a doença de chagas...para meu crescimento profissional e pessoal. ao professor washington tafuri em...

Universidade Federal de Ouro Preto Instituto de Ciências Exatas e Biológicas

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas

INFLUÊNCIA DA UTILIZAÇÃO DA DESFERRIOXAMINA, QUELANTE DE FERRO,

SOBRE O CURSO DA INFECÇÃO PELO Trypanosoma cruzi EM CAMUNDONGOS

Jerusa Marilda Arantes

0uro Preto, MG 2006

INFLUÊNCIA DA UTILIZAÇÃO DA DESFERRIOXAMINA, QUELANTE DE FERRO,

SOBRE O CURSO DA INFECÇÃO PELO Trypanosoma cruzi EM CAMUNDONGOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração Imunoparasitologia de Protozoários. Orientadora: Profa Cláudia Martins Carneiro Co-Orientadora: Profa Maria Lúcia Pedrosa

Ouro Preto, MG 2006

ARANTES, J.M. Agradecimentos

i

A Deus,

“ Que em sua infinita bondade, e pela força que age sobre nós, podendo fazer muito

mais do que pedimos ou imaginamos, agradeço por ter me dado coragem de

conquistar meus objetivos e de me acalentar nos momentos de fraqueza. A ti ofereço

minha vida.....”

A minha mãe e a minha avó,

A quem devo toda a minha gratidão e que desde minha infância, incentivaram-me a

estudar sempre. Sou grata pelo amor, carinho e confiança em mim depositada.

Obrigada por serem exemplos de dignidade e fortaleza, sempre me mostrando os fatos

e a vida como realmente são e nunca me deixando desistir.

A minha querida irmã,

Pelo carinho e pelo apoio de sempre. Por todas as vezes que mesmo sem dominar

muito bem o assunto, ficava me olhando, ouvindo, dando conselhos e sugestões.


ii

À professora Cláudia, pela orientação dedicada e compreensiva que influenciou de

forma decisiva a conclusão deste trabalho e pelo apoio, ensinamento e incentivo em

importantes etapas da minha formação profissional. Obrigada por esta convivência

mais que agradável, onde eu pude aprender que competência, aprendizagem e

liderança somente fazem sentido se vierem acompanhadas de gentileza, atenção, bom

humor e principalmente amizade.

À Maria Chaves, agradeço pela disponibilidade com que me acolheu no laboratório,

pela acessibilidade, competência com que me ensinou tudo o que sei de técnicas

histopatológicas. Pela amizade, paciência e pelas conversas que muito contribuíram

para meu crescimento profissional e pessoal.

Ao professor Washington Tafuri em especial, que desde a minha monografia de

conclusão de curso, acreditou e apoiou a continuidade do projeto com fantásticas

sugestões. Pelo enorme carinho, respeito e incentivo áqueles que estão apenas

começando a seguir a enorme estrada por ele trilhada.

Ao amigo Vitor, pela grande amizade, companheirismo, lealdade em todos estes anos

de convivência no laboratório. Pela cumplicidade e alegria que dividimos em todas as

etapas da nossa formação profissional. Muito obrigada por tudo.

À professora Maria Lúcia, pela oportunidade e confiança a mim depositada. Pela co-

orientação dedicada, enriquecedora e compreensiva e pelo decisivo estímulo à

conclusão deste trabalho.

Aos meus queridos amigos do laboratório de Histopatologia, Ana Luíza, Amanda,

Carolina, Fernanda, Juliana Santiago, Juliana Vitoriano, Vanessa, Sheler, Tália, Nádia,

Wendel, Rodrigo, Bruno e Rodolfo que me apoiaram no desenvolvimento do trabalho e

pela contribuição de cada um em algum momento. Pela agradável convivência,

amizade e compreensão.

Agradeço a todos que direta ou indiretamente participaram da realização deste

trabalho, em especial a Vanessa, Maísa, Daniela, Amanda, Hélen, Arnaldo, Lílian,


iii

Geovan, Jaqueline que foram imprescindíveis para a execução do mesmo. A minha

mais profunda gratidão.

A todos os professores e colegas de pós-graduação que de diversas maneiras

colaboraram para a viabilização deste trabalho. Em especial a Dani, Arlete, Vitor,

Lizziane, Maísa, Darlen, Michele e André pelo carinho, apoio e amizade.

A professora Terezinha pelo inóculo dos animais.

Ao professor Alexandre e a professora Marta de Lana pela agradável convivência,

sugestões e incentivo.

A Hélen, Lêda, professora Marta e amigos do laboratório de histopatologia pelas

enriquecedoras sugestões feitas durante a análise prévia.

Ao professor Marcelo Silva, funcionários e alunos do laboratório de Nutrição

Experimental da Escola de Nutrição da Universidade Federal de Ouro Preto pelo

acolhimento e apoio durante a execução do trabalho.

A todos os funcionários do Biotério da Universidade Federal de Ouro Preto que

apoiaram a realização deste trabalho, em especial, Cristina e Marcos pela amizade e

apoio constante.

Á Cida, secretária do Nupeb, pela disponibilidade, sempre.

Ao Fábio, por todas as vezes que tivemos que deixar de lado algo que faz de nossas

vidas momentos saudáveis e felizes. Agradeço-te pela compreensão, paciência,

carinho, amizade e pelo incentivo dado a cada momento.

ARANTES, J.M. Resumo

iv

Utilizaram-se camundongos Swiss machos com trinta dias de idade, divididos em

quatro grupos experimentais: (1) controle não-tratado - CNT; (2) controle tratado - CT;

(3) infectado com a cepa Y do T. cruzi e não-tratado - INT e (4) infectado com a cepa Y

do T. cruzi e tratado - IT. Os animais tratados receberam 5mg/animal/dia de

Desferrioxamina (DFA) durante os 14 dias que precederam a infecção (500 formas

sanguíneas da cepa Y do T. cruzi via intraperitoneal). Após a infecção, o grupo IT

recebeu DFA por mais 21 dias. Nos grupos infectados, tratados ou não, avaliaram-se a

curva de parasitemia diária, período pré-patente, patente, pico de parasitemia, dia do

pico de parasitemia, taxa de mortalidade, e nos animais que sobreviveram à fase

aguda da infecção, hemocultura, PCR e ELISA. Nos quatro grupos experimentais

foram realizadas a dosagem de ferro no fígado, ferro sérico e hemoglobina. Avaliou-se

também o peso dos animais, o peso relativo do coração, fígado, baço e linfonodo e as

alterações histopatológicas, bem como o parasitismo tecidual nestes órgãos. Os

animais foram necropsiados no 14o e 21o dia após a infecção (DAI). No grupo IT, a

média dos níveis de parasitemia, a taxa de mortalidade apresentaram-se menores em

relação ao grupo INT. Não foram observadas diferenças significativas no período pré-

patente. O pico de parasitemia no grupo INT foi no 11o dia e no grupo IT no 10o. O

período patente no grupo INT (11 dias) foi significativamente menor que no grupo IT

(21 dias). Cinco animais do grupo IT e 1 animal do grupo INT sobreviveram à infecção.

Todos os animais tratados apresentaram hemocultura negativa na fase aguda e crônica

da infecção enquanto o animal não-tratado apresentou hemocultura positiva nas duas

fases. A PCR apresentou-se positiva em todos os animais tratados avaliados aos 60

DAI e 3 destes apresentaram PCR negativa aos 240 DAI. O animal infectado e não-

tratado apresentou PCR positiva aos 60 e 240. Todos os animais apresentaram ELISA

positiva aos 60 e 240 DAI. Os animais infectados apresentaram menores níveis de

ferro no fígado que os animais não-infectados no 14o e 21o DAI. Os animais do grupo

INT apresentaram maiores concentrações de ferro sérico quando comparados aos

animais dos grupos CNT e IT no 21o DAI. No 14o DAI, os animais do grupo IT

apresentaram níveis mais baixos de hemoglobina quando comparados ao grupo CT. O

tratamento com a DFA reduziu o peso corporal dos animais infectados ou não. Entre o

14o e 21o DAI, observou-se aumento de peso relativo do coração, baço, fígado e

linfonodo apenas no grupo INT. Os animais infectados, tratados ou não apresentaram

alterações histológicas semelhantes no coração. O fígado dos animais do grupo IT,

apresentou menor intensidade de alterações e a avaliação dos órgãos linfóides

ARANTES, J.M. Resumo

v

demonstrou resposta mais precoce no grupo IT. Não foram observadas diferenças em

relação ao parasitismo tecidual nos órgãos analizados dos animais infectados, tratados

ou não com DFA. Estes resultados demonstram que a diminuição dos níveis de ferro

do hospedeiro contribui para a melhora do quadro clínico da infecção.

ARANTES, J.M. Abstract

vi

Male Swiss mice with thirty days of age, were divided in four experimental groups: (1)

no-treated control - NTC; (2) treated control - TC; (3) no-treated and infected with Y

strain of T. cruzi - NTI; (4) treated and infected with Y strain of T. cruzi - TI. Animals

treated received daily doses (5mg/animal/day) of desferrioxamine (DF) during 14 days

before the infection (500 blood forms of Y strain of T. cruzi via intraperitoneal). After

infection, treated groups received DF for more 21 days. In TI and NTI groups

parasitaemia, prepatent period, patent period, day of maximum parasitemia mortality

were evaluated daily. Hemoculture, PCR and ELISA were performed in animals that

had survived to the acute phase. In all groups iron evaluations were performed by

means of the dosage of iron levels in the liver, hemoglobin and serum iron. One also

evaluated the weight of the animals, the relative weight and the histopathological

alterations, as well as tissue parasitism in the heart, liver, spleen and lymph nodes.

These animals had been sacrificed in 14o and 21o days after the infection. Treatment

produced a less severe disease. All treated animals that had survived to the acute

phase of the infection presented negative hemoculture in the acute and chronic phase

of the infection while no treated present positive hemoculture in both phases. All treated

animals presented positive PCR assay in the acute phase and 3 of these presented

negative PCR in the chronic phase. No treated animal presented positive PCR in both,

acute and chronic phase. Treated and no treated animals presented positive ELISA in

the acute and chronic phase. Infected groups presented minors levels of iron in the liver

when compared to no infected groups, treated or no treated. NTI group presented

greater levels of serum iron when compared to NTC and TI in 21o days after infection. In

14o day after infection, the TI presented lower levels of hemoglobin than NTI group. DF

treatment diminished the corporal weight of the infected animals or not. Between 14o

and 21o day after infection, were observed increase of relative weight of the heart,

spleen, liver and lymph nodes only in the NTI group. The infected, treated or no treated

animals presented similar histological alterations in the heart. The liver of the animals of

IT group, presented minor intensity of alterations and the evaluation of the lymphatic

organs demonstrated precocious reply in IT group. Differences in relation to tissue

parasitism in the analyzed organs of the infected treated or no treated animals had not

been observed. These results demonstrate that the reduction of the host iron levels

contributes for the improvement of the clinical picture of the infection.

ARANTES, J.M. Lista de Gráficos

vii

Gráfico 1 - Curvas de parasitemia média em camundongos Swiss inoculados intraperitonealmente com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi, submetidos ou não ao tratamento com desferrioxamina até o 32o dia após a infecção. .................................................................................................... 31

Gráfico 2 - Taxa de mortalidade cumulativa de camundongos Swiss inoculados intraperitonealmente com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi submetidos ou não ao tratamento com desferrioxamina até o 32o dia após a infecção. .................................................................................................... 32

Gráfico 3 - Média da quantidade de ferro no fígado realizada no 14o e 21o dia após a infecção em camundongos Swiss pertencentes aos grupos controle não-tratado, controle tratado, infectado não-tratado e infectado tratado . ....................................... 35

Gráfico 4 - Média da dosagem de ferro sérico realizada no 21o dia após a infecção ..... 36

Gráfico 5 - Média da dosagem de hemoglobina realizada antes da infecção e no 14o dia após a infecção nos camundongos Swiss pertencentes aos grupos controle não-tratado, controle tratado, infectado não-tratado e infectado tratado . ........................ 37

Gráfico 6 - Média do peso corporal dos camundongos Swiss antes da infecção e aos 7, 14 e 21 dias após a infecção nos grupos controle não-tratado, controle tratado, infectado não-tratado e infectado tratado. ...................................................................... 38

Gráfico 7 - Peso relativo do coração, baço, fígado e linfonodo dos animais pertencentes aos grupos controle não-tratado, controle tratado, infectado não-tratado e infectado tratado no 14o e 21o dias após infecção..................................................................40

ARANTES, J.M. Lista de Figuras

viii

Figura 1 – Delineamento experimental. Camundongos Swiss machos (n=32), infectados com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi, tratados (n=16) ou não (n=16) com desferrioxamina. .............. 21

Figura 2 - Delineamento experimental. Camundongos Swiss machos (n=80), infectados (n=40) ou não (n=40) com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi, tratados ou não com desferrioxamina. ....................................... 22

Figura 3 - Produtos específicos de 330pb do minicírculo de kDNA do Trypanosoma cruzi obtidos com os iniciadores S35 e S36 em DNA extraído do sangue de camundongos infectados com a cepa Y, tratados com desferrioxamina e não-tratado, coletados nas fases aguda e crônica da infecção e visualizados em gel de poliacrilamida a 6%, corado pela prata ........................................................................... 33

Figura 4 - Fotomicrografia de secções de coração de camundongos (A) e (B) Grupo controle tratado com desferrioxamina: ausência de alterações inflamatórias ou degenerativas; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi: (C) processo inflamatório discreto e (D) intenso; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi tratado com desferrioxamina: (E) processo inflamatório moderado e (F) intenso constituído em todos os campos por células mononucleadas. Observa-se a presença de degeneração hialina em todos os grupos infectados e a presença de ninhos (C) e amastigotas isoladas (D) (setas). Hematoxilina Eosina X600. ............ 42

Figura 5 - Fotomicrografia de secções de fígado de camundongos (A) e (B) Grupo controle tratado com desferrioxamina: focos inflamatórios discretos; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi: (C) processo inflamatório moderado e (D) intenso; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi tratado com desferrioxamina: (E) processo inflamatório discreto e (F) discreto constituído em todos os campos por células mononucleadas. Hematoxilina Eosina X600. .................................................................................................................................... 43

Figura 6 - Fotomicrografia de secções de baço de camundongos (A) e (B) Grupo controle tratado com desferrioxamina; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi: (C) e (D) intenso; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi tratado com desferrioxamina: (E) e (F). Hematoxilina Eosina X600. .................................................................................................................................... 44

Figura 7 - Fotomicrografias de secções de linfonodo de camundongos (A) e (B) Grupo controle tratado com desferrioxamina: quadro histológico compatível com normalidade; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi: (C) discreta hiperplasia folicular e (D) hiperplasia folicular instalada; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi tratado com desferrioxamina: (E e F) hiperplasia folicular. Hematoxilina Eosina B X300; A,C-F X130 ..................................................... 45

Figura 8 - Fotomicrografias de secções histológicas, de animais pertencentes aos grupos infectados com a cepa Y do Trypanosoma cruzi, tratados (A, C, E e G) ou não (B, D, F e H) com desferrioxamina, submetidas à reação imuno-histoquímica anti-Trypanosoma cruzi. (A) amastigotas isoladas, processo inflamatório intenso e difuso; (B) ninho de amastigotas, inflamação discreta; (C) ninho de amastigotas e foco inflamatório ativo; (D) amastigota isolada e raras células inflamatórias;

ARANTES, J.M. Lista de Figuras

ix

(E,F,G,H) amastigotas isoladas e ninhos de amastigotas. Peroxidase Anti-Peroxidase X1000 .............................................................................................................. 46

