CULTIVO DE MICROORGANISMOS

EXIGNCIAS NUTRICIONAIS DOS MICROORGANISMOS Essenciais: gua Solvente universal para nutrientes Meio de cultura Atende s exigncias nutricionais e condies fsicas

Condies ambientes para estudo dos microorganismos 1. 2. Pode-se estudar os organismos no habitat natural (antrtica, oceanos, tratamento de esgoto etc). Pode cultiva-los em meio de cultura no laboratorio (crescimento in vitro). 3. Necessrio para identificao e caracterizao de propriedades fisiolgicas, bioqumicas e de crescimento.

Organismos no cultivveis (Fastidiosos) no so cultivados em meio artificial (exigncias nutricionais complexas e indefinidas) Necessrio cultivar in vivo (celulas ou hospedeiro vivo)

NUTRIO DOS MICROORGANISMOS Meio de cultura ideal: condies que simulam ou melhoram as condies naturais Elementos qumicos essenciais: carbono, nitrognio, hidrognio, oxignio, enxofre e fsforo Funes dos elementos qumicos essenciais 1. Carbono Compostos organicos (aucar, proteina, etc, e compostos inorganicos CO2) Funo celular: Esqueleto dos nutrientes orgnicos - carboidratos, lipdeos e protenas (que fornecem energia e formam a estrutura da clula) Microorganismos Heterotroficos: usam compostos orgnicos como principal fonte de carbono (fontes: meio ambiente, organismos autotrficos ou heterotrficos) Microorganismos Autotroficos: usam CO2 como fonte de carbono (precisam somente de moleculas inorganicas simples e ions do meio)

2. Nitrognio Parte essencial dos aminocidos (componente de peptideos e proteinas) Algumas bactrias fixam nitrognio atmosfrico, outras usam compostos inorgnicos (nitratos (NO3), nitritos (NO2), ou sais de NH3) e outras N orgnico (peptideos, aminoacidos)

3. Hidrognio e oxignio Parte de muitos compostos orgnicos

4. Enxofre Presente nos Aminoacidos cisteina, cistina e metionina

5. Fsforo Para sntese de cidos nucleicos a ATP (armazena e transfere energia)

6. Outros elementos essenciais (em quantidades menores) Na+ essencial para funo da enzima permease (transporta aucar atravs damembrana celular em E. coli) Fe2+ exemplo - cofator de enzimas catalases

7. Elementos trao (essenciais quantidades de mg/l) Zn2+, Cu2+, Mn2+, Mo6+, Co2+ - cofatores de enzimasExemplo: Nitrogenase usa Mo6+ como cofator Fixao de nitrognio: N2 Enzimas NH3

CLASSIFICAO DOS MICRORGANISMOS QUANTO FORMA DE NUTRIO

1. Quimiotrficos Organismos que utilizam compostos qumicos para obter energia

2. Fototrficos Organismos que utilizam energia radiante(Luz) para obter energia

CONSIDERANDO A FONTE DE CARBONO (AUTOTROFO / HETEROTROFO) - SURGEM 4 GRUPOS:A) Quimioautotrficos Utilizam substancias qumicas (inorgnicas) como fonte de energia (exemplos: H2S para Beggiatoa, S para Thiobacillus thiooxidans, NH3 para Nitrosomonas) e CO2 como fonte de carbono (exemplo bactria nitrificantes) B) Quimioheterotrficos Utilizam substncias qumicas (orgnicas) como fonte de energia e compostos orgnicos como fonte de carbono (maioria das bactrias, fungos, protozorios e animais) Saprofitas (vivem em material organico morto) e Parasitas (material organico vivo) C) Fotoautotrficos Utilizam a luz como fonte de energia e CO2 como fonte de carbono (bactria de enxofre verde e purpura, plantas, cianobacterias (Anabaena) D) Fotoheterotrficos Utilizam a luz como fonte de energia e compostos orgnicos como fonte de carbono (bactrias purpuras e verdes no-enxofradas)

Classificao nutricional NEM SEMPRE FIXA: Exemplo: Rhodospirillum rubrum Ausncia de O2 fotoheterotrofo O2 & escuro - quimioheterotrofoContem carotenoids para fotosintese

Exigencias nutricionais IMPORTANTE NA IDENTIFICAO DE M/Os Testes laboratorias - crescimento em meios, API ZYM identificar m/o em horas!!

