993) ou inativao de microorganismos
patognicos(Kim Thayer, 1995).
O sangue humano.
O sangue Inumano tem inmeras aplicaes em Medicina, servindo para
repor as perdas de seus vrios constituintes em pacientes com choque
hemorrgico ou insuficiente produo de alguns de seus elementos. Em sua
composio encontramos duas fraes principais, um meio liquido, plasma,
constitudo de protenas e sais, e uma parte celular, composta de hemcias,
leuccitos e plaquetas. Todas as clulas do sangue possuem um ancestral
comum, clulas pluripotentes, das quais se originam por diferenciao celular,
sendo que cada um apresenta funes especficas. Assim, os leuccitos, clulas
nucleadas do sangue, tambm so divididos em vrios grupos celulares, sendo
principais os neutrfilos, clulas de defesa inespecficas, e os linfcitos
responsveis pela resposta imune especfica. As plaquetas, fragmentos celulares
dos megacaricitos, so responsveis pela manuteno da integridade vascular,
atuando tanto mecanicamente como no sistema de coagulao(Nakauchi &
Gachelin, 1993)
O maior contingente celular do sangue composto de hemcias. Estas
clulas anucleadas so repletas de hemoglobina, protena responsvel pelo
transporte de oxignio, circulando por todo o organismo. Estas clulas so
formadas na medula ssea, apresentando uma maturao bem conhecida que
termina na produo macia de hemoglobina. Durante a sua maturao, ocorre a
perda do ncleo e a aquisio de uma forma bicncava caracterstica, mantida
por um interessante citoesqueleto. Esta arquitetura celular, forma um conjunto
bastante flexvel permitindo que uma clula de 8|i atravesse repetidas vezes por
capilares de 3,5|im, perfazendo um percurso de quase 500 Km durante sua vida
til de aproximadamente 100 dias(Hoffbrand & Petit, 1993).
O sangue como um rgo transplantado
Quase sempre associada a atos religiosos, rejuvenescimento ou
prolongamento da vida a idia e a prtica das transfuses de sangue tem um
passado emprico e folclrico, repleto de insucessos, at os primrdios do sculo
XX, quando os grupos sanguneos e uma soluo anti-coagulante adequada
foram descobertos(Greenwalt, 1997)
Em doentes agudos ou com choque hemorrgico, estas preparaes
mostraram-se salvadoras, permitindo a recuperao de inmeras vidas. Com o
aprimoramento da armazenagem, solues e materiais para uso em transfuses,
hoje possvel usar sangue ou seus subprodutos at quarenta e dois dias aps a
coleta, na maior parte dos centros hospitalares. Em pacientes crnicos, com
doenas hematolgicas ou em grupos especiais de pacientes com altos volumes
de sangue transfundido, leuccitos contaminantes e grupos sanguneos de menor
importncia passaram a ser um novo problema. Antes de Landstainer, as
transfuses davam sucesso aleatrio, pois a incompatibilidade para os grupos
sanguneos de maior prevalncia levava a hemlise rpida das hemcias
transfundidas, com suas conseqncias(Greenwalth, 1997). A descoberta de
outros fatores presentes na superfcie de hemcias levou a deteco de novas
sndromes relacionadas a incompatiblidade sangunea, com doena hemoltica,
em fetos e neonato, relacionadas ao antgeno Rh da superfcie de
hemcias(Bowman, 1997). Embora cercada de medidas profilticas corretas, este
tipo de terapia est sujeita a vrios problemas como os decorrentes de reaes
entre o hospedeiro e o sangue transplantado, com poucos estudos sobre a
resposta dos leuccitos transplantados contra o hospedeiro at 1960. Os
mecanismo envolvidos nessa forma de resposta imune, so hoje estudados como
doena do enxerto versus hospedeiro(Leitman & Holland, 1985). Os primeiros
estudos sobre a doena relatam a ocorrncia de uma sndrome, descrita em
animais experimentais irradiados e que ocorria seis semanas aps receberem
infuso de macerados celulares homlogos de bao, linfonodos ou timo, ou
clulas da medula ssea, para regenerao dos efeitos da radiao. Os animais
apresentavam perda de peso, aumento do bao, diarria, anemia e diminuio
dos leuccitos circulantes(Bekkum, 1965). Aps esse perodo, foram descobertos
os antgenos de histocompatibilidade, responsveis pela cooperao entre clulas
da resposta imune(Bodmer e al, 1966). Hoje, sabemos que esta forma de
resposta em geral causada pela maior ou menor histocompatibilidade do
hospedeiro em resposta a proliferao celular de linfcitos T maduros
provenientes do doador(Thomas e al, 1975), embora uma certa discusso tenina
havido(Persijn etal, 1982).
Usos do sangue e seu derivados
Diversas condies clnicas podem recomendar o uso do sangue total ou
de seus derivados, de forma ocasional ou em tratamentos continuados. Dentre as
mltiplas indicaes da hemoterapia, situam-se as desordens do recm nascido
de carter imuno-hematolgico, que requerem transfuses, at na vida intra-
uterina(Winkelstein & Kiss, 1997) ou ainda, doenas sistmicas do sangue,
transplante de rgos ou determinadas intervenes cirrgicas, onde o volume do
sangue utilizado muito elevado(Utley e al, 1995). Assim, alm do sangue total,
so utilizados rotineiramente nos centros hospitalares, a administrao de plasma
concentrados de plaquetas ou de hemcias, inclusive com medidas padronizadas
para seu uso(Hillmann e al, 1979). Desde que o doador seja absolutamente
saudvel, apenas os fatores supracitados relativos a novos antgenos ou clulas
apresentadas ao doador so considerados.
O risco da transfuso
A transfuso sangnea, embora seja de uso corriqueiro, continua sendo
uma medida que envolve nscos. Recentemente, tornou-se uma prtica usual a
transfuso homloga(Blais, 1996) como forma de prevenir os riscos das
incompatibilidades entre grupos sanguneos e outras reaes imunolgicas
adversas.
Reaes hemolticas, clinicamente importantes decon-entes das
transfuses, esto com maior freqncia associadas ao sistema ABO e Rh(Mair
& Benson, 1998). Reaes associadas a outros sistemas so raras e ocasionais.
Contaminaes operacionais, decon-entes do manuseio do sangue pode
ocorrer nas diferentes fases do processo, por bactrias, fungos e
microorganismos saprofitas, sendo isolados de frascos contaminados, cepas do
gnero Pseudomonas, Enterobacter e Bacillus. A fonte pode ser o prprio sangue,
assepsia incorreta ou material esterilizado incorretamente. O uso de antisspticos
pode no ser eficaz na preveno das diferentes formas de infeco (Soerensen,
1975), mas as contaminaes bacterianas geralmente so de mais fcil
identificao, por apresentarem freqentemente intenso crescimento(Burstain et
al, 1997).
Por outro lado, infeces parasitrias podem ser veiculadas, por ocasio
das transfuses ou durante a utilizao de concentrados de plaquetas ou de
hemcias. Assim, a existncia de protozorios no sangue perifrico durante o
perodo de coleta torna possvel a transmisso da malria, sendo descritos casos
de malria aps transfuso em reas endmicas e reas no
endmicas(Soerensen 1975). Outras parasitoses onde o parasita se mantm no
sangue sem crescimento evidente, como a doena de Chagas, toxoplasmose,
leishmaniose visceral e outras, podem ser veiculadas durante as
transfuses(Shulman, 1994). Bactrias com comportamento semelhante, como
Treponema pallidum, podem representar um risco para transfuses, embora estes
agentes sejam mais frgeis, sendo eliminados por armazenagem prolongada do
sangue em temperaturas de 4C, mas continua a existir o risco potencial da
transmisso da sfilis via transfuso, caso hajam menores tempos de
conservao, o que freqente(van der Shuis et al, 1985).
As infeces virais so tambm um importante e crucial problema, sendo
um fator de risco maior nas transfuses. Os vrus so agentes submicroscpicos
de difcil eliminao e alta transmisso em materiais biolgicos, sendo facilmente
veiculados pelo sangue, mesmo aps cuidadosa armazenagem(Tyler & Fields,
1996; Chamberland, 1998). Doenas como as hepatites virais B e C,
Mononucleose infecciosa, Citomegalovirose e AIDS podem se propagar por esse
caminho(Gurtler, 1994). As avaliaes sorolgicas, destinadas a manter um
estoque de sangue isento de todas as formas de contaminao, pelo descarte de
material com contato prvio com o agente, requerem o emprego de recursos
laboratoriais tecnicamente sofisticados(Poleski, 1996), bem como pessoal
especializado, o que resulta em custo social e econmico, pelo descarte do
material doado possivelmente contaminado.(Schmunis etal, 1998).
Radiao e sangue
Leuccitos tm sido utilizado como modelo para identificar a exposio
radiao, problema recente, motivado pelo aumento da capacidade humana de
concentrar material radioativo ou produo de radiaes com elevados nveis
energticos.(Muller & Streffer, 1991). Neste aspecto, o estudo dos efeitos da
radiao concentram-se na agresso s clulas nucleadas, tanto por leso do
DNA (Mill etal, 1996; Anonimous, IAEA, 1986) quanto pela induo de apoptose
em linfcitos e outras clulas (Haimovitz Friedman et al, 1994), resultando em
morte celular.