ARANTES, J.M. Lista de Tabelas

x

Tabela 1- Hemocultura, PCR e ELISA realizados nas fases aguda (60 dias) e crônica (240 dias) nos camundongos que sobreviveram à infecção pela cepa Y do Trypanosoma cruzi tratados ou não com desferrioxamina ..................................... 34

ARANTES, J.M. Sumário

xi

1 - Introdução .................................................................................................................. 1

2 - Objetivos .................................................................................................................. 18 2.1 - Objetivo geral ..................................................................................................... 19 2.2 - Objetivos específicos ......................................................................................... 19

3 - Animais, materiais e métodos .................................................................................. 20 3.1 - Animais e tratamentos utilizados ....................................................................... 21 3.2 - Infecção e parâmetros biológicos avaliados ...................................................... 23

3.2.1 - Curva de parasitemia .................................................................................. 23 3.2.2 - Taxa de mortalidade .................................................................................... 24 3.2.3 - Hemocultura ................................................................................................ 24 3.2.4 - Reação em cadeia da polimerase (PCR) .................................................... 24 3.2.5 - ELISA .......................................................................................................... 25

3.3 - Parâmetros relacionados à avaliação do ferro ................................................... 26 3.3.1 - Ferro tecidual .............................................................................................. 26 3.3.2 - Ferro sérico ................................................................................................. 26 3.3.3 - Níveis de hemoglobina ................................................................................ 27

3.4 - Necrópsias, coleta, fixação e processamento do material para microscopia óptica ......................................................................................................................... 27 3.5 - Técnica de Imuno-histoquímica para identificação do T. cruzi .......................... 28 3.6 - Análise estatística .............................................................................................. 29

4 - Resultados ............................................................................................................... 30 4.1 - Curva de parasitemia ......................................................................................... 31 4.2 - Taxa de mortalidade .......................................................................................... 32 4.3 - Hemocultura ...................................................................................................... 33 4.4 - PCR ................................................................................................................... 33 4.5 - ELISA ................................................................................................................. 34 4.6 - Ferro tecidual ..................................................................................................... 35 4.7 - Dosagem de ferro sérico .................................................................................... 36 4.8 - Níveis de hemoglobina ...................................................................................... 37 4.9 - Peso dos animais............................................................................................... 38 4.10 - Peso relativo dos órgãos ................................................................................. 39 4.11 - Análise histopatológica .................................................................................... 41

5 - Discussão ................................................................................................................. 47

6 - Conclusões ............................................................................................................... 60

7 - Perspectivas futuras ................................................................................................. 62

8 - Referências Bibliográficas ........................................................................................ 64

1 - Introdução

ARANTES, J.M. Introdução

2

A doença de Chagas é causada pelo protozoário hemoflagelado Trypanosoma

cruzi e é transmitida por insetos hematófagos da subfamília Triatominae (Chagas,

1909). As estimativas indicam uma prevalência da infecção em 13 milhões de pessoas,

uma incidência anual de 200.000 novos casos e que existam cerca de 3,0 - 3,3 milhões

de indivíduos sintomáticos (WHO, 2003).

Essa enfermidade é caracterizada por uma fase aguda de curta duração,

seguida por uma fase crônica que na ausência de tratamento específico, pode persistir

por toda a vida do indivíduo. A fase aguda se instala após um período de incubação de

sete a dez dias; sintomas gerais como febre, linfadenopatia, esplenomegalia e edema

são observados, mas a infecção pode passar despercebida devido à escassez de

sintomas clínicos (Prata, 2001). Por outro lado, pacientes imunossuprimidos e crianças

podem desenvolver uma fase aguda mais grave, com envolvimento cardíaco e

encefalomielite (Zhang e Tarleton, 1999). Parasitismo tecidual mais frequente e

elevada parasitemia (Prata, 2001) são característicos nesta fase, entretanto, com a

instalação da resposta imune tendem a diminuir até tornarem-se subpatentes na fase

crônica (Giordanengo et al., 2002).

A fase crônica pode apresentar-se assintomática por período variável

caracterizando a forma indeterminada ou inaparente da doença de Chagas (Prata,

2001). Nesta forma, o indivíduo apresenta ausência de sintomas, exames

eletrocardiográficos e radiológicos do tórax e abdomem normais e parasitemia baixa ou

ausente. Entretanto, a suspeita da infecção pode ser confirmada por testes sorológicos

(ELISA, IFI, HAI) ou evidenciada por testes parasitológicos (Hemocultura,

Xenodiagnóstico e PCR) como demonstrado por Chiari et al., (1989), Barreto e Lanni

(1994) e Gomes et al., (1998). A forma indeterminada é a mais freqüente ocorrendo em

70% dos indivíduos (Tanowitz et al., 1992; Prata, 2001). Contudo, cerca de 30% destes

desenvolvem a fase crônica sintomática em um período variável de 10 a 30 anos após

a infecção (Amato Neto, 1986; Dias, 1989; Brener e Gazzinelli, 1997) caracterizando as

formas clínicas cardíaca e digestiva, (Moncayo, 1999), esta última compreendendo o

megacólon e/ou megaesôfago. A ocorrência de manifestações cardíacas e digestivas

caracteriza a forma mista da doença (Tanowitz et al., 1992; Prata, 2001). As razões

pelas quais a doença se manifesta de forma distinta ainda permanecem desconhecidas

e diferenças regionais na distribuição dessas formas clínicas também têm sido

registradas (Coura et al., 1983; Rezende e Moreira, 1988).


3

Cepas diferentes do T. cruzi têm sido utilizadas nos estudos das fases aguda e

crônica da infecção, o que é de extrema relevância, devido a grande heterogeneidade

observada no comportamento biológico de populações distintas do parasito (Andrade e

Magalhães, 1996). Análises moleculares de diferentes cepas do T. cruzi têm

demonstrado também que as populações do parasito são extremamente polimórficas

(Buscaglia e Di Noia, 2003) e a correlação entre a genética do parasito, suas

propriedades biológicas e a susceptibilidade a droga tem sido evidenciada por diversos

estudos in vivo e in vitro (Andrade et al., 1985; Andrade e Magalhães, 1997; Laurent et

al., 1997; Revollo et al., 1998; Toledo et al., 2002; Toledo et al., 2003).

A presença de populações geneticamente distintas vem sendo sugerida como

fator determinante das alterações observadas em diferentes formas clínicas da doença

(Vago et al., 2000), possivelmente devido ao tropismo tecidual característico de cada

população (Macedo, 2004). Os estudos de Andrade et al. (1999) corroboram com esta

hipótese. Ao infectarem camundongos BALB/c simultaneamente com duas diferentes

populações do parasito (cepa JG e clone CoL1.7G2), os autores demonstraram uma

clara diferença na distribuição tecidual para as duas populações. Do mesmo modo,

Vago et al. (2000) através da caracterização genética do T. cruzi diretamente de

tecidos de pacientes na fase crônica da doença, verificaram que em um indivíduo com

cardiopatia e processo inflamatório no esôfago, foram detectadas diferentes

populações nos respectivos órgãos através da assinatura do kDNA. Por outro lado,

Franco et al. (2003) em infecções mistas de ratos com a cepa JG (isolado de um

paciente com megaesôfago) e o clone Cl_Brener miotrópico, verificaram alteração no

tropismo tecidual dos estoques, quando comparados às populações isoladas,

sugerindo que outros fatores podem influenciar no curso da infecção.

Andrade (1974) ao analisar a variação entre cepas do T. cruzi sob o aspecto

morfobiológico e comportamental em camundongos propôs o primeiro critério de

classificação para a espécie. Três tipos foram estabelecidos: Tipo I - (cepa Y e

Peruviana) de multiplicação rápida, picos de parasitemia e mortalidade altos e

precoces, predominância de formas finas e reticulotropismo na fase inicial da infecção;

Tipo II - (16 cepas isoladas no Recôncavo Baiano) de multiplicação lenta, picos

irregulares de parasitemia entre 12o e 20o dias, predominância de formas largas ao

longo da infecção, mas com formas finas em pequeno número na fase inicial, e

tropismo predominante para o miocárdio; Tipo III - (cepa Colombiana) de multiplicação

lenta, altos picos de parasitemia entre o 20o e 30o dias de infecção, baixas taxas de


4

mortalidade, predominância de formas largas ao longo da infecção com envolvimento

predominante do músculo esquelético.

A resposta imune do hospedeiro apresenta importante papel no controle da

infecção pelo T. cruzi, pois através de seus mecanismos de ação, o parasito é

continuamente combatido, diminuindo sua multiplicação nos tecidos. Grande parte das

manifestações clínicas da doença de Chagas deve-se a ativação da resposta imune

dirigida contra o parasito (Aliberti et al., 1996). A mobilização do sistema imune é

importante na redução da carga parasitária, mas por outro lado, eventualmente

contribui para o aparecimento das manifestações clínicas crônicas devido às respostas

auto-imunes (Leon e Engman, 2001). No entanto, tanto o parasito quanto a resposta

imune podem persistir indefinidamente no hospedeiro e as lesões teciduais resultantes

da atividade prolongada de ambos causam alterações morfofuncionais características

da doença (Tarleton, 2001).

Vários estudos têm sido realizados no intuito de compreender a relação entre o

T. cruzi e seus hospedeiros, e como esta interação pode direcionar o curso da

infecção. Aparentemente, a ativação de diferentes células do sistema imune e

moléculas solúveis por elas produzidas desempenham participação direta no controle

da carga parasitária durante a fase aguda da infecção (Aliberti et al., 1999). O T. cruzi é

capaz de induzir a ativação/produção de proteínas e enzimas efetoras da imunidade

inata natural. Porém, a forma tripomastigota consegue resistir ao ataque da via

alternativa do Complemento, o que permite a instalação da infecção.

A resposta imune inata é essencial na resistência do hospedeiro contra a

invasão por protozoários. As células Natural Killer (NK) são importantes por limitarem o

crescimento parasitário e por iniciarem o desenvolvimento da resposta imune adquirida

(Scott et al., 1995).

O papel dos macrófagos como primeira linha de defesa do organismo contra

patógenos intracelulares está bem estabelecido (Taliaferro e Pizzi, 1955; Mackaness,

1969). Kierszenbaum et al. (1976) demonstraram que o tratamento de macrófagos com

sílica torna camundongos mais susceptíveis à infecção pelo T. cruzi, mesmo com a

utilização de cepas avirulentas, por bloquear a fagocitose.

A capacidade dos macrófagos participarem da destruição de certos parasitos

envolve vários mecanismos complexos que dependem da cepa do parasito (Milder et

al., 1977; Alcantara e Brener, 1978), da forma evolutiva (Milder et al., 1977; Nogueira et

al., 1980; Kloetzel et al., 1984; Umezawa et al., 1985), além do estado de ativação dos


5

macrófagos (Nogueira et al., 1977). Borges et al. (1992) descreveram que a ativação

dos macrófagos peritoniais, avaliada pela capacidade destas células liberarem peróxido

de hidrogênio (H2O2), dependia do hospedeiro e da cepa do parasito utilizada no

estudo. O mais importante sinal para a ativação dos macrófagos é o IFN-γ, que

desempenha papel significativo na destruição do T. cruzi (Plata et al., 1984; Murray et

al., 1985). Outras citocinas como o TNF-α e fatores inespecíficos, como o LPS

(lipopolissacarídeo), podem estar envolvidos no processo de ativação dos macrófagos

(Alcina e Fresno, 1987). Quando o T. cruzi inicia sua interação molecular em

macrófagos, a produção de IL-12 é induzida e, além de estimular a proliferação de

linfócitos T, ativa as células NK a produzirem IFN-γ, cuja função é induzir o

recrutamento de macrófagos para a atividade microbicida (Aliberti et al., 1996). Dessa

forma o TNF-α, produzido pelos macrófagos durante a infecção, interage de forma

sinérgica tanto com IL-12 como com IFN- , ativando os macrófagos a expressarem a

enzima óxido-nítrico (NO) sintase induzida e a produzirem NO (Miller et al., 2002).

Alguns estudos mostraram que camundongos resistentes à infecção apresentaram

elevada produção de NO, estimulada pelo aumento da produção de IFN- (Plata et al.,

1984; Reed, 1988; Vespa et al., 1994).

A imunidade celular também é importante na defesa contra o T. cruzi e as

células T representam a maior parte das células no infiltrado inflamatório do miocárdio

de pacientes com a forma cardíaca da doença (Reis et al., 1993; Higuchi et al., 1997)

sendo hábeis em reagir ao parasito (Mosca et al., 1985; Morato et al., 1986) e a

antígenos do hospedeiro relacionados a doença de Chagas (Gazzinelli et al., 1990;

Dutra et al., 2000). Provavelmente as células T são as principais ”orquestrantes” da

reatividade imune (Dutra et al., 2005).

Animais deficientes destas células são ainda mais susceptíveis à infecção

(Tarleton et al., 1996). A necessidade das células T CD4 pode estar relacionada a sua

capacidade em auxiliar na produção de anticorpos e citocinas como o IFN- (Brener,

1986; Tarleton et al., 1996). Por outro lado, o papel das células T CD8 pode estar

associado ao fato do T. cruzi poder infectar qualquer tipo de célula. As células não-

linfóides infectadas expressam apenas moléculas do MHC de classe I, que não são

reconhecidos por linfócitos T CD4, mas poderiam ser identificadas por células T CD8

efetoras (Lenzi et al., 1996). Estudos in vitro indicam que células infectadas com o T.

cruzi são reconhecidas por linfócitos T CD8 obtidos de animais infectados com o


6

mesmo parasito (Nickell et al., 1993). Animais deficientes no gene β2-microgobulina,

não expressam moléculas de classe I, perdem linfócitos T CD8 e são altamente

susceptíveis à infecção pelo T. cruzi (Tarleton et al., 1992).

A resposta das diferentes sub-populações de linfócios T nem sempre é benéfica

para o hospedeiro. A produção de IFN-γ na fase aguda da infecção pelo T. cruzi em

camundongos está associada à resistência (Reed, 1988; Nabors et al., 1991; Minoprio

et al., 1993) e a sua depleção exacerba a parasitemia e aumenta a mortalidade (Torrico

et al., 1991; Petray et al., 1993). Similarmente, IL-12, relacionada à resposta Th1,

promove resistência em camundongos (Silva et al., 1998). Por outro lado, o oposto

acontece com o padrão Th2, onde a IL-10 está associada a susceptilidade à infecção

pelo T. cruzi em camundongos (Silva et al., 1992; Reed et al., 1994).

Evidências da ocorrência de imunidade humoral estão representadas pela

presença de anticorpos atuando na defesa contra o parasito em diversos estudos

experimentais e humanos. Em infecções agudas no modelo murino foi observado que

ocorre ativação policlonal intensa de linfócitos B, com hiperprodução de

imunoglobulinas (Minoprio et al., 1989). Contudo, a distribuição de isotipos permanece

invariável ao longo do curso da infecção e é caracterizada pela predominância de

IgG2a e IgG2b (D’Império et al., 1986).

A doença de Chagas pode ser avaliada através do acompanhamento de sua

evolução em diferentes modelos experimentais como ratos, camundongos, roedores

silvestres, cães, coelhos, primatas e cobaios, nos quais é possível reproduzir os

distintos aspectos patológicos da doença humana. O modelo murino tem apresentado

uma maior preferência por diversos pesquisadores pela facilidade de obtenção,

manutenção e pequeno porte. Os camundongos têm também sido utilizados no estudo

de diversos parâmetros na relação parasito-hospedeiro, como por exemplo, no

comportamento de cepas do T. cruzi, na eficácia de várias drogas para a terapia e na

resposta imunológica e histopatológica do hospedeiro (Brener et al., 1976; Andrade et

al., 1985; Ben Younés-Chennoufi et al., 1988; Rottenberg et al., 1988).

No modelo murino, a doença de Chagas se desenvolve de forma diferente da

observada em humanos. Nestes animais, a fase aguda da infecção é caracterizada por

alta parasitemia e mortalidade, grande disseminação do parasito e imunossupressão

(Minoprio et al., 1989).