These flexible systems identify around 2000 bacteria, yeast and fungal species based on their respiration in the presence of 95 carbon sources

FATORES FSICOS NECESSRIOS AO CRESCIMENTO Temperatura, pH, atmosfera gasosa e presso osmotica 1. Temperatura Maioria dos microorganismos crescem nas temperaturas ideais para seres humanos Microorganismos crescem em uma amplitude grande de temperaturas: Exemplos: Bacillus subtilis 8 53 oC, Neisseria gonorrhoeae 30 40 oC Taxa de crescimento = No divises celulares/hora (Dobra para cada aumento de 10 oC, na faixa de temperatura ideal) Temperatura tima de crescimento: temperatura na qual o m/o cresce mais rapido Temperaturas cardinais: Temperaturas de crescimento mnima, otima e maxima (variam com estagio da vida, contedo nutricional do meio de cultura) Temperatura tima: perto da temperatura maxima (no a mdia entre mnima e mxima!!) Reflete o aumento na velocidade das reaes enzimticas at o ponto que o calor danifica as enzimas)

CLASSIFICAO DE BACTRIAS QUANTO HABILIDADE DE CRESCER EM TEMPERATURAS EXTREMAS Psicrfilas crescem em temperaturas baixas Psicrotroficas crescem em temperaturas baixas at moderadas Mesofilas crescem em temperaturas moderadas Termofilas crescem em temperaturas altas

Psicrfilos Mnima 10 C, tima +15 C, mxima +20 C Habitat: Profundezas dos oceanos, regio rtica Psicrotrficos Mnima 0 C, tima + 20 C, mxima +30 C Habitat: Refrigeradores degradao de alimentos Exemplo Listeria

Mesfilos Mnima 10 C, tima 25 37 C, mxima 40 C Habitat: degradao de alimentos, patogenos de animais e plantas, saprfitos Termfilos Mnima 40 C, tima 50 60 C, mxima 70 C Habitat: guas termais, compostos orgnicos Termfilos extremos / hipertermfilos Archaea temperatura tima de 80 C, mxima 110 C Habitat: guas quentes em regioes vulcnicas

2. POTENCIAL HIDROGENINICO (pH) pH otimo mdia entre pH mximo e mnimo Bem definido para cada espcie Microorganismos mantm pH ~7.5 dentro da celula (mesmo que o pH externo seja bem cido ou bsico) Controle pela expulso ou absoro de ions de hidrognio pela clula Exemplos de ambientes extremos com microorganismos: guas de escoamento de solos vulcnicos e minas pH 1 3 guas de nescentes pH 10 Solos com amnia pH 11 Oceanos pH 8 guas polares pH 6 (com CO2 dissolvido)

Bactrias: Valor de pH para Maioria de bactrias: Mnimo 4, mdia 7, mximo 9 Exemplos de bacterias resistentes aos extremos de pH Bacillus pH 11, Thiobacillus pH 0,5 Fungos e leveduras: Variao de pH mais extensa que bactrias pH timo 5 6 Protozorios: pH timo 6.7 7.7 Algas: pH timo 4 8.5 Meios de cultura e pH: O crescimento de um m/o no meio de cultura pode alterar o pH do meio levando inibio do crescimento Soluo: adicionar um tampo ao meio

3. ATMOSFERA GASOSA No habitat natural os microorganismos necessitam de concentraes diferentes de O2, CO2, N2, CH4 No laboratrio - necessrio fornecer estes gases em concentraes apropriadas CO2 & O2: os dois gases principais que afetam o crescimento de m/os 4 grupos fisiolgicos de m/os, em termos de resposta ao oxignio: A. M/Os aerbios B. M/Os microaerfilos C. M/Os facultativos D. M/Os anaerbios

1.