Dentre os diversificados usos das radiaes ionizantes na rea mdica, a
in-adiao de sangue e derivados tem sido indicada como forma de eliminar
problemas relacionados com a rejeio do tipo transplante versus hospedeiro,
causa de insucesso nas transfuses especialmente em politransfundidos ou
imunosuprimidos. Acidentes desta natureza esto relacionados com falhas no
sistema imune do receptor, que se revela incapaz de eliminar linfcitos
transfundidos. Irradiar sangue, portanto uma prtica rotineiramente adotada
pelos mais aparelhados bancos de sangue em todos os continentes. Neste caso,
o alvo principal dentre os diferentes componentes do tecido sanguneo so os
linfcitos, por estarem diretamente envolvidos com os mecanismos das rejeies
(Fagiolo et al, 1983). Os esquemas de irradiao do sangue foram portanto muito
bem estudados, atendem aos propsitos estabelecidos e obedecem a legislaes
recomendadas pela FDA. As doses recomendadas so de 2500 cGy (Cable,
1966; Butch & 1996) com estocagem nunca superior a 28 dias aps a irradiao.
As hemcias, no entanto, so sabidamente mais radioresistententes do que
linfcitos e plaquetas.
A manuteno dos estoques de sangue e derivados requer avaliaes
laboratoriais onerosas, para prevenir a veiculao de diferentes microorganismos
patognicos encontrados no sangue. Essa vigilncia implica em investimentos
elevados. Entretanto, uma possvel reduo dos custos e ganho de qualidade do
sangue e derivados pode advir do incremento da dose usualmente adotada pelos
bancos de sangue (Sweeney et al, 1994). Foi desaito que radiao ionizante nas
doses de 200Gy produziu sensvel reduo da parasitemia em Plasmodium
falciparum(}NaW\ et al, 1983.), e Toxoplasma gondii (Dubey et al, 1996, Hiramoto,
1998), com esterilizao, donde se vislumbra a possibilidade de ampliao dos
benefcios da irradiao do sangue com reduo dos custos e ganho de
qualidade.
A relatada radioresistencia presente nas hemcias(Button et al, 1981) nos
pareceu uma atraente caracterstica biolgica, necessitando de avaliaes mais
aprofundadas quanto a extenso e fixao dos danos radioinduzidos. Assim,
8
averiguaes sobre mudanas moleculares ocorridas na membrana
conseqentes ao uso das radiaes ionizantes, capazes de interferir na
habilidade de modificao espacial celular, das hemcias, quando
fisiologicamente solicitadas pela hemodinamica prpria de cada compartimento
corpreo, a ser irrigado, durante a circulao sangunea (Stuart & Nash, 1990;
Nash & Gratzer, 1993) . Modificaes desta natureza, poderiam ser mensuradas
em simuladores adequados do tipo ecktacitometro. Laser assistido, que pelas
suas avanadas caractersticas tecnolgicas, conseguem submeter as clulas a
diferentes nveis de presso rotacional, similares aos experimentados pelas
hemcias quando no meio circulante (Mohandas & Chasis 1993).
A questo da armazenagem do sangue irradiado, bem como os limites de
irradiao tambm poderia ser revista, quanto aos aspectos relativos a fragilidade
osmtica e perdas inicas referidas na literatura (Arseniev et al, 1994). Para tanto,
avaliaes citomtricas, associadas a variaes da osmolaridade do meio
poderiam nos levar a proposio de novos parmetros para irradiao e
conservao do sangue e derivados.
A maioria dos estudos envolvendo radiaes e seus efeitos sobre sistemas
biolgicos, foram direcionados aos danos molcula de DNA, devido
implicaes decorrentes, como alteraes na sntese de protena, herana
biolgica e morte celular (Muller & Streffer, 1991).
Embora igualmente afetadas, as protenas foram apenas ocasionalmente
avaliadas com finalidades dosimtricas, sendo a radiao usada mais como
tecnologia para finalidades especficas (Nascimento et al, 1996). Os efeitos da
radiao sobre protenas do soro foram estudados de forma externa, com doses
elevadas de radiao, com deteco de agregao e perda de algumas fraes
(Schuessier & Schilling, 1984). Para uma avaliao dosimtrica, as alteraes
induzidas pela radiao ionizante sobre protenas de membranas seriam um
modelo ideal, pelo menor nmero de protenas envolvido e maior acessibilidade
para uso de sondas como anticorpos, quer em protena isolada ou clulas
irradiadas.
O estudo da fixao dos danos induzidos pela radiao ionizante a
membrana de hemcias humanas um alvo ideal como modelo experimental
para dosimetria biolgica dos efeitos da radiao, pelas suas peculiaridades
celulares. Assim, a facilidade de obteno do tecido sanguneo, a simplicidade da
9
metodologia de purificao de hemcias e purificao de "ghosts", a ausncia de
outros organoides celulares,a presena de um nico sistema de membranas
aliada ao conhecimento acumulado sobre a sua estrutura e fisiologia, auxiliam na
compreenso do fenmeno.
Detalhado estudo dos mais expressivos polipeptdeos encontrados na
membrana dos eritrocitos humanos, foi conduzido, usando eletroforese em gel de
poliacrilamida SDS-PAGE, determinando-se o perfil eletrofortico das protenas
isoladas de "ghosts" de membrana, comparando a eficincia de corantes e
relatando a presena de agregados de protena quando estas foram tratadas com
solventes orgnicos cidos, ou quando submetidas a elevao de temperatura na
presena de baixas concentraes de SDS(FairiDanks etal, 1971).
A formao de ligaes intermoleculares ou cross-links nas maiores
protenas de membrana foi estudada quando ficou demonstrado que este tipo de
ligao ocorria em protenas tratadas com formaldedo, e glutaraldedo, formando
agregados de alto peso molecular(Steak, 1984). Posteriormente, foi encontrada a
formao de agregados de alto peso molecular quando protenas isoladas ghost
de hemcias foram irradiadas com raios X, sendo que a maioria destes
resultavam da agregao de pequenas fraes de espectrina, provavelmente
determinadas por pontes dissulfidcas S-S, como mecanismo molecular para a
formao destas ligaes (Schuurhuis et a/, 1984)
Em estudo semelhante, modificaes estruturais em protenas de
membranas in-adiadas foram observadas(Todo et al, 1982). Foi demonstrado por
SDS-PAGE, que a espectrina uma protena de grandes dimenses e que possui
duas sub-unidades pesando 240 kDa e 215 kDa respectivamente e que era o alvo
principal com maior radiosensibilidade aos raios X, quando comparado com
outras menores protenas de membrana. Esse fenmeno se acentuou de forma
proporcional ao aumento da dose de radiao. sugerido que a extenso da fibra
de espectrina , cerca de 1000 angstrons favorece a ao dos radicais livres. Foi
tambm sugerido que a banda 3, uma protena 88 KDa, no se modifica com a
ao da radiao ionizante at a dose mxima utilizada nos seus experimentos,
400Gy em condies aerbicas. Outras observaes relativas as modificaes
estruturais de protenas de membranas irradiadas foram feitas em hemcias
ntegras, com o auxlio da microscopia .de contraste de fase. Neste caso
possvel observar que modificaes conformacionais da membrana comeam a
10
acontecer na dose de 400Gy, sendo no entanto descartada a formao de
agregados, por haver trabalhado em altas concentraes de SDS (Todo et al,
1982).
As abordagens encontradas na literatura especializada abrangem aspectos
resultantes das modificaes radioinduzidas, em protena s isoladas de hemcias
e avaliam seu comprometimento estrutural. Outros estudos se debruam sobre
modificaes espaciais das hemcias irradiadas, visveis em suspenso aquosa,
luz da microscopia eletrnica. Entretanto o potencial modificador das radiaes
ionizantes tem sido pouco aproveitado no sentido de avaliar o comportamento de
hemcias irradiadas quando no meio circulante e em diferentes patamares de
presso, desencadeadas pelo estreitamento e alargamento dos vasos, bem como
pelas bombas e vlvulas propulsoras encontradas no seu trajeto. Embora o
rastreamento dessas clulas irradiadas seja de difcil execuo no sistema
circulatrio, o uso de simuladores adequados pode simplificar essa tarefa e ainda
fornecer dados numricos confiveis (Treicheler 1993).
Os estudos relativos aos efeitos das radiaes ionizantes, comtemplam de
forma isolada a ao dessas radiaes sobre protenas, de membranas, a
peroxidao de lipdios ou ainda o efeito dessas radiaes sobre as hemcias
intactas, em alguns aspectos de sua fisiologia. Esses estudos no entanto se
concentram sobre modificaes fsicas estmturais detectveis por diferentes
ensaios. So esparsas as referncias aos aspectos fisiolgicos das hemcias
irradiadas(Helszer etal, 1980). Foi estudada a fisiologia das hemcias in-adiadas,
em associao com radicais livres e uma mistura de scavengers, com enfoque
principal em medidas das variaes de permeabilidade da membrana, feitas em
"ghosts" irradiados e re-selados(Kong et al, 1981). No encontramos na literatura
levantada referncias aos efeitos das radiaes ionizantes sobre a gerao de
novos eptopos em protenas estruturais de membrana e/ou suas implicaes
quanto a deformabilidade das hemcias aps radiao, frente a modificaes de
presso que ocorrem no meio circulante.
