/ BIBLIOTECA Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Universidade de São P<lu19

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos Área de Nutrição Experimental

Efeito dos compostos fenólicos presentes no alecrim (Rosmarinus

officinalis L.) sobre as enzimas antioxidantes e os parâmetros

bioquímicos de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina

Ana Mara de Oliveira e Silva

Dissertação para obtenção do grau de MESTRE

Orientador: Praf. Tit. Jorge Mancini Filho

São Paulo 2008

../3 It.JJ

DEDALUS - Acervo - CQ

1: ~IIII ·IIIIIIII~ ·II~I·IIIIIIIIIIIII'IIIIIIIIIIIII~, III.~1I 30100013537

Ficha Catalográfica Elaborada pela Divisão de Biblioteca e

Documentação do Conjunto das Químicas da USP.

') Silva, Ana Mara de Oliveira e S586e Efei to dos compostos fenólicos pres en tes no ai ec rim (Rosmarinus

officinalis L.) sobre as enzimas antioxidantes e os parâmetros bi oq u í mi cos de ratos diabéti cos i nduzi dos por estreptozotoc i na / Ana Mara de Oliveira e Silva. -- São Paulo , 2008.

83p.

Dissertação (mestrado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental.

Orientador: Mancini Filho, Jorge

1. Nutrição experimental : Ciência dos alimentos 2. Alimentos funcionais: Ciência dos alimentos 3. Antioxidante: Ciência dos alimentos 4. Diabetes M e llitus I. T. II Mancini Filho, Jorge, orientador.

641.1 CDD

moam. —sels!nbuoo `sapepninpodo `soB!we

`cume' equiw `eppx equiw 313 e oSapeffie --aoalemoi aw e apod opn4 anb wa `snaa v

.oss! oprn weznpe4 anb seineled wa}s!xe oeN .sewn!"aldwas Soluawow

sesioa sewe} Jod Jessed ap spdap 'inbe soweBalp a oc5enpea6-sqd ep oquos olad soweini

a SOWeillaljUG `oc,5!AnN ap os.Ing op so!Bc4sa solad sowessed •oc5enpeJ6 eu nopm as anb

cappepian apez!we a owswauuedwoo ap eBuol cuqls!q ewn •••cau! `e6!we ewn 'euen y

oc5eJog naw ou scoon oBeJ .BSOJOWC a esoquueo `ep!un oimw sew

`cuanbad eniwel ewn ••-sowud rso4 `sove 'euuppew Soclui! `aew equiw ep aBuoi Jeo4

I alpo 3 'dom a ()Apeou! `e5Jo4 el!nw nap aw aldwas aweTs!!) owsaw anb e!!!we4 equiw v

iV0V512:180 •oss! .10d lancsuodsai apuei6 o a `oined `,900A 3

•Jel wn ap oBauguoge ou oms aw scoon woo -oined oes wa !nbe !auue6 anb e!!!we enou v

.oluemuloge a o!ode `ouuueo olad oined ocs ap sale!!!wei snaw soy

aTsap oe5ezfleal e eied weJinquwoo esoquueo a eis!ww eauol ap anb

`ouepd!o B!L1ÇA e epuewad 'euen `eJeqicE! `ewo 'euen iepadsa we `SOB!We SO SOPOT V

•alueTsuoa aidwas oA4ueou! e oiode olad !ne!d op leaapad apep!sian!un ep seJossajoid sv

.espq ap OESSGOU00 elad bdNO ov

.apez!we `opm ap ewpe

a apewon eoq epnw opuciisuowap Saivasaid weJaniisa as adwas oulegen aisa aweinp

anb SoTuaw!iv sop epucn ap ewei6oJd op so lepadsa wa `dsnind ep sopcuopunj soy

.on!A u! soluawpadxe so aweinp opdc ()Rd dsn/co!wino ap opmisul op a seopcoewied

sepuclo ap apepinged ep oe5cluewuedx3 a ocánpom ap ouc4o!8 op soucuopuni. soy

.s!e}uawpadxa so!esue ap oc5ez!leal a soluewed!nba

ap osn ou oe5eJoqeloo a ezapue6 elad dSfl/düd ep efflopled ap offleJoqei op o6o!G

a co!wino ap oinmsul op sogien sopuenpeJ6-sqd soe a emoono cpueloi eJossei.oad v

•ouleqe4 a;sau s!eluawcpunj sao5cluapo a sagisa6ns sesomen selad oueosewca c!!6cN

EJOSSGIOJd e uno !nd Jossai.om `e6uepa8 e!AMS CJOSS040Jd lep!A s!xciv Jossai.cud ov

•e!ip e eip op soa!auuedwoo

•••o6opp ap soluawow a oquueo 'apez!we elad osJno e ougneJoqel ap se6aloa soy

.ou!sue

ap !negai; olad dsnidod ep soluawlly sop ep1.910 ap eweJBoJd op saJossajoad soy

'es!nbsad ap a

copapeoe ep!A equiw eu 0A4UGOU! e e5LIC41100 `ocõeluapo elad !upuen 96.10r JOSS04.0.1d OV

SOIN3IN133aVaDV

SILVA, AM.O. Efeito dos compostos fenólicos presentes no alecrim (Rosmarinus officinalis L.) sobre as enzimas antioxidantes e os parâmetros bioquímicos de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina. São Paulo, 2008. 83p. Dissertação de Mestrado - Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Universidade de São Paulo.

Resumo

As ervas e especiarias são fontes de antioxidantes. Essa capacidade antioxidante está relacionada aos compostos fenólicos que apresentam papel importante nos processos de inibição da peroxidação e podem atuar sobre o estresse oxidativo, relacionado com diversas patologias, inclusive o diabetes. O alecrim é bastante apreciado por seu aroma e sabor, tendo como constituintes os seguintes compostos fenólicos: ácido carnósico, carnosol, ácido rosmarínico, ácido caféico e éster do ácido hidroxicinâmico. Objetivou-se avaliar a capacidade antioxidante in vitro de extratos e frações de ácidos fenólicos obtidos das folhas de alecrim e seu efeito sobre ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina. Constatou-se que tanto os extratos como as frações apresentaram altos teores de compostos fenólicos totais e expressiva atividade antioxidante in vitro nos três métodos utilizados: ~­caroteno/ácido linoléico, varredura do radical DPPH e ORAC. No ensaio in vivo, foi utilizado modelo de diabetes tipo 1, apresentando as características principais: poliúria, polifagia, polidipsia e perda de peso. Observaram-se alterações na atividade das enzimas antioxidantes, nos parâmetros bioquímicos do sangue e aumento significativo (p<0,05) da glicemia, no percentual de hemoglobina glicosilada (Hb-G), nos níveis de triglicérides, de colesterol total, de creatinina, de AL T e de AST. O extrato aquoso de alecrim administrado por 30 dias na concentração de 50 mg/Kg aumentou a atividade das enzimas CAT e GPx, no fígado, e da SOD no cérebro de ratos diabéticos, diminuindo também o percentual de Hb-G. A mesma dose, quando administrada por 60 dias, reduziu o percentual de Hb-G, nos lipídios circulantes, na creatinina, na atividade das enzimas SOD e GPx dos tecidos avaliados e manteve os valores normais das enzimas de função hepática AL T e AST. Não foi observado efeito dose resposta nos parâmetros analisados, sugerindo que a maior dose (100mg/Kg) apresentou níveis de toxicidade que devem ser melhor caracterizados. Portanto, o extrato aquoso de alecrim apresentou capacidade antioxidante in vitro significativa e quando administrado na concentração de 50 mg/Kg pode ter papel importante sobre o estresse oxidativo presente no diabetes experimental.

Palavras-chave: antioxidantes naturais; compostos fenólicos; alecrim; estresse oxidativo; diabetes

SILVA, A.M.O. Efeito dos compostos fenólicos presentes no alecrim (Rosmarinus officinalis L.) sobre as enzimas antioxidantes e os parâmetros bioquímicas de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina. São Paulo, 2008. 83p. Dissertação de Mestrado - Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Universidade de São Paulo.

Abstract

Herbs and spices are potential sources of antioxidants. This antioxidant capacity is related to the presence of phenolic compounds that play an important role in the peroxidation inhibition processes, that can act on the oxidative stress, which is related to various diseases, including the diabetes. Rosemary is much appreciated due to its aroma and flavor properties, and has the following constituents as phenolic compounds: carnosic acid, carnosol, rosmannlc acid, cafeic · acid , and hydroxycinnamic ester. This study aimed to evaluate the in vitro antioxidant capacity of the extracts and fractions of phenolic acids obtained from the leaves of rosemary and its effect on diabetic rats induced by streptozotocin. The results showed that both extract and fractions contains high leveis of total phenolic compounds, and a significant in vitro antioxidative activity evaluated by three methods: ~-carotene / Linoleic acid system, DPPH radical scavenging and ORAC. For in vivo tests, it was used a type 1 diabetes model, which presented the main clinicai features : polyuria, polyfagia, polydipsia, and weight loss. It was also observed the following changes in biochemical markers: an altered antioxidant enzymatic activity; a significant increase (p<0.05) of blood glucose, percentage of glycosylated hemoglobin (Hb-G), triglycerides, total cholesterol, creatinine, and enzymes AL T and AST. The aqueous extract of rosemary administered daily for 30 days at dose of 50 mg/kg increased the activity of enzymes CAT and GPx in the liver and SOD in the brain of diabetic rats, also decreased the percentage of Hb-G. The same dose, when administered for 60 days, led to a reduction of percentage of Hb-G, circulating lipids, and creatinine, also reducing the activity of enzymes SOD and GPx in the analyzed tissues, and maintaining the normal function of liver enzymes AL T and AST. There was no dose­response effect on the studied parameters. Some toxic effect was observed when higher doses were used (100 mg/kg) but this effect must be better characterized. Therefore, aqueous extracts of rosemary at dose of 50 mg/kg presented a significant in vitro antioxidant capacity that can be an important role on the oxidative stress in experimental diabetes.

