A mitocôndria como alvo de toxicidade

Crise bioenergética induzida por xenobióticos

MECHANISTIC TOXICOLOGY. The molecular basis of how

chemicals disrupt biological targets. Boelsterli, U.A., Taylor &

Francis, London, 2005.

Cap. 15: Disruption of cellular energy production by xenobiotics.

A mitocôndria como alvo de toxicidade 2

A mitocôndria como alvo de toxicidade

Locais de acção de xenobióticos 3

A mitocôndria como alvo de toxicidade 4

A membrana interna mitocondrial é um alvo frequente da

toxicidade de xenobióticos.

3 aspectos toxicologicamente relevantes :

1. A composição lipídica peculiar da membrana

mitocondrial interna: cardiolipina.

2. potencial transmembranar gerado pela respiração

mitocondrial (negativo no interior)

3. Poro de permeabilidade transitória

A mitocôndria como alvo de toxicidade 5

Aspectos toxicologicamente relevantes:

3. Poro de permeabilidade transitória

Mega-canal composto por

complexos proteicos, atravessando

membranas mitocondriais interna

e externa.

Normalmente, baixa condutância:

gradiente de H+ é mantido.

Alta condutância:

�colapso do potencial

transmembranar e

�libertação de moléculas

sinalizadoras para citosol (cit c)--

apoptose.

Actividade protonoforética e dissociadora (uncoupling) 6

Exs: FCCP e

DNP

Actividade protonoforética e dissociadora (uncoupling) 7

UCPs promovem dissociação moderada

da fosforilação oxidativa

Actividade protonoforética e dissociadora (uncoupling) 8

UCPs

[ácidos gordos] é regulada

hormonalmente

(noradrenalina)

Inibição do sistema de transporte de electrões 9

O fluxo de electrões pode ser

inibido em vários pontos da

cadeia de transferência de

electrões

Dois tipos de inibidores:

1) bloqueiam transporte de electrões, ligando-se a um componente da cadeia (rotenona,

cianeto);

2) estimulam fluxo de electrões na parte inicial da cadeia, mas captam-nos a determinado

nível, desviando-os da sua via normal (agentes promotores de ciclo redox, como

doxorubicina).

Inibição do sistema de transporte de electrões 10Inibidores que bloqueiam transporte de electrões, ligando-se a um componente específico

da cadeia.

Inibição do sistema de transporte de electrões 11

Inibição do sistema de transporte de electrões e aumento da geração de ROS 12

Inibidores que estimulam fluxo de electrões na parte inicial da cadeia, mas captam-

nos e desviam-nos da sua via normal. O caso da DOXORUBICINA.

DXR

Complexo I (NADH:ubiquinona oxidoredutase) alvo frequente da acção de

compostos que desviam os electrões do seu fluxo normal, actuando como

receptores de electrões.

Consequências: decréscimo da produção de energia e “stresse redutor”

Inibição do sistema de transporte de electrões e aumento da geração de ROS 13

O caso da

DOXORUBICINA

Geração de ROS, um mecanismo utilizado por alguns fármacos para favorecer a morte programada de células

cancerígenas 14

As células cancerígenas têm uma capacidade anti-oxidante muito inferior às células

normais; são, por isso, mais susceptíveis a agentes que elevam o stresse oxidativo.

Apoptose 15

Após recepção do sinal que desencadeia a apoptose1º evento: activação de CASPASES

-

Caspases iniciadoras

Activadoras de outras caspases

Caspases efectoras

Actuam em constituintes celulares

Caspases e pro-caspases 16

Acção de endonucleases activadas por caspases 17

Clivagem internucleossomal de DNA1ª alteração morfológica:

condensação da cromatina

Mecanismos gerais de apoptose 18

min. 3H

Como reconhecem os macrófagos a célula destinada a

sofrer apoptose? PS no lado externo da membrana celular.

Apoptose: duas vias distintas 19dependendo do tipo de célula e do sinal iniciador

O Papel da mitocôndria na apoptose 20

Mitocôndria sequestra arsenal de

proteínas pro-apoptóticas (AIF,

Smac/DIABLO, citocromo c)

O papel da mitocôndria na apoptose 21

A mitocôndria papel-chave na apoptose porque liberta factores que activam os eventos subsequentes.

Isto pode acontecer após activação do receptor de morte (via extrínseca) ou após estímulos internos

(via intrínseca). O stresse oxidativo é um evento importante desencadeador de apoptose.

O Papel do citocromo c na apoptose 22

Apoptose induzida por xenobióticos 23

Localização da Cardiolipina na Membrana Mitocondrial 24

A deficiência em CL e a diminuição da peroxidação de CL estão associadas com o aumento da resistência a estímulos pró-apoptóticos.