Uma outra atraente abordagem relativa a radiao ionizante e seus efeitos
sobre protenas de membranas, e que no foi convenientemente estudada,
consiste no estabelecimento de uma sonda imunolgica capaz identificar
hemcias irradiadas no meio circulante pela produo de anticorpos dirigidos
contra eptopos especficos de superfcie de membranas induzidos pela radiao.
11
Nesse trabalho nos propusemos a estudar os efeitos das radiaes ionizantes
sobre protenas de superfcie de hemcias irradiadas, enfocando esses dois
aspectos ainda no contemplados pela literatura especializada.
12
2 - OBJETIVOS
Geral
Em nossos estudos, pretendemos avaliar os efeitos de doses progressivas de
radiao ionizante de Cobalto-60 sobre hemcias humanas, procurando
alteraes em sua estrutura, fisiologia e propriedades antignicas.
Especficos
a. Avaliar as alteraes de volume e concentrao de hemoglobina em hemcias
submetidas a radiao ionizante, entre 25 e 1600 Gy.
b. Avaliar a resistncia da membrana a choque hiposmtico e a deformabilidade
de hemcias humanas submetidas a radiao ionizante.
c. Avaliar modificaes introduzidas em protenas de membrana de hemcias
humanas, submetidas a diferentes doses de radiao ionizante, avaliando os
tipos de radicais livres promotores de eventuais modificaes, pelo uso de
captores especficos.
d. Avaliar modificaes nas propriedades antignicas em protenas de
membranas de hemcias irradiadas, tanto em sua forma ntegra ou
dissociada.
e. Identificar e quantificar alteraes antignicas em hemcias irradiadas, por
mtodos de hemaglutinao, imunofluorescncia e citometria de fluxo.
13
3 - MATERIAIS E MTODOS
3.1 - Materiais
3.1.1 - Fontes de irradiao
Foram utilizados dois tipos de fontes de irradiao, com determinao
prvia da sua capacidade de exposio e eventuais interferncias do meio, com o
apoio da Profa.Dra. Barbara Ryzki(IPEN/CNEN-SP). Utilizou-se a fonte de
in-adiao uniforme GammaCell 220(Atomic Energy of Canada) com uma taxa de
dose de 380 Gy/hora, e a fonte panormica(Yoshizawa Kiko Co.Ltd.), com taxa de
dose 280 Gy/hora, sob rotao constante.
3.1.2 - Sangue
O sangue humano utilizado para preparao das hemcias, foi obtido de
duas formas: Sangue fresco de dois doadores voluntrios, saudveis,
cooperantes durante o todo o perodo; e sangue estocado de bolsas de sangue
A+ em soluo conservante CPDA-1 (Knight e al, 1993), fornecidas pela
Fundao HemoCentro de So Paulo, com pelo menos 02 semanas de
estocagem, testado para ausncia dos patgenos habituais transmitidos pelo
sangue.
3.1.3 - Animais
Todos os animais utilizados nos experimentos foram fornecidos pelo
Biotrio Central da Faculdade de Medicina da USP, mantidos e manipulados de
acordo com as normas preconizadas para pesquisa(NIH), sendo sempre utilizado
o nmero mnimo recomendado pela variao provvel do experimento, calculada
pelo programa Epi-Info 4.0 (Centers of Disease Control, Atlanta, GA, USA).
3.1.4 - Reagentes
Todos os reagentes utilizados nos experimentos foram de qualidade pr-
anlise, obtidos de fontes comerciais idneas, sendo as solues preparadas com
gua estril de alta qualidade, obtida em sistema Milli Q(Millipore). Quando
necessrio, a procedncia de um determinado reagente ser explicitada no texto.
14
3.1.5 - Meios de cultura de clula
Os meios de cultura, de congelamento, reagentes de dissociao, fatores
de crescimento e antibiticos utilizados na manuteno de mielomas, fuso,
manuteno de hibridomas e armazenamento de clulas a -190C, foram
fornecidos por SIGMA(St.Louis, USA) e estocados de acordo com as
especificaes do fabricante.
3.2 - Mtodos
3.2.1 - Purificao e irradiao de hemcias humanas.
Hemcias humanas A+ mantidas em soluo conservante CPDA-1 e a 4
C foram lavadas em 10 volumes de salina tamponada com fosfato (PBS= NaCI
0,15 M tampo fosfato de Na 0,02 pH 7,2) estril, por centrifugao a 1000 g por
10 minutos, desprezando-se o sobrenadante e a camada superior do precipitado,
de cor mais clara e com maior contedo de leuccitos(creme leucocitrio). O
processo foi repetido at que o esfregao corado pela soluo de Giemsa
mostrasse a ausncia de elementos nucleados. Hemcias assim purificadas
foram diludas em PBS formando uma suspenso a 10% concentrada. Alquotas
de Iml dessa suspenso foram acondicionadas em tubos plsticos estreis e
expostas radiao gama em fonte de ^Co. Quando irradiadas em fonte
panormica, as amostras, mantidas em refrigerao, foram posicionadas em
dispositivo giratrio, "Speed controller"-modelo 4555-3 Cole-Parmer Chicago
Illinois a uma velocidade de 8 RPM, para manter a uniformidade da radiao. A
atividade da fonte era de 2371, 046 MBq. a taxa de dose era de 0.315 KGy/h a 25
cm da fonte. A exposio foi efetivada sem barreira, com doses de 10, 15, 25, 40,
100, 400, 800e 1600Gy.
As irradiaes de hemcias, tambm foram processadas em irradiador tipo
Gamma Cell (Atomic Energy of Canad), com doses de 400, 800, e 1600 Gy.
Adequaes de geometria e tempo de exposio foram feitas para atender as
caractersticas tcnicas de construo e atividade de cada equipamento.
Nenhuma distoro dos resultados foi registrada, para as mesmas doses, pelos
nossos sistemas de aferio, quando se utilizou um ou outro irradiador.
15
3.2.2 - Estudos citomtricos
Os estudos citomtricos de hemcias foram feitos em sangue total ou
hemcias livres de plasma e suspensas em PBS. Para isto, o sangue estocado
teve suas hemcias purificadas por centrifugao a lOOOg por 10 minutos, livres
da camada supenor das hemcias, do creme leucocitrio e do plasma, sendo
suspensas em salina tamponada com fostato de sdio(PBS) e recentrifugadas. A
partir desta suspenso de hemcias lavadas ou de sangue total irradiado, as
hemcias foram analisados em um sistema automtico Technicon H3-RTX(Miles,
USA), por anlise de aproximadamente 50000 clulas isoladas, com
determinao do volume por impedncia e da hemoglobina por microcolohmetria.
O sistema fornece os seguintes parmetros analisados:
a. Concentrao de hemoglobina corpuscular mdia (g/dl)
b. Hemoglobina total por clula ( em pg)
c. Volume celular(em femtolitros)
d. Distribuio relativa das clulas em relao ao seu volume e sua concentrao
de hemoglobina
e. Porcentagem de clulas hipocrmicas(HB< 20 pg/clula)
3.2.3 - Estudos de hemBise isosmtica e de resistncia globular
ao choque osmtico
A fragilidade osmtica das hemcias foi feita atravs de uma tcnica
simplificada da reao usualmente feita em tubos(Wu,S.G.1998). Assim, em uma
microplaca de 96 poos contendo, em cada poo, 10 /I de uma suspenso de
20% de hemcias em PBS, foram distribudos 200^1 de solues
proporcionalmente decrescentes de PBS(1 - 0,05), . Aps agitao e incubao
por 30 minutos, para sedimentao das hemcias ntegras, 100 fi\ do
sobrenadante era retirado e colocado em placa idntica com fundo ptico. A
densidade ptica a 540 nm foi determinada em um leitor de microplacas. A
D.0.540 nm do poo com 1x PBS e a do poo com 0,05x PBS foram
considerados respectivamente O e 100% de hemlise. A curva de sensibilidade foi
determinada por anlise de modelos no lineares sigmoidal com comparao de
curvas em pacote estatstico GrapPad Prism verso 2.0, obtendo-se a proporo
16
mdia de PBS que determinava liemlise 50%, com respectivo intervalo de
confiana de 95% de sua medida.
3.2.4 - Estudos da deformabilidade celular ao estresse
rotacional.
O ndice de elongao de hemcias no inradiadas e irradiadas em
diferentes doses foi avaliado sob diferentes presses rotacionais ou estresses de
cisalhamento ("shear stress") em ektacitmetro -Laser Assited Optical Rotational
Cell Analyzer ( Lorca) verso 1.0. As amostras foram preparadas em soluo de
PBS pH 7.4 com osmolaridade de 300 m osm/kg. A soluo continha NaCI 140
mM, Na2HP04 18.4 mM NaHa PO4I.3 mM. e 300g de polyvinylpyrrolidone(PVP)
diludas em 6 litros de PBS e mantidas em refrigerao em alquotas de 5ml at o
momento do uso. A viscosidade e temperatura da soluo foram de 37 C e 31+ 2
mPa*s, respectivamente. Amostras de 2 1 de sangue no in^adiado, irradiado em
diferentes doses, fresco ou estocado foram avaliadas quanto aos seus ndices de
elongao em diferentes nveis de "shear stress". Foram considerados dois nveis
de estresses, um considerado baixo de 0,3 Pa e outro mais elevado de 3,0 Pa,
respectivamente 10 e 100x o stress especfico de repouso. A deformabilidade da
hemcia foi expressa em seu ndice de elongao nos dois nveis acima
especificados, com respectivo intervalo de confiana de 95%.