Keywords: natural antioxidants; phenolic compounds; rosemary; oxidative stress; diabetes

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

1. INTRODUÇÃO 1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3

2.1 Diabetes mellitus 3

2.2 O papel da hiperglicemia no estresse oxidativo do diabetes 5

2.3 Glicosilação de proteínas e formação dos AGE 9

2.4 Modelo de diabetes experimental 12

2.5 Antioxidantes no diabetes 13

2.6 Compostos fenólicos 15

2.7 Alecrim 17

3. OBJETIVOS 20

4. MATERIAL E MÉTODOS 21

4.1 Material 21

4.1.1 Amostras 21

4.1.2 Animais 21

4.2 Métodos 21

4.2.1 Preparação dos extratos etéreo, alcoólico e aquoso 21

4.2.2 Extração e hidrólise de ácidos fenólicos 22

4.2.3 Compostos fenólicos 24

4.2.4 Identificação dos ácidos fenólicos 25

4.2.5 Atividade antioxidante em sistema modelo [3-caroteno/ácido linoléico 26

4.2.6 Atividade antioxidante em sistema de varredura de radicais livres (DPPHo) 27

4.2.7 Atividade antioxidante pelo método ORAC 28

4.2.8 Avaliação da atividade antioxidante in vivo 29

4.2.8.1 Efeito da administração do extrato aquoso de alecrim por 30 dias em

ratos diabéticos 29

4.2.8.2 Indução do diabetes 29

4.2.8.3 Separação do fígado e cérebro 30

4.2.8.4 Preparo dos homogeneizados dos tecidos cerebral e hepático 31

4.2.8.5 Determinação das atividades das enzimas antioxidantes 31

4.2.9 Efeito da administração do extrato aquoso de alecrim por 60 dias em

ratos diabéticos 33

4.3 Análise estatística

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Caracterização química

5.2 Atividade antioxidante in vitro

5.2.1 Sistema (3-caroteno/ácido linoléico

5.2.2 Sistema de varredura do radical DPPH·

5.2.3 Atividade antioxidante pelo método ORAC

5.3 Atividade antioxidante in vivo

34

35

35

36

37

38

41

44

5.3.1 Efeito da administração do extrato aquoso de alecrim por 30 dias em 44

ratos diabéticos

5.3.1.1 Efeito do extrato aquoso de alecrim sobre as enzimas antioxidantes 47

nos tecidos hepático e cerebral

5.3.2 Efeito da administração do extrato aquoso de alecrim por 60 dias em 51

ratos diabéticos

5.3.2.1 Efeito do extrato aquoso de alecrim sobre os parâmetros de função

renal 54

5.3.2.2 Efeito do extrato aquoso de alecrim sobre os lipídios circulantes 56

5.3.2.3 Efeito do extrato aquoso de alecrim sobre as enzimas

transaminases glutâmico piruvato (AL T) e glutâmico oxalacética (AST) 58

5.3.2.4 Efeito do extrato aquoso de alecrim sobre as enzimas antioxidantes

nos tecidos hepático, renal e cerebral

6. CONCLUSÕES

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

8. ANEXOS

59

64

65

76

LISTA DE ABREVIATURAS

AAPH

AFL

AFS

AFI

AGE

ALT

AST

BSA

CAT

0-H20

0-25

O-50

0-100

OM

OPPH

EA

EAI

EEt

GPx

GR

GSH

GSSH

H20 2

HbA1c

ORAC

PKC

SOO

STZ

THF

2,2'-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride

Ácidos fenólicos livres

Ácidos fenólicos solúveis

Ácidos fenólicos insolúveis

Produtos de glicação avançada

Aminotransferase de alanina

Aminotransferase de aspartato

N, O-Bis (trimetilsilil)-acetamina

Catalase

Animais diabéticos tratados com água

Animais diabéticos tratados com extrato aquoso na dose de 25 mg/Kg

Animais diabéticos tratados com extrato aquoso na dose de 50 mg/Kg

Animais diabéticos tratados com extrato aquoso na dose de 100 mg/Kg

Diabetes mellitus

2,2 difenil-1-pricril-hidrazil

Extrato aquoso de alecrim

Extrato alcoólico de alecrim

Extrato etéreo de alecrim

Glutationa peroxidase

Glutationa redutase

Glutationa reduzida

Glutationa oxidada

Peróxido de hidrogênio

Hemoglobina glicosilada

Oxigen radical absorbance capacity assay

Proteína quinase C

Superóxido dismutase

Estreptozotocina

Tetraidrofurano

LISTA DE TABELAS

Tabela 1

Tabela 2

Tabela 3

Tabela 4

Tabela 5

Tabela 6

Tabela 7

Tabela 8

Tabela 9

Tabela 10

Quantidade de fenólicos totais de extratos e frações de ácidos

fenólicos obtidos das folhas de alecrim expressa por mg de

equivalente de ácido gálico.

Teor de ácidos fenólicos livres e de esterificados solúveis e

insolúveis individuais presentes na amostra de alecrim.

Atividade antioxidante dos extratos aquoso e alcoólico e das

frações AFL, AFS e AFI obtidos das folhas de alecrim em sistema

f3-caroteno/ácido linoléico.

Resultados de atividade antioxidante de extratos e frações de

ácidos fenólicos de alecrim expresso em micromoles equivalentes

de Trolox®/ g de peso seco do material.

Controle de peso (g) de ratos controle e diabéticos tratados com

água ou extrato aquoso de alecrim por 30 dias.

Consumo de ração (g/dia) e ingestão de água (mUdia) de ratos

controle e diabéticos tratados com água ou extrato aquoso de

alecrim por 30 dias.

Determinação da glicemia de ratos controle e diabéticos tratados

com água ou extrato aquoso de alecrim por 30 dias.

Controle de peso (g) de ratos controle e diabéticos tratados com

água ou extrato aquoso de alecrim por 60 dias.

Consumo de ração (g/dia) e ingestão de água (mUdia) de ratos

controle e diabéticos tratados com água ou extrato aquoso de

alecrim por 60 dias.

Determinação da glicemia de ratos controle e diabéticos tratados

com água ou extrato aquoso de alecrim por 60 dias.

35

36

38

42

44

45

46

52

52

53

LISTA DE FIGURAS

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Figura 7

Figura 8

'Figura 9

Figura 10

Figura 11

Figura 12

Figura 13

Figura 14

Figura 15

Figura 16

Geração das espécies reativas de oxigênio e ativação das

principais vias induzidas pela hiperglicemia 5

Produção dos precursores dos produtos de glicação avançada

e suas conseqüências 6

Esquema simplificado do envolvimento da oxidação e glicação

na neuropatia periférica e doença vascular do diabetes 8

Estágios da glicação não-enzimática das proteínas 9

Percentual de hemoglobina glicosilada e risco relativo de

complicações microvasculares

Mecanismo simplificado envolvendo a hiperglicemia

Biossíntese dos compostos fenólicos

Fluxograma da obtenção dos extratos de alecrim

Fluxograma de obtenção das frações de ácidos fenólicos

Distribuição dos grupos experimentais

Atividade antioxidante e valores de IC50 dos extratos etéreo,

alcoólico e aquoso e frações de ácidos fenólicos livres,

solúveis e insolúveis obtidos das folhas de alecrim em sistema

10

12

16

22

24

30

de varredura do radical DPPH· 40

Correlação entre os três métodos: f3-caroteno/ácido linoléico,

DPPH e ORAC dos extratos e frações de ácidos fenólicos

obtidos das folhas de alecrim

Dosagem de Hemoglobina glicosilada (HbA1c) de ratos

controle e diabéticos tratados com água ou extrato aquoso de

alecrim por 30 dias

Determinação da atividade das enzimas antioxidantes no

tecido hepático de animais controle e diabéticos tratados com

43

47

água ou extrato aquoso de alecrim nas concentrações 30 dias 48

Determinação da atividade das enzimas antioxidantes no

tecido cerebral de animais controle e diabéticos tratados com

água ou extrato aquoso de alecrim por 30 dias 49

Dosagem de hemoglobina glicada (HbA 1c) de ratos controle e

diabéticos tratados com água ou extrato aquoso de alecrim por

60 dias 54

Figura 17

Figura 18

Figura 19

Figura 20

Figura 21

Figura 22

Determinação da creatinina, uréia, proteínas totais e albumina

sérica de ratos controle e diabéticos tratados com água ou

extrato aquoso de alecrim por 60 dias 55

Determinação de triglicérides, colesterol total e colesterol HDL

sérico de ratos controle e diabéticos tratados com água ou

extrato aquoso de alecrim por 60 dias

Determinação das enzimas marcadoras de dano hepático de

ratos controle e diabéticos tratados com água ou extrato

aquoso de alecrim por 60 dias

Determinação da atividade das enzimas antioxidantes no

tecido hepático de animais controle e diabéticos tratados com

água ou extrato aquoso de alecrim por 60 dias

Determinação da atividade das enzimas antioxidantes no

tecido renal de animais controle e diabéticos tratados com

57

59

60

água ou extrato aquoso de alecrim por 60 dias 61

Determinação da atividade das enzimas antioxidantes no tecido

cerebral de animais controle e diabéticos tratados com água ou

extrato aquoso de alecrim por 60 dias 62

1. INTRODUÇÃO

Diabetes mellitus (DM) é um dos principais problemas de saúde pública no

mundo. Estima-se que cerca de 143 milhões de pessoas em todo o mundo sofram de

diabetes e acredita-se que esse número possa dobrar até 2030 (WILD et aI., 2004;

ROCHA et aI., 2006). O Brasil estaria entre os 10 países com a maior taxa de

prevalência.

O diabetes é um distúrbio endócrino no qual o metabolismo da glicose está

alterado devido à liberação ou à perda total de insulina após destruição das células J3

pancreáticas responsáveis pela produção e liberação desse hormônio. É, também, uma

insensibilidade à insulina pelos tecidos alvos (ROCHA et aI., 2006) .

Descobertas recentes sobre a fisiopatologia do diabetes mostram que o

desequilíbrio no metabolismo de carboidratos propicia um quadro de hiperglicemia,

associado ao aumento na produção de radicais livres e à depleção nos sistemas

fisiológicos de defesa antioxidante (estresse oxidativo). Os danos oxidativos

hiperglicêmicos podem favorecer o desenvolvimento de enfermidades, tais como:

catarata, microangiopatias, nefropatias, aterosclerose, infecções e alterações

neurológicas (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 1999).

Além disso, a hiperglicemia induz à ativação das isoformas da proteína

quinase C (PKC), ao aumento na formação dos precursores dos produtos de glicação

avançada (AGE); também estimula a elevação no fluxo de glicose na via das aldose­

redutases, resultando em acúmulo de sorbitol e ativação da via da hexosamina

(BROWNLEE, 2001; PACKER; KRAEMER; RIMBACH, 2001; BROWNLEE, 2005;

ROCHA et aI., 2006; ROLO e PALMEIRA, 2006). Esses são os principais mecanismos

metabólicos pelos quais a hiperglicemia causa as complicações do diabetes com lesão

tecidual.