Microorganismos aerbios Precisam de O2 em concentraoes normais (atmosfera de 21% O2). Adquirem mais energia dos nutrientes no meio do que anaerbios. Em meios slidos crescem sem problemas, mas em meios lquidos precisam de agitao para aumentar o O2 dissolvido no meio. Exemplos: Fungos filamentosos e bactrias Legionella, Mycobacterium

2.

Microorganismos facultativos Crescem na presena de O2 (aerobicamente) ou na ausncia de O2 (anaerobicamente), quando realizam o processo metablico da fermentao. Exemplos: Enterobacteriaceae como E. Coli e leveduras como Saccharomyces

3.

Microorganismos anaerbios No utilizam O2 na produo de energia No crescem na presena de O2 (O2 txico - causa morte da clula) M/Os anaerbios que toleram baixas concentraes de O2: C. perfringens, C. tetani M/Os no tolerantes (anaerbios estritos): Methanobacterium, Methanospirillum

Causa de toxicidade de O2: Reaes qumicas com O2 podem produzir: Radicais superxido O2- (danificam celulas) Perxido de Hidrognio H2O2 (Da origem aos radicais hidroxilas) Radicais hidroxila OH-2 (danificam celulas) M/Os aerbios tem mecanismos de proteo: Enzima superxido dismutase - elimina Radicais superxidos O2 Enzimas Catalase & peroxidase - metabolizam o H2O2, e OH no acumula 4.

Microorganismos Microaerfilos Utilizam O2 nas reaes quimicas para produo de energia Toleram concentraes de O2 mais baixas que os aerbios (1 - 15%) Exemplo: Campylobacter jejuni - diarria

4. Presso osmtica A fora com a qual a gua se move atravs da membrana citoplasmtica de uma soluo com baixa conc de substncias (solutos) para soluo com alta concentrao. Soluo isotnica fora e dentro da clula: fluxo de gua para dentro e fora da clula em equilbrio clula cresce normalmente Soluo hipertnica fora da celula: clula perde gua, crescimento inibido (ex: alimentos salgados). Soluo hipotnica fora da clula: gua flui para dentro da clula e a membrana se rompe.Presso hidrosttica: Presso exercida nas clulas pelo peso da gua na superfcie. Exemplo: m/os no fundo do oceano Barfilos - 2500m abaixo presso = 250bars (250 x mais que atmosfrica). No crescem no laboratrio porque vesiculas de gas intracelulares se expandem celula se rompe.

Meios de cultura para crescimento de microorganismosMeio de cultura: qualquer substrato que utilizado para o crescimento. Usado para cultivar microorganismos no laboratrio e revelar a identidade dos mesmos. Preparados usando meios desidratados, ou meios prontos para uso. Muitos meios comerciais disponveis: dependem das necessidades nutricionais dos microorganismos, origem do material, e a espcie que se imagina estar presente Meio estril livre de qualquer forma de vida. Esterilizado por aquecimento at uma temperatura suficiente para destruir todos os microorganismos potencialmente contaminantes.

Agar: Agente solidificante. Polissacardeo complexo obtido a partir de algas marinhas. Permanece solido (porque poucos mos podem degradar o agar). Solidifica em temperaturas abaixo de 40 C.

1.

Meios quimicamente definidos: Composio qumica exata e conhecida Precisa de: fonte de energia, carbono, nitrognio, enxofre, fsforo, e fatores orgnicos necessrios e que no no sintetizados pelos microorganismos. Microorganismos Fastidiosos - muito exigentes em termos nutricionais por exemplo Neisseria e Lactobacillus

2.