3.2.5 - Purificao de "ghosts"
O isolamento de fraes contendo membranas de hemcias ou "ghosts" foi
realizado atravs de hemlise hipotnica das hemcias lavadas seguida de
centrifugao diferencial a 4 C, de acordo com o descrito por Dodge et.al.(1963).
Uma suspenso de hemcias a 50%, previamente lavada em PBS e livre de
clulas nucleadas foi diluda em 20 vol de gua estril. Aps agitao, a
suspenso foi centrifugada a 1500 rpm por 10 minutos para a retirada de clulas
ntegras e de restos celulares maiores. O sobrenadante foi recentrifugado a
15000g por 30 minutos, sendo desprezado o lquido superior e mantido o
precipitado frouxo esbranquiado. Estes "ghosts" foram suspensos em PBS
durante 12 horas a 4C, para resselagem e novamente submetidos ao processo
de choque osmtico. Todo o processo de centrifugaes foi repetido, at que o
precipitado de ghost apresentasse o mnimo de hemoglobina, exibindo cor branca
17
amarelada. O precipitado foi ento diludo em PBS e sua protena determinada
pelo mtodo descrito por Bradford(1976). As amostras foram aliquotadas e
estocadas a-70 C at o momento de uso. Em algumas preparaes, foram
adicionados inibidores de proteases(fenilmetilsulfonilfluoreto 0,1 mM e
benzamidina 1 mM) em todas as solues utilizadas.
3.2.6 - Irradiao de " ghosts"
Protenas de ghost de hemcias, isoladas como acima descrito, foram
acondicionadas em tubos plsticos estreis, em alquotas de 1 ml, nas mesmas
condies experimentais descritas para as hemcias. Inicialmente, as protenas
foram irradiadas no irradiador Gamma Cell nas doses de 400, 800 e 1600 Gy, na
taxa de dose descrita, mas com sua sada de operao para recarga, as demais
amostras foram irradiadas no in'adiador panormico, na mesma condio descrita
acima para as hemcias integras.
3.2.7 - Irradiao na presena de captores especficos
(scavengers) para classes de radicais livres induzidos pela radiao.
Protenas de ghosts de hemcias, aps estocagem, foram suspensas antes
da irradiao, em solues contendo diversos captores especficos para classes
de radicais livres induzidos pela radiao, para determinao de classe de
radicais envolvidos no efeito encontrado. Para tanto, foram utilizados os seguintes
captores, isolados ou em associao, sempre na concentrao de 10 mM final:
Captor Tipo de radical
Butanol(ref) Hidroxila (OH')
Nitrato de sdio(ref) Electron aquoso ( e')
Ac.ascrbico(ref) Ambos
Aps a suspenso, as fraes foram irradiadas na presena de captores, a
uma dose padronizada de 800 Gy, na fonte panormica nas condies acima
descritas. Para cada frao testada, o controle no irradiado foi mantido em iguais
condies ambientais.
3.2.8 - Anlise de Protenas(SDS-PAGE)
18
A anlise de peso molecular das protenas de ghost no irradiada e
irradiadas com diferentes doses de radiao foi feita atravs de eletroforese em
gel de poliacrilamida, na presena de dodecil sulfato de sdio (SDS-PAGE), de
acordo com Laemmli(1970). O sistema descontnuo utilizado apresentou na parte
de resoluo uma concentrao de 7,5% de poliacrilamida, sendo que, na rea de
empilhamento, a concentrao utilizada era de 4%, sendo mantida constante a
relao entre polmero e agentes de ligao. A amostra proteica continha 2Qag de
protena total em 15^1 a 2Qal de tampo de amostra contendo 4 M de uria, para
solubilizar mais eficientemente protenas de membranas, e 5% de ^-mercapto-
etanol, para ruptura de eventuais pontes dissuifdricas. As amostras, previamente
aquecidas por 5 minutos a 100C, foram aplicadas e a eletroforese feita em
tenso da fonte constante de 150 V, em sistema Bio-Rad Mini Protean II. Aps a
chegada da frente de solvente ao fim do gel, a condida era interrompida e as
protenas separadas fixadas e identificadas por dois tipo diferentes de colorao.
Inicialmente, o gel fixado era corado com Coomassie Brilliant Blue G 250,
evidenciando as bandas proteicas em azul(Wilson,1983). Caso a definio das
bandas fosse insuficiente ou a marcao de bandas minoritrias pouco visvel, o
gel era corado pela precipitao de prata coloidal (Men-il 1984). Aps a colorao,
o gel foi fotografado em sistema digital(UltraLum UV-Vis Transilluminator, Carso,
CA, USA), sendo aps isso processada sua secagem entre duas folhas de
celofane especial, aps prvia exposio em soluo de 10% de metanol e 1 % de
glicerol em gua, mantido em estufa a 37C. Padres adequados de alto peso
molecular foram utilizados em poos demarcados. Aps a secagem do gel,
imagens digitalizadas foram obtidas em mapeador computadorizado ou
digitalizador de imagem, sendo reproduzidas em papel.
3.2.9 - Produo de anticorpos
As propriedades antignicas de protenas de ghost modificadas por
radiao ionizante foram avaliadas atravs da produo de anticorpos policlonais
em coelhos e camundongos, alm da tentativa de produo de anticorpos
monoclonais especficos.
3.2.9.1 - Policlonais
19
Coelhos jovens, Albinos New Zeland foram imunizados com protenas de
ghost expostas radiao, de acordo com o protocolo descrito a seguir. Na
primeira sensibilizao, 0,5 mg do antgeno foi suspenso em Iml de PBS e
emulsificado com 1 ml de adjuvante completo de Freund. Aps sonicao, 1,5 ml
do antgeno (333|ig) foi inoculado em trs diferentes pontos do dorso do animal.
Seguiram-se mais duas injees semelhantes em intervalos regulares de 15 dias,
exceto que o adjuvante utilizado era o incompleto de Freund e a partir da Quarta
no mais se utilizava adjuvante. Dada a ttulo de reforo "Booster", uma nova
dose era feita dois dias antes da avaliao da produo de anticorpos.
Camundongos albinos BALB/c machos pesando entre 23 e 28 gramas
foram sensibilizados em trs ocasies com antgeno de protena de ghost de
hemcias humanas irradiadas. O protocolo de imunizaes foi semelhante ao
utilizado em coelhos, com uma primeira dose com adjuvante completo de Freund,
a segunda com adjuvante incompleto e terceira sem adjuvante, mas com uma
menor quantidade de protena, nunca maior que 50 |ig/dose. As sensibilizaes
ocorreram em intervalos regulares de 15 dias. Em todas as ocasies, 150 ^1(300
pg) do antgeno foi utilizado para cada 2 ml da preparao e 0,2 ml do composto
antignco foi inoculado em cada animal, por via intraperitoneal. Uma quarta
sensibilizao "Booster" foi efetivada com antgeno diludo em PBS nas mesmas
concentraes j descritas, com inoculao intraperitoneal.
3.2.9.2 - Monoclonais
Anticorpos monoclonais contra antgenos de superfcie de hemcias
irradiadas foram procurados. Neste sentido, clulas de mieloma de
camundongo(P3X63AgU.1) foram cultivadas em meio DMEM com 4,5% de
glicose e suplementado 10% de soro fetal, 8 azaguanina, L-glutamina e
gentamicina. Aps intensa proliferao celular armazenamos em nitrognio
lquido 8 tubos plsticos de 1ml contendo 4x10^ clulas em cada tubo.
Clulas de bao de camundongos BALB/c sensibilizados contra protenas
de ghost foram obtidas em condies estreis. Aps lise dos eritrocitos com
NH4CI, essas clulas foram fundidas com clulas de mieloma na proporo de 10
clulas de bao para uma de mieloma e na presena de Polietileno Glicol - PEG.
As clulas fundidas foram depositadas em placas de cultura de 96 poos, com
20
100 fi\ da suspenso de cultura de hibridoma por poo, contendo OPI-HT. Aps a
fuso, as clulas foram incubadas em estufa a 37 C em atmosfera de CO2 a 5%.
Decorridas 24 horas, foi adicionado 100/I do meio seletivo OPI-H2T e as
culturas foram novamente incubadas nas condies descritas.
A seleo dos hibridomas foi feita sete dias aps a fuso.Os hibridomas
selecionados foram transferidos para placas de cultura de oito poos e em
seguida cultivados em garrafas em meio sinttico DMEM com 4,5% de glicose e
suplementado com 15% de soro fetal bovino, glutamina, gentamicina 100 x OPI e
lOOxHT.