Interacção da Cardiolipina com o Citocromo c 25Caspase-8

BH3

A CL oxidada pode criar instabilidade transitória da

membrana mitocondrial, favorecendo a libertação de Cit. c

Localização da Cardiolipina na Membrana Mitocondrial 26

CL + PE (são os fosfolípidos maioritários nos

locais de contacto entre MMI e MME)

Formação de fases não lamelares podem

favorecer acesso de CL a face citosólica da

mitocôndria para ancorar tBid

proteínas Bcl-2 e inibidores de COX-2 27

Família de proteínas Bcl-2 e relação com poro de permeabilidade

transitória da membrana mitocondrial 28

Bcl-2 mantém MPTP no estado encerrado e inibe libertação de cit c;

Bax conduz à abertura do poro promovendo a apoptose.

O que é o poro de permeabilidade transitória da membrana mitocondrial

29

É um complexo proteico, composto por várias proteínas:

VDAC (canal aniónico dependente de voltagem), na membrana externa;

translocador de ADP/ATP, na membrana interna;

ciclofilina D,

outras proteínas acessórias.

Função fisiológica do poro: regular

Ca2+ intramitocondrial?!

Ionóforos de Ca 2+ adicionados a células

em cultura---aumento de Ca2+

mitocondrial---abertura do poro.

O stresse oxidativo é um importante indutor da

abertura do poro de permeabilidade transitória

da membrana mitocondrial 30

Muitos xenobióticos causadores de stresse oxidativo

(directamente, por darem lugar a ROS ou indirectamente, por

baixarem as defesas anti-oxidantes)

induzem a abertura do poro e a apoptose ou necrose.

Learning points 31

�A toxicidade mitocondrial induzida por xenobióticos pode ter por base vários mecanismos, todos os quais conduzem, por último, a um decréscimo da produção de ATP e a uma crise energética para a célula. Locais de interferência com a função mitocondrial

incluem disponibilidade de substratos e de oxigénio, ciclo de Krebs e produção de NADH,

transporte de electrões e ejecção de protões, síntese de ATP conduzida pela ATP sintetase.

�A dissociação da fosforilação oxidativa pode ser induzida por protonóforos que reconduzem os protões extruídos no espaço intermembranar para a matriz mitocondrial,

conduzindo um ciclo fútil.

�A inibição do transporte de electrões ao nível do Complexo I pode desviar os electrões e resultar na produção de ROS. Isto potencialmente conduz a dano oxidativo do DNAmitocondrial muito susceptível.

�Doxorubicina pode injuriar o músculo cardíaco devido a ter uma alta afinidade por cardolipina mitocondrial e poder iniciar um ciclo redox.

�O stresse oxidativo e outras formas de stresse induzido por compostos químicos pode levar à abertura do poro de permeabilidade transitória mitocondrial, com colapso do potencial membranar da mitocôndria, esgotamento do ATP e facilitando a libertação de factores pro-apoptóticos.

Abordagens técnicas ao estudo da

função mitocondrial sob o efeito

de xenobióticos

Bioquímica, Voet & Voet, 3ª Ed.,2004

e protocolos das aulas práticas

Avaliação do funcionamento da cadeia mitocondrial de transporte de electrões, por medida do consumo de oxigénio

em câmara fechada (eléctrodo de oxigénio) 33

Estabelecimento da sequência de complexos transportadores de electrões por bloqueamento do fluxo de electrões com

inibidores selectivos da cadeia mitocondrial 34

A fosforilação e a oxidação estão estreitamente associadas 35

ADP

Tempo

∆O2

Estado 4

Estado 3

Estado 4

veloc consumo O2 est.3

veloc consumo O2 est.4ICR =

Estequiometria da oxidação associada à fosforilação 36

Razão ADP/O = ATP sintetizado por átomo de Oxigénio reduzido (par de electrões captado)

Efeito de dissociadores da fosforilação oxidativa 37

[O2]≈0

ADPFCCP

FCCP

ADP

oligomicina

FCCP

Efeitos tóxicos de xenobióticos no potencial transmembranar mitocondrial 38

Registos típicos do potencial

transmembranar mitocondrial suportado

por succinato, na ausência e na presença de

metopreno nas concentrações indicadas.

Efeito do metopreno no potencial

transmembranar mitocondrial. O parâmetro

“Energização inicial” refere-se ao potencial

obtido para cada experiência, imediatamente

antes de adicionar o metopreno.

Efeitos de xenobióticos na indução da abertura do poro de

permeabilidade transitória mitocondrial induzida por Ca2+ 39

Decréscim

o da pseudo-

absorvência

intumescim

ento