Meios complexos Para o cultivo de rotina no laboratrio usamos meios de cultura complexos (preparados a partir de produtos naturais (quimicamente indefinidos)). Exemplos de produtos naturais adicionados: extrato de levedura, de carne, de planta. Menos controle sobre as concentraes exatas de componentes qumicos. Para crescimento de microorganismos heterotroficos / organotroficos (requer uma fonte orgnica decarbono). Componente protico (peptonas = pequenas cadeias de aminoacidos) fornece a energia, carbono, nitrognio e enxofre que podem ser metabolizados pelas bactrias.

MEIOS PARA CULTIVO DE BACTRIAS Ideal: Imitar o habitat natural. Exemplos: Meio com sangue para bactrias que utilizam nutrientes presentes no sangue. Meio com aucar para bactrias que ocupam um nicho com glicose. Fotoautotrofico precisa de luz no ambiente de crescimento, CO2, agua e ions inorgnicos. Quimioautotrofico - Mesmas exigncias nutricionais, porm sem luz. Meio quimicamente definido para quimioautotrofo: Ingrediente (NH4)2SO4 NaHCO3 Na2HPO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O FeCl3.6H2O CaCl2.2H2O Agua Fonte de quantidade nitrogenio, energia 0,5g Carbono (CO2) em soluo 0,5g Ions essenciais 13,5g Ions essenciais 0,7g Ions essenciais 0,1g Ions essenciais 0,014g Ions essenciais 0,18g Solvente 1,000ml

Meio quimicamente definido para um bactria quimioheterotrofica: (exemplo E. coli - precisa somente 1 fonte de C organico (no fastidioso)) Ingrediente Glicose NH4H2PO4 K2HPO4 NaCl MgSO4.7H2O Agua Fonte de quantidade Energia, carbono 1g nitrogenio, ions essenciais 5g Ions essenciais 1g Ions essenciais 5g Ions essenciais 0,2g Solvente 1,000ml

Meio complexo para bactria quimioheterotrofica fastidioso - Caldo Nutriente (Definio "Fastidioso" - Bactria que precisa de muitos aminoacidos e vitaminas para crescer) Ingrediente Extrato de carne Peptona NaCl Agua Fonte de quantidade carbohidrato, nitrogenio,vitaminas 3g nitrogenio, vitaminas 5g Ions, condies osmticas certas 8g Solvente 1,000ml

(Adiciona 15g de agar = Agar Nutriente)

Bacterias mais fastidiosas Usa meios complexos contendo por exemplo Sangue ou soro animal Bacterias no cultivveis - super fastidiosas pode-se cultivar em culturas de celulas - eg Treponema pallidum - celulas de coelho. Meios para cultivo de Fungos

Todos os fungos so heterotrofos (Pouco at muito fastidiosos) Mais aucar do que meios para bacterias Mais cido (pH 3.8 - 5.6) do que os meios para bacterias (pH 6,5 - 7.5) Observao disso na natureza: Bacterias contaminam carne e leite Fungos contaminam frutas citricas, gelias

Meio complexo geral para crescimento de fungos - Sabouraud agar Ingrediente Fonte de quantidade Peptona Carbono, nitrognio, elementos 10g Glicose Carbono e energia (alta conc para favorecer fungos) 40g gua Solvente 1,000g PH Baixo (para favorecer fungos)

Meios para Anaerbicos Oxignio pode causar morte de bactrias anaerbicas Usa MEIOS REDUTORES Contem reagentes como tioglicolato de sdio se combina com oxignio eliminando-o do ambiente Usa tubos com tampas seladoras Usa jarras para placas: com bicarbonato de sdio e boroidreto de sdio (na presena de gua liberam CO2 e H2) com o catalisador paladio (Hidrognio + oxignio H2O) Quando muitos organismos anaerbicos usa capela com gs inerte