A deteco de anticorpos foi feita por ELISA. Os hibridomas foram
colocados em meio de congelamento composto de 5% de DMSO e 95% de soro
fetal bovino, aliquotados em tubos plsticos de Iml e postos em "freezer" -70 C
por12 horas. Em seguida, os hibridomas foram estocados em nitrognio lquido.
3.2.10 - Deteco de especificidade de anticorpos policlonais
produzidos contra "ghosts" de hemcias irradiadas
3.2.10.1 - ELISA
O ensaio de ELISA foi conduzido de acordo o mtodo proposto por
(Kemeny & Challacombe,S.J.1988) para ensaio de captura, utilizando microplacas
de alta ligao a protenas. Para sensibilizao das placas, utilizamos protenas
de ghosts de hemcias irradiadas ou nativas, suspensas em tampo carbonato de
sdio 0,05M pH 9,5, na concentrao de 10 \ig/rr\\ de protena determinada pelo
mtodo de Bradford. Esta soluo denatura as membranas e expe as protenas
de maneira uniforme, livres de bicamada lipdica. As placas foram sensibilizadas
com 100 |il de cada soluo por 18 hs a 4 C, seguidas de trs lavagens com PBS
contendo 0,2% de Tween 20(PBST) por 5 minutos. As placas sensibilizadas
tiveram seus stios de ligao eventualmente livres, bloqueados por incubao
com leite desnatado a 5% em PBST por 2 horas imediatamente antes do uso.
Todas as demais solues e lavagens foram feitas em leite desnatado a 1 % em
PBST, exceto o revelador da atividade enzimtica. Soros de camundongos
previamente imunizados com ghosts de hemcias normais ou hemcias
21
irradiadas com 1600 Gy, conforme descrito, foram diluidos a 1/100 e aplicadas
aos poos. Aps 3 lavagens, anticorpo anti-imunoglobulina de camundongos
conjugado a peroxidase, preparado no laboratrio e com ttulo de 1/1000, foi
adicionado por 1 hora a 37 C aos poos, com controles adequados. A revelao
da presena de anticorpos anti-protenas de ghost de hemcias foi feita pela
adio de soluo de citrato de sdio 0,05 M pH 5,8, contendo o-fenilenodiamina
0,4 mg/ml e H2O2 0,03%. A cor dos poos aps incubao por 1 hora e
interrupo da reao pela adio de 1 volume de cido sulfrico 10%, foi
determinada espectrofotometricamente a 492 nm em um leitor automtico de
microplacas.
3.2.10.2-Western blot
Uma abordagem mais especfica na identificao de anticorpos anti-
protenas de ghost irradiado foi conduzida pela tcnica do Western- Blot.
Protenas isoladas por eletroforese como descrito, foram transferidas
eletroforeticamente para membrana de nitrocelulose em sistema convencional tipo
Trans-Blot SD Semi - Dry Transfer Cell (BIO RAD). Tiras recortadas aps pr
colorao com Ponceau S foram bloqueadas com leite desnatado a 2% em PBST
por 18 hs. Estas tiras foram ensaiadas com diluies de soros de camundongos
imunizados com as diferentes preparaes. Aps lavagem cuidadosa com PBST,
anticorpos ligados foram revelados pela incubao com anticorpo de coelho anti-
imunoglobulina de camundongo conjugado a peroxidase produzido no laboratrio,
por 2 hs a temperatura ambiente e com agitao oscilante contnua. Aps
lavagem cuidadosa em PBST, o conjugado ligado foi revelado com tampo
fostato de sdio contendo Diaminobenzidina (DAB)1 mg/ml e H2O2 0,03%. O
protocolo seguiu basicamente os procedimentos propostos por Hudson & Hay,
1985. Aps secagem, as tiras reagidas foram digitalizadas eletronicamente em
Scanner HP4p e estocadas.
3.2.10.3 - Hemaglutinao
Hemcias humanas A+ normais ou irradiadas com 800 Gy foram fixadas
em 20 volumes de PBS contendo 4% de formaldedo, assim permanecendo por
18 horas a 4 C, com agitao ocasional. A suspenso foi centrifugada e
resuspensa em PBS contendo 1% de formaldedo. A suspenso de uso, contendo
22
1% de hemcias A+ fixadas e lavadas em PBS, foi preparada no momento do
uso. Diluies seriadas do soro teste , alm de soro padro foram preparadas em
placas plsticas de fundo em V, com um volume final de 100 fx\, sendo
adicionadas 25 f da suspenso a 1 % de hemcias lavadas irradiadas ou no.
Aps agitao, a placa foi deixada em repouso por uma hora para sedimentao
das hemcias. A reao foi considerada positiva nos poos onde a ligao
antgeno-anticorpo formou um manto no fundo, sendo a reao negativa
caracterizada pela formao de um ponto central, formado pela sedimentao das
hemcias, nos poos onde no ocorreu ligao antgeno-anticorpo
3.2.10.4 - Reao de Imunofluorescncia Indireta. IFI
A busca da presena de anticorpos no soro de coelho sensibilizado com
protenas de ghost in^adiado de hemcias tambm foi efetivada por
imunofluorescncia indireta. Nesses ensaios, hemcias humanas A+ normais ou
irradiadas com 800 Gy foram colocadas na superfcie de lminas de
imunofluorescncia e aps secagem foram estocadas sob refrigerao a -20 C
at o momento do uso. Em seguida, foi adicionado soro de camundongos
sensibilizados com ghost irradiado de hemcias, em diferentes concentraes,
tendo como controles soro de camundongos no sensibilizados de hemcias
posteriormente adicionado sobre as hemcias, previamente aderidas lmina.
Aps incubao, as lminas foram cobertas com conjugado anti-imunoglobulina
de coelho ligado a fluorescena, produzido no Laboratrio de Protozoologia do
IMTSP ou comercial(Sigma Co. St.Louis, USA). Aps lavagem e montagem na
presena de Azul de Evans, para colorao de fundo, as lminas foram
observadas em microscpio de fluorescncia, com filtros adequados a
fluorescena, sendo considerados positivos os poos onde mais de 25% das
hemcias apresentavam uma clara fluorescncia de membrana.
3.2.10.5 - Citometria de fluxo
As reaes de imunofluorescncia permitem a visualizao das ligaes
antgeno anticorpo, entretanto, a mensurao do fenmeno observado um
critrio pessoal do observador, sendo, portanto, um ensaio semiquantitativo, de
difcil interpretao matemtica. Portanto, para obtermos uma confirmao
quantitativa confivel do fenmeno j identificado com soro de coelhos,
23
procedemos uma avaliao da presena de anticorpos anti-ghost irradiado em
camundongos BALB/c direcionados contra protenas de superfcie de hemcias
humanas irradiadas, utilizando a citometria de fluxo. As hemcias humanas
utilizadas foram irradiadas com doses de 25 e 100 Gy com respectivos controles
de hemcias no irradiadas. O soro utilizado foi de animais sensibilizados com
ghosts irradiados conforme descrito anteriormente, utilizado em diluies
progressivas(25, 100 e 200 vezes). Soro total de animal no sensibilizado foi
utilizado como controle. A ligao do anticorpos sobre a superfcie de hemcias
foi revelada pela incubao com anticorpo anti-imunoglobulina de camundongo
marcado com fluorescena. Todas as reaes foram conduzidas em suspenso
de hemcias, sendo procedida a lavagem por centrifugao em microcentrfuga.
Em cada fase, pelo menos 5 lavagens foram efetuadas entre cada reao e
entre a leitura final. Os experimentos foram conduzidos em citmetro Becton
Dickson Lysys II verso 2.0, em canais de fluorescena. No pnmeiro bloco de
experimento, soro total no irradiado foi confrontado com hemcias no
in-adiadas, irradiadas com 25Gy e com lOOGy. No segundo bloco, soro irradiado
diludo 25 vezes foi confrontado com hemcias no irradiadas, irradiadas com 25
Gy e com 100 Gy. No terceiro e quarto blocos o soro foi diludo 100 e 200 vezes
respectivamente e confrontados com hemcias no irradiadas, irradiadas com
25Gy e lOOGy. A fluorescncia de cada clula foi mensurada, considerando
10.000 clulas por reao. Parmetros estatsticos, tais como mdia, mediana e
desvio-padro foram fornecidos, bem como o histograma de cada reao. Para
verificao da especificidade da reao, soro positivo foi previamente absorvido
com vasto excesso de suspenso de hemcias irradiadas ou no antes do
experimento final.
24
4 - RESULTADOS
4.1 - Irradiao de hemcias
Em nossos ensaios, um dos principais achados, mas de difcil
demonstrao, foi a radioresistencia das hemcias, quando mantidas em
ambiente isosmtico. Assim, no houve alteraes morfolgicas significativas das
hemcias humanas, estocadas ou frescas, quando submetidas irradiao de at
1600 Gy, observadas microscopia de fase ou coradas por Giemsa. Como este
processo apresentava baixa capacidade de resoluo e para a determinao de
alteraes mais sutis, utilizamos abordagens mais sofisticadas que
demonstraremos a seguir.
4.2 - Estudos citomtricos
Para estes estudos, analisamos inicialmente hemcias frescas submetidas
a radiao por ^Co em citmetro automtico, conforme descrito em mtodos,
sendo seus valores mostrados na Figura 1.