O curso da infecção aguda ou crônica pelo T. cruzi em camundongos depende

do background genético do hospedeiro (Pizzi et al., 1949; Trischmann et al, 1978;


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Corsini et al., 1980; Soares et al., 2001) e do parasito isolado (Brener, 1965; Postan et

al., 1983; Soares et al., 2001).

O acometimento cardíaco é a principal causa de morbidade e mortalidade na

doença de Chagas, com diferentes níveis de danos ao sistema de condução e com a

ocorrência de falha cardíaca em muitos casos graves (Prata, 2001). Diversos estudos

confirmaram que durante o curso da infecção cardíaca, ocorrem alterações

microvasculares induzidas pelo parasito que podem conduzir a degeneração

miocárdica e inflamação crônica (Factor et al., 1985; Morris et al., 1990; Petkova et al.,

2001).

Os camundongos sobreviventes a um longo período de infecção pelo T. cruzi

podem desenvolver miocardite intensa e lesões na inervação autonômica do coração

(Tafuri, 1970; Machado et al., 1975), na microcirculação (Factor et al., 1985) e

mudanças eletrocardiográficas, parecidas com aquelas encontradas na miocardite

chagásica humana (Laguens et al., 1981a). A inflamação do miocárdio é de extrema

importância em todo o processo patológico da doença de Chagas, devido à maneira

como as reações ao T. cruzi se desenvolvem no coração. O acometimento do

miocárdio em camundongos cronicamente infectados parece ser conseqüência do

parasitismo e da inflamação durante os primeiros estágios da doença (Schlemper et al.,

1983). A miocardite pode ser induzida experimentalmente através de injeções múltiplas

de antígenos sub-celulares específicos do T. cruzi (Teixeira et al., 1975) ou através da

transferência de células do baço de animais imunizados para animais normais

(Laguens et al., 1981b) sugerindo a participação do sistema imune na patogênese da

miocardite crônica.

Estudos histológicos do coração de indivíduos que vieram a óbito em

decorrência da doença, mostraram fibrose intersticial difusa, infiltração linfocítica e

miocitólise, mesmo na ausência de parasitos (Engman e Leon, 2002). Em 1999, Zhang

e Tarleton demonstraram que o DNA do parasito e suas proteínas podem estar

presentes no foco inflamatório, mesmo na ausência de formas amastigotas intactas.

Estes dados foram confirmados pelo encontro de grande porcentagem destas formas

em biópsias cardíacas de indivíduos cronicamente infectados (Anez et al., 1999).

A imunossupressão e a autoimunidade presentes durante a infecção pelo T.

cruzi podem ser explicadas pela ativação policlonal das células B, que afeta

mecanismos regulatórios imunes (Minoprio, 2001). Antígenos persistentes do T. cruzi

podem se tornar focos para as células T específicas mediando o processo de


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hipersensibilidade tardia, que conduz a lesões nos tecidos dos hospedeiros (Ben

Younés-Chennoufi et al., 1998; Tarleton e Zhang, 1999; Tarleton, 2001).

Fatores nutricionais também influenciam no desenvolvimento da infecção. O

ferro, dentre todos os micronutrientes, é o metal pesado mais encontrado nos tecidos e

fluidos corporais (Crichton e Ward, 1992). Este mineral é essencial para a

sobrevivência de praticamente todas as células vivas, sendo requerido para o

crescimento e proliferação das mesmas. Além disso, possui papel importante no

transporte de elétrons, síntese de DNA e várias reações redox essenciais (Letendre,

1985).

O ferro é um elemento versátil, altamente reativo, que existe em duas valências

naturais, ferroso (2+) e férrico (3+), e esta propriedade é a base de seu papel biológico

essencial no transporte de oxigênio e reações redox, particularmente na respiração

celular. Em um ambiente aeróbico, de pH neutro, o ferro existe na forma oxidada férrica

(Fe3+), utilizada pelas células em associação com uma variedade de proteínas e

compostos. A formação de intermediários reativos de oxigênio e radicais livres tóxicos

é requerida por muitos processos celulares, que incluem respostas anti-tumorais e

morte fagocítica de patógenos. Porém, estas espécies reativas são potencialmente

perigosas e quando o ferro está presente em excesso, pode ocorrer dano tecidual

(Griffiths et al., 1999).

Muitos estudos têm demonstrado que o excesso de ferro no organismo pode se

tornar tóxico pela indução da produção de espécies reativas de oxigênio, como O2- e

OH. O fígado é o principal órgão de estocagem de ferro durante a ocorrência de

doenças por acúmulo de ferro como a hemocromatose genética e o excesso de ferro

neste órgão contribui para o desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular

(Niederau et al., 1985, Griffiths et al., 1999). Em algumas situações patológicas,

incluindo a talassemia e a siderose experimental, a deposição excessiva de ferro pode

ocorrer nos rins e a toxicidade neste órgão vem sendo demonstrada (Landing et al.,

1989). Apesar da função do ferro no coração ainda não ser totalmente conhecida, sua

homeostase é importante para a sua funcionalidade normal. Sabe-se que o ferro

cataliza a formação de radicais livres via reações de Fenton, onde pode causar danos

nos compostos de todas as classes bioquímicas incluindo membranas lipídicas,

proteínas e DNA (Lesnefsky, 1994; McCord, 1996).

A deficiência de ferro prejudica a função de vários compostos que estão ligados

a ele. Há redução da atividade da ribonucleotídeo redutase, requerida para a síntese


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de DNA (Bergeron, 1986), diminuição da atividade das desidrogenases contendo ferro-

enxofre, do ciclo do ácido cítrico (Davies et al., 1982) e diminuição da concentração de

mioglobina e hemoglobina (Siimes et al., 1980).

A manutenção da homeostase celular de ferro não é somente um requerimento

geral para o crescimento e proliferação de todas as células, mas é também de extrema

importância para a regulação do sistema imune. A sua deficiência predispõe o

hospedeiro a infecções por interferir tanto na resposta celular quanto na humoral

(Weinberg, 1984; Galan et al., 1988; Blakley e Hamilton, 1988; Kent et al., 1990). As

deficiências no status de ferro também são conhecidas por prejudicarem a função das

células do sistema imune, especialmente dos linfócitos (Baliga et al., 1982). O ferro

modula a expressão de moléculas de superfície de células T (Santos et al., 1994), a

função fagocítica de macrófagos (Jiang et al., 1993) e a atividade de células NK

(Nishiya et al., 1982). Além disso, o ferro diminui a atividade do IFN- em células

mielomonocíticas humanas (Weiss et al., 1992) e reduz a produção de NO em células

microgliais murinas (Saleppico et al., 1996). Estudos das funções celulares em quadros

clínicos que reportam excesso de ferro, como por exemplo a talassemia, demonstraram

função prejudicada ou alterada de células T CD4 (de Sousa, 1989).

Algumas citocinas podem influenciar o metabolismo de ferro e, por sua vez, o

status deste metal alterado no organismo, pode influenciar a produção das mesmas. O

TNF-α possui papel significativo na homeostase de ferro por ser um dos principais

fatores na modulação do metabolismo de ferro durante a inflamação. Silver et al. (1997)

sugeriram que a expressão do gene TNF-α pode ser controlada por ferro intracelular.

Esse fato tem sido corroborado por estudos, que demonstraram que a sua aplicação

em animais experimentais ou em humanos levou a uma redução da concentração de

ferro sérico (Tanaka et al., 1987). Estes achados demonstraram uma possível interação

entre TNF-α e ferro durante a inflamação. A hipoferremia associada à infecção ou

inflamação é provavelmente mediada por TNF-α, que também inibe a liberação de ferro

de macrófagos peritoneais, uma vez que macrófagos de camundongos com excesso

de ferro produzem mais TNF-α (Omara et al., 1994).

Kuvibidila et al. (2004) demonstraram que a deficiência de ferro em

camundongos reduziu os níveis de IL-12p40 e IFN- enquanto a subnutrição aumentou

os níveis de IL-10. Estes dados sugerem que a deficiência de ferro altera o balanço

entre as citocinas pró e anti-inflamatórias e desse modo pode afetar a imunidade

humoral e celular.


10

No hospedeiro vertebrado, o ferro encontra-se em associação com proteínas

ligantes de alta afinidade como a lactoferrina e a transferrina, não estando disponível

livremente para os microrganismos (Aisen e Listowsky, 1980). O primeiro pool de ferro

no organismo é o do ferro associado à hemoglobina e, como ela está sempre sendo

seqüestrada dentro dos eritrócitos, o ferro não está diretamente disponível para

patógenos extracelulares (Bothwell et al., 1979).

A lactoferrina tem uma grande afinidade pelo ferro e está localizada nas

superfícies mucosas e secreções exócrinas como muco e lágrimas, que podem, desta

maneira dificultar o crescimento dos microrganismos nestas vias de entrada. A

transferrina é uma glicoproteína que se encontra no sangue dos hospedeiros

vertebrados, constituindo o segundo pool de ferro do organismo. Ela é a mais

importante proteína de transporte no plasma (Bothwell et al., 1979), e a sua alta

afinidade pelo ferro limita a disponibilidade do metal para os microrganismos. O

receptor de transferrina (TfR1) é expresso em várias células que requerem o ferro para

o seu desenvolvimento. O TfR1 de camundongo é uma glicoproteína de 200 KDa

composta de duas cadeias idênticas ligadas a dissulfeto, cada uma sendo capaz de se

ligar a transferrina. A ligação da transferrina ao seu receptor, seguido pela endocitose

do complexo ligante-receptor, consiste no principal mecanismo celular de captação de

ferro. O ferro incorporado é estocado também em depósitos de ferritina e os TfR1 são

reciclados na superfície da célula. Recentemente, outra molécula com a mesma

similaridade estrutural e funcional a da TfR1 foi clonada e recebeu o nome de TfR2. O

papel da TfR2 no metabolismo de ferro permanece desconhecido, apesar da

transfecção dentro de células que perderam o TfR1 resultar em captação de ferro de

transferrina (Kawabata et al., 1999). Em contraste ao TfR1 que é regulado pela

concentração de ferro intracelular, o TfR2 não parece ser regulado da mesma maneira

(Kawabata et al., 2000).

Como relatado acima, a obtenção de ferro pelos patógenos não é fácil. Para

superar esta dificuldade, algumas espécies de bactérias patogênicas produzem

algumas moléculas, denominadas sideróforas, que possuem alta afinidade pelo ferro.

Estas moléculas de baixo peso molecular competem com a transferrina pelo metal

(Neilands, 1981).

O mecanismo básico pelo qual a forma amastigota do T. cruzi obtém os

micronutrientes do hospedeiro mamífero para sua multiplicação intracelular ainda é

desconhecido. Tem-se investigado o papel das proteínas dos hospedeiros,


11

principalmente, a transferrina no transporte destes micronutrientes para estas formas

parasitárias. Os receptores de transferrina têm sido encontrados em praticamente

todas as células, e aumentam em quantidade com a proliferação das mesmas (Barnes

et al., 1980; Weiel et al., 1984). Em trabalhos relacionando os receptores do T. cruzi

para a transferrina humana e o seu papel, Lima e Villalta (1989), mostraram que as

formas amastigotas apresentam receptores para esta proteína. O ferro é essencial para

o crescimento desta forma parasitária e é obtido da transferrina através da endocitose

mediada por receptores.

A relação parasito-hospedeiro é complexa, não somente os patógenos

desenvolvem estratégias para a obtenção de nutrientes dentro dos hospedeiros

vertebrados, como estes, por sua vez, conseguem obter meios de inviabilizar a

sobrevivência dos agentes infecciosos por diferentes mecanismos. Como foi verificado

por Weinberg em 1978, em muitas doenças infecciosas ocorre um ajuste no

metabolismo de ferro caracterizado pela hipoferremia, onde há redução dos níveis de

saturação da transferrina. A hipoferremia é predominantemente o resultado do

seqüestro de ferro dentro de estoques intracelulares do sistema fagocitário

mononuclear (Roeser, 1980; Letendre e Holbein, 1983). Como todos os

microorganismos patogênicos requerem ferro para o crescimento e virulência, a

resposta hipoferrêmica é protetora porque reduz a disponibilidade do ferro para os

patógenos extracelulares (Weinberg, 1978). Dessa maneira, a hipoferremia é um

benefício questionável na defesa contra parasitos intracelulares que replicam dentro do

sistema fagocitário mononuclear utilizando os pools de ferro intracelular do hospedeiro

(Lalonde e Holbein, 1984).

Deste modo, as alterações nos níveis de ferro podem afetar a relação parasito-

hospedeiro. Se uma quantidade suficiente de ferro não for disponível para o patógeno a

sua propagação poderá se tornar dificultada e a infecção atenuada (Payne e

Finkelstein, 1978).

Os dados da literatura em relação à deficiência de ferro e a resistência às

infecções têm levado alguns investigadores a sugerir duas diferentes hipóteses. Alguns

defendem que a deficiência de ferro predispõe a infecção (Baggs e Miller, 1973;

Cummins et al., 1978; Duncombe et al., 1979; Kuvibidila et al., 1981; Humbert e Moore,

1983; Weinberg, 1984; Galan et al., 1988; Blakley e Hamilton, 1988; Kent et al., 1990) e

outros defendem que a deficiência de ferro protege contra a infecção (Sword, 1966;

Weinberg, 1974; Murray et al., 1975; Jones et al., 1977; Pushman e Ganzoni, 1977;


12

Murray et al., 1978; Murray et al., 1981; Raventos-Suarez et al., 1982; Lalonde e

Holbein, 1984; Harvey et al., 1985; Pollack et al., 1987; Bullen et al., 1991; Griffiths e

Bullen, 1999). Trabalhos realizados por estas duas vertentes apóiam tais suposições.

Muitos estudos relataram que a deficiência do ferro protege contra infecções e

mostraram uma alta resistência de camundongos deficientes em ferro quando

comparados a animais controles submetidos a diversas infecções experimentais,

incluindo Plasmodium chabaudi (Harvey et al., 1985), Listeria monocytogenes (Sword,

1966), T. cruzi (Lalonde e Holbein, 1984), Plasmodium berghei (Murray et al., 1975),

Plasmodium falciparum (Heywood e Harvey, 1985) e Salmonella typhimurium (Jones et

al., 1977; Puschman e Ganzoni, 1977).

A deficiência de ferro em humanos também gera controvérsias em relação à

infecção. Em estudos epidemiológicos de adultos deficientes em ferro na Indonésia e

Quênia foi observada alta taxa de morbidade devido a infecções em relação a

indivíduos não-anêmicos (INACG, 1977; Keusch et al., 1983). Em seu trabalho, Murray

et al. (1978) mostraram que a administração de ferro a africanos deficientes do metal

levou a um maior numero de infecções como tuberculose, malária e brucelose quando

comparado àqueles que não receberam o metal.

É muito difícil comparar os estudos em animais e humanos. O que é mais

relevante diz respeito à saturação da transferrina, que é conhecida pela sua

importância crucial na relação entre o hospedeiro e a invasão dos microorganismos

(Weinberg, 1974; Baltimore et al., 1982) e também ao risco de infecção (Payne e

Finkelstein, 1978; Beisel, 1982), que é muito diferente em camundongos e em

humanos. Em camundongos, a saturação normal da transferrina é em torno de 70-85%

(Elin e Wolff, 1974; Mainou-Fowler e Brock, 1985; Brock e Mainou-Fowler, 1986),

enquanto em humanos a saturação normal é em torno de 33%. Puschman e Ganzoni

(1977) presumiram que uma deficiência moderada de ferro em camundongos pode

aumentar a resistência à infecção por Salmonella pela diminuição na saturação da

transferrina. O ferro só pode aumentar a incidência da infecção se sua concentração é

aumentada no sangue ou localmente, ou se a saturação da transferrina aumenta acima

de 60% (Weinberg, 1971).

O organismo humano adulto contém de 3 a 5 g de ferro, aproximadamente 2 g

como hemoglobina e 8 mg como enzimas. Ambas as formas são muito importantes

para a função normal do indivíduo. O ferro é bem conservado pelo organismo;

aproximadamente 90% é recuperado e reutilizado extensivamente. Na deficiência de


13

ferro, os valores de transferrina (expressos como capacidade total de ligação de ferro)

são elevados, maiores que os normais, 410 µg DL-1, com saturação de ferro no soro

abaixo de 16% (Finch et al., 1982).

Quelantes têm sido utilizados em estudos que avaliam a relação entre doenças

e o status de ferro. As evidências de que quelantes de ferro atenuam as lesões pós-

isquêmicas em uma variedade de sistemas orgânicos, inclusive em músculos

esqueléticos, documentam a participação do ferro na patogênese da lesão tecidual

pós-isquêmica (Ambrosio et al., 1987; Paller et al., 1988; Sardinha, 1994).

Os quelantes de ferro podem também induzir fortemente a transcrição de NO

sintase (NOS) e aumentar a liberação de IL-1B em macrófagos alveolares humanos

(Rouser et al., 1968; Tang et al., 1997). Estas observações sugerem que os quelantes

de ferro podem modular certos mediadores regulando os processos inflamatórios

(Rouser et al., 1968).

O Desferal (mesilato de desferrioxamina) foi lançado no mercado em 1963 como

um medicamento no tratamento do excesso de alumínio e ferro decorrente da

talassemia. Ele vem sendo empregado com sucesso na clínica médica como agente de

remoção de ferro em casos de doenças de estoques de ferro, no tratamento de

envenenamento por ferro e como um auxílio na normalização de estoques de ferro

(Keberle, 1964). Para ser efetivo, o medicamento deve ser administrado por infusões

parenterais com doses diárias de 100 a 150 mg/kg em humanos (Modell e Berdoukas,

1984; Brittenham, 1988). A desferrioxamina (DFA) como consequência de seu rápido

metabolismo (Aouad et al., 2002), possui um período curto de meia-vida no plasma, e

deve ser administrada lentamente por um determinado tempo (Summers et al., 1979;

Lee, 1993).

Este quelante contém como substância ativa a DFA, um sideróforo hexadentado

natural que contém tiohidroxamato produzido por Streptomyces pylosis (Keberle, 1964;

Barry et al., 1974). Este agente é capaz de promover a excreção de ferro do organismo

pela formação de complexos predominantemente com os íons trivalentes do ferro. Em

decorrência de suas propriedades quelantes, a DFA é capaz de deslocar o ferro na

forma livre, encontrado tanto no plasma como nas células, dando origem ao complexo

ferrioxamina. Uma vez ligado, o ferro é inativado metabolicamente não resultando na

formação de espécies ativas de oxigênio.

A DFA tem sido empregada em estudos que buscam avaliar a relação entre

infecção e status de ferro (Dhur et al., 1989) e atua tanto no meio intracelular quanto no


14

extracelular. Dois mecanismos são propostos para esta ação, a indução da deficiência

de ferro por limitar sua disponibilidade dentro da célula ou a interferência direta com a

aquisição de ferro pelo parasito (Hershko e Peto, 1988).

Muitos estudos de triagens clínicas bem como estudos in vivo e in vitro têm

demonstrado que alguns tumores agressivos em humanos, particularmente

neuroblastoma e leucemia, são sensíveis à terapia de quelação de ferro pela DFA

(Donfrancesco et al., 1996; Richardson, 1997). Algumas células cancerosas são mais

susceptíveis aos efeitos dos quelantes do que as células normais, que podem desta

maneira ser utilizados na oncoterapia. Estudos em animais têm apresentado uma

variedade de evidências confirmando a eficácia da DFA em inibir o crescimento de

tumores. A DFA inibiu ou causou a regressão total do carcinoma hepatocelular em

camundongos (Hann et al., 1992), inibiu o crescimento de carcinoma mamário em ratos

Fisher (Wang et al., 1999) e também prolongou a vida de camundongos com leucemia

do tipo L1210 (Wolfe et al., 1988).

Oexle et al. (1999) têm demonstrado que a expressão de algumas enzimas

envolvidas no ciclo do ácido cítrico é reduzida após a exposição à DFA. Por exemplo, a

depleção de ferro celular utilizando a DFA resultou em um decréscimo na expressão de

aconitase mitocondrial, citrato sintase, isocitrato desidrogenase e succinato

desidrogenase. Em contraste, a suplementação com ferro aumentou a expressão

destas enzimas. Portanto, a depleção de ferro resulta em um decréscimo no consumo

de oxigênio mitocondrial e formação de ATP via fosforilação oxidativa e um aumento na

glicogênese. Outros alvos da DFA incluem proteínas envolvidas no controle do ciclo

celular, como a p53, que têm sua expressão induzida (An et al., 1998).

Em relação ao sistema imune foi demonstrado que a DFA bloqueia a expressão

do receptor de IL-2 em células T humanas e inibe a síntese de DNA como um resultado

da inativação da ribonucleotídeo redutase (Carotenuto et al., 1986). Este quelante

também apresenta efeitos antivirais inibindo a replicação do citomegalovírus in vitro

(Cinatl et al., 1994, 1995) sendo efetivo na redução da lesão mediada por radicais livres

posterior ao trauma (Shadid et al., 1998; Martelius et al., 1999). O tratamento com DFA

suprime os sintomas clínicos e patológicos da encefalomielite alérgica em ratos, com

redução das lesões inflamatórias no sistema nervoso central e da resposta de células T

(Bowern et al., 1984). Tanjii et al. (2001) demonstraram que a DFA aumenta a

expressão de cyclooxygenase-2 e prostaglandina em macrófagos humanos.


15

Muitos agentes quelantes podem ter uma atividade potencial anti-tripanomicida

porque fazem a privação seletiva do ferro o que pode inibir a proliferação de certos

patógenos (Cabantchick et al., 1996; Singh et al., 1997; Cinque et al., 1998).

Em relação a doenças parasitárias, a DFA apresenta efeitos inibidores no

crescimento do Plasmodium falciparum (Hershko e Peto, 1988) e das formas

sangüíneas do T. brucei (Breidbach et al., 2002), sendo também considerada uma

droga promissora contra o T. gondii em camundongos (Mahmoud, 1999). Em relação

ao T. cruzi, observou-se redução da patogenicidade em camundongos infectados pela

cepa Brasil do T. cruzi (Lalonde e Holbein, 1984), infecção branda com a cepa YuYu e

ausência de alterações na parasitemia e mortalidade de camundongos infectados pela

cepa Y (Pedrosa et al., 1990). Estudos em malária humana demonstraram que,

somente o tratamento com a DFA ou a sua combinação com a terapia padrão,

aumentou a remoção dos parasitos na malária assintomática e complicada (Traore et

al., 1991; Gordeuk et al., 1992; Mabeza et al., 1996).

Os primeiros trabalhos correlacionando o T. cruzi com as alterações nos níveis

de ferro e a infecção foram realizados por Lalonde e Holbein (1984) e por Loo e

Lalonde (1984). Os autores observaram que os camundongos infectados com (103 ou

104) formas sangüíneas da cepa Brasil do T. cruzi e com estoques intracelulares de

ferro aumentados pela injeção de ferro-dextran (5mg de ferro/animal 5o DAI)

apresentaram maior mortalidade. O ferro-dextran (ferric hydroxide dextran complex) é

amplamente utilizado para aumentar os níveis de ferro no corpo (Holbein et al., 1979).

Por outro lado, a diminuição dos estoques de ferro do hospedeiro com DFA (10

mg/animal 5o e 6o DAI) e dieta deficiente em ferro reduziu a patogenicidade.

Também através de estudos sobre os efeitos da deficiência e da suplementação

de ferro na evolução da infecção experimental de camundongos por diferentes cepas

do T. cruzi, Pedrosa et al. (1990) apresentaram resultados que variaram em

decorrência do tipo da cepa utilizada, cepa Y e CL (1.400 formas sangüíneas) e cepa

YuYu (15.000 formas sangüíneas). O tratamento com ferro-dextran (5 mg de

ferro/animal 5o DAI) resultou em maior parasitemia e mortalidade com a cepa Y, maior

parasitemia com a cepa CL e nenhum efeito com a cepa YuYu. O tratamento com DFA

(10 mg/ animal 5o DAI) não provocou alteração com as cepas Y e CL e uma infecção

branda com a cepa YuYu. Posteriormente, Pedrosa et al. (1993), em trabalhos

utilizando camundongos convencionais e gnotobióticos, obtiveram os mesmos

resultados em relação à cepa Y do T. cruzi.


16

Diversos fatores inerentes ao hospedeiro e dependentes do parasito como o

inóculo e cepa, podem conferir diferenças no que se refere ao tropismo celular,

parasitemia e capacidade de produzir lesões. Segundo Brener (1977, 1985) a cepa Y

produz elevado pico de parasitemia dos sete aos 12 dias de infecção, alta taxa de

mortalidade, intenso parasitismo no baço, células fagocíticas do fígado nos primeiros

estágios de infecção e miotropismo nos estágios mais tardios. A cepa Y é considerada

reticulotrópica, parasitando baço, fígado e medula óssea (Melo e Brener, 1978).

No trabalho realizado por Postma et al. (1998) procurou-se otimizar a DFA no

tratamento do Plasmodium vinckei em camundongos. A droga foi administrada através

de injeções subcutâneas múltiplas ou infusão intraperitoneal da droga livre e múltiplas

injeções subcutâneas da DFA na forma lipossomal. As múltiplas injeções subcutâneas

da droga antes e durante a infecção controlaram a parasitemia, enquanto somente as

injeções anteriores à infecção não controlaram a parasitemia. A supressão da

parasitemia e a sobrevivência dos camundongos a longo prazo (mais de 1 mês após

infecção) foram obtidas pela infusão intraperitoneal iniciada um dia antes da infecção

ou por injeções subcutâneas da DFA na forma lipossomal anterior à infecção (Postma

et al., 1998). Os resultados deste trabalho também indicaram que a exposição contínua

do parasito a doses baixas da DFA (130 mg/Kg/dia) é suficiente para remover a

parasitemia, enquanto altas doses (800-1500 mg/Kg/dia) são insuficientes (Postma et

al., 1998).

Resultados preliminares em nosso laboratório demonstraram que camundongos

infectados com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do T. cruzi e

submetidos a alterações nos níveis de ferro com a utilização da DFA (10 mg/animal a

cada 2 dias de experimentação) ou do ferro-dextran (5 mg de ferro/animal - 2 vezes por

semana) apresentaram diferentes resultados. Os animais tratados com ferro-dextran

apresentaram um aumento da proliferação in vivo do parasito e maior gravidade das

lesões cardíacas. Já os animais tratados com DFA associados à dieta deficiente de

ferro apresentaram decréscimo na concentração de hemoglobina, diminuição da

proliferação in vivo do parasito e melhora do quadro histopatológico cardíaco (Arantes,

2003).

Os trabalhos que avaliam os efeitos do tratamento com desferrioxamina em

protozoários utilizaram tratamentos curtos e não ao longo da infecção. Na infecção

pelo T. cruzi, Lalonde e Holbein (1984) utilizaram a desferrrioxamina no 5o e 6o dia

após a infecção (DAI) e Pedrosa et al., (1990) no 5o DAI. Como ocorre uma rápida


17

remoção da DFA da circulação (Brittenham, 1988), foi hipotetizado neste trabalho se

um tratamento mais longo com o quelante poderia afetar mais intensamente o

desenvolvimento da infecção pelo T. cruzi. A cepa Y foi escolhida por ser uma cepa

parcialmente resistente ao tratamento sendo avaliado durante a fase aguda da

infecção, se a quelação do ferro interfere na virulência do parasito e sobrevida do

hospedeiro.

Estes resultados indicam que a manipulação dos níveis de ferro do hospedeiro,

principalmente no que diz respeito a sua redução com a utilização de doses diárias da

DFA, antes e durante a infecção, em muito poderá contribuir para a melhora do quadro

clínico da doença de Chagas.

2 - Objetivos

ARANTES, J.M. Objetivos

19

2.1 - Objetivo geral

Avaliar a influência da utilização de um quelante de ferro, DFA, sobre o curso da

infecção pela cepa Y do T. cruzi em camundongos Swiss.

2.2 - Objetivos específicos

Em animais infectados pela cepa Y do T. cruzi, submetidos ou não ao

tratamento com DFA, determinar:

1. a curva de parasitemia, período pré-patente, período patente,

níveis de parasitemia e a taxa de mortalidade;

2. hemocultura, ELISA e PCR nos animais resistentes à fase aguda

da infecção.

Em animais não-infectados e infectados pela cepa Y do T. cruzi,

submetidos ou não ao tratamento com DFA, avaliar:

1. os níveis de hemoglobina antes da infecção e no 14o dia após a

infecção;

2. os níveis de ferro sérico e tecidual (fígado) no 14o e 21o dia após a

infecção;

3. o peso relativo e as alterações histopatológicas bem como o

parasitismo tecidual no coração, fígado, baço e linfonodo no 14o e

21o dia após a infecção.

3 - Animais, materiais e métodos

ARANTES, J.M. Animais, materiais e métodos

21

3.1 - Animais e tratamentos utilizados

Foram utilizados 112 camundongos Swiss machos, com aproximadamente trinta

dias de idade e aproximadamente 20 g de peso corporal, provenientes do Biotério da

UFOP e alimentados durante o período de avaliação com ração comercial.

Para a avaliação da parasitemia diária, mortalidade, hemocultura, PCR e ELISA,

utilizaram-se 32 animais infectados pelo T. cruzi sendo 16 tratados pela DFA (Figura 1).

Os demais animais (80) foram divididos em quatro grupos experimentais: (1) controle

não-tratado - CNT; (2) controle tratado com DFA - CT; (3) infectado com a cepa Y do T.

cruzi e não-tratado - INT e (4) infectado com a cepa Y do T. cruzi e tratado com DFA -

IT sendo utilizados para avaliar os outros parâmetros (Figura 2).

Figura 1 – Delineamento experimental. Camundongos Swiss machos (n=32), infectados com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi, tratados (n=16) ou não (n=16) com desferrioxamina.

n=

32 c

am

un

don

gos

30

dia

s d

e ida

de

-14 0

Não-tratado

Recebeu diluente

do medicamento

n=16

Inóculo

500 formas cepa Y

Tratado

DFA 5 mg/animal/dia

n= 16

Tratado

DFA 5 mg/animal/dia

Infectado

n=16

Não tratado

Recebeu diluente

do medicamento

Infectado

n=16

32

Parasitemia e mortalidade diária

60 240 dias

Coleta de sangue

Hemocultura

PCR

ELISA

Tratamento

n=

32 c

am

un

don

gos

30

dia

s d

e ida

de

-14 0

Não-tratado

Recebeu diluente

do medicamento

n=16

Inóculo

500 formas cepa Y

Tratado

DFA 5 mg/animal/dia

n= 16

Tratado

DFA 5 mg/animal/dia

Infectado

n=16

Não tratado

Recebeu diluente

do medicamento

Infectado

n=16

32


60 240 dias

Coleta de sangue

Hemocultura

PCR

ELISA

n=

32 c

am

un

don

gos

30

dia

s d

e ida

de

-14 0

Não-tratado

Recebeu diluente

do medicamento

n=16

Inóculo

500 formas cepa Y

Tratado

DFA 5 mg/animal/dia

n= 16

Tratado

DFA 5 mg/animal/dia

Infectado

n=16

Não tratado

Recebeu diluente

do medicamento

Infectado

n=16

32


60 240 dias

Coleta de sangue

Hemocultura

PCR

ELISA

Tratamento


22

Os animais tratados com desferrioxamina (Desferal - Novartis) receberam o

medicamento pela via intraperitoneal (5mg/animal/dia) durante 14 dias que precederam

à infecção até o 32o DAI (Figura 1) ou 21o (Figura 2). Os camundongos pertencentes

aos grupos controle receberam a mesma quantidade (mL) do diluente do medicamento

(água para injeção) no mesmo período. Ambos os experimentos foram realizados em

duplicata sendo n=8 (Figura 1) e n=10 (Figura 2) para cada experimento, totalizando

n=16 e n=20, respectivamente, para cada grupo.

Figura 2 - Delineamento experimental. Camundongos Swiss machos (n=80), infectados (n=40) ou não (n=40) com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi, tratados ou não com desferrioxamina.

n=

80 c

am

undongos

30 d

ias d

e idade

-14 0

Não tratado

Recebeu diluente

do medicamento

n=40

Dosagem de Hemoglobina

Inóculo

500 formas cepa Y

Tratado

DFA 5 mg/animal/dia

n= 40

Tratado

DFA 5 mg/animal/dia

n=20

Tratado

DFA 5 mg/animal/dia

Infectado

n=20

Não tratado

Recebeu diluente

do medicamento

n=20

Não tratado

Recebeu diluente

do medicamento

Infectado

n=20

14 21 dias


Dosagem de

hemoglobina,

ferro sérico e

tecidual.

Necrópsias

n=

80 c

am

undongos

30 d

ias d

e idade

-14 0

Não tratado

Recebeu diluente

do medicamento

n=40

Dosagem de Hemoglobina

Inóculo

500 formas cepa Y

Tratado

DFA 5 mg/animal/dia

n= 40

Tratado

DFA 5 mg/animal/dia

n=20

Tratado

DFA 5 mg/animal/dia

Infectado

n=20

Não tratado

Recebeu diluente

do medicamento

n=20

Não tratado

Recebeu diluente

do medicamento

Infectado

n=20

14 21 dias


Dosagem de

hemoglobina,

ferro sérico e

tecidual.

Necrópsias


23

3.2 - Infecção e parâmetros biológicos avaliados

Após 14 dias de tratamento com a DFA ou com o diluente do medicamento, os

animais foram inoculados intraperitonealmente com 500 formas tripomastigotas

sangüíneas da cepa Y do T. cruzi.

3.2.1 - Curva de parasitemia

A parasitemia foi determinada diariamente após a infecção até a negativação por

cinco dias consecutivos, através da coleta de 5 µL de sangue da veia caudal dos

camundongos. A contagem dos tripomastigotas foi realizada pela técnica de Brener

(1962) e as curvas representam a contagem média/dia de infecção. Foram avaliados os

seguintes parâmetros:

Período pré-patente (PPP)

O PPP corresponde ao período compreendido entre a inoculação e o primeiro

dia de detecção do parasito no sangue periférico do animal através do exame a fresco

e foi expresso em dias.

Período patente (PP)

O PP corresponde ao período compreendido entre o primeiro dia de exame a

fresco positivo até a completa negativação da parasitemia e foi expresso em dias.

Pico de parasitemia (PMP)

O PMP corresponde ao valor máximo de parasitemia encontrado e foi expresso

em número de tripomastigotas sangüíneos/0.1 mL de sangue.

Dia do pico de parasitemia (DPP)

O DPP corresponde ao dia de ocorrência do máximo de parasitemia e foi

expresso em dias.


24

3.2.2 - Taxa de mortalidade

Para a determinação da taxa de mortalidade, os animais foram acompanhados

diariamente e a mortalidade registrada sendo expressa em porcentagem cumulativa.

3.2.3 - Hemocultura

A hemocultura foi realizada de acordo com a metodologia de Filardi e Brener

(1987) no 600 e 2400 DAI. Para este exame, cerca de 0,5 mL de sangue foram

coletados assepticamente do seio venoso retro-orbital dos animais que sobreviveram à

fase aguda da infecção (n=6). O sangue foi distribuído em dois tubos, cada um com 3

mL de meio LIT (Camargo, 1964), incubados na estufa a 28ºC e uma gota do

sedimento foi examinada ao microscópio para detectar o parasito aos 30, 60, 90 e 120

dias após a incubação.

3.2.4 - Reação em cadeia da polimerase (PCR)

As amostras de sangue foram coletadas no 600 e 2400 DAI. Duzentos microlitros

de sangue do plexo venoso retro-orbital dos animais que sobreviveram à fase aguda da

infecção (n=6) foram acrescentados ao dobro de volume de Guanidina/EDTA 6,0 M e

conservados a temperatura ambiente. Uma semana após a coleta, o lisado foi fervido

por 7 minutos e mantido à temperatura ambiente. A extração de DNA das amostras foi

realizada com fenol-clorofórmio, posteriormente precipitado com etanol, secado,

ressuspendido em água e conservado a 4°C segundo protocolo de Gomes et al.

(1998), com ligeiras modificações. A PCR foi processada pela mistura de 2uL da

solução de DNA de cada amostra, Tris-HCl 10mM (pH 9,0), Triton X-100 0,1%, KCl

75mM, MgCl2 3,5mM, 0,2mM de cada desoxinucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP,

Sigma Company Ltda), 0,5U de Taq DNA polimerase (Platinum, Invitrogen), 25 pmoles

de cada iniciador (S35 e S36 descritos por Ávila et al. (1991), Invitrogen ) para 9 L de

reação. A essa mistura foi adicionado 30 uL de óleo mineral e então, submetida a

amplificação em termociclador (MJ Research, PTC-150) nas seguintes condições: uma

etapa inicial de desnaturação do DNA a 95 C por 5 minutos; 35 ciclos de amplificação


25

com desnaturação a 95ºC por 1 minuto, anelamento dos iniciadores a 65 C por 1

minuto e extensão a 72 C por 1 minuto e uma etapa final de extensão a 72ºC por 10

minutos. O DNA amplificado foi visualizado por eletroforese em gel de poliacrilamida a

6% revelado pela prata (Santos et al., 1993)

3.2.5 – Pesquisa de anticorpos anti- T.cruzi (ELISA)

As amostras de soro foram coletadas no 600 e 2400 DAI dos animais que

sobreviveram à fase aguda da infecção (n=6) e testadas a uma diluição de 1:80 em

PBS segundo a metodologia de Voller et al. (1976).

Microplacas de poliestireno de 96 poços de fundo chato foram sensibilizadas

com extrato antigênico alcalino, na concentração de 3 g de proteína/mL, obtido de

cultura exponencial da cepa Y de T. cruzi em meio LIT (Vitor e Chiari, 1987). Após

incubação por 18h, a 4oC, o excesso de solução antigênica foi removido por quatro

lavagens sucessivas com solução salina contendo Tween 20 a 0,05%. Após a lavagem,

os soros foram incubados a 37oC por 45 minutos.

A seguir, foi adicionado o conjugado anti-IgG de camundongo, marcado com

peroxidase (Sigma). Entre as etapas da reação, as placas de ELISA foram submetidas

a quatro lavagens com PBS-Tween 20. A reação foi interrompida pela adição de ácido

sulfúrico 4N (32 l por poço) e as leituras realizadas no leitor de microplaca (BIO RAD,

Modelo 3550) com filtro de 490 nm. Controles positivos e negativos foram processados

concomitantemente às amostras avaliadas, em cada placa.

A ELISA foi considerada positiva quando a leitura, em densidade ótica, foi maior

do que a média, somada a duas vezes ao desvio padrão do valor obtido de 10 soros de

animais não-infectados pelo T. cruzi (Gusmão et al., 1984).


26

3.3 - Parâmetros relacionados à avaliação do ferro

3.3.1 - Ferro tecidual

As dosagens de ferro tecidual foram realizadas no 140 e 210 DAI, sendo utilizado

o método de orto-fenantrolina. A hidroxilamina reduz o ferro 3+ a ferro 2+ e este é

associado com orto-fenantrolina. Esta substância produz coloração na amostra que é

proporcional a concentração de ferro. Durante a necrópsia foram coletados 10 mg do

fígado de cada animal, submetidos à digestão em 2 mL de ácido nítrico concentrado

em tubos de ensaio que foram colocados no digestor Kieldahl a 110ºC.

Logo após a evaporação do ácido, o resíduo seco foi resuspenso em 2 mL de

ácido clorídrico concentrado, e o material foi transferido para um balão volumétrico com

capacidade para 10 mL e completado o volume com água deionizada.

A 0,5 mL da solução obtida foram adicionados 0,2 mL de solução de

hidroxilamina 10%, 4,1 mL de tampão acetato 2 M pH 3,5 e 0,2 mL de orto-fenantrolina

a 0,1%. Para a leitura no espectrofotômetro utilizou-se um branco contendo 0,5 mL de

água deionizada, 0,2 mL de hidroxilamina, 4,1 mL de tampão acetato pH 3,5 e 0,2 mL

de orto-fenantrolina. A leitura foi realizada a 510 nm. O padrão foi obtido a partir de

uma curva feita com uma solução de padrão de ferro 500 g/mL. Os valores foram

obtidos em mg/0,1 g de tecido.

3.3.2 - Ferro sérico

As dosagens de ferro no soro foram realizadas no 140 e 210 DAI de acordo com

Goodwin et al. (1966) com modificações utilizando-se Kit comercial (Labtest, Cat 38,

ANVS: 10009010014, Lagoa Santa, MG, Brasil).

Em pH ácido, os íons férricos são dissociados e reduzidos a íons ferrosos por

ação da hidroxilamina. A intensidade da cor magenta brilhante formada após a adição

da Ferrozine é proporcional à quantidade de ferro na amostra.

Em um volume de 0,250 µL de tampão fornecido pelo Kit foram adicionados 62,5

µL de soro para cada teste, para o padrão foram adicionados 62,5 µL de padrão de

ferro sérico e para o branco foram adicionados 62,5 µL de água destilada que foi usada

para zerar o espectrofotômetro. Foi homogenizado e lido a 560nm e obtida a


27

absorbância 1 (A1). Foram adicionados, em cada tudo, 6,2 µL de ferrozine, incubado a

37ºC em banho-maria por dez minutos. Logo após foi realizada a leitura da

absorbância 2 (A2). Para se obter a concentração de ferro nas amostras, A1 foi

subtraído de A2, dividido pela absorbância do padrão e multiplicado pela concentração

do padrão. Os valores foram obtidos em unidades convencionais (μg/dL).

3.3.3 - Níveis de hemoglobina

A avaliação dos níveis de hemoglobina foi realizada antes da infecção e no 140

DAI, através de Kit comercial (Labtest, Cat 43, Lagoa Santa, MG, Brasil).

O ferro, no estado ferroso, do grupo heme da hemoglobina, oxihemoglobina e

carboxihemoglobina é oxidado para o estado férrico pelo ferriocianeto, contido no

reagente de cor fornecido pelo Kit, formando a hemiglobina (Hi). Esta combina-se com

o cianeto ionizado, também contido no reagente de cor e produz o cianeto de

hemoglobina (HiCN), que é submetido à leitura no espectrofotômetro com um

comprimento de onda de 540 nm.

Foram retirados 5 µL de sangue da cauda dos animais de cada grupo e

misturado a 1,25 µL do reagente de cor. Para o padrão foi misturado 1,25 µL do

reagente a 5 µL de padrão de hemoglobina. A fim de se obter a concentração de

hemoglobina na amostra, a absorbância da amostra foi dividida pela absorbância do

padrão e multiplicada pela concentração do padrão. Os valores foram obtidos em

unidades convencionais (μg/dL).

3.4 - Necrópsias, coleta, fixação e processamento do material para microscopia

óptica

Todos os camundongos foram pesados semanalmente e no dia da necrópsia.

Os animais foram necropsiados no 140 e 210 DAI. Cada animal recebeu um número

que apenas foi decodificado ao final de todos os experimentos.

Foi realizada a retirada do coração, baço, fígado e linfonodo in totum que foram

imediatamente pesados. Posteriormente foram realizados cortes transversais dos

órgãos e obtidos fragmentos com aproximadamente 2 mm de espessura, fixados em

formol tamponado a 10% (pH 7,2) por 24 horas.


28

Os fragmentos submetidos à fixação química foram desidratados em

concentrações crescentes de álcoois (70%, 80%, 90% e três trocas de álcool absoluto),

diafanizados em duas trocas de xilol, embebidos e incluídos em parafina histológica.

Os blocos de parafina foram submetidos à microtomia e de cada bloco

obtiveram-se cortes com espessura de 3 m. Foram confeccionadas duas lâminas, a

primeira foi corada pelo método da Hematoxilina-Eosina para observações rotineiras

das alterações histopatológicas e avaliadas ao microscópio óptico (em 100 campos

microscópicos, com a objetiva de 40X). Foram realizadas descrições histopatológicas

de todos os cortes atentando-se para as alterações degenerativas e inflamatórias.

Para quantificar o parasitismo tecidual no coração, baço, fígado e linfonodo

utilizou-se a técnica de imuno-histoquímica peroxidase anti-peroxidase na segunda

lâmina.

3.5 - Técnica de Imuno-histoquímica para identificação do T. cruzi

Os cortes histológicos foram desparafinizados em duas trocas de xilol de 15

minutos cada, hidratados em concentrações decrescentes de álcool (100%, 90%, 80%,

70%) por três minutos em cada. Seguiu-se a lavagem em água corrente por 5 minutos

e em PBS pH 7,2-7,4 por 5 minutos.

Posteriormente, os cortes foram submetidos ao bloqueio da peroxidase

endógena em um banho de 30 minutos em PBS/Peróxido de Hidrogênio (240 mL de

PBS e 10 mL de Peróxido de Hidrogênio a 30%) à temperatura ambiente. Os cortes

histológicos passaram então por três banhos consecutivos em PBS de 5 minutos cada.

Após a secagem das bordas dos cortes com papel absorvente, aplicou-se o soro

normal de cabra diluído na proporção 1:40 em PBS, por 30 minutos em câmara úmida

à temperatura ambiente, com o objetivo de bloquear as reações cruzadas

inespecíficas.

Em seguida, secou-se o excesso de soro normal de cabra e as lâminas foram

incubadas com anticorpo primário (anti-T. cruzi produzido em coelho, diluição 1:1000

em PBS/Albumina a 0,1%) em câmara úmida à 37ºC, por uma hora. Seguiram-se três

banhos de 5 minutos cada em PBS.

As bordas dos cortes foram secas novamente e aplicou-se o anticorpo

secundário (anti-IgG de coelho, produzido em cabra). A seguir, as lâminas foram


29

incubadas em câmara úmida por 30 minutos e, posteriormente, lavadas em 3 banhos

de 5 minutos cada, em PBS.

Procedeu-se a secagem das bordas, a aplicação do complexo peroxidase-anti-

peroxidase (PAP diluído 1:250 em PBS/Albumina a 0,1%) e as lâminas foram

incubadas por 30 minutos em câmara úmida à temperatura ambiente. Seguiram-se três

banhos de 5 minutos cada, em PBS.

A revelação da reação da peroxidase foi obtida através da incubação em

solução de DAB (50 mg de Diaminobenzidina em 250 mL de PBS e 500 l de Peróxido

de Hidrogênio 30%) durante 5 minutos. No intuito de interromper a revelação os cortes

foram mergulhados em PBS por três vezes. Posteriormente foram lavados em água

corrente por 5 minutos, contracorados com Hematoxilina de Harris por dez segundos,

lavados em água corrente por 5 minutos e desidratados em concentrações crescentes

de álcool (70%, 80%, 90% e 100%), diafanizados em xilol e montados em Entellan

(Merck ).

3.6 - Análise estatística

A parasitemia foi analisada pelo teste não-paramétrico Kolmogorov-Sminorv

(KS) que compara a área sob a curva entre duas amostras (Conares, 1980).

Os demais resultados foram expressos como média ± desvio padrão. As

análises estatísticas dos dados foram realizadas usando o MINITAB 13 Software (State

College, PA). Os dados foram testados pela ANOVA, análise bivariada. Quando as

alterações foram significativas, o teste de Tukey foi realizado para determinar as

diferenças específicas entre as médias.

Diferenças com valores de P < 0,05 foram consideradas significativas.

4 - Resultados

ARANTES, J.M. Resultados

31

4.1 - Curva de parasitemia

A parasitemia dos animais infectados, tratados ou não está representada no

Gráfico 1. Entre os dois grupos analisados (INT e IT) não foram observadas diferenças

significativas entre os períodos pré-patente (INT= 7 dias e IT= 7 dias), entretanto,

diferenças significativas no período patente foram detectadas (INT= 11 dias e IT= 21

dias). O dia do pico de parasitemia dos animais não-tratados ocorreu no 11o dia e dos

animais tratados no 10o dia. Já a média dos níveis de parasitemia nos animais

infectados e tratados (274.666 tripomastigotas/0,1 mL de sangue) foi cinco vezes

menor do que a dos animais infectados e não-tratados (1.397.000 tripomastigotas/0,1

mL de sangue) (p<0,05).

Gráfico 1 - Curvas de parasitemia média em camundongos Swiss inoculados intraperitonealmente com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi, submetidos (---) ou não ( ) ao tratamento com desferrioxamina até o 32o dia após a infecção.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

Dias após a infecção

Núm

ero

de p

ara

sitas/0

,1 m

lde s

angu

e x

10

3

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32


Núm

ero

de p

ara

sitas/0

,1 m

lde s

angu

e x

10

3


32

4.2 - Taxa de mortalidade

No Gráfico 2 estão representadas as taxas de mortalidade cumulativa dos

camundongos infectados pelo T. cruzi, tratados ou não com a DFA. No grupo infectado

não-tratado observou-se uma taxa de sobrevida de 6,25% e uma taxa de mortalidade

de 93,75% dos animais e a mortalidade foi observada a partir do 13º DAI. No grupo

infectado tratado a taxa de sobrevida foi de 31,25% e mortalidade de 67,75%, a partir

do 14º DAI.

Gráfico 2 - Taxa de mortalidade cumulativa de camundongos Swiss inoculados intraperitonealmente com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi submetidos (------) ou não ( ) ao tratamento com desferrioxamina até o 32o dia após a infecção.


Perc

entu

al de m

ort

alid

ade

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32


Perc

entu

al de m

ort

alid

ade

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32


Perc

entu

al de m

ort

alid

ade

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32


33

4.3 - Hemocultura

Dos animais infectados e tratados (n=16), 5 (31,25%) sobreviveram à fase

aguda e apresentaram hemocultura negativa no 30o, 60o, 90o e 180o dias após a

incubação. Por outro lado, dos 16 animais infectados e não-tratados apenas um

(6,25%) sobreviveu à fase aguda e apresentou hemocultura positiva neste mesmo

período (Tabela 1).

4.4 - PCR

Dos cinco animais infectados e tratados que sobreviveram à infecção, todos

apresentaram PCR positiva na fase aguda (60 DAI). Na fase crônica (240 DAI) a PCR

foi negativa em três destes animais. O único animal infectado não-tratado que

sobreviveu à infecção apresentou PCR positiva nas fases aguda (60 DAI) e crônica da

infecção (240 DAI) (Tabela 1 – Figura 3).

Figura 3 - Produtos específicos de 330pb do minicírculo de kDNA do Trypanosoma cruzi obtidos com os iniciadores S35 e S36 em DNA extraído do sangue de camundongos infectados com a cepa Y, tratados com desferrioxamina e não-tratado, coletados nas fases aguda e crônica da infecção e visualizados em gel de poliacrilamida a 6%, corado pela prata

PM

200 pb

300 pb

400 pb

500 pb

Br C- 1A 1C 2A 2C 3A 3C 4A 4C 5A 5C 6A 6C C+ PMPM

200 pb

300 pb

400 pb

500 pb

Br C- 1A 1C 2A 2C 3A 3C 4A 4C 5A 5C 6A 6C C+ PMPM

200 pb

300 pb

400 pb

500 pb

Br C- 1A 1C 2A 2C 3A 3C 4A 4C 5A 5C 6A 6C C+ PM


34

4.5 - ELISA

Anticorpos específicos da classe IgG foram detectados no soro de todos os

animais infectados, tratados ou não nas fases aguda e crônica da infecção (Tabela 1).

Tabela 1- Hemocultura, PCR e ELISA realizados nas fases aguda (60 dias) e crônica (240 dias) nos camundongos que sobreviveram à infecção pela cepa Y do Trypanosoma cruzi.

Hemocultura

PCR

ELISA

Animais Aguda Crônica Aguda Crônica Aguda Crônica

IT

1 - - + - + + 2 - - + - + + 3 - - + + + + 4 - - + - + + 5 - - + + + +

INT 6 + + + + + +

IT: grupo infectado tratado e INT: grupo infectado não-tratado com desferrioxamina - negativo + positivo / aguda (60DAI) e crônica (240 DAI)


35

4.6 - Ferro tecidual

Em relação à dosagem de ferro no fígado representada no Gráfico 3, observou-

se diferença significativa (p<0,05) entre os animais infectados e não-infectados no 14o

e 21o DAI. Os animais infectados tratados ou não apresentaram menor quantidade de

ferro no fígado que os animais não-infectados.

Gráfico 3 - Média da quantidade de ferro no fígado realizada no 14o e 21o dia após a infecção em camundongos Swiss pertencentes aos grupos controle não-tratado (CNT), controle tratado (CT), infectado não-tratado (INT) e infectado tratado (IT).

0

1

2

3

4

5

6

7

0

1

2

3

4

5

6

7

CNT CT INT IT

Mg/0

,1g

de

tecid

o

*

*

**

21 dias após a infecção


0

1

2

3

4

5

6

7

0

1

2

3

4

5

6

7

CNT CT INT IT

Mg/0

,1g

de

tecid

o

*

*

**




36

4.7 - Dosagem de ferro sérico

Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos no 14o DAI. No

21o DAI verificou-se diferença significativa (p<0,05) entre o grupo infectado não-tratado

quando comparado aos grupos controle não-tratado e infectado tratado (Gráfico 4). Os

animais infectados não-tratados apresentaram em média maior concentração de ferro

sérico (273,47 µg/dL) quando comparados aos animais dos grupos controle não-tratado

(100,9 µg/dL) e infectado tratado (119,28 µg/dL).

Gráfico 4 - Média da dosagem de ferro sérico realizada no 21o dia após a infecção nos

camundongos Swiss pertencentes aos grupos controle não-tratado (CNT), controle tratado (CT), infectado não-tratado (INT) e infectado tratado (IT).

0

100

200

300

400

500

600

700

g/d

L


*

CNT CT INT IT

*

0

100

200

300

400

500

600

700

g/d

L


**

CNT CT INT IT

**


37

4.8 - Níveis de hemoglobina

Não foram observadas diferenças significativas nos níveis de hemoglobina

avaliados antes da infecção entre os diferentes grupos. Observou-se diferença

significativa (p<0,05) entre os animais infectados e não-infectados tratados pela DFA

no 14o DAI (Gráfico 5). Os animais infectados tratados apresentaram em média níveis

mais baixos de hemoglobina (7,14 µg/dL) quando comparados aos animais não-

infectados tratados que apresentaram em média níveis mais elevados de hemoglobina

(10,9 µg/dL).

Gráfico 5 - Média da dosagem de hemoglobina realizada antes da infecção e no 14o dia após a infecção nos camundongos Swiss pertencentes aos grupos controle não-tratado (CNT), controle tratado (CT), infectado não-tratado (INT) e infectado tratado (IT).

0

5

10

15

20

25

g/d

l 0

5

10

15

20

25Antes da infecção


*

CNT CT INT IT

0

5

10

15

20

25

g/d

l 0

5

10

15

20

25Antes da infecção


*

CNT CT INT IT


38

4.9 - Peso dos animais

No Gráfico 6 está representada a média do peso dos animais dos grupos CNT,

CT, INT e IT antes da infecção e aos 7, 14 e 21 DAI.

Observou-se diferença significativa em relação ao tratamento com DFA nos dias

7, 14 e 21 após a infecção. Os animais tratados com DFA, infectados ou não,

apresentaram em média um menor peso corporal do que os animais não-tratados,

infectados ou não (p<0,05).

Gráfico 6 - Média do peso corporal dos camundongos Swiss antes da infecção e aos 7, 14 e 21 dias após a infecção nos grupos controle não-tratado ( ), controle tratado ( ), infectado não-tratado ( ) e infectado tratado ( ).. Letras diferentes representam diferenças significativas.


0 7 14 21

Peso (

g)

a

a

b

ba

a

b

b

a

a

b

b

10

15

20

25

30

35


0 7 14 21

Peso (

g)

a

a

b

ba

a

b

b

a

a

b

b

10

15

20

25

30

35


39

4.10 - Peso relativo dos órgãos

O coração, baço, fígado e linfonodo cervical dos animais foram pesados após

sacrifício e o peso relativo calculado considerando-se o peso corporal de cada animal.

Os resultados estão apresentados no Gráfico 7. Não foram observadas diferenças

significativas nos grupos controle, tratados com DFA ou não entre 14 e 21 dias.

No coração (Gráfico 7A) observou-se aumento significativo no peso relativo no

21o DAI no grupo infectado não-tratado quando comparado ao seu respectivo controle.

Quando foi comparado o peso relativo do coração entre o 14o e 21o DAI, observou-se

aumento do peso relativo apenas no grupo infectado (p<0,05).

No baço, fígado e linfonodo (Gráficos 7B, 7C e D) observou-se aumento

significativo no peso relativo nos grupos infectados, tratados ou não, quando

comparados aos seus respectivos controles no 21o DAI. No 14o DAI apenas o grupo

infectado tratado com DFA apresentou maior peso relativo quando comparado ao seu

controle. Observou-se aumento do peso relativo do fígado e linfonodo entre o 14o e 21o

DAI apenas no grupo infectado (p<0,05).


40

Gráfico 7 - Peso relativo do coração, baço, fígado e linfonodo dos animais pertencentes aos grupos controle não-tratado (CNT), controle tratado (CT), infectado não-tratado (INT) e infectado tratado (IT) no 14o e 21o dias após infecção. * representa diferença significativa entre os grupos infectados e seus controles. # representa diferença significativa entre os grupos infectados, tratados ou não no 21o dia em relação ao 14o dia após a infecção.

0

0,0005

0,001

0,0015

0,002

Coração

Fígado

Baço

Linfonodo

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0

0,0025

0,005

0,0075

0,01

0

0,025

0,05

0,075

0,1

A B

C D

CNT CT INT IT INT IT

14 dias14 dias 21 dias21 dias 14 dias14 dias 21 dias21 dias

CNT CT INT IT INT IT

* #* #

**

** #

** # *

*


41

4.11 - Análise histopatológica

Nos animais controle, tratados ou não, necropsiados no 14o (Figura 4 A) e 21o

(Figura 4 B) DAI as secções histológicas do coração, mostraram estruturas

características, sem sinais de alterações indicativos de lesão ou qualquer tipo de

processo inflamatório. Nos animais do grupo infectado, tratados ou não com DFA

verificou-se processo inflamatório variando de discreto a moderado no 14o DAI e de

moderado a intenso no 21o DAI em ambos os grupos. Não foi verificada diferença entre

os dois grupos.

Nas secções histológicas do fígado dos animais controle, tratados ou não com

DFA, necropsiados no 14o e no 21o DAI, verificou-se processo inflamatório focal e

discreto (Figuras 5 A e B). Nos animais do grupo infectado não-tratado necropsiados no

14o DAI (Figura 5 C), o fígado apresentou processo inflamatório mononuclear

moderado e difuso, com degeneração hidrópica, hialina e necrose. No 21o DAI

observou-se um agravamento deste quadro (Figura 5 D) com aumento na quantidade

de células inflamatórias e no tamanho dos infiltrados. Os animais pertencentes ao

grupo infectado e tratado apresentaram morfologia hepática mais preservada do que o

grupo não-tratado, tanto no 14o quanto no 21o DAI (Figuras 5 E e F).

Nas secções histológicas do baço dos animais controle, tratados ou não com

DFA, necropsiados no 14o e no 21o DAI, verificou-se aspecto morfológico compatível

com normalidade (Figuras 6 A e B). O baço dos animais do grupo infectado e não-

tratado necropsiados no 14o DAI apresentou hiperplasia e hipertrofia da polpa branca e

no 21o DAI um aumento de reatividade com congestão (Figura 6 C e D). No 14o DAI, o

baço dos animais pertencentes ao grupo infectado e tratado apresentou alta reatividade

no 14o DAI que se manteve no 21o DAI, sendo mais intensa a hiperplasia e hipertrofia

levando a confluência folicular do que no grupo não-tratado (Figuras 6 E e F).

Nos cortes histológicos de linfonodo observa-se hiperplasia folicular nos animais

infectados. Esta hiperplasia é precoce nos animais tratados com DFA no 14o DAI

(Figuras 7 A-F).

Não foram observadas diferenças em relação ao parasitismo tecidual avaliado

no coração, baço, fígado e linfonodo dos animais infectados, tratados ou não com DFA,

no 14o e no 21o DAI. Entretanto, o parasitismo foi menor nos dois grupos no 21o em

comparação ao 14o DAI (Figuras 8 A-H).


42

Figura 4 - Fotomicrografia de secções de coração de camundongos (A) e (B) Grupo controle tratado com desferrioxamina: ausência de alterações inflamatórias ou degenerativas; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi: (C) processo inflamatório discreto e (D) intenso; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi tratado com desferrioxamina: (E) processo inflamatório moderado e (F) intenso constituído em todos os campos por células mononucleadas. Observa-se a presença de degeneração hialina em todos os grupos infectados e a presença de ninhos (C) e amastigotas isoladas (D) (setas). Hematoxilina Eosina X600.


43

Figura 5 - Fotomicrografia de secções de fígado de camundongos (A) e (B) Grupo controle tratado com desferrioxamina: focos inflamatórios discretos; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi: (C) processo inflamatório moderado e (D) intenso; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi tratado com desferrioxamina: (E) processo inflamatório discreto e (F) discreto constituído em todos os campos por células mononucleadas. Hematoxilina Eosina X600.


44

Figura 6 - Fotomicrografia de secções de baço de camundongos (A) e (B) Grupo controle tratado com desferrioxamina; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi: (C) e (D) intenso; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi tratado com desferrioxamina: (E) e (F). Hematoxilina Eosina X600.


45

Figura 7 - Fotomicrografias de secções de linfonodo de camundongos (A) e (B) Grupo controle tratado com desferrioxamina: quadro histológico compatível com normalidade; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi: (C) discreta hiperplasia folicular e (D) hiperplasia folicular instalada; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi tratado com desferrioxamina: (E e F) hiperplasia folicular. Hematoxilina Eosina B X300; A,C-F X130


46

Figura 8 - Fotomicrografias de secções histológicas, de animais pertencentes aos grupos infectados com a cepa Y do Trypanosoma cruzi, tratados ou não com desferrioxamina, submetidas à reação imuno-histoquímica anti- Trypanosoma cruzi. (A) amastigotas isoladas, processo inflamatório intenso e difuso; (B) ninho de amastigotas, inflamação discreta; (C) ninho de amastigotas e foco inflamatório ativo; (D) amastigota isolada e raras células inflamatórias; (E,F,G,H) amastigotas isoladas e ninhos de amastigotas. Peroxidase Anti-Peroxidase X1000

5 - Discussão

ARANTES, J.M. Discussão

48

O ferro é importante na patogênese de muitas doenças. Lima e Villalta (1989)

demonstraram que o ferro é essencial para o crescimento das formas amastigotas do

T. cruzi e é obtido da transferrina por meio da endocitose mediada por receptores

presentes nestas formas, confirmando desta maneira que fatores nutricionais também

podem influenciar o curso da infecção pelo T. cruzi. Uma hipótese a ser considerada é

que se houver diminuição nos níveis de ferro no hospedeiro, o parasito poderá ter

dificuldades em sobreviver.

Para se estudar e correlacionar a deficiência de ferro e infecção, muitos agentes

quelantes também têm sido utilizados. A DFA é uma droga bastante utilizada na terapia

de quelação de ferro. Estudos em malária humana demonstraram que somente o

tratamento com a DFA ou a sua combinação com a terapia padrão, aumentou a

remoção dos parasitos na malária assintomática e complicada (Traore et al., 1991;

Gordeuk et al., 1992; Mabeza et al., 1996).

Em relação à doença de Chagas, estudos iniciais sugeriram que a deficiência de

ferro poderia agravar a infecção pelo T. cruzi em roedores (Lee et al., 1977). Por outro

lado, Lalonde e Holbein (1984) mostraram que a depleção dos estoques de ferro pelo

agente quelante DFA e uma dieta deficiente em ferro causava proteção contra a

infecção em camundongos. Arantes (2003) demonstrou que camundongos infectados

com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do T. cruzi submetidos ao

tratamento com DFA ou com dieta deficiente de ferro apresentaram resultados

semelhantes.

Considerando a hipótese de que o ferro é importante para a proliferação do

parasito, a sua remoção através da utilização deste quelante pode dificultar a

proliferação do mesmo, reduzindo seus níveis na corrente sanguínea. Neste trabalho

foi observada a redução dos níveis de parasitemia e um maior período patente no

grupo infectado e tratado com DFA, mostrando que a gravidade da infecção pela cepa

Y em camundongos foi atenuada pelo tratamento com este quelante, confirmando a

hipótese do estudo. Provavelmente, quanto menor a quantidade de ferro disponível

para o parasito, maior seria a dificuldade de reprodução do mesmo. Estes dados

também foram observados por Hershko e Peto (1988) que apontaram que a DFA inibe

o crescimento de agentes infecciosos, como na malária, por interferir com os

mecanismos de aquisição de ferro pelo patógeno ou por reduzir os estoques de ferro

do hospedeiro. Em trabalhos de Pedrosa et al. (1990), a cepa Y do T. cruzi não foi

sensível a este tipo de tratamento, sendo verificado apenas sua sensibilidade à


49

ausência total de ferro na dieta. Os autores acreditam que isto foi possível devido à

multiplicação rápida da cepa Y nos camundongos e ao menor tempo para esta alcançar

o pico de parasitemia, quando comparado à cepa YuYu, que por apresentar uma

multiplicação mais lenta no hospedeiro foi sensivel ao tratamento com DFA. O inóculo

utilizado por estes autores (1400 formas tripomastigotas) foi maior que o utilizado neste

experimento (500 formas tripomastigotas) e o modo de tratamento, apenas uma dose

de DFA no 5o DAI, foi diferente do utilizado neste trabalho, o que poderia explicar as

diferenças observadas nos resultados obtidos nos dois protocolos experimentais.

Os efeitos benéficos do tratamento com DFA não são somente observados em

parasitos. Weinberg (1994) demonstrou in vivo seu efeito contra Pneumocystis carinii

através de injeções diárias da droga, e encontrou redução na intensidade da infecção

em ratos e camundongos e alterações na morfologia do fungo. Estes autores

demonstraram ao comparar injeções intraperitoneais diárias e semanais que a terapia

semanal reduz em menor intensidade os trofozoítos do que a terapia diária.

Os efeitos limitantes na proliferação de parasitos pela DFA podem estar

relacionados a outros fatores que não sejam somente a restrição da disponibilidade de

ferro para o patógeno (Hershko e Peto, 1988). É sugerido que este resultado benéfico

pode ser devido à imunomodulação induzida pela droga. Dados in vitro indicam que a

fagocitose do ferro pelos macrófagos reduz sua habilidade em eliminar patógenos, o

que pode explicar, em parte, o efeito inibitório do ferro na atividade de IFN- (Weiss et

al., 1992). O tratamento com DFA em crianças com malária cerebral resultou na

estimulação de vias efetoras de IFN- e aumentou os níveis de nitrito e nitrato no soro,

produto estável final do NO (Weiss et al., 1997). O NO é um radical de duração curta

que está envolvido em vários processos biológicos, como por exemplo, relaxamento

vascular, neurotransmissão e citotoxidade celular contra vários microorganismos

(Nathan, 1987; MacMicking et al., 1997).

O NO e o metabolismo do ferro estão funcionalmente ligados, enquanto o NO

regula a expressão de mRNA no metabolismo celular de ferro, nomeados receptores

de mRNA de ferritina e transferrina em níveis pós-transcripcionais, via ativação de

proteínas regulatórias do ferro (Drapier et al., 1993; Weiss et al., 1993), o ferro inibe a

expressão de NO sintase (iNOS), enzima responsável pela elevada formação de NO

em macrófagos, após estimulação por citocinas (Weiss et al., 1994).

Depois de avaliadas as interações regulatórias entre o ferro e o metabolismo do

NO na defesa imune contra a infecção por Plasmodium falciparum (Fritsche et al.,


50

2001), observaram que a estimulação por citocinas em células intestinais humanas ou

macrófagos de camundongos, resultou no aumento de formação de NO e diminuição

da sobrevivência do plasmódio em co-cultura com eritrócitos humanos. A adição da

DFA antes do tratamento com citocinas aumentou a formação do NO e morte do

parasito, mas não apresentou nenhum efeito na formação de inibidor de NO (L-N6). O

efeito da droga na remoção do parasito parece ser devido ao aumento da geração de

NO mais do que a limitação da disponibilidade de ferro para o parasito (Fritsche et al.,

2001).

Em relação à infecção pelo T. cruzi, a resposta protetora depende da imunidade

inata e adquirida, requerendo a participação de macrófagos, células NK, linfócitos B e T

e produção de diferentes citocinas, que possuem importantes papéis na regulação da

replicação do parasito e da resposta imune (Tarleton, 2003; Silva et al., 2003). A fase

aguda da infecção é caracterizada pela ativação de macrófagos e produção de

citocinas inflamatórias, especialmente TNF- e IL-12 (Silva et al., 1995; Aliberti, 1996),

que ativam a produção de IFN- por células NK (Cardillo, 1995). O IFN- é crucial para

a defesa contra o parasito, porque em parte, sua combinação com TNF- leva a

síntese da enzima iNOS por macrófagos, resultando na produção de NO, que por sua

vez, controla a replicação do T. cruzi (Vespa et al., 1994; Martins et al., 2001).

Dada a importância do NO contra a proliferação do T. cruzi, pode-se especular

que uma das ações da DFA poderá ter sido o aumento da síntese de NO no

hospedeiro, além da diminuição do ferro, que controla a replicação do parasito,

consistindo também em uma das hipóteses que explicam a diminuição de parasitos

circulantes nos animais infectados e tratados em relação aos animais infectados.

Camundongos Swiss são susceptíveis à infecção pelo T. cruzi e apresentam modesta

indução de iNOS frente a infecção, em relação a camundongos C57BL6 que são

resistentes ao T. cruzi e respondem à infecção com uma forte indução do gene iNOS

em fagócitos (Malvezi et al., 2004). Portanto, a DFA pode ter favorecido maior

resistência ao hospedeiro atuando de duas formas: 1- reduzindo a oferta de ferro para

o parasito e 2- ampliando a produção de NO pelo hospedeiro, ambas, favorecendo a

eliminação do parasito. Estas duas hipóteses deverão ser confirmadas em novos

experimentos.

Neste trabalho, além das médias dos níveis de parasitemia dos animais

infectados e tratados se apresentarem menores que a dos animais somente infectados,


51

também foi demonstrada uma taxa menor de mortalidade (IT=67,75%; INT= 93,65%).

Os animais tratados com DFA, apresentando uma menor quantidade de parasitos na

corrente sanguínea, são provavelmente mais resistentes à infecção e sobrevivem mais

tempo a ela.

Lalonde e Holbein (1984) demonstraram que a depleção dos estoques de ferro

com DFA e dieta deficiente em ferro, promoveu a redução da mortalidade em

camundongos infectados pelo T. cruzi. Harvey et al. (1985) também demonstraram que

a deficiência de ferro protegeu camundongos contra a infecção por Plasmodium

chabaudi. Os animais que receberam dieta deficiente em ferro exibiram menor

parasitemia e mortalidade do que os animais que receberam dieta com ferro.

Nos animais que sobreviveram à infecção, coletou-se sangue na fase aguda e

crônica da infecção (fase aguda: 60 DAI e fase crônica: 240 DAI de acordo com

Miyamoto et al., 2006) para a realização dos exames parasitológicos (hemocultura e

PCR) e sorológicos (ELISA).

Os testes parasitológicos como a hemocultura ou xenodiagnóstico têm

apresentado alta especificidade, mas a sensibilidade destas técnicas é baixa. A

hemocultura alcança na forma crônica da doença, 0% a 94% de positividade (Gomes et

al., 1999). Embora tenham ocorrido aprimoramentos no diagnóstico parasitológico da

doença de Chagas crônica, a baixa sensibilidade dos exames indiretos é uma limitação

para sua aplicação ao diagnóstico e controle pós-terapêutico (Portela-Lindoso e

Shikanai-Yasuda, 2003).

Neste trabalho, os animais infectados e tratados com a DFA apresentaram

hemocultura negativa e o animal somente infectado apresentou hemocultura positiva

nas fases aguda e crônica da infecção. Esse resultado foi surpreendente, uma vez que

grupos de animais infectados com a Cepa Y e tratados com benznidazol na fase aguda

da infecção apresentam 50% de hemocultura positiva enquanto animais não tratados

apresentam 100% de hemocultura positiva (Filardi e Brener, 1987). Diante desses

resultados um questionamento é se estes animais infectados e tratados haviam se

curado da infecção. Como a hemocultura apresenta baixa sensibilidade e não pode ser

utilizada sozinha como critério de cura, foi utilizado a PCR e ELISA, como métodos de

avaliação da infecção nestes animais.

Recentemente, técnicas moleculares como a PCR vêm demonstrando níveis

variados de sensibilidade na detecção de DNA do T. cruzi (44.6-100%) em amostras de

pacientes (Ávila et al., 1993; Brito et al., 1995; Castro et al., 2002; Gomes et al., 1998).


52

Esta variação pode resultar, dentre outros fatores, das diferenças genéticas dos

parasitos (Portela-Lindoso e Shikanai-Yasuda, 2003) e principalmente dos protocolos

utilizados (Gomes et al., 1998).

A infecção pelo T. cruzi vem sendo indiretamente diagnosticada através de

testes sorológicos como ELISA. Este método é empregado devido a sua simplicidade,

baixo custo e bom desempenho. Um problema associado a este teste é a possível

reação cruzada entre antígenos do T. cruzi, Leishmania spp e Trypanosoma rangeli,

que podem levar a resultados falso-positivos e reduzem a sua sensibilidade (Umezawa

et al., 2003). Além disso, diversos trabalhos demonstram que a sorologia convencional

pode permanecer muito tempo positiva mesmo após o tratamento efetivo (Andrade et

al., 1991a/b) enquanto a pesquisa de anticorpos líticos pode negativar mais

precocemente (Krettli et al., 1982; Martins-Filho et al., 1995).

Entre os animais infectados e tratados com DFA que sobreviveram à fase aguda

da infecção (n=5), todos foram positivos pela PCR e pela ELISA na fase aguda da

infecção; enquanto na fase crônica 3 animais foram negativos pela PCR. O animal

infectado que sobreviveu a infecção foi positivo em ambas as fases. Esses resultados

indicam que não ocorreu cura parasitológica dos camundongos infectados e tratados

pela DFA. Entretanto, uma diminuição significativa da parasitemia foi verificada tanto

pela curva de parasitemia, quanto pela taxa de positividade dos exames

parasitológicos. Esse fato associado à menor mortalidade observada no grupo tratado,

sugere que embora o tratamento com a DFA não tenha curado os animais, ele

desempenha um papel protetor importante durante o curso da infecção. Breidbach et

al. (2002), avaliaram a inibição das formas sangüíneas do Trypanosoma brucei pela

DFA e observaram que a incubação do parasito com o quelante levou a inibição da

síntese de DNA e menor consumo de oxigênio, o que indica que a DFA pode afetar a

ribonucleotídeo redutase e oxidase alternativa.

Dallman et al. (1986) demonstraram que a deficiência de ferro no organismo

acontece em três estágios, com sobreposição destes. O primeiro estágio é

caracterizado pela diminuição na concentração de ferritina sérica que reflete perda nos

estoques de ferro no baço, fígado e medula óssea. O segundo estágio é caracterizado

por um aumento na capacidade de ligação de ferro e diminuição da concentração de

ferro sérico. No último estágio, as concentrações de hemoglobina e hematócrito

diminuem, e os estoques de ferro no baço e fígado tornam-se bastante exauridos.


53

Os animais infectados (tratados ou não) apresentaram uma menor quantidade

de ferro no fígado no 14o e 21o DAI provavelmente relacionado à regulação do ferro

pelo organismo frente à infecção pelo T. cruzi.

A hepcidina é um hormônio produzido pelo fígado, secretado na circulação,

envolvido na regulação do ferro no organismo, que atua na diminuição da absorção

pelos enterócitos e na posterior liberação do ferro dos macrófagos e hepatócitos. Este

hormônio contribui para a diminuição da absorção do ferro intestinal na presença de

processos inflamatórios o que favorece a anemia associada à inflamação (Fleming e

Bacon, 2005).

No presente trabalho, a liberação da hepcidina pelo fígado poderia explicar a

diminuição do ferro tecidual encontrada nos animais infectados (tratados ou não).

Provavelmente, esta liberação causou a diminuição da absorção de ferro pelos

enterócitos e conseqüentemente o seu transporte para o fígado. Aliado a isto, a

diminuição do ferro pode ser explicada pela infecção pelo T. cruzi, na própria

necessidade do parasito em adquirir ferro para seu metabolismo.

Após o 40o DAI no trabalho realizado por Pedrosa et al. (1990), observou-se

diminuição da quantidade de ferro no fígado de animais infectados com a cepa Y e CL

e tratados com DFA e no baço deste mesmo grupo, quando infectados com a cepa Y.

O tratamento com DFA não alterou os níveis de ferro no fígado e baço em

camundongos convencionais e germfrees no 15o dia após infecção pelo T. cruzi

(Pedrosa et al., 1993). Lalonde e Holbein (1984) apenas verificaram redução nos

estoques de ferro do organismo (48% no fígado e 15% no baço) de animais não-

infectados quando associaram o tratamento com DFA e uma dieta deficiente em ferro.

Apesar dos níveis de ferro tecidual no 14o DAI apresentarem-se diminuídos nos

animais infectados (tratados ou não) os níveis de ferro sérico apresentaram-se

normais. Já no 21o DAI, observou-se um aumento dos níveis de ferro sérico. Supõe-se

que de alguma forma o parasito desencadeie uma maior liberação de ferro do fígado

aumentando sua concentração no plasma dos animais infectados (tratados ou não). A

diminuição dos níveis de ferro sérico no grupo dos animais infectados e tratados está

correlacionada a quelação do ferro plasmático pela ação da DFA.

Letendre (1985) observou que durante as infecções há uma redução nos níveis

de ferro circulante devido à diminuição da liberação do ferro do sistema fagocitário

mononuclear, restringindo a quantidade de ferro para parasitos extracelulares, mas

sendo um benefício questionável no caso de parasitos intracelulares como o T. cruzi,


54

que se aloja em células fagocíticas mononucleares do sistema fagocitário mononuclear.

No trabalho realizado por Pedrosa et al. (1990) os níveis de ferro sérico em

camundongos tratados com DFA e infectados pelas cepas Y, CL e YuYu do T. cruzi

não sofreram redução. Lalonde e Holbein (1984) mostraram que camundongos não-

infectados pelo T. cruzi e tratados com DFA não apresentaram mudanças significativas

nos níveis de ferro sérico, enquanto os animais infectados e tratados apresentaram

suficientes estoques de ferro para manterem uma resposta imune normal. O protocolo

utilizado pelos autores acima diferiu do utilizado neste trabalho, pois tanto o inóculo

quanto a dose e a forma de administração da DFA foram diferentes.

No presente trabalho não se observou a diminuição de ferro sérico,

provavelmente porque as formas amastigotas do T. cruzi, ao se estabelecerem nas

células do sistema fagocítico mononuclear, na incapacidade de obtenção do ferro

necessário a sua sobrevivência diretamente do sistema fagocitário mononuclear,

favoreceram a liberação do mesmo para o soro. Uma vez no soro, este se liga a

transferrina e só então é disponibilizado para o parasito intracelular via endocitose

mediada por receptores.

Como observado por Bothwell et al. (1979), o primeiro pool de ferro no sangue

do hospedeiro vertebrado é constituído pelo ferro associado à hemoglobina. A

dosagem da hemoglobina é importante para se correlacionar à deficiência férrica do

hospedeiro quando submetido a dietas deficientes, infecções ou algum tipo de

tratamento que acarrete alterações nos níveis de ferro.

Alterações relacionadas aos níveis de hemoglobina foram descritas em várias

infecções por tripanosomas (Esievo et al., 1982; Igbokwe e Anosa, 1989). Estas

alterações foram observadas na infecção pelo T. cruzi e incluem redução no número de

plaquetas (Cardoso e Brener, 1980; Ruiz et al., 1989), no número de eritrócitos

(Cardoso e Brener, 1980) e no valor do hematrócrito (Lalonde e Holbein, 1984).

Marcondes et al. (2000) observaram que a infecção experimental aguda pelo T.

cruzi está associada à anemia, trombocitopenia, leucopenia e hipoplasia da medula

óssea. Contudo, os mecanismos responsáveis por estas alterações hematológicas não

são bem entendidos.

Pedrosa et al. (1990) avaliaram a deficiência de ferro e correlacionaram os

efeitos desta deficiência à evolução da doença de Chagas. Os autores mostraram que

a hipohemoglobinemia apresentada pelo hospedeiro foi permanente no grupo de

camundongos alimentados com dieta sem ferro, provavelmente porque os baixos


55

estoques de ferro não foram suficientes para compensar a eritropoiese que segue a

anemia. Nos animais tratados com DFA houve recuperação dos níveis de hemoglobina

quando infectados com as cepas CL e Y, sugerindo que este tratamento não interferiu

nas necessidades adequadas para a eritropoiese.

A diminuição dos níveis de hemoglobina observados no grupo dos animais

infectados e tratados em relação ao grupo dos animais não-infectados e tratados, é

explicada pela infecção pelo T. cruzi associado à ação da DFA na dose administrada

no presente trabalho.

Neste trabalho, os animais tratados com DFA, infectados ou não, apresentaram

em média um menor peso corporal do que os animais não-tratados de forma

semelhante ao observado por Hershko e Peto (1988). Possivelmente isto se deva a

ação do quelante que tenha levado à diminuição do peso corporal, ou o fármaco tenha

causado um desequilíbrio de ferro no organismo. A comparação do grupo infectado ao

controle mostrou que a infecção pelo T. cruzi não provocou redução do peso dos

animais. Carlomagno et al. (1987) demonstraram que o ganho de peso, os níveis de

proteínas e albumina no soro dos camundongos infectados pelo T. cruzi, não diferiram

em comparação aos animais controles, comprovando que a infecção não conduziu à

perda de peso.

No 14o e 21o DAI foram observadas diferenças significativas nos pesos relativos

do coração, baço, fígado e linfonodo em relação à infecção pelo T. cruzi. No 21o DAI os

órgãos dos animais infectados não-tratados apresentaram pesos relativos maiores do

que dos animais infectados tratados, possivelmente em decorrência do próprio

processo de infecção, com alterações nos órgãos afetados, sendo semelhantes ao

controles no 14o DAI. No 14o e 21o DAI, o baço, fígado e linfonodo dos animais do

grupo infectado não-tratado e infectado tratado com DFA apresentaram aumento de

peso em relação aos seus respectivos controles bem como em relação ao grupo

infectado no 14o DAI (p<0,05). No 21o DAI os grupos infectado tratado e infectado

foram semelhantes. Entre o 14o e o 21o DAI, observou-se aumento de peso relativo do

coração, baço, fígado e linfonodo apenas no grupo infectado não-tratado.

Possivelmente a ação da DFA é mais precoce, antes mesmo do 14o, e permite que os

animais infectados e tratados elaborem uma resposta imune mais efetiva do que os

animais infectados, aumentando sua sobrevida.

Experimentos em camundongos (Alden et al., 1987) e autópsias de crianças

desnutridas mostraram que o coração sofre hipotrofia proporcional ao grau de perda de


56

peso (Webb et al., 1986; Freeman et al., 1994). Herschko e Peto (1988) avaliando os

efeitos da DFA em ratos infectados por malária, mostraram que houve um ganho de

peso no baço de animais infectados pelo Plasmodium berghei. Por outro lado durante a

fase aguda da infecção pelo T. cruzi, a esplenomegalia e linfadenopatia relacionadas à

ativação policlonal de células B e T são características marcantes (Minoprio et al.,

1986a; Minoprio et al., 1986b).

A partir de várias indicações sobre a importância do ferro no desenvolvimento da

doença de Chagas, pode ser observado que alterações em seus níveis podem não só

mudar o curso da infecção, mas juntamente com o agente patogênico, podem alterar a

integridade dos diversos tecidos e órgãos afetados.

Os processos patogênicos na fase aguda da infecção no camundongo são

complexos e nele estão envolvidos o parasito, sua multiplicação, morte intracelular e os

mecanismos imunológicos, com as respostas humoral e celular, que levam às lesões

características dessa fase.

No curso destes processos, o surgimento de alterações nos órgãos e tecidos

está relacionado também ao tropismo da cepa e conseqüentemente ao maior

parasitismo dos diferentes setores do organismo (Andrade et al., 1970; Andrade, 1974).

O tempo de infecção e o inóculo utilizado podem também ser fatores relevantes no

curso da infecção.

Em estudos histopatológicos de ratos inoculados com as cepas Y, 12 SF e

Colombiana, Chapadeiro et al. (1980) descreveram lesões das fases aguda e crônica e

mostraram a importância do inóculo na intensidade destas. Inóculos baixos da cepa Y,

não determinaram lesões ou estas eram de grau leve. Nos ratos infectados com

inóculos médios e altos desta cepa, as lesões histopatológicas estavam presentes em

todos os grupos estudados.

Marinho et al. (1999) avaliaram a influência da carga parasitária em relação ao

parasitismo, patologia e ativação de sistema imune na fase crônica da doença de

Chagas. Os autores observaram que camundongos infectados com um inóculo maior

da cepa Y do T. cruzi (105 parasitos), apresentaram maior parasitemia, intensidade do

processo inflamatório no coração e músculo esquelético e maior ativação do sistema

imune do que os camundongos infectados com um inóculo menor (103 parasitos).

A forma aguda da doença representa uma infecção generalizada pelo T. cruzi,

pois suas formas amastigotas podem ser encontradas nas secções histológicas de

quase todos os órgãos e no interior de vários tipos celulares, usualmente com a


57

presença de infiltrado inflamatório mononuclear, congestão aguda e edema. A

inflamação é o processo patológico básico nos tecidos afetados, com a presença de

células inflamatórias, que incluem macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e células T

(Villalta e Kierszenbaum, 1983; 1984).

Apesar dos mecanismos envolvidos na patogênese de órgãos alvos do T. cruzi

não serem elucidados completamente, a persistência do parasito e os eventos auto-

imunes têm sido apontados como fundamentais na formação das lesões teciduais

(Tarleton, 1999).

Neste trabalho, os órgãos analisados são importantes para o entendimento das

lesões provocadas pelo T. cruzi e dos processos decorrentes dos tratamentos

empregados na experimentação. A inflamação do miocárdio é de extrema importância

em todo o processo patológico da doença, devido à maneira como as reações ao

parasito se desenvolvem neste órgão. O fígado é o principal órgão metabólico do corpo

e os hepatócitos têm a função de desintoxicação e de metabolização de muitas

substâncias exógenas. O baço e o linfonodo são órgãos importantes na resposta imune

e remoção do T. cruzi, sendo ao mesmo tempo alvo e componente ativo de resistência

à infecção pelo T. cruzi (Olivieri et al., 2002).

Os animais infectados não-tratados e tratados apresentaram alterações

semelhantes no coração, com variações dentro dos grupos na intensidade das

alterações histológicas.

O tratamento com o quelante não alterou a integridade dos órgãos nos grupos

não-infectados. O fígado dos animais do grupo infectado e tratado, apresentou menor

intensidade de alterações, sugerindo proteção pela DFA no 14o e 21o DAI quanto ao

baço este apresentou maior reatividade (hiperplasia e hipertrofia de polpa branca) do

que os animais não-tratados, compatível com resposta mais precoce neste grupo e

eventual proteção.

Lima et al. (2001) demonstraram que camundongos infectados com uma cepa

macrofagotrópica do T. cruzi (cepa Peruviana), desenvolveram esplenomeglia devido a

hiperplasia reativa com quantidades aumentadas de linfócitos e macrófagos,

culminando em desintegração do parasito e necrose de células parasitadas. A necrose

vem sendo atribuída à liberação de citocinas tóxicas, incluindo TNF-α, de macrófagos

parasitados. As lesões necróticas apresentaram-se mais intensas em camundongos

susceptíveis (C3H e Swiss) do que em camundongos resistentes (DBA).

Bowern et al. (1984) demonstraram que o tratamento com DFA na


58

encefalomielite alérgica no cérebro e medula espinhal de ratos levou a lesões sem

inflamação. É possível que o ferro influencie na migração e atividade de células imune

efetoras, que agem na formação de radicais livres. Por outro lado, Pedrosa et al.

(1993), não observaram diferenças na avaliação histopatológica dos órgãos dos

camundongos pertencentes ao grupo tratado com DFA, tratados com ferro-dextran e

seus controles.

No estudo histopatológico do coração dos animais infectados, tratados ou não,

foi observada a presença de parasitismo, processos inflamatórios e degenerativos.

Ribeiro dos Santos et al. (1991) observaram no modelo murino, que as lesões difusas

do miocárdio e as lesões de fibras cardíacas não-parasitadas estão ligadas aos

mecanismos de imunidade celular desde a fase aguda da doença. Como demonstrado

por Grimaud e Andrade (1984), a integridade das miocélulas é mantida mesmo na

presença do ninho parasitário, mas a partir do momento que as formas parasitárias

começam a se desintegrar as alterações nestas células têm início, levam à necrose e

induzem o aparecimento do infiltrado inflamatório. A determinação da inflamação aguda

é também confirmada por Silva et al. (1985), segundo os autores, a inflamação é

devido a formação de um complexo antígeno-anticorpo, a partir da liberação de

produtos antigênicos do parasito no interstício.

Apesar da redução dos níveis de parasitemia no grupo infectado e tratado com

DFA, não foram observadas diferenças significativas em relação ao parasitismo

tecidual avaliado no coração, baço, fígado e linfonodo dos animais infectados, apenas

a redução na intensidade do parasitismo do 14o para o 21o DAI, como era de se

esperar. Entretanto, de acordo com Melo e Brener (1978) não há correlação entre os

níveis de parasitemia e o número de parasitos intracelulares no coração durante o

curso da infecção pela cepa Y. Segundo Alvarenga (1960), o parasitismo hepático

também é escasso e se limita quase que exclusivamente às células de Kupffer.

A única droga disponível para o uso clínico que age diretamente no parasito é o

benznidazol. É um derivado nitro conhecido por reduzir os níveis de parasitismo e

eliminar os sintomas da fase aguda (Coura et al., 2002). Contudo, a eficácia da terapia

anti-T. cruzi na fase crônica é ainda controvérsia (Andrade et al., 1991a/b; Galvão et

al., 1993; Segura et al., 1994; Coura et al., 2002). Em decorrência disso, vários outros

caminhos bioquímicos estão sendo identificados como potenciais alvos quimioterápicos

contra o T. cruzi, entre eles estão os inibidores da biossíntese de esterol, da cisteína

protease, do metabolismo do pirofosfato e da biossíntese de novo da purina (Urbina e


59

Docampo, 2003).

A DFA, ao dificultar a disponibilização do ferro para os parasitos poderá ser de

grande valia para o esclarecimento dos efeitos das reduções de ferro durante a

infecção pelo T. cruzi. Além disso, outros estudos precisam ser realizados para

esclarecer os efeitos imunomoduladores da DFA no curso da infecção pelo T. cruzi e,

eventualmente, considerando que a DFA favoreceu o hospedeiro, reduzindo a

parasitemia e mortalidade do mesmo, a associação DFA/Benznidazol poderá contribuir

para a quimioterapia da doença de Chagas. Experimentos utilizando outras variáveis

tais como cepas que apresentem diferentes graus de susceptibilidade/resistência à

quimioterapia, cepas não letais para camundongos, camundongos naturalmente

resistentes à infecção pelo T. cruzi, quelantes mais potentes, precisam ser ainda

estudados para avaliar o real efeito dos níveis de ferro durante a infecção chagásica

tanto aguda quanto crônica.

6 - Conclusões

ARANTES, J.M. Conclusões

62

O tratamento com a DFA em dose de 5mg/dia/animal reduz a taxa de

mortalidade e o número de parasitos circulantes, no entanto, não afeta o parasitismo

tecidual.

A infecção por si só, reduz o ferro hepático, enquanto a associação

DFA/infecção mostra uma tendência a maior redução.

A infecção aumenta os níveis de ferro sérico; na associação DFA/infecção os

níveis de ferro sérico são mantidos.

O tratamento com DFA reduz os níveis de hemoglobina apenas nos animais

infectados.

O tratamento com a DFA reduz o peso dos animais independente da infecção.

Porém, o peso cardíaco nos animais infectados e tratados é mantido possivelmente

pelo desenvolvimento de uma resposta imune mais precoce, sendo observada pelo

aumento do peso relativo dos órgãos linfóides (fígado, baço e linfonodo) no 14o DAI e

pelo maior acometimento histopatológico do baço e linfonodo.

7 – Perspectivas futuras

ARANTES, J.M. Perspectivas futuras

64

Variações no período de tratamento bem como na forma de administração do

medicamento;

Testes in vitro utilizando diferentes quelantes;

Avaliar a modulação dos quelantes de ferro na resposta imune durante a infecção

pelo T. cruzi;

Associação de quelantes de ferro ao Benznidazol na fase aguda da infecção, com o

objetivo de avaliar os benefícios sobre o curso da infecção, utilizando cepas com

diferentes graus de susceptibilidade/resistência ao benznidazol;

Avaliação histopatológica do infiltrado inflamatório (quantificação de linfócitos CD4,

CD8, CD3 e neutrófilos);

8 - Referências Bibliográficas

ARANTES, J.M. Referências Bibliográficas

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a doença de chagas...para meu crescimento profissional e pessoal. ao professor washington tafuri em...

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