Meios de cultivo seletivo e diferencial Comum na microbiologia clnica e sade pblica Favorece o crescimento da bactria de interesse Impede o crescimento de outras bactrias Exemplos: Meio sulfeto de bismuto para isolamento do bacterium Salmonella typhi (causador de tifo), a partir de fezes Meio Sabouraud dextrose agar pH 5.6 favorece mais os fungos que bactrias Meios com acido lctico favorecem fungos basidiomicetos Ganoderma por exemplo Meio Diferencial Usado para identificar mos de interesse, quando existem outras microorganismos na placa. Por exemplo: Agar-sangue para identificao de Streptococcus pyogenes (atravs da hemolise das clulas sangneas) (causador de infees de garganta) Agar-sal manitol para identificao de Staphylococcus aureus (nas fossas nasais), contem alta concentrao de cloreto de sdio (S.aureus agenta alta concentrao de sal) contm indicador de pH (S. aureus fermenta carboidrato para acido, formando uma cor diferente do meio) Agar MacConkey com sais biliares, cristal violeta, e lactose inibio de Gram positivos, e diferencial para os que fermentam lactose

Meio de enriquecimento Para isolamento de bactria em baixas concentraes, na presena de outras em altas concentraes Exemplos de amostras: fazes, solo Teoria: estimular o crescimento do organismo de interesse, num meio seletivo, varias vezes, ate s ele estar presente no final, em quantidades detectveis Exemplo: meio lquido com fenol (letal para maioria das bactrias)

PRESERVAO DE CULTURAS PURASIsolar microorganism os e preservar por tem po suficiente para estud-lo Mtodos Curto prazo: 4 C na geladeira Transferncia regular para novo meio de cultura Longo Prazo Nitrognio liquido (196 C) Freezer (-80 ate 120 C) Liofilizao (congelamento a seco) (desidrata a am ostra enquanto esta congelada)

Colees de microrganismos Importante quando: Quer identificar um microorganismo raro Quer escolher um microorganismo para ensino etc. Quer comparar seu microorganismo e um mutante de um outro Quer comparar a diferena gentica entre sua populao e outras (filogenia etc.) Quer buscar genes candidatos Quer simplesmente preservar colees de diversidade Duas colees internacionais: ATCC American type culture collection (>9500 especies depositadas) CABI Bioscience (IMI) (UK)

CRESCIMENTO DE CULTURAS BACTERIANAS Crescimento bacteriano= o aumento de nmero de indivduos (no o crescimento celular) Diviso por fisso binria Aumento exponencial 1, 2, 4, 8, 16, 32 etc ( = 2numero de geraes) (porque celula se divide em 2)

TEMPO DE GERAO: Tempo necessario para uma celula se dividir (= populao dobrar de tamanho) Depende de: Organismo Condies ambientais Maioria das bactrias: 1- 3 horas Algumas Bacterias: 24 horas E. coli: 20 minutos Clculo do nmero final de clulas numero de geraes Numero inicial de celulas x 2 = numero de clulas Eg: 5 clulas se dividem 9 vezes: 9 5 X 2 = 2560 clulas

CURVA DE CRESCIMENTO BACTERIANO Objetivo: contagem da populao em intervalos de tempo aps a inoculao. 4 fases: 1. Lag 2. Log 3. Estacionria 4. Declneo ou morte celular

1. Fase Lag ou latente Bacterias no se reproduzem imediatamente depois de inocular um novo meio O que esta acontecendo? : sintese de DNA, expresso gnica e produo de enzimas necessarias ao metabolismo Durao: 1 hora at dias 2. Fase Log / crescimento exponencial Diviso celular Aumento logarithmico Tempo de gerao atinge um valor constante Perodo de maior atividade metablica da clula Melhor estgio para fins industriais mais eficiente

3. Fase estacionria Depois do crescimento exponencial acumulao de celulas Velocidade de crescimento diminui Numero de celulas mortas = numero de celulas novas = populao estavel Atividade metablica decresce Causas: Exausto de nutrientes Acmulo de produtos de degradao Mudanas no pH 4. Fase de Declneo / morte celular Numero de clulas mortas excede o de celulas novas Continua at a populao desaparecer totalmente