Volume
150-,
125-
3 O >
100-
75
' Concentrao de hemoglobina
Hemoglobina celular
r40
1 r~ 10
h30 I O
(O o o-5"
"D
-20 S
100 1000 -10
10000
Dose total de irradiao ^Co (Gy)
Figura 1. Valores de citometria celular de hemcias frescas irradiadas com diferentes doses de
Co. Faixas representam a disperso dos valores obtidos de hemcias no irradiadas mantidas
em mesmas condies, para volume e concentrao celular de hemoglobina. As barras
representam o desvio padro de cada medida, para 50000 clulas. A linha estimada da regresso
no linear do volume pela dose de radiao tambm mostrada como linha contnua
25
O sangue recm-coletado e submetido a radiao ionizante apresentou
crescente liipocromia, em funo do incremento da dose de radiao. Um
aumento de volume das hemcias, ou macrocitose, foi observado, de forma
proporcional ao aumento da hipocromia. Estes fenmenos tornaram-se evidentes
somente para doses iguais ou supenores a 800Gy. Lise celular no foi observada
durante o experimento. O incremento do volume obedeceu a um modelo
polinomial de segunda ordem( y= 88,19 + 0,0174*X - 6.116x10"^X^) com r =
0,9942 e p
100-
- Volume Concentrao de hemoglobina
- Hemoglobina celular
r40
Dose total de irradiao ^Co (Gy)
10000
Figura 2. Valores de citometria celular de hemcias estocadas em CPD-1 por pelo menos 2 semanas e irradiadas com diferentes doses de ^Co. Faixas representam a disperso desvalores
obtidos de hemcias no irradiadas mantidas em mesmas condies, para volume e concentrao
celular de hemoglobina. As barras representam o desvio padro de cada medida, para 50000
clulas. A linha estimada da regresso no linear do volume pela dose de radiao tambm
mostrada como linha contnua
26
Como pode ser observado na Figura 2, o comportamento do sangue
estocado foi semelliante porm de maior amplitude que o observado com
hemcias frescas. Assim, a armazenagem do sangue favoreceu a intensificao
dos fenmenos de macrocitose e hipocromia, sem no entanto promover a lise
celular. O aumento do volume celular obedeceu um modelo polinomial de
segunda ordem, de maneira equivalente, obedecendo a equao Y= 88,72 +
0,04855*X - 1,96x10"^X^), com r de 0,9798 e p
27
Como pode ser observado, a fragilidade osmtica aumentou
proporcionalmente a dose aplicada, significativa somente em doses acima de 800
Gy. O modelo de anlise no linear mostrou uma correlao exponencial entre a
dose de radiao e a fragilidade osmtica, seguindo a equao Y= 5 2 , 1 5 ' ^ ^ ^ ,
com r de 0,8302 e p=0,011
Os eventos acima mostraram que haviam alteraes significativas nas
hemcias irradiadas, no evidenciveis em hemlise isoosmtica. No sentido de
verificar o comportamento destas hemcias em condies hemodinmicas,
procedemos a anlise de seu comportamento em stress rotacional, conforme
descrito em mtodos. Diante da complexidade dos resultados, que envolvem
curvas de ndices de elongao em diferentes condies de stress rotacional,
aliadas ao grau vahado de exposio radiao, tornana a anlise muito
complexa pelo que optamos pela apresentao dos ndices de elongao em dois
nveis de stress, um apenas 10 vezes o stress esttico e outro de 100 vezes o
stress esttico, que pode ser visto na Figura 4.
0.4n o t> (D o - c o o o 0.2 o o "O
c 0 . 1 -
0.0 1
I
10 100 1000 10000
60/ Dose total de Irradiao do Co(Gy)
Figura 4. Anlise da defonnabilidade de hemcias armazenadas submetidas a diferentes doses de radiao ionizante de ^Co. Os nveis de defonnabilidade so expressos em ndice de
elongao, basicamente uma relao de raios menor e menor de cada hemcia analisada. As
barras representam o desvio padro de medida de pelo menos 50 hemcias em cada nvel de
stress. As reas pontilhadas representam a faixa de intervalo de confiana encontrada em
hemcias no irradiadas.
Como pode ser claramente observado, as hemcias irradiadas apresentam
o mesmo tipo de deformabilidade que as hemcias normais em nveis elevados
28
de stress(3 Pa). No entanto, a irradiao acima de 400Gy promove uma
diminuio proporcional nesta deformabilidade em nveis mais baixos de
stress(0,3 Pa), com um modelo exponencial seguindo a equao Y= 0,1540 "
O.CX307326-X ^2 de 0,9401 e p
29
alm do aparecimento de uma faixa de agregados, de difcil visualizao na parte
superior do gel. O fato tambm ocorreu com as bandas de espectrina, na parte
superior do gel
A faixa de banda 3 mostrou um decrscimo significativo tambm, mas
havia problemas de protelise parcial no gel, sendo visvel a diminuio de um de
seus produtos especficos ao nvel de 65 kDa No houve degradao no
especifica de protenas em peptdeos pequenos, pelo no aumento de rastro na
parte inferior do gel. Estes fatos sugerem que a irradiao de ghosts promoveu,
numa forma dose dependente, a agregao de protenas em produtos de alto
peso molecular.
Influncia de captores de radicais livres sobre os efeitos da radiao
ionizante em protenas de ghosts de hemcias irradiados.
Para identificar qual o radical livre induzido pela radiao envolvido no na
agregao de protenas, procedemos a eletroforese das protenas na presena de
captores de radicais livres em gel de acrilamida na concentrao de 7,5%,
visando identificar as protenas de maior peso molecular. Na faixa 1, pudemos
comprovar os efeitos da radiao anteriormente demonstrado, com realce para a
diminuio da intensidade das bandas de espectrina. Na anlise do perfil
eletrofortico na presena de vasto excesso de captores, ficou demonstrado que
a presena do captor butanol foi capaz de prevenir a formao de agregados, ao
contrrio do captor nitrato, sugerindo o envolvimento do radical OH* na formao
dos agregados. O captor ascrbico tambm inibiu eficientemente esta formao,
com manuteno das bandas de espectrina, sugerindo que apenas o e" no
estava influindo nesta reao.
30
8* PM
200
116 66
45
Figura 6: Composio eletrnica da eletroforese de protenas irradiadas e no irradiadas em presena de captores de radicais livres. O asterisco representa a amostra irradiada. Amostra
1 reentrle. Amostra 2:+BLitanol. Amostra 3: + Nitrato. Amostra 4:+Ascorbato. .Amostra 5:+Birtanol
e Ascorbato. Amostra 6: Butanol e Nitrato. Amostra 7 + Ascorbato e Nitrato. Amostra 8:
Associao de todos.
4.5 - Produo de anticorpos anti-gAioste de hemcias Irradiados
Os achados antenores mostraram alteraes nas protenas do ghost de
hemcias aps irradiao e para a identificao desta alteraes, optamos pela
utilizao de sondas imunolgicas, ou seja, anticorpos especficos, visando uma
anlise mais fina desta modificaes.
4.5.1 - Imunizao de coelhos e camundongos
Coelhos e camundongos foram imunizados com ghosts de hemcias
irradiados, como descrito em Mtodos, visando a produo de anticorpos mais
especficos, evitando-se a produo de anticorpos contra elementos
citoplasmticos, principalmente hemoglobina, majontrios em preparaes de
hemcias ntegras.
4.5.2 - Deteco de anticorpos por hemaglutinao de hemcias
irradiadas
Aps a produo dos anticorpos, sua deteco era fundamental e foram
utilizadas diversas abordagens para este fim. A primeira delas consistiu na reao
de hemaglutinao de hemcias irradiadas ou no conforme descrito em
31
Mtodos. Neste ensaio, utilizamos sangue de coelhos imunizados e o resultado
pode ser visto na Figura 7.
Figura 7. Composio eletrnica de microplaca da reao de hemaglutinao onde se observa resposta positiva entre soro imune de coelho e a superfcie de hemcias humanas inradiadas ou
no. Linha A: Hemcias irradiadas com 1600 Gy. Linha C Hemcias irradiadas com 800 Gy. Linha
E - Hemacias inradiadas com 400 Gy. Linha G Hemcias in-adiadas com 200 Gy. Linhas B.D,F e
H. Hemcias humanas no in-adiadas. Soro de coelho foi diludo em base 2 at coluna 11. Coluna
12 PBS.
Como pode ser observado, o soro do coelho imunizado foi capaz de
aglutinar preferencialmente as hemcias irradiadas, com um ttulo mximo de 128
em hemcias irradiadas com 1600 e 800 Gy, caindo para 64 em hemcias com
dose menores de radiao. Para hemcias normais, o ttulo encontrado foi de 8,
mostrando inespecificidade da reao.
4.5.3 - Deteco de anticorpos anti-ghosts de hemcias
irradiadas por ensaio imunoenzimtico (ELISA)
Como os coelho tiveram baixa resposta na produo de anticorpos
especficos, apesar de mltiplas imunizaes, com inespecificidade da reao,
optamos pela produo de anticorpos em camundongos, com deteco
imunoenzimtica dos anticorpos, tendo em vista o pequeno volume de soro obtido
dos animais. A imunizao foi feita como descrito em Mtodos, assim como a
reao imunoenzimtica. Os resultados obtidos em um camundongo tpico podem
ser vistos no Quadro 1.
Nela pode ser constatado que os camundongos foram eficientes na
produo de anticorpos contra ghosts de hemcias, principalmente os imunizados
32
com ghosts de hemcias irradiadas, que produziram anticorpos em maior
quantidade que os imunizados com ghosts no in-adiados. Entretanto, a
sensibilizao da placa com ghosts irradiados produziu uma menor quantidade de
epitopos expostos, identificveis na reao. No houve possibilidade de
identificao de maior quantidade de anticorpos especficos.
Quadro 1. Ensaio imunoenzimtico tpico de um soro de camundongos
imunizados com ghosts de hemcias irradiados ou no, diluidos 100 vezes. Os
valores de anticorpos so expresso em DO final da reao.
Extrato de ghosts utilizados para
sensibilizar a placa
Hemcias nativas Hemcias irradiadas
com 1600Gy
Camundongos Ghosts de
hemcias nativas 0,617/0,679 0.487/0.307
Imunizados Ghosts de
hemcias inradiadas
com 1600 Gy
1.028/1.036 0,787/0.805
Com No imunizados 0,006/0,072 0,030/0,074
4.5.4 Deteco de anticorpos em hemcias ntegras, por
imunofluorescncia indireta
Buscando um maior refinamento e confirmao dos resultados obtidos,
confrontamos hemcias ntegras irradiadas e no irradiadas com soro de
camundongos imunizados com ghosts de hemcias irradiados, por uma tcnica
de deteco que fosse mais sensvel que a hemaglutinao, utilizando a
imunofluorescncia indireta como descrito em Mtodos. A reprografia
computadorizada das microfotografias obtidas desta preparao pode ser vita na
Figura 8.
Como pode ser observado, havia uma clara fluorescncia positiva das
hemcias irradiadas com 800 Gy nesta preparao, ao contrrio do que ocorria
com hemcias no irradiadas, mantidas em igual condio. A reao perdia
especificidade se a concentrao de anticorpos fosse aumentada pela menor
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33
diluio do soro, mas em diluies de at 1/160, o ensaio foi reprodutivo em
vrias preparaes e vrias imunizaes de camundongos. Ocasionalmente,
hemcias isoladas apresentavam fluorescencia menos intensa, sugerindo uma
variao da quantidade de epitopos induzidos pela radiao em clulas isoladas.
Ainda assim, o ttulo encontrado em hemcias nativas mostrava apenas uma
predominncia dos anticorpos produzidos contra epitopos induzidos pela
radiao.
Figura 8: Reao de imunofluorescncia Indireta entre soro de camundongo imunizado com
hemcias irradiadas, na diluio 1/160, em hemcias humanas armazenadas normais ou
irradiadas com radiao gama na dose de 800Gy. A- hemcias no irradiadas, B- hemcias
in-adiadas. X630
34
4.5.5 - Identificao de anticorpos em protenas separadas em SDS-
PAGE(Westem-Blot)
Para aprimorarmos a utilizao de anticorpos policlonais, buscamos uma
melhor caracterizao, identificando antgenos pela tcnica de transferncia
eletrofortica (Western-Blot) conforme descrito em Mtodos, utilizando protenas
de ghosts irradiados e no irradiados, tranferidas eletroforeticamente para
membranas de nitrocelulose, seguida de reao com soros de camundongos
imunizados com ghosts irradiados e reveladas com conjugado anti-lgG de
camundongo. Os resultados podem ser vistos na Figura 9
Figura 9: cpia digitalizada de reao de anticorpos de camundongos imunizados com ghost e hemcias irradiados contra protenas de ghost de hemcias irradiados transferidas ps-
eletroforese. Faixa 1: Soro de camundongo imunizado com ghost irradiados, 2- Soro de
camundongo imunizado com ghost no irradiado. 3. Soro de camundongo controle e 4 Soro de
camundongo contra fita no transferida.
A avaliao dos resultados demonstrou que o soro de animais imunizados
com ghost, irradiado ou no, reconheceu bandas de protenas de ghost de
35
hemcias irradiadas. No foi possivel identificar bandas especificas produzidas
pelo antgeno irradiado, sendo predominante a reao com protenas de alto peso
molecular.
4.6 . Citometria de fluxo
Em face dos bons resultados obtidos com as reaes utilizando hemcias
integras e a diculdade de clarificar os ensaios com antigenos solubilizados ou
separados, procuramos aprimorar aquelas tcnicas pela citometria de fluxo, como
deschto em Mtodos, considerando o poder de discriminao quantitativa
oferecida por esse tipo de ensaio. O conjugado utilizado permitia identificar
quantitativamente a presena de anticorpos ligados superfcie das vrias
preparaes, sendo mostrado os histogramas de distribuio de fluorescncia na
Figura 10, r !
i 3 1 E i
D
\ ^ l
B i
'i [ A \
. 1 1 Canal de intensidade de fluorescncia
Figura 10: Distribuio da fluorescncia especfica de 10000 hemcias irradiadas ou no, desafiadas com anticorpo anti-protenas de superfcie de hemcias humanas produzidos em
camundongos (SHI). A- Hemcias no irradiadas com soro normal de camundongo {SNC).B-
Hemcias irradiadas com 25Gy e SNC. C- Hemcias irradiadas com lOOGy e SNC. D- Hemcias
no irradiadas e SHI.E- Hemcias in-adiadas com 25Gy e SHI e F- Hemcias irradiadas com 100
Gy e SHI.
A distribuio relativa de hemcias no mostrou diferenas significativas
quando ensaiadas com soro normal de camundongo, mantendo um padro de
fluorescncia de canais de menor intensidade. J a distribuio das diferentes
hemcias, quando reagidas com soro imune mostrou uma maior freqncia nos
canais de maior intensidade, sendo que esta distribuio tendeu a ser mais
36
elevada quando se elevaram as doses de irradiao. Os dados quantitativos
desta reao podem ser vistos na Tabela 2.
Tabela 2. Mdia dos canais de fluorescncia em relao freqncia de
hemcias posisitvas nas vahas reaes analisadas.
Amostra Mdia dos canais de
fluorescncia Desvio Padro
A -soro normal X hemcias no irradiadas 127,80 76,86
B -soro normal X hemcias irradiadas - 25Gy 142,80 76,48
C.-soro normal X hemcias irradiadas.-. 100 Gy 134,65 80,01
D -soro imune 1/25 X hemcias no irradiadas 266,17 110,88
E.-soro imune 1/25 X hemcias irradiadas - 25
Gy
320,34 92,26
F-soro imune 1/25 X hemcias irradiadas - 100
Gy
328,96 101,69
Para otimizar a relao antgeno anticorpo a reao foi feita com diferentes
concentraes de soro, como mostra a Figura 11. Embora tenhamos diludo
progressivamente esta sonda, a fluorescncia das hemcias inradiadas
permaneceu supenor das hemcias controles em todas as diluies. As
diluies progressivas levaram a uma reduo do sinal de fluorescncia,
compatvel com a reduo da oferta de anticorpos.
37
r SNCj
: SNQ
; SNCj
Canal de intensidade de fluorescencia
Figura 11: Distribuio de fluorescencia de 10.000 hemcias para cada evento, desafiadas
contra anticorpos anti protenas de superfcie de hemcias irradiadas .A,D,G hemcias no
irradiadas B'E H .Hemcias irradiadas com 25 Gy C,F, I Hemcias irradiadas com 100Gy.A,B,C
Soro 1:25. D,E,F Soro 1:100. G,H,I Soro 1:200. Os dados destas hemcias com soro normal de
camundongo tambm so mostrados.
4.6.1 - Ensaios de citometria de fluxo com absoro prvia do
anticorpo.
Para definir mais seletivamente a presena de eptopos especficos,
procedemos a absoro do soro de camundongo imunizado com ghosts de
hemcias irradiados com hemcias humanas A+ de mesma procedncia, sendo
analisado este soro adsorvido contra hemcias com dois niveis de irradiao.
Dados quantitativos so mostrados na Tabela 3. Como pode ser observado, a
absoro por hemcias normais no afeta a sensibilidade do anticorpo produzido,
mostrando a especificidade da reao contra hemcias irradiadas.
38
F R E
Q u N C I A
-A
B
D
E
F
G Mh-.^
1 I t
Canal de Fluorescncia
Figura 12: Distribuio de citometria de fluxo de anticorpos presentes em soro de camundongos
imunizados com ghost de hemcias armazenadas irradiados, aps absoro com hemcias
humanas de mesmo doador.
Tabela 3. Efeito da absoro prvia por hemcias humanas normais sobre a
fluorescncia em citometria de fluxo de soro de camundongo imunizado com
ghosts de hemcias irradiados, em diferentes preparaes
Tipo de preparao Mdia Geomtrica Desvio
Padro
A - soro adsorvido X hemcias irradiadas - 800 Gy 351,57 110,91
B - soro adsorvido X hemcias irradiadas - 100 Gy 252,65 139,76
C - soro imune X hemcias irradiadas - 800 Gy 417,76 91,98
D - soro imune X hemcias irradiadas - 100 Gy 307,43 147,61
E - soro normal X hemcias no irradiadas. 133,72 104,89
F - soro normal X hemcias irradiadas - 800 Gy 274,61 106,82
G- soro normal X hemcias irradiadas - 100 Gy 206,65 129,73
39
5 - DISCUSSO
Em nossos estudos, conseguimos demonstrar alteraes citomtricas de
hemcias, induzidas pela irradiao por ^Co, em um modelo dose dependente,
com preservao da integridade celular. As alteraes encontradas foram um
aumento do volume celular, com manuteno da quantidade de hemoglobina
intracelular, principal protena citoplasmtica da hemcia, at em doses elevadas
de irradiao, acima de 800 Gy. Existem relatos ocasionais do aumento do
volume celular em hemcias irradiadas, citados na literatura disponvel, mas
nossos dados so certamente mais amplos e abrangentes do que os encontrados
na literatura disponvel, principalmente se observamos a variao da dose de
radiao aplicada. A preservao da hemoglobina celular e o aumento de volume
podem ser explicados pela perda da capacidade de manter o balano salino
adequado no interior da hemcia aps a irradiao, principalmente sdio e
potssio. Nossos dados so semelhantes aos descritos por outros autores, (Kover
6 Schoffeniels, 1965; Arseniev et al 1994), que encontraram uma diminuio do
potssio em hemcias irradiadas, associado a um efluxo do potssio intracelular,
dependente tanto da dose de radiao como do tempo de estocagem. Outros
fatores relevantes para este efluxo parecem ser a temperatura de conservao,
com melhora do balano salino se as hemcias so incubadas a 37 G aps a
irradiao, e a quantidade de oxignio dissolvido no sangue, que, se elevada,
aumenta o efluxo deste on(Anderson & Mintz, 1994) Estes dados corroboram
nossos achados de potssio extracelular elevado evidente em sangue estocado.
O tipo de soluo preservante parece interferir neste processo, sendo que a
soluo por ns utilizada para preservao do sangue, CPDA-1, promove maior
liberao de potssio celular que solues de preservao mais complexas(Jeter
et al, 1991). Todos estes autores utilizaram menos que 50 Gy de irradiao, ao
contrrio de nossos nveis mais elevados de radiao. As alteraes encontradas
nessas doses mais elevadas foram semelhantes as descritas e exacerbadas pela
prvia conservao do sangue. Assim acreditamos que o aumento do volume das
hemcias imadiadas em doses mais elevadas foi causada por alterao no
equilbrio inico citoplasmtico das hemcias, sem ruptura de sua membrana,
pela ausncia de liberao de hemoglobina. Estas alteraes poderiam estar
40
relacionadas a modificaes em protenas de transporte de ons, mas a sua
recuperao pela incubao a 37 C(Brugnara & Churchill, 1992) ou reposio de
ATP e 2,3 DPG (Samuel ef al, 1997) fala contra este fenmeno. Isto corrobora o
uso da radiao ionizante na preservao de sangue ou outras finalidades, j que
sistemas que visam a preservao das hemcias por fotoxidao geram novos
radicais nesta membrana, identificveis quimicamente e causando agresso
definitiva fisiologia da membrana(Kochevar, 1990).
Outro dado importante nosso foi a observao da resistncia ao choque
osmtico praticamente inalterada em hemcias irradiadas at 400 Gy. Este fato
mostra que, apesar do aumento do volume da hemcia, esta no se apresenta
com maior fragilidade, em nossos experimentos. Somente em doses muito
elevadas, esta resistncia alterada. Os dados da literatura so contraditnos
quanto a este efeito da radiao havendo autores que relatam ausncia de
anormalidade da concentrao plasmtica de hemoglobina e enzimas
intracelulares em sangue irradiado(Hillyer et al, 1991) enquanto outros referem
que ocorre uma hemlise pequena mas significativa aps irradiao,
principalmente quando um maior tempo de armazenagem previsto(Davey et al,
1992), inclusive com liberao para o plasma de nveis maiores de hemoglobina e
potssio, com risco para o receptor. Apesar destes achados, corroborado por
outros autores, recomendando que o tempo de armazenamento de hemcias
fosse reduzido, em dose de at 30 Gy, a maioha dos autores concorda em um
tempo de conservao de at 28 dias, bastante compatvel com uma disposio
adequada do produto irradiado.(Mintz & Anderson, 1993; Davey, 1995).
As causas da hemlise aumentada em hemcias irradiadas com altas
doses de radiao e desafiadas com choque osmtico devem estar relacionadas
a alteraes da membrana celular. Foi demonstrado que ocorre uma peroxidao
de lipdios mesmo em doses relativamente seguras de radiao(Anand et al,
1997), que pode resultar em leses oxidativas em protenas da membrana da
hemcia, exceto glicoprotenas(Sullivan & Stern, 1984), principalmente em clulas
neonatais ou com deficincia de ferro(Katz et al, 1996). Estas leses foram
demonstradas mais claramente em "ghosts" isolados de hemcias, mostrando
significativamente agregao de espectrina, a membrana do esqueleto celular da
hemcia. Aliado a estes estudos, estudos ultraestruturais de hemcias irradiadas
mostraram que ocorriam alteraes significativas da superfcie de hemcias.
41
decorrentes de alteraes conformacionais das protenas, com diminuio da
viscosidade interna{Gwozdzinski, 1991).
Em nosso estudos de deformabilidade a estresse rotacional das hemcias
irradiadas, foi possvel demonstrar uma modificao extremamente interessante
desta propriedade, decorrente da radiao, por um elegante sistema de
ectacitometria. Assim, hemcias irradiadas com doses acima de 400 Gy
apresentavam uma maior resistncia a deformabilidade induzida por estresse de
menor intensidade, quando comparada a hemcias nativas, embora com igual
deformidade em estresse mais elevado. Isto poderia significar uma maior rigidez
do citoesqueleto celular, gerando hemcias com maior dificuldade de adaptao
ao fluxo capilar, onde menores presses esto ocon^endo e maiores
deformabilidades so exigidas, mas capazes de resistir ao turbilho cardaco.
Este fato vem em oposio a trabalhos semelhantes, utilizando hemcias
hipxicas e que encontraram uma maior resistncia a deformabilidade em maior
estresse, sem alterao significativa em baixo estresse(Kaniewski et al, 1994),
alm de trabalhos em hemcias de pacientes com malria falciparum severa, que
apresentam uma resistncia a deformao alta em estresse intermedirios e
elevados(Dondorp et al, 1997). Nossos achados mostram que a irradiao
promoveu um efeito de estabilizar o citoesqueleto mas sem retirar sua
flexibilidade, apenas sendo necessria a aplicao de maiores foras para obter a
mesma deformabilidade. As alteraes de deformabilidade de hemcias
in-adiadas tinham sido apenas esporadicamente citadas na literatura(Karie &
Hansen, 1971). Este problema s poderia ser avaliado em modelos in vivo,
verificando a circulao e a sobrevivncia das hemcias. Nas doses habituais
utilizadas para sangue, de at 50 Gy, existem relatos de que a sobrevivncia
aguda da hemcia irradiada semelhante a da hemcia normal(Suda etal, 1993),
por estudos utilizando ^^Cr, concordante com nossos resultados, mas sem
estudos em hemcias submetidas a maiores doses de radiao e que apresentam
menor deformabilidade a baixo stress. Este conhecimento fundamental pois o
eventual bloqueio de capilares poderia mostrar efeitos adversos ao uso de doses
maiores de radiao sobre as hemcias ou sangue, como demonstrado em
agregados qumicos de hemcias em mesentrio de ratos(Durussel etal, 1998).
Para melhor compreendermos o processo com um menor nmero de
protenas, passamos a estudar o citoesqueleto isolado da hemcia, atravs da
42
irradiao de gliosts purificados. Este tipo de abordagem j liavia sido estudado
por grupos anteriores, mas o nosso objetivo era caracterizar o tipo de alterao
encontrada para propormos um tipo de sondagem imunolgica que permitisse sua
identificao, mas com tcnica de menor complexidade e em clulas individuais.
Assim, nossos estudos de irradiao de ghosts de hemcias mostraram
degradao de algumas protenas de superfcie da hemcia, atravs de SDS-
PAGE. Entre estas destaca-se a banda 3 ou capnoforina, que apresentou
degradao especfica em nossos ensaios, por protelise dependente de
proteases contaminantes, livres ou agregadas a membrana eritroctica(Bartosz et
al, 1992) ou ainda pela prpria radiao, fenmeno j descrito por outros
autores(Rybczynska ef a/, 1996).
Independente destes fatores intervenientes, foi possvel demonstrar que a
in-adiao promovia, nas doses empregada, uma agregao dose dependente
das protenas da membrana da hemcias, diminuindo progressivamente a
proporo de protenas isoladas de baixo peso molecular, acompanhado do
aumento de um rastro de agregados proteicos de alto e variado peso molecular,
compostos principalmente por espectrina(Todo et al, 1982, Schuurtnuis et al
1984). Alguns autores sugeriram que as modificaes ocorridas eram
dependentes da interao entre os lipdios da membrana e suas protenas
integrais(Cantafora et al, 1988). Estes achados so