Universidade Federal de PelotasCentro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec

Graduação em BiotecnologiaDisciplina de BIOPROCESSOS

Profa. Dra. Patrícia S. Diaz

Preparo do Inóculo para o Processo Fermentativo

Industrial

Inóculo

Chama-se inóculo, pé-de-cuba ou pé-de-fermentação um volume de suspensão de microrganismos de concentração adequada capaz de garantir, em condições econômicas, a fermentação de um dado volume de mosto.

O volume de inóculo introduzido no fermentador está comumente ao redor de 5 a 10% de sua capacidade útil. No entanto, pode variar de 0,5 a 50%.

Sendo o volume de mosto a fermentar muito grande – alguns fermentadores com capacidade para 50.000 L – é necessário escalonar o inóculo inicial, aumentando-o, até atingir determinado volume, proporcional ao volume de mosto e contendo o número de células próximo da concentração ótima.

ATENÇÃO:O nome pé provém das práticas das destilarias, de reservarem para o

inóculo da fermentação seguinte todo o material sólido decantado, que separa ao final de cada fermentação, formando um depósito ou pé, contendo as leveduras floculadas, depositadas no fundo da dorna.

Processo utilizado na produção de cerveja!!!

Culturas “velhas” – fase lag grande

A técnica de preparo do inóculo inicial ou starter compreende duas fases: laboratório; industrial.

A cada passo, os microrganismos devem crescer rapidamente, sendo as transferências feitas na fase log de crescimento.

O número de transferências vai depender do volume útil do pré-fermentador (germinador).

Dependendo do volume do fermentador de produção, poderá ser necessário mais de um germinador.

Se o inóculo inicial estiver fora de escala - pequeno: demora excessiva no início da fermentação – fase lag; riscos de contaminação; inativação por osmo-repressão do mosto.

Classificação

Em escala industrial, muitos processos são adaptados com o objetivo de otimizar a produção. Os processos descontínuos são classificados de acordo com o modo como a inoculação é realizada em três grandes grupos:

1) Culturas puras - inoculação de uma dorna com um microrganismo que foi propagado a partir de uma cultura pura;

2) Recirculação do microrganismo - reaproveitam como inóculo o microrganismo da batelada anterior.

a) Sedimentação do microrganismo – destilarias de álcool;b) Separação das células por centrifugação.

3) Por meio de cortes - opera-se da seguinte maneira: inocula-se uma cuba (chamada de A), quando a fermentação atinge um determinado estágio, passa-se parte do conteúdo para uma dorna vazia (chamada B) e, em seguida, enchem-se as duas com meio de cultivo. Essa operação é chamada de cortes. Diz-se que a dorna A foi cortada para a dorna B.

Fluxograma do processo de fabricação de levedura para panificação

Crescimento Populacional:

É definido como o aumento do número, ou da massa microbiana.

Taxa de crescimento: é a variação no número ou massa por unidade de tempo.Tempo de geração: é o intervalo de tempo necessário para que uma célula se duplique.

O tempo de geração é variável para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos até dias, sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas.

O tempo de geração pode ser calculado quando uma cultura encontra-se em fase exponencial, pela fórmula abaixo:

N=No.2n

N número final de células No número inicial de célulasn número de gerações.

n= log(N) - log(No)/0.301

g = t/n

g tempo de geraçãot tempo de crescimento n determinado acima

Medidas do Crescimento Microbiano

O crescimento dos microrganismos pode ser mensurado por diferentes técnicas, tais como pelo acompanhamento da variação no número ou peso de células.

1) Contagem total de células:Esta metodologia envolve a contagem direta das células em um

microscópio, utilizando-se câmaras de contagem. A contagem direta é uma técnica rápida, mas tem como principais limitações a impossibilidade de distinção entre células vivas e mortas (o que pode ser contornado pelo uso de corantes vitais, para leveduras) e contagens errôneas, devido às pequenas dimensões de algumas células, ou pela formação de agregados celulares.

2) Contagem de células viáveis:

Procedimento também conhecido como contagem em placa, que estima o número de células viáveis – vivas - em uma amostra.

Esta metodologia envolve a coleta de alíquotas de uma cultura microbiana em diferentes tempos de crescimento, as quais são então inoculadas em meio sólido. Após a incubação dos meios, o número de colônias é contado.

Como uma colônia normalmente é originada a partir de um organismo, o total de colônias que se desenvolvem no meio corresponde ao número de células viáveis presentes na alíquota analisada.

3) Massa de células:

Pode ser determinada a partir da estimativa do peso seco ou do peso úmido de uma cultura. Este tipo de procedimento é realizado quando não é necessário determinar o número preciso de microrganismos presentes.

Peso seco: Muito utilizado na quantificação de fungos, onde o micélio é retirado da cultura, lavado e transferido para um frasco e submetido à secagem.

Realizam-se então sucessivas pesagens, até o momento onde não observa-se mais variações. Este procedimento pode também ser realizado centrifugando-se a cultura e pesando o sedimento, ou então secando-o e depois pesando.

4) Turbidimetria:

Quantificação em espectrofotômetro ou colorímetro a 660 nm, uma vez que neste comprimento de onda, a cor geralmente parda dos meios de cultura não interfere com os resultados.

Tal metodologia requer a confecção de uma curva padrão. Embora a análise turbidimétrica seja menos sensível, é de rápida e fácil execução. Entretanto, não permite a determinação de células viáveis.

5) Análises químicas:

A partir da quantificação de proteínas ou de nitrogênio, ou por meio da análise de diferentes atividades metabólicas.

Gráfico da quantidade de oxigênio dissolvido versus tempo na fermentação de Pichia pastoris X-33. Laboratório 4.

0 10 20 30 40 50

0

20

40

60

80

100

120

dO2

(%)

Tempo (h)

dO2

A quantidade de O2 dissolvido reflete a atividade metabólica do microrganismo durante a fermentação.