Estudos mostram que, além do aumento na formação de radicais livres, os

sistemas fisiológicos de defesa antioxidante encontram-se depletados no diabetes. Por

esta razão, vários pesquisadores têm usado modelos de animais diabéticos, pacientes

diabéticos ou cultura de células vasculares para avaliar o efeito de antioxidantes

2

clássicos , como as vitaminas C e E, o l3-caroteno, o ácido lipóico, entre outros, na

prevenção e no tratamento das complicações do diabetes (ZHAO, 2001) .

Alguns compostos obtidos de fontes naturais podem atuar na inibição da

patogenicidade multifatorial do diabetes, através do controle do metabolismo de

carboidratos, na prevenção e restauração da integridade e função das células 13

pancreáticas, no estímulo à liberação de insulina, na melhora da captação e utilização

da glicose e por suas propriedades antioxidantes (ROCHA et ai., 2006).

As ervas e especiarias são fontes desses compostos naturais e o alecrim

(Rosmarinus officinalis L.), pertencente à família Labiatae, tem sido muito estudado por

suas propriedades aromáticas, antioxidante, antimicrobiana e antitumoral (ALMELA et

a/., 2006) .

Cintra (1998) demonstrou que os extratos de alecrim apresentaram potencial

antioxidante no sistema l3-caroteno/ácido linoléico, em homogeneizado de cérebro e na

fração microssomal hepática in vitro. O extrato aquoso dessa especiaria também

preveniu hepatoxicidade induzida por azatioprine em ratos , reduzindo o estresse

oxidativo (AMIN e HAMZA, 2005). Da mesma forma, foi observado efeito hepatoprotetor

contra a lesão aguda provocada pelo tetracloreto de carbono, via aumento na atividade

do sistema de desintoxicação dependente da glutationa S-transferase (SOTELO-FÉLlX

et aI. , 2002) .

3

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Diabetes mel/itus

Diabetes é uma síndrome de etiologia múltipla, decorrente da falta de insulina

e/ou da incapacidade desta de exercer adequadamente seus efeitos. Caracteriza-se por

hiperglicemia crônica, freqüentemente acompanhada de dislipidemia, hipertensão

arterial e disfunção endotelial (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 1999). É

considerada uma doença metabólica crônica, que interfere no metabolismo dos

carboidratos, lipídios e proteínas (DUCKWORTH, 2001).

O diabetes é considerado um problema de importância crescente em saúde

pública; cujas incidência e prevalência aumentam cada vez mais e alcançam

proporções epidêmicas. Um estudo recente da Organização Mundial de Saúde estimou

que a prevalência mundial de diabetes em 2002 foi de 170 milhões de casos, com

projeção de crescimento para 366 milhões de pessoas acometidas pela doença em

2030. O Brasil, de acordo com esse estudo, ocupará a sexta posição, com 11,3 milhões

de casos estimados (WILD et aI., 2004).

As conseqüências, a longo prazo, decorrem de alterações micro e

macrovasculares que proporcionam disfunção, dano ou falência de vários órgãos

(DUCKWORTH, 2001). As complicações crônicas incluem: nefropatia, retinopatia ,

neuropatia, artropatia de Charcot e manifestações de disfunção autonômica, incluindo

disfunção sexual. Além do mais, indivíduos diabéticos apresentam risco maior de

doença vascular aterosclerótica, como doença coronariana, doença arterial periférica e

doença vascular cerebral (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 1999).

O diabetes está associado a complicações que comprometem a qualidade de

vida e a sobrevida dos indivíduos. Além disso, acarreta elevados custos para o controle

metabólico e o tratamento de suas complicações. Aparece como a sexta causa mais

freqüente em internação hospitalar e participa de forma significativa (30% a 50%) de

outras enfermidades, como cardiopatia isquêmica, insuficiência cardíaca,

colecistopatias, acidente vascular cerebral (AVC) e hipertensão arterial. Também é a

principal causa de amputações de membros inferiores e de cegueira adquirida. Cerca

4

de 26% dos pacientes que ingressam em programas de diálise são diabéticos

(SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES, 2003).

A classificação atualmente recomendada incorpora o conceito de estágios

clínicos do DM, desde a normalidade, passando para a tolerância à glicose diminuída

e/ou glicemia de jejum alterada, até o DM propriamente dito. A nova classificação

baseia-se na etiologia do DM, eliminando os termos diabetes melito insulinodependente

(IDDM) e não-insulinodependente (NIDDM). Essa classificação inclui: diabetes tipo 1,

tipo 2, diabetes gestacional e a categoria de outros tipos específicos, contendo várias

formas de DM decorrentes de defeitos genéticos associados com outras doenças ou

com uso de fármacos diabetogênicos (SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES,

2003).

O diabetes tipo I resulta primariamente da destruição das células beta

pancreáticas e tem tendência à cetoacidose. Inclui casos decorrentes de doença auto­

imune e aqueles nos quais a causa da destruição das células beta não é conhecida.

Corresponde a 5% a 10% do total de casos. A forma rapidamente progressiva é co­

mumente observada em crianças e adolescentes, porém pode ocorrer também em

adultos. A forma lentamente progressiva ocorre geralmente em adultos e é referida

como diabetes latente auto-imune do adulto (LADA). Já o DM do tipo 2 resulta, em

geral, de graus variáveis de resistência à insulina e deficiência relativa de secreção de

insulina. A maioria dos pacientes tem excesso de peso e a cetoacidose ocorre apenas

em situações especiais, como durante infecções graves. O diagnóstico, na maioria dos

casos, é feito a partir dos 40 anos de idade, embora possa ocorrer mais cedo, mais

raramente em adolescentes. Abrange de 85% a 90% do total de casos. É importante

ressaltar que, nos últimos anos, a incidência de diabetes do tipo 2 vem crescendo entre

crianças e jovens nos Estados Unidos, em associação ao aumento da obesidade

(ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 1999).

Os principais sintomas no DM tipo 1 são: polidipsia, poliúria, perda de peso,

polifagia , visão comprometida, infecções repetidas na pele ou mucosas, fadiga e dores

nas pernas. Em alguns casos não há sintomas. Isto ocorre com maior freqüência no

diabetes tipo 2. Neste caso, o diagnóstico pode demorar muitos meses, às vezes anos.

5

Os sintomas muitas vezes são vagos, como formigamento nas mãos e pés

(SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES, 2007).

O quadro de hiperglicemia crônica e persistente nos dois tipos de diabetes

leva ao aparecimento do estresse oxidativo e diminuição no potencial antioxidante. As

espécies reativas formadas no diabetes estão envolvidas com peroxidação lipídica,

glicação de proteínas, inativação de enzimas e alteração nas estruturas celulares e,

conseqüentemente, com danos ao organismo (PACKER; KRAEMER; RIMBACH , 2001 ;

ROLO e PALMEIRA, 2006).

2.2 O papel da hiperglicemia no estresse oxidativo do diabetes

O estresse oxidativo no diabetes com aumento das espécies reativas na

mitocôndria está associado a vários mecanismos envolvendo a hiperglicemia como fator

principal , que resulta na estimulação de quatro vias principais : via do poliol , produção

intracelular dos precursores dos AGE, ativação da proteína quinase C (PKC) e ativação

da via da hexosamina (BROWNLEE, 2001; PACKER; KRAEMER; RIMBACH, 2001;

BROWNLEE, 2005; LAPOLLA; FEDELE; TRALDI, 2005; ROLO e PALMEIRA, 2006).

Essas vias estão apresentadas na Figura 1.

t Glucose NAD, ~IADP+ NAD+

~ .•. ~.. q t S~rbi tol ";;~Ioooooo~ t Glucose-6-P ]111 VIa do polrol ! ! ··-·---GFAT-- m

------- -----••• ••• - - ••••

NADH NAD+

t DHAP \, <1 t a:-Glycerol-P + t DAG+ t PKC

t Glyceralclellyde-3-P ~ Via da PKC

N::'~IGAPDH~ ~,_ 1.3-Diphosphoglycerate

t Meul ylglyoxal-+t AGEs

Via dos AGE

i Fatores de transcrição

i i expressão de genes

pró-inflamatórios

Figura 1 - Geração das espécies reativas de oxigênio e ativação das principais vias induzidas pela hiperglicemia (BROWNLEE, 2001).

6

A via do poliol foca na enzima aldose redutase, que tem a função de reduzir

aldeídos téxicos a álcoois inativos nas células. Mas em altas concentrações de glicose

essa enzima converte a glicose em sorbitol, que depois será oxidado à frutose. Nessa

reação, a aldose redutase consume NADPH, que é também um cofator essencial para

regenerar a glutationa, um antioxidante intracelular, aumentando a susceptibilidade ao

estresse oxidativo intracelular (BROWNLEE, 2005).

A produção intracelular dos precursores dos produtos finais de glicação

avançada (AGE) pode causar dano celular por três mecanismos (ilustrados na Figura

2).

Glicose

Matriz

Integrinas

Receptorde AGE

Fatores decrescimento e

citocinas

Macrófago ecélulas

mesangiais

Figura 2 - Produção dos precursores dos produtos de glicação avançada e suasconseqüências (BROWNLEE, 2001).

o primeiro mecanismo demonstrado numa célula endotelial é a modificação

de proteínas intracelulares, incluindo principalmente proteínas envolvidas na regulação

de transcrição de genes. O segundo está associado à capacidade destes precursores

se difundirem na célula e modificarem moléculas da matriz extracelular, alterando a

sinalização entre a matriz e a célula e, assim, causando disfunção celular. Estes

7

precursores, uma vez atingido o espaço extracelular, podem modificar também

proteínas sanguíneas como a albumina. Essas proteínas modificadas podem então se

ligar aos receptores dos AGE e ativá-los. Quando ativados, esses receptores sinalizam

uma série de reações de produção de citocinas inflamatórias e fatores de crescimento,

ocorrendo as complicações vasculares (BROWNLEE, 2005).

A hiperglicemia aumenta a síntese celular do diacilglicerol (DAG), que é um

cofator para ativação das isoformas da PKC. Quando essa proteína é ativada pela

hiperglicemia celular, ocorre uma variedade de eventos como: inibição da expressão da

enzima óxido nítrico sintase tipo endotelial, aumento na expressão do NF-KB, aumento

na atividade das enzimas NADPH oxidases e na expressão do fator de crescimento

endotelial vascular (VEGF) - aumento que está associado ao processo de

angiogênese e permeabilidade vascular, entre outros. A inibição da PKC previne,

portanto, alterações na retina e rins de animais diabéticos que têm associação com as

alterações micro e macrovasculares (BROWNLEE, 2005).

A via da hexosamina está relacionada com a formação da UDP N-acetil

glicosamina (UDP-GlcNAc) a partir de um intermediário da via glicolítica, a frutose 6-

fosfato. Essa glicosamina tem papel importante, tanto nas alterações da expressão

gênica em células glomerulares, como na disfunção de cardiomiócitos em cultura

celular, ambas induzidas pela hiperglicemia (BROWNLEE, 2005).

No entanto, outros eventos também contribuem para o aumento do estresse

oxidativo no diabetes, tais como: produção excessiva de radicais livres, pela

autoxidação da glicose e via cadeia transportadora de elétrons mitocondrial;

estimulação da via do citocromo P-450, pelo excesso de NADPH produzido a partir do

metabolismo da glicose; alteração na taxa NADPH:NADP; redução da atividade das

enzimas antioxidantes, que limita sua capacidade de eliminar as espécies reativas; e

ativação das NADPH oxidases (DICKINSON et aI. , 2002; JAIN, 2006). A produção das

espécies reativas de oxigênio associadas à NADPH oxidase pode alterar parâmetros de

tradução de sinal , secreção de insulina, ação da insulina e proliferação e morte celular,

sendo, portanto, uma via estratégica de intervenção para reverter o impacto negativo da

toxicidade dessas espécies reativas no diabetes (NEWSHOLME et aI., 2007) .

8

Esses eventos estão associados com o aparecimento das complicações

crônicas, entre elas a neuropatia periférica e a doença vascular, como são mostrados

na Figura 3.

Durante o desenvolvimento do diabetes, inúmeros fatores fisiológicos e

bioquímicos resultam em disfunção endotelial e inflamação vascular. A disfunção

endotelial é causada pela exposição crônica ao estresse oxidativo e modificação da

lipoproteína de baixa densidade (colesterol LDL), entre outros processos que

promovem menor disponibilidade de óxido nítrico (NO), pelo desacoplamento da enzima

óxido nítrico sintase endotelial e/ou formação de peroxinitrito, e inflamação crônica. A

inflamação vascular aumentada, incluindo acréscimo na expressão da interleucina-6 (IL-

6) e moléculas de adesão celular vascular (VCAM), também contribui com a diminuição

do fator de relaxamento endotelial (NO). A hiperglicemia persistente no diabetes

compromete a função endotelial ligada à formação dos AGE. Em contrapartida, a

inibição da síntese destes produtos previne a depleção de NO (HARTGE; UNGER;

KINTSCHER, 2007).

(

t Autoxidação da glicose Desacoplamento

da eNOS E S i Respiração mitocondrial T

~ ~~:~:~~:::::~dente de p~~.?.~ ................ ~....... . .. , i NADH/NADPH oxidase . t produção de radicais i S

! E livres intra/extra celular; ~

t Superóxido 'O HIPERGLICEMIA 7"ãO t Peroxinitrito

•........................................................ ~

i Glicação protéica/formação dos AGE

X I D A

i Ligação dos receptores dos AGE

t Glicação de HDL e albumina / i

v O

Depleção da

defesa antioxidante

• Oxidação da LDL

• Peroxidação lipídica

• t Fluxo sanguíneo

endoneural

~

• Disfunção

periférica neural

• Disfunção

vascular

Figura 3 - Esquema simplificado do envolvimento da oxidação e glicação na neuropatia periférica e doença vascular do diabetes (DICKINSON et a/. , 2002).

9

2.3 Glicosilação de proteínas e formação dos produtos de glicação avançada

A glicosilação não-enzimática de proteínas ocorre numa reação direta entre

os açúcares e o grupo amino das proteínas, formando a base de Schíff, seguida de um

rearranjo de Amadori (Figura 4). Nessa reação, a lisina aparece como a principal amina

primária intracelular, sendo as glicosilaminas e frutosaminas os principais intermediários

da cascata de glicação não-enzimática (SZWERGOLD; HOWELL; BEISSWENGER,

2002; BEM e KUNDE, 2006). Estes, por sua vez, podem levar à formação dos AGE, que

depois participam de reações bioquímicas (PENCKOFER; SCHWERTZ; FLORCZA,

2002) e, também, podem acumular-se nos tecidos diabéticos, causando danos

especialmente às proteínas de vida longa, como as proteínas do cristalino, proteínas

dos eritrócitos, albumina, colágeno, mielina, entre outras, produzindo efeitos

indesejáveis à função celular (ASGARY et ai. , 1999; SZWERGOLD; HOWELL;

BEISSWENGER, 2002).

NH2

~ +

o OH

~\ I C-C- R

/ I H H

1 r OH I

- N = CH - CH-R

l i o II

- NH - CH"- C - R "'-

n f

(Açúcar)

(Base de Schiff)

(Produto de Amadorr)

Produtos Finais de Glicação Avançada (AGEs)

Figura 4 - Estágios da glicação não-enzimática das proteínas (BEM e KUNDE, 2006).

10

A hemoglobina glicosilada (A 1 c) é formada pela reação irreversível entre a

glicose sanguínea e a hemoglobina, como resultado do processo de glicação, que liga a

glicose sanguínea a muitas proteínas do corpo. Este é o mesmo processo de glicação,

relacionado ao desenvolvimento das complicações crônicas, mencionado

anteriormente.

A glicação não-enzimática da hemoglobina (HbA1c) já é bem definida e, no

diabetes, encontra-se significativamente aumentada (GOLDSTEIN, 1995; ASGARY et

aI., 1999; SENGUPTA e SWENSON, 2005; SHIMADA et aI., 2005). Por se tratar de

uma reação oxidativa, os antioxidantes seriam capazes de prevenir a glicosilação das

proteínas.

A hemoglobina glicosilada (A 1 c) deve ser medida rotineiramente nos

pacientes com diabetes mellitus para documentar o grau de controle glicêmico. As

metas de tratamento devem ser baseadas em resultados de estudos clínicos

prospectivos e randomizados, tais como o Diabetes Control and Complications Trial

(DCCT) e o United Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS). Esses estudos

mostraram correlação entre o controle glicêmico, quantificado por determinações

seriadas de A 1 c, e os riscos de desenvolvimento e progressão das complicações

crônicas do diabetes (GRUPO INTERDISCIPLINAR DE PADRONIZAÇÃO DA

HEMOGLOBINA GLlCOSILADA - A1c, 2004), como mostra a Figura 5 .

20

15

13

Aic (%) 1i 12

..... Retinopatía

...... Nefropatia

-4- Neuropatia

- Microalbuminúria

Figura 5 - Percentual de hemoglobina glicosilada e risco relativo de complicações microvasculares (Grupo Interdisciplinar de Padronização da Hemoglobina Glicosilada -A1c, 2004).

1 I

A hemoglobina glicosilada funciona como um marcador do controle glicêmico,

assim como a dislipidemia para doenças cardiovasculares.

Muitos estudos têm demonstrado a ação dos antioxidantes na glicação

protéica. Asgary et aI. (1999) observaram o efeito antioxidante dos flavonóides

quercetina, rutina e canferol na glicação da hemoglobina. Bae e Lee (2004) também

verificaram efeito protetor de extratos de ginseng na glicação da hemoglobina; tal efeito

foi atribuído à sua capacidade antioxidante. Um estudo mais recente avaliou in vitro o

potencial antioxidante de substâncias naturais de plantas, incluindo os compostos

fenólicos, usando como modelo a glicoxidação de proteína (BOUSOVÁ et aI., 2005).

O processo de glicoxidação leva à produção de carbonilas extremamente

reativas. Uma vez formados, os AGE podem ser oxidados, levando à formação de

dicarbonilas, tais como metil glioxal (MG), glioxal e 3-deoxiglicosona, bem como diacetil

e piruvaldeído. Este processo ocorre quando há excesso de glicose e altos níveis de

moléculas oxidantes, um problema particular no diabetes. MG e glioxal podem ser

formados através de outros mecanismos, como no fluxo glicolítico aumentado; e como

estes compostos reagem com proteínas, por fim , aumentam a taxa de formação dos

AGE. Os produtos de glicoxidação podem exacerbar várias condições patológicas. Em

ratos diabéticos, níveis aumentados de MG e glioxal levam à carbonilação de proteínas,

contribuindo para a formação da catarata, além de contribuir para o desenvolvimento

das complicações vasculares em diabéticos (ELLlS, 2007).

No entanto, esses compostos podem ser metabolizados a compostos menos

tóxicos através de reações de oxidação/redução (fase I) ou conjugação (fase 11). As

enzimas envolvidas nessa metabolização incluem a glutationa S-transferase, aldeído

deidrogenases, citocromo P450, aldoceto redutases e álcool desidrogenases (ELLlS,

2007). Compostos que atuam nessas vias, tanto inibindo a glicoxidação ou ativando as

enzimas responsáveis pela metabolização dos produtos de glicoxidação, podem atuar

de forma efetiva sobre o diabetes.

Os mecanismos envolvendo a hiperglicemia, sua relação com o estresse

oxidativo e, assim, o aparecimento das complicações crônicas, já discutidos

anteriormente, podem ser resumidos na Figura 6.

Hiperglicemia

l Estresse oxidativo

l Complicações crônicas

Doença vascular

Catarata Retinopatia Neuropatia

Figura 6 - Mecanismo simplificado envolvendo a hiperglicemia.

2.4 Modelo de diabetes experimental

12

Nefropatia

Tanto o diabetes em humanos como em modelos experimentais guardam

estreita relação com o estresse oxidativo (BAYNES e THORPE, 1996). Tais modelos

experimentais incluem o diabetes induzido por aloxana ou estreptozotocina (COSKUN

et aI., 2004) .

A estreptozotocina (STZ) , produzida pelo Streptomyces achromogenes, é um

antibiótico comum utilizado no diabetes experimental, identificado no século passado,

no período de 1950, e aprovado pelo Food and Orug Administration (FDA) no

tratamento do câncer metatástico de células das ilhotas pancreáticas, reduzindo os

sintomas, especialmente a hipoglicemia, devido à secreção excessiva de insulina pelos

insulinomas (BRENT JENS e SALTZ, 2001).

O mecanismo pela qual a STZ destrói as células ~ do pâncreas, induzindo o

diabetes tipo I com quadro de hiperglicemia e estresse oxidativo, não está bem

esclarecido (BAYNES e THORPE, 1996). Uma das ações que pode ser atribuída à STZ

é a depleção intracelular de NAD nas células das ilhotas pancreáticas (SCHEIN et a/. ,

1973).

Por ser uma glicosamina pertencente à classe das nitrosuréias, é tóxica à

célula causando dano ao DNA. Além disso, a molécula de STZ apresenta similaridade

13

com a glicose, sendo transportada para a célula pelo GLUT2, proteína transportadora

de glicose, não sendo reconhecida por outras proteínas transportadoras de glicose. Isso

explica sua toxicidade específica às células 13 pancreáticas, pois estas células têm

níveis relativamente elevados de GLUT2 (SCHNEOL et aI., 1994; WANG e

GLEICHMANN, 1998).

O modelo de diabetes experimental induzido por STZ é um modelo

interessante de diabetes tipo 1 e permite investigar vários eventos e mecanismos de

ação de substâncias envolvendo o estresse oxidativo e as complicações crônicas, como

retinopatia, nefropatia, neuropatia e complicações vasculares. Nos animais também se

observa claramente a tríade do diabetes: poliúria, polifagia e polidipsia, além da perda

de peso.

2.5 Antioxidantes no diabetes

A exposição aos radicais livres por uma variedade de vias de formação

propiciou ao organismo desenvolver uma série de mecanismos de defesa contra o

estresse oxidativo induzido por espécies reativas: preventivos, reparadores e de

defesas antioxidantes (VALKO et aI., 2006). As defesas antioxidantes enzimáticas

incluem quatro enzimas principais responsáveis pela remoção do excesso,

principalmente de ânion superóxido e peróxido de hidrogênio (H20 2) nas células, e são:

superóxido dismutase (SOO), catalase (CAT) , glutationa peroxidase (GPx) e glutationa

redutase (GR) (HALLlWELL, 1994). Os antioxidantes não enzimáticos são

representados pelo ácido ascórbico, o-tocoferol , glutationa, moléculas endógenas

quelantes de metais, além dos antioxidantes obtidos a partir da dieta (carotenóides,

minerais , compostos fenólicos, entre outros) (VALKO et a/. , 2006).

O comportamento das enzimas antioxidantes frente ao estresse oxidativo no

diabetes ainda é bem controverso.

A GPx e a GR são enzimas encontradas no citoplasma, na mitocôndria e no

núcleo. A GPx converte o peróxido de hidrogênio em água utilizando a glutationa

reduzida como doador de hidrogênio. A molécula de glutationa oxidada formada é

regenerada pela GR usando o NADPH como cofator (HALLlWELL, 1994). Várias

investigações sobre a atividade dessas enzimas em tecidos de diabéticos são

14

encontradas na literatura. No entanto, não existe consenso sobre a atividade das

mesmas frente a uma terapia antioxidante (MARITIM; SANDERS; WATKINS, 2003). Foi

observada atividade aumentada da GPx em fígado, rins, aorta, pâncreas e células

sanguíneas e atividade reduzida em coração e retina de ratos. As alterações induzidas

pelo diabetes foram revertidas pelo tratamento com vitaminas C e E, quercetina e

outras substâncias antioxidantes (MARITIM; SANDERS; WATKINS, 2003).

A catalase, localizada nos peroxissomos, decompõe H20 2 em água e

oxigênio. Mudanças também na atividade desta enzima são documentadas em ratos

diabéticos. Atividade aumentada ou diminuída já foi determinada no fígado e nos rins,

respectivamente, desses animais (MARITIM; SANOERS; WATKINS, 2003).

Nesse mesmo trabalho, os autores fizeram um apanhado dos principais

estudos com diabetes, estresse oxidativo e antioxidantes. Nele também é citado o papel

da dismutação do ânion superóxido pela SOD, inibindo a interação desse ânion com o

óxido nítrico e, conseqüentemente, a formação do peroxinitrito, uma molécula mais

reativa. Contudo, o efeito do diabetes na atividade da SOO também é controverso e

varia de acordo com a espécie animal estudada, a duração do diabetes e o tecido

avaliado.

Estudos mais recentes (SINDHUN e KOO, 2004; AKSOY et aI., 2005)

demonstraram que há depleção no mecanismo de defesa antioxidante no diabetes, com

alterações na atividade das enzimas antioxidantes. Com isso, crescem as investigações

sobre o efeito de substâncias com propriedades antioxidantes, uma vez que as defesas

antioxidantes endógenas não são suficientes para manter os níveis normais de

espécies reativas no diabetes. Nesse contexto, ganham importância os estudos com

compostos fenólicos (BALASUBASHINI et aI., 2004; COSKUN et aI., 2005).

Dois estudos publicados pelos autores YEH e YEN (2006a ,b) sustentam a

hipótese de que os compostos fenólicos, especialmente os ácidos fenólicos: gentíssico,

gálico, ferúlico e p-cumárico, induzem a atividade e a expressão das enzimas

antioxidantes (SOO, CAT e GPx) e das enzimas de fase 11, as fenol sulfotransferases,

em fígado de ratos, desenvolvendo papel importante contra os efeitos adversos

relacionados com mutagenicidade e dano oxidativo.

15

2.6 Compostos fenólicos

Os compostos fenólicos são compostos fitoquímicos que estruturalmente

possuem um anel aromático com uma ou mais hidroxila e, freqüentemente, apresentam

propriedades antioxidantes. Podem se apresentar na natureza na forma livre ou ligados

a açúcares e proteínas; estando divididos em dois grandes grupos: os flavonóides e

derivados e os ácidos fenólicos (ácidos benzóicos, cinâmico e seus derivados) e

cumarinas (SOARES, 2002). Todos os compostos fenólicos são derivados de uma via

de biossíntesse comum (Figura 7), incorporando precursores tanto da via do ácido

chiquímico como da via do acetato-malonato (VATTEM e SHETTY, 2005).

Inúmeros compostos fenólicos são encontrados em vegetais, principalmente

ervas, especiarias e frutas . Essas substâncias influenciam a qualidade e a estabilidade

de alimentos por agirem como flavours, corantes e antioxidantes (CRAIG, 1999).

Os compostos fenólicos exibem grande diversidade de efeitos biológicos e

podem ser divididos em duas categorias. A primeira está associada com a relação

estrutura-atividade, devido à presença do anel fenólico e hidroxilas, atuando como

antioxidantes efetivos no seqüestro de radicais livres e na inibição da oxidação em

cascata e, dessa forma , inibindo reações oxidativas desses radicais com moléculas

biológicas como: lipídios, carboidratos, proteínas e ONA (VATTEM e SHETTY, 2005).

O segundo e mais significativo mecanismo de ação é uma conseqüência de

sua habilidade em modular a fisiologia celular em ambos: em níveis moleculares e

bioquímicos/fisiológicos. Por causa da sua estrutura similar a várias moléculas

biológicas sinalizadoras e efetoras, são capazes de participar nos processos de

repressão/indução da expressão gênica ou na ativação/desativação de proteínas,

enzimas e fatores de transcrição de vias metabólicas (LUSINI et ai., 2001; OROGE,

2002; YEH e YEN, 2006a; YEH e YEN, 2006b

) .

Alguns desses mecanismos de sinalização celular foram evidenciados no

artigo publicado por Soobrattee e colaboladores (2005) , estes incluem a regulação de

enzimas antioxidantes desintoxicantes de fase 11 , supressão de enzimas pró­

inflamatórias (COX-2 e iNOS) e, por fim , ativação e/ou aumento na expressão das

enzimas antioxidantes: SOO, CAT, GPx (YEH e YEN, 2006a) , bem como modulam

vários genes envolvidos no ciclo celular.

UDP-Glicose ~ ~ Metabolismo Nucleotídeo

Metabolismo Carboidrato

Metabolismo Aminoâcido

Glicose

~Il ~ Glicose-6-fosfato

~ H Metabolismo

ç

/~~ S-Adenosilmetionina

Glicosilação de fenóis

~ Metilação de fenóis

Via Pentose

V Glicólíse =

fosfato

H NADPH2 Fosfatos de açúcar Via do ç shiquimato

Malonil CoA

Piruvato

~ Acetil CoA

ij ~ ~

Fenilalanina

/' ~ Ciclo do ácido citrico

Defesa

Estrutura celular

Pigmento defesa

Biossíntese Cumarinas

Biossíntese ligninas

Biossíntese Flavona

{} ~ ATP,NADPH

Via do tenil .L?- propanóide ~

/ " .. L~ Flavanóis glicosídicos

Pigmento Proteção UV

Biossintese Estilbenos

Biossíntese Taninos

Biossintese antocianinas

Defesa

Flavour Pigmento

defesa

Pigmento

Figura 7 - Biossíntese dos compostos fenólicos (VATTEM e SHETTY, 2005).

16

Scott et aI. (1993) avaliaram a atividade antioxidante de alguns compostos

fenólicos (ácido ferúlico e catequinas) em sistemas in vitro, mostrando maior eficiência

destes compostos quando comparados com as propriedades de antioxidantes mais

conhecidos, como as vitaminas C e E.

Singh et ai. (2005), estudando diabetes em modelo experimental induzido por

STZ, observaram a atenuação da hiperglicemia e dos parâmetros bioquímicos

associados ao estresse oxidativo nos ratos diabéticos suplementados com uma dieta

rica em compostos polifenólicos.

Muitas ervas e especiarias, utilizadas como ingredientes ou temperos, são

excelentes fontes de compostos fenólicos e foram reportadas por mostrar elevada

atividade antioxidante (RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996; ZHENG e WANG,

2001).

17

Em contrapartida, nos estudos com compostos fenólicos, um ponto

importante diz respeito à sua segurança. Muitas ervas ou seus subprodutos podem ser

seguros para o consumo e conter compostos com efeitos fisiológicos benéficos; por

outro lado, outras podem não apresentar a mesma segurança. O FDA tem classificado

várias ervas como inseguras. Estudos com a raiz da espécie G/ycyrrhiza g/abra

mostraram ser eficiente em pequenas quantidades no tratamento de úlcera gástrica e

duodenal. Mas, em concentrações elevadas causam hipocalemia, aumento na pressão

sanguínea e falência cardíaca. Já a espécie Teucrium scordium pode ocasionar

hepatite fatal. Outras são permitidas em quantidades modestas, mas podem apresentar

efeitos tóxicos em altas doses. Existem algumas ervas que são reconhecidas por serem

letais (CRAIG, 1999); é o caso de ervas chinesas que contêm altas concentrações de

alcalóides tóxicos, tais como a aconitina, que leva a distúrbios gastrointestinais,

cardiovasculares e neurológicos, podendo resultar em morte (CHAN et a/. , 1993).

Galati e O'brien (2004) citam em sua revisão o potencial tóxico de flavonóides

e outros fenólicos obtidos da dieta, atribuído às suas propriedades quimiopreventiva e

anticâncer (YU et a/., 2005; AGGARWAL e SHISHODIA, 2006). Suas propriedades

antioxidante, antiinflamatória, antimicrobiana, entre outras , são amplamente

reconhecidas. No entanto, poucos estudos são realizados para investigar sua eficácia e

seu potencial tóxico, relacionado à sua atividade pró-oxidante (na presença de metais

de transição e peroxidases), toxicidade mitocondrial (propriedade indutora de apoptose)

e interações com enzimas que metabolizam xenobióticos, tornando-os potencialmente

tóxicos.

2.7 Alecrim

O alecrim, nome científico Rosmarinus officinalis L. (Lamiaceae) , pertence à

família Labiatae e nos últimos anos tem sido bastante utilizado na indústria de

alimentos, muito apreciado por suas propriedades aromáticas, antioxidante,

antimicrobiana e antitumoral (ALMELA et aI. , 2006) .

Nos extratos de alecrim podem ser encontrados três grupos de compostos

fenólicos: diterpenos fenólicos, flavonóides e ácidos fenólicos. Ácido carnósico,

carnosol , diterpenos e ácido rosmarínico, um éster do ácido hidroxicinâmico, são os

18

principais compostos antioxidantes presentes nessa especiaria (HARAGUCHI et a/. ,

1994). Essas substâncias, juntamente com outros isoprenóides (esteróis, isopreno,

mono e diterpenos, tocoferóis e carotenóides) , desenvolvem papel fotoprotetor e são

considerados constituintes bioativos. A quantidade desses compostos varia

dependendo das condições do ambiente, como água e altas temperaturas, que podem

reduzir a fixação do CO2 . Sob essas condições, o conteúdo de antioxidantes no vegetal

aumenta oferendo proteção contra a oxidação causada pelo oxigênio sing/et e radicais

peroxil e superóxido (ALMELA et a/., 2006) .

No Laboratório de Lípides da FCF/USP, Cintra (1998) verificou, em estudos

anteriores, que os extratos de alecrim e outras especiarias apresentaram capacidade

antioxidante no sistema f3-caroteno/ácido linoléico. Além desses efeitos, observou

atividade antioxidante destas especiarias em homogenato de cérebro e fração

microssomal hepática in vitro.

A presença significativa desses compostos também em outras especiarias

levou Moreira e Mancini-Filho (2004) a avaliarem a atividade antioxidante de uma

mistura de mostarda, canela e erva-doce sobre o metabolismo dos ácidos graxos das

séries (03 e (06; sugerindo, portanto, a partir dos resultados obtidos, efeito antioxidante

das substâncias fenólicas identificadas na mistura das especiarias.

Mancini-Filho et aI. (1998) estudaram a atividade antioxidante em canela

(Cinnamon zey/anicum, Breyne) que se apresentou expressiva; isto se deveu ao fato de

estar relacionada com a presença de compostos fenólicos. Em um outro estudo, foi

averiguado que uma determinada fração, obtida também do extrato aquoso da canela,

além de demonstrar significativa ação antioxidante, inibiu a replicação do vírus influenza

em culturas de células MDCK (Madin Oarby Canine) e VERO (African Green Monkey)

(MANCINI et a/., 1999) .

Considerando seu elevado conteúdo de fenólicos, o extrato aquoso de

alecrim apresentou efeito hepatoprotetor na toxicidade induzida por azatioprine em

ratos, reduzindo os níveis de malonaldeído provocado pelo estresse e diminuindo o

efeito inibitório do azatioprine sobre a atividade das enzimas: SOD, CAT e GPx (AMIN e

HAMZA, 2005).

19

Sotelo-Félix et aI. (2002), estudando o efeito do extrato de alecrim

administrado na concentração de 200 mg/kg, p.o., correspondente a 6,04 mg/kg de

carnosol , em ratos, durante cinco dias, observaram efeito hepatoprotetor contra a lesão

ag.uda provocada por tetracloreto de carbono, pelo qual o alecrim atuou como

antioxidante, eliminando os radicais triclorometilperoxil formados pela metabolização

hepática do agente químico agressor, e aumentou a atividade do sistema de

desintoxicação dependente da glutationa S-transferase (GST).

Estudos com extratos de plantas, usados como antioxidantes, testaram doses

entre 50 e 100 mg/Kg. A dose de 200 mg/Kg utilizada por Sotelo-Félix et aI. (2002) foi

efetiva no modelo estudado. Por outro lado, os próprios autores relatam que em doses

mais elevadas pode não ser observado o efeito protetor, mas pode induzir efeitos

tóxicos. Estudos dose-resposta são necessários para se obter a concentração que

produza o melhor resultado sem demonstrar reações adversas e, assim, uma avaliação

toxicológica faz-se necessária para atingir tal objetivo.

Considerando o alecrim como uma fonte potencial de compostos fenólicos

com propriedades biológicas já bem relatadas na literatura, a hipótese desse trabalho

foi de que os compostos fenólicos presentes no alecrim podem atuar sobre o estresse

oxidativo e parâmetros bioquímicos de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina

(STZ), retardando o aparecimento ou a progressão das complicações crônicas do

diabetes; e que parte desses efeitos é atribuída às suas propriedades antioxidantes.

20

3. OBJETIVOS

Geral:

./ Estudar o efeito dos compostos fenólicos presentes no alecrim (Rosmarinus

officinalis L.) sobre as enzimas antioxidantes e os parâmetros bioquímicas do

sangue de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ).

Específicos:

./ Caracterizar a amostra a ser estudada e identificar os ácidos fenólicos presentes no

alecrim (Rosmarinus officinalis L.) .

./ Avaliar in vitro a atividade antioxidante dos extratos e frações obtidos das folhas de

alecrim nos sistemas modelos: !)-caroteno/ácido linoléico, varredura do radical

DPPH e ORAC .

./ Avaliar o efeito do extrato aquoso de alecrim administrado durante 30 e 60 dias

sobre as enzimas antioxidantes de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina .

./ Avaliar o efeito do extrato aquoso administrado durante 60 dias sobre parâmetros

bioquímicos de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina.

21

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material

4.1.1 Amostras

As amostras de alecrim (Rosmarinus officinalis L.) foram adquiridas no

comércio local da cidade de São Paulo/SP. As amostras foram trituradas em moinho

analítico (modelo I KA A 11 basic, Wilmington, USA) à temperatura ambiente, passadas

por tamis 32 mesh e mantidas em freezer a -20°C até posteriores análises.

4.1.2 Animais

Foram utilizados ratos (Rattus novergicus, var. albinus) machos da linhagem

"Wistar", com 45 dias de vida, pesando entre 220 e 240g, provenientes do Biotério de

Produção e Experimentação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas e do Instituto de

Química/USP.

4.2 Métodos

4.2.1 Preparação dos extratos etéreo, alcoólico e aquoso

Os extratos de alecrim foram obtidos pelo método de extração seqüencial

com solventes de diferentes polaridades a partir da amostra triturada, segundo Moreira

e Mancini-Filho (2003).

A Figura 8 mostra o fluxograma de obtenção dos extratos. Inicialmente, foi

feita extração com éter etílico na proporção de 1:5 (g da amostra:solvente) durante 1 h

em agitador magnético (modelo R015 power, IKA®, Staufen, Alemanha), à temperatura

ambiente. A solução foi filtrada a vácuo em funil Büchner, obtendo-se o extrato etéreo

(EEt), e o resíduo recuperado (após secagem à temperatura ambiente) foi extraído com

álcool etílico, na mesma proporção de 1 :5, também sob agitação por 1 h e depois

filtrado a vácuo para se obter o extrato alcoólico (EAI). Por fim, o resíduo formado foi

seco e extraído, desta vez com água destilada, sob as mesmas condições dos extratos

anteriores; obtendo, assim, o extrato aquoso (EA).

~ 20 9 amostra J 100 mL éter etílico (1 :5) 1 h de agitação Filtração a vácuo

Sobrenadante

EEt

Sobrenadante

EAI

Sobrenadante

EA

Figura 8 - Fluxograma da obtenção dos extratos de alecrim.

4.2.2 Extração e hidrólise de ácidos fenólicos

I

I

I

Resíduo J Álco( 1 h d Filtra

I etílico (1 :5) e agitação ção a vácuo

Resíduo J Águc 1 h d Cent Filtra

(1 :5) e agitação fugação

ção a vácuo

Resíduo J

22

Um grama de amostra de alecrim previamente desengordurada foi extraído 6 vezes

em Ultra-Turrax (modelo DI 25 basic, IKA® , Staufen, Alemanha) por 1 minuto com 20 mL

de tetraidrofurano (THF), à temperatura ambiente, e protegido da luz (Figura 9). As frações

obtidas foram combinadas, desidratadas com sulfato de sódio anidro e o solvente existente

foi evaporado em evaporador rotativo (B525, Micronal, São Paulo, Brasil) sob vácuo, a

30°C. O concentrado foi ressuspenso em 5 mL de metanol e transferido para frasco âmbar.

Esta fração foi analisada para os ácidos fenólicos livres (AFL).

O resíduo restante foi novamente extraído 6 vezes em Ultra-Turrax com uma

solução de metanol:acetona:água (1:1 :1), à temperatura ambiente; em seguida as frações

obtidas foram filtradas. Os filtrados combinados foram evaporados em evaporador rotativo

sob vácuo a 40°C até a fase aquosa. A suspensão aquosa e novamente o resíduo

23

formado foram hidrolisados com volume igual e 20 mL de NaOH 4 N, respectivamente, por

4 h sob fluxo de nitrogênio, à temperatura ambiente, e protegidos da luz. Posteriormente, o

pH das soluções foi ajustado com HCI 6 N para 2. Após a acidificação, os sobrenadantes

foram extraídos 5 vezes com hexano com a finalidade de remover ácidos graxos livres e

outros lipídios contaminantes. Os ácidos fenólicos liberados da fração solúvel e insolúvel

foram, então, re-extraídos separadamente 6 vezes com éter etílico:acetato de etila:THF

(1:1 :1). Ao final de cada extração, as frações foram combinadas, desidratadas com sulfato

de sódio anidro, filtradas, evaporadas em evaporador rotativo sob vácuo a 40°C e, em

seguida, ressuspensas em 5 mL de metanol, as quais foram analisadas para ácidos

fenólicos liberados das frações de ésteres solúveis (AFS) e de insolúveis (AFI).

Todas as frações permaneceram em freezer (-20°C) até posteriores análises

cromatográficas e determinação da atividade antioxidante.

Amostra desengordurada

Ext ro,;ã:; c em THF (t et rdl idrofurmo)

ISOBRENA.DANTE I RESíDUO I I I

Exi rCIJ;OO cem rnet aro L ocet m a e ágUJ. ce:nt r ifugooo

[ __ ........ 1 ................ _______ .... SOBRE~,I.A.DANTE I

Cm cent raç,"ib h ti rói ise alool in acid if iooç0o

: FASE A QUÓS:4j J &1 ,~oo ~m h e~o ext rat os : FA ~E 4QUOS 4)

... ; .• ~ I . I !

E~;TOJ

Des id rat cção sulfolo sódio cnidro

ÁCIDOS FEt~ÓLICOS

LIVRES

'~~:_. ]~~·~ •. ~~.~···~E/~.ITH F

! EX TPv4.T Os i , ! i DE/EA/THF! , ................. _._ ... _ .... .1

Desid rol cção su lfat o de sód io on idro

ÁCIDOS

, :EE~~~;! SOLÚVEIS j

I RESíDUO I ,

hid r ólise alcol irrJ. oc idifk:cção ce:nt r ifiJgcção

SOBREt'L4.DANTE I Resíduo ,

Ext ro:;oo rorn he >:JXlO

FASE AQUOSA I hex.om ... Ext ro.ção E/ EAITH F

EXT RATO sl DE/ EAlTHFI ,

Desidrol cção su lfato s.:.::tio ond ro

ÁCIDOS FENÓLICOS LIGAt~TES

INSOLÚVEIS

Figura 9 - Fluxograma de obtenção das frações de ácidos fenólicos.

4.2.3 Compostos fenólicos

24

Os fenólicos totais foram determinados seguindo a metodologia descrita por

Swain e Hills (1959) .

Após a obtenção dos extratos (EEt, EAI e EA) e das frações (AFL, AFS e AFI)

de alecrim , foram tomados 0,5 mL de cada, adicionados 8 mL de H20 destilada e 0,5 mL

de reagente Folin Ciocateau. A solução foi homogeneizada e, após 3 minutos, foi

acrescentado 1 mL de solução saturada de NaC03. Decorrida 1 h de repouso da

solução, foram realizadas as leituras das absorbâncias em espectrofotômetro

SPECTRONIC ® 20 GENESYS ™ (Rochester, USA) a 720 nm. Paralelamente, foi feita

../ li ti l. C. i ~ ," 1-ij •. llllJfi:, .1r. l~ AI I. . ;"i' L..:I":' .1 \. ~1.I1. . 1 ..

" l.Ir,)~·~ · ~ ':": .;~ -,'-; \.~ ~,1~ ?A' ... IO 25

uma CUNa padrão com ácido gálico, nas concentrações de 2; 5; 10; 15 e 20 ~lg . Os

resultados das amostras foram expressos em equivalente de ácido gálico.

4.2.4 Identificação dos ácidos fenólicos

Os ácidos fenólicos livres, ésteres solúveis e ligantes insolúveis de ácidos

fenólicos foram identificados por cromatografia a gás (CG), empregando-se a

metodologia descrita por Orabrowski e Sosulski (1984), com modificações descritas por

Moreira e Mancini-Filho (2003).

4.2.4.1 Derivatização

Os ácidos fenólicos liberados das frações obtidas (0,25 mL) foram

transferidos para frascos contendo 0,1 mL de padrão interno (éster metila de ácido

heptadecanóico) e o metanol foi evaporado com nitrogênio, antes do processo de

sililação realizado pela adição de 0,2 mL de BSA (N , O-Bis (trimetilsilil)-acetamina). Este

processo de derivatização fez-se necessário a fim de esterificar os ácidos fenólicos para

melhor separação por cromatografia gasosa. Para a completa sililação, a solução foi

incubada a 60°C por 30 min; obtendo-se, portanto, as amostras prontas para serem

injetadas no cromatógrafo.

4.2.4.2 Equipamentos

As determinações cromatográficas foram realizadas em cromatógrafo a gás

(modelo GC 17 A, Shimadzu, Kyoto, Japão), equipado com detector de ionização de

chama.

A separação foi feita em coluna capilar de sílica fundida J&W - (OB5 - 5 %

fenil-metilpolisiloxano - 30 m x 0,25 mm x 0,25 ~lm) . x 0,25 ~lm, USA).

26

4.2.4.3 Condições cromatográficas

As condições para a identificação dos ácidos fenólicos obedeceram a

seguinte programação:

- Gradiente de temperatura: iniciou-se com 150°C, permanecendo isotérmica

durante 3 mino Finalizado este período, a temperatura foi programada para aumentar,

aquecendo 5 °C/min., até 300°C, permanecendo isotérmica, nesta mesma temperatura,

por mais 3 mino

- Temperatura da câmara injetora: 310°C

- Temperatura do detector: 320 °C

- Gás de arraste: He

- Fluxo: 1 mUmin.

- Razão de divisão da amostra no injetor (Split): 1/50

- Volume de injeção: 1 JlL

As áreas dos picos foram calculadas por um integrador GC Wortkstation Class­

GC-10 (Shimadzu).

4.2.4.4 Identificação dos picos

As áreas dos picos foram calculadas por um integrador modelo GC

Wortkstation Class-GC-10 (Shimadzu, Kyoto, Japão) . Os ácidos fenólicos foram

identificados comparando os tempos de retenção com padrões da marca Sigma

(caféico, cinâmico, clorogênico, elágico, ferúlico, gálico, gentíssico, o-cumárico, p­

cumárico, pirogálico, protocatequínico, quínico, salicilico, sináptico, t-cinâmico e

vanílico), baseando-se no padrão interno.

4.2.5 Atividade antioxidante em sistema modelo p-caroteno/ácido linoléico

Os procedimentos de análise foram realizados de acordo com o método

descrito por Miller (1971), adaptado por Moreira e Mancini-Filho (2003). Neste método,

os produtos de degradação do ácido linoléico pela oxidação, devido a diferentes

indutores (oxigênio, luz, calor), são medidos indiretamente pela taxa de destruição

oxidativa do p-caroteno, determinada por espectometria a 450-470 nm. A queda na

27

leitura da densidade óptica das amostras é correlacionada com o controle (sem

antioxidante) , considerado como 100% de oxidação.

Para o preparo do meio emulsionado, adicionaram-se 0,02 mL de solução (3-

caroteno (20 mg/mL de clorofórmio) , 0,04 mL de ácido linoléico, 530 mg de

emulsificador Tween 40 e 1 mL de clorofórmio. Posteriormente, o clorofórmio foi

totalmente evaporado com nitrogênio gasoso. Por fim, foram acrescidos 100 mL de

água destilada previamente saturada com oxigênio num período de 30 minutos,

agitando-se vigorosamente. O meio apresentou-se límpido, com absorbância entre 0,6

e 0,7 em 470 nm. Alíquotas de 5 mL desta emulsão foram transferidas para tubos

espectrofotométricos contendo os extratos (EA e EAI) ou as frações (AFL, AFS e AFI)

obtidos das folhas de alecrim , em diferentes concentrações. O BHT foi utilizado como

padrão, na concentração de 10 mg/100 mL MeOH. Todas as determinações foram

feitas em triplicata e acompanhadas de um controle sem antioxidante. Os valores da

densidade óptica foram obtidos no período de 120 minutos a intervalos de 15 minutos,

enquanto as amostras eram mantidas em banho-maria a 50°, em espectrofotômetro

(modelo SPECTRONIC ® 20, GENESYS TM , Rochester, USA). Os resultados foram

expressos em percentual de inibição da oxidação, dados pelo seguinte cálculo: o

decaimento da densidade óptica do controle (Absco - Abscf) foi considerado como 100 %

de oxidação. A partir desta relação, o decréscimo na leitura da absorbância das

amostras foi correlacionado com o controle; estabelecendo-se, deste modo, o

percentual de inibição da oxidação das amostras antioxidantes pela equação:

% de Oxidação = (Abs amostra X 100)/ Abs controle

% de Inibição da oxidação = 100 - % de Oxidação

4.2.6 Atividade antioxidante em sistema de varredura de radicais livres (DPPH-)

A atividade antioxidante dos extratos e das frações de alecrim foi também

avaliada pelo ensaio DPPH·, segundo Blois (1958) e Brand-Willians et aI. (1995) , que

tem por base a redução do radical 2,2 difenil-1-pricril-hidrazil (DPPH·). Ao fixar um H·,

removido do antioxidante em estudo, observou-se diminuição da absorbância, o que

28

permitiu calcular, após o estabelecimento do equilíbrio da reação, a quantidade de

antioxidante gasta para reduzir 50% do radical. Uma alíquota de 0,5 mL de amostra,

contendo diferentes concentrações de extratos ou frações, foi adicionada a 1,5 mL de

solução metanólica de DPPH· 6x10-5 moi/L. Todas as determinações foram

acompanhadas de um controle sem antioxidante e comparadas ao antioxidante

sintético BHT. A redução do radical DPPH· foi medida a 515 nm em espectrofotômetro

(SPECTRONIC ® 20 GENESYS TM, Rochester, USA) após 30 minutos de repouso. O

decréscimo nos valores de densidade óptica das amostras foi correlacionado com os do

controle e estabelecido o percentual de descoloração do radical DPPH·, expresso pela

equação:

% de proteção = (Abscontrole - Absamostra) / Abscontrole x 100

4.2.7 Atividade antioxidante pelo método ORAC

As amostras de alecrim também foram avaliadas pelo método ORAC (Oxigen

radical absorbance capacity assay) , desenvolvido por Cao e colaboradores (1993), que

determina por fluorescência o potencial antioxidante de um composto. Esse método

consiste na análise de soluções de amostras ou padrões misturados com uma solução

de fluoresceína , adicionado por uma solução de AAPH (2,2'-azobis (2-amidinopropane)

dihydrochloride) , gerador de radical livre que reage com a fluoresceína . Através da

medida de intensidade de fluoresceína, obtêm-se a capacidade antioxidante da

amostra, sendo que, na presença de compostos antioxidantes, o decaimento da

fluorescência é inibido (CAO; ALESSIO; CULTER, 1993).

Para a realização do ensaio foram adicionados, em cada cavidade da placa

(Fisher Scientific, Hanover Park, IL), 25 ~lL de padrão (Trolox® 1 00 ~lM) ou amostra, em

concentrações diferentes, e 150 ~lL de fluoresceína 40 nM, incubados a 3rC, por 30

minutos. Em seguida, colocaram-se 25 ~lL de AAPH 153 mM nas cavidades do controle,

que continha apenas tampão fosfato 75 mM pH 7,0, do padrão e das amostras. Após a

adição do AAPH foi agitado por 10 segundos com intensidade máxima e realizada a

leitura a cada 1 minuto, por 1 hora, em Leitor de Placas (Multi - Detection microplate

29

reader Synergy - BIOTEK), excitação em 493 nm (filtro 485/20) e emissão em 515 nm

(filtro 528/20) .

O valor final foi calculado através da equação de regressão entre a

concentração de Trolox® e a área sob a curva de decaimento de fluorescência (AUC),

sendo expresso o resultado em micromoles equivalentes de Trolox®/ g da amostra. A

interpretação dos resultados é feita conforme a intensidade de fluorescência é mantida,

ou seja, quanto maior o tempo de decaimento da fluoresceína pela presença da

amostra, maior é a capacidade antioxidante da mesma.

4.2.8 Avaliação da atividade antioxidante in vivo

4.2.8.1: Efeito da administração do extrato aquoso de alecrim por 30 dias em ratos

diabéticos

4.2.8.2 Indução do diabetes

O estudo utilizando animais de laboratório foi previamente aprovado pela

Comissão de Ética em Experimentação Animal (Anexo 6) da Faculdade de Ciências

Farmacêuticas/USP.

Foram utilizados ratos (Rattus novergicus, var. albinus) machos da linhagem

"Wistar", com um mês e 15 dias de vida , pesando entre 220 e 240g, provenientes do

Biotério de Produção e Experimentação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas e do

Instituto de Química/USP, submetidos ao jejum por 16h, recebendo água ad libitum. O

diabetes foi induzido pela injeção de estreptozotocina marca Sigma (STZ, 40mg/Kg de

peso, por via endovenosa) , dissolvida em tampão citrato 0,01 M, pH 4,5. Os animais

controle receberam o mesmo volume apenas do tampão citrato. A glicemia foi avaliada

após 72h, sendo considerados diabéticos os animais que apresentaram glicemia de

jejum igualou superior a 250 mg/dL. O sangue foi coletado na veia da cauda e a

glicemia foi determinada com o uso de glicosímetro Accu-Check Go (Rache Diagnostics

GmbH, D-68298 Mannheim, Germany).

Os animais controle e diabéticos foram mantidos em gaiolas individuais, à

temperatura de 22 a 25°C, em ciclo claro/escuro de 12 h, tendo acesso livre à água e à

30

ração comercial peletizada Nuvilab CR-1 irradiada (as especificações da ração

oferecida aos animais encontram-se no Anexo 1).

Os animais foram distribuídos da forma apresentada na Figura 10:

Grupos

(n:40 animais)

! J ! ! Controle 0-H 2O 0-25 O-50 0-100

água água 25 mg/Kg 50 mg/Kg 100 mg/Kg

Figura 10 - Distribuição dos grupos experimentais.

Após administração, tanto no grupo de animais saudáveis (Controle) como

nos diabéticos (D-H20), que receberam água, por via oral (v.o.), ou nos diabéticos

tratados com extrato aquoso de alecrim nas concentrações 25 mg/Kg (0-25) , 50 mg/Kg

(O-50) ou 100 mg/Kg (0-100) (n= 8 animais/grupo) , durante 30 dias, os animais foram

sacrificados e, então, foi coletado o sangue para a determinação da hemoglobina

glicada pelo método de troca iônica, utilizando kit comercial (Labtest®). O fígado e

cérebro foram coletados para a análise da atividade das enzimas antioxidantes.

4.2.8.3 Separação do fígado e cérebro

Os animais foram anestesiados com injeção intraperitonial de uma mistura de

cetamina (90 mg/Kg) e xilazina (10 mg/Kg), dose recomendada pelo Biotério de

Produção e Experimentação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas e do Instituto de

Química/USP.

O sangue foi coletado para a determinação da hemoglobina glicada e, em

seguida, o cérebro e fígado foram perfundidos com solução NaCI 0,9 %. Tanto o tecido

cerebral quanto o hepático foram separados para a quantificação da atividade

enzimática.

31

4.2.8.4 Preparo dos homogeneizados dos tecidos cerebral e hepático

O cérebro foi homogeneizado, em homogeneizador tipo Potter-Elvehjem, com

um volume de tampão fosfato de potássio 0,1 M pH 7,0 igual a quatro vezes o valor

absoluto da massa da amostra. O homogeneizado foi centrifugado a 1.010 x g por 20

min à temperatura de 4°C. 1 mL do sobrenadante foi novamente centrifugado a 11 .000

x g por 15 min a 4°C, empregando-se o novo sobrenadante para a determinação da

atividade enzimática da SOO, GPx e GR.

Fragmentos do fígado perfundido foram então homogeneizados com tampão

fosfato de potássio 0,1 M pH 7,0 igual a três vezes o valor absoluto da massa da

amostra. O homogeneizado foi centrifugado também a 1.010 x g por 20 mino à

temperatura de 4°C. Em seguida, foi tomado 1 mL do sobrenadante e, novamente,

centrifugado a 11 .200 x g por 20 mino a 4°C. O novo sobrenadante obtido foi agora

centrifugado em ultracentrífuga a 105.000 x g por 60 mino a 4°C, obtendo-se a fração

citosólica para a determinação da atividade das enzimas antioxidantes: SOO, CAT, GPx

eGR.

4.2.8.5 Determinação da atividade das enzimas antioxidantes

Superóxido Dismutase (SOD)

A atividade da SOO citoplasmática foi avaliada de acordo com a metodologia

de McCord e Fridovich (1969) , que verifica a produção dos ânions peróxidos produzidos

pela xantina oxidase em presença da xantina. O ânion superóxido produzido reduziu o

citocromo c e esta redução foi medida pelo aumento da densidade óptica a 550 nm

numa temperatura de 25°C. O volume de xantina oxidase que foi utilizado na reação foi

determinado em um branco, na ausência da SOO; obtendo-se, desta, uma variação na

absorbância, a 500 nm, entre 0,0250 e 0,0300/min. O meio de reação foi composto por

citocromo c 1 00 ~lM , xantina 500 ~lM, EOTA 1 mM e KCN 200 ~lM em tampão fosfato de

potássio 0,05 M pH 7,8. A 1 mL do meio, em cu beta de vidro, foram adicionados xantina

oxidase (volume encontrado no branco) e 15 ~lL da fração citosólica de cada tecido. A

medição foi feita em duplicata. Os resultados foram expressos em U/mg de proteína.

32

Entendeu-se por uma unidade (U) a atividade da enzima que promoveu 50 %

de inibição da reação da xantina a 25°C em pH 7,8.

Catalase (CAT)

A CAT propicia a oxidação do peróxido de hidrogênio a H20 e O2. A

metodologia empregada foi descrita por Beutler (1975) , quantificando a velocidade de

decomposição do peróxido de hidrogênio pela enzima, mediante o decréscimo da

densidade óptica a 230 nm (coeficiente de extensão molar 0,0071 nM-1.cm-1) a 37°C. O

meio de reação foi composto por H20 2 10 mM (10 ~lL de peridrol 30 % em 10 mL de

H20 miliQ) e tampão Tris HCI 1 M EDT A 5 mM pH 8,0. Para a reação, foram utilizadas

duas diluições, ou seja , 15 ~lL do homogeneizado mais 985 ~lL do meio e 20 ~lL também

do homogeneizado adicionados a 980 ~lL do meio. As amostras (frações citosólicas)

foram incubadas a 37°C e realizadas leituras das absorbâncias a cada um minuto

durante 6 mino Os resultados foram expressos em U/mg de proteína.

Uma unidade (U) da catalase correspondeu a atividade da enzima que

realizou a hidrólise de 1 ~lmol de H20 2 por minuto a 37°C em pH 8,0.

Glutationa Peroxidase (GPx)

A atividade da GPx na fração citosólica foi determinada pela metodologia

padronizada por Sies (1979) . Este método fundamenta-se na medição do decaimento

da densidade óptica, a 340 nm, promovido pela oxidação do NADPH a 30 °C

(coeficiente de extinção molar igual a 6,22 nM-1.cm- 1) durante a redução da glutationa

oxidada (GSSG) catalisada pela glutationa redutase. O meio de reação contém

glutationa 1 mM, GR 0,1 U/mL, NADPH 20 mM, EDTA 5 mM pH 7,0 e tampão fosfato

de potássio 0,1 M pH 7,0. Inicialmente, tomou-se 1 mL deste meio, acrescentando-se

1 ° ~lL de cada amostra (fração citosólica) , em triplicata, incubando esta solução a 30 °C

durante um minuto. Após este tempo, foram adicionados à solução 1 ° ~lL de peróxido

de terc-butila 0,5 mM (apenas em duas cubetas), novamente a solução foi incubada e

as leituras realizadas a cada minuto num período de 6 mino Os resultados foram

expressos em U/mg de proteína.

33

Uma unidade (U) da enzima foi definida como atividade da enzima que oxidou

1 ~lmol de NADPH por minuto a 30 °C em pH 7,0.

Glutationa Redutase (GR)

A GR catalisa a redução da GSSG pela oxidação do NADPH, medição feita

em espectrofotômetro a 340 nm em 37°C (coeficiente de extinção molar 6,22 nM-1.cm-

1) (SIES, 1979). O meio de reação foi composto tampão fosfato de potássio 0,1 M pH

7,0, EDTA 5 Mm, GSSG 0,1M e NADPH 20 Mm. O ensaio foi realizado em duplicata,

foram tomados 50 ~lL da amostra e adicionados a 970 ~lL de meio, incubados a 30 °C e

realizadas leituras a cada minuto durante seis minutos. Os resultados foram expressos

em U/mg de proteína.

Uma unidade (U) de enzima foi definida como a atividade da enzima que

oxidou 1 ~lmol de NADPH por minuto, em pH 7,0.

Quantificação de proteínas nos tecidos

A determinação do conteúdo de proteínas presente nos tecidos cerebral e

hepático foi realizada segundo o método de Bradford (1985). Foi feita uma curva padrão

de proteína com solução padrão de albumina.

4.2.9 Efeito da administração do extrato aquoso de alecrim por 60 dias em ratos

diabéticos

O segundo ensaio foi realizado nas mesmas condições empregadas no

primeiro ensaio (item 4.2.8.1), mantendo-se as concentrações do extrato aquoso (EA)

de alecrim administradas aos animais (25, 50 e 100 mg/Kg), todavia , os ratos foram

expostos ao diabetes por 