QUANTIFICAO DO CRESCIMENTO BACTERIANO 1. CONTAGEM EM PLACA Mtodo mais comum - demora 24 horas para colonias crescerem na placa (Nao serve na industria de alimentos ex: leite no pode esperar 24 horas) 3 principios bsicos: 1. Cada colnia surge do crescimento de uma bacteria 2. Inculo original e bem homogeneo 3. No existe agregao de celulas Ideal: crescimento de nmero limitado na placa (25 - 250 colonias) No ideal: muitas colnias e saturao da placa impossvel contar Para garantir numero de colnias na faixa desejada: Diluio seriada do inculo, e depois a) Pour plate ou b) Espalhamento em placa

a) Pour plate Diluio do inculo para placa de petri Adiciona meio solido derretido (50 C) Deixar solidificar Incubar na temperatura ideal Problemas: no serve para m/os sensveis ao calor no serve para m/os que identifica usando morfologia da colonia na superficie do meio (ficam dentro) b) Espalhamento em placa Alternativo ao pour plate Inculo adicionado ao superfcie do meio slido Espalhado com ala de grigalski Incubao e contagem

Filtrao Usado com liquidos contaminados com poucas bacterias Exemplos: gua potvel, lagos E. coli (poluio fecal) Passagem de 100ml de liquido numa membrana de filtro com poros pequenos (retm as bactrias) Filtro (com bacterias) incubado no superficie de um meio liquido em placa de petri Contagem direta

CONTAGEM DIRETA NO M ICROSCPIO Lm ina especialm ente adaptada Petroff Hausser Determ ina o num ero de clulas em um rea conhecida (quadrado grande) Multiplicado por 1250000 = nm ero clulas por m l

TURBIDIMETRIA Bactrias multiplicam meio liquido fica turbido (com alta densidade de celulas) Tubidez medida com espectrofotmetro Feixe de luz transmitido atravs da suspenso para clula fotoeltrica Mais crescimento bacteriano = menos luz atinge a clula fotoeltrica, medida como absorbncia ou densidade tica (OD) indicador de concentrao de clulas bacterianas na soluo

Tcnicas de cultura puraNaturalmente microorganismos existem em culturas mistas (muitas espcies diferentes ocupando o mesmo ambiente) Para caracterizar e identificar microorganismo deve estar em cultura pura (todas as clulas na populao idnticas (originaram de uma mesma clula parental))

TCNICAS ASSPTICAS PARA CULTURA PURA(PROCEDIMENTOS PARA TRANSFERNCIA DE MICROORGANISMOS)

1. Esterilizar a ala Flambar a ala num ngulo no bico de bunsen at ficar incandescente Sempre segurar a ala (para evitar uma contaminao) Deixar esfriar por alguns segundos (para no matar o inculo!!) 2. Transferncia do inoculo Remoo de uma cultura liquida Segurar o tubo numa mo, e a ala na outra Remover a tampa com dedinho da mo segurando a ala Nunca colocar a tampa na bancada vai ficar contaminada Flambar a abertura do tubo (causa uma corrente forcando ar fora do tubo) Inserir a ala para tirar um pouco inculo Flambar a abertura do tubo Repor a tampa

Remoo de uma cultura de uma placa Flambar a ala num ngulo no bico de bunsen at ficar laranja Abra a tampa da placa de petri Colocar ala no agar fora da cultura (para resfriar) Tirar um pouco inculo Transferncia do inoculo para meio estril Para um meio liquido Tirar a tampa com dedinho Flambar a abertura do tubo Colocar o inculo no tubo Repor a tampa Re-esterilizar a ala, flambando no bico de bunsen Para um meio solido Abrir a tampa da placa o suficiente para inserir a ala Riscar a ala na superfcie da placa (para espalhar o inculo) Tirar a ala e fechar a tampa Re-esterilizar a ala, flambando no bico de bunsen

QUESTES PARA TESTINHO PRXIMA AULA

1 Diferencie os microrganismos quanto sua forma de obteno de energia e carbono. 2 Explique os tipos de microrganismos quanto ao seu consumo de O2 . 3 Explique as fases de crescimento da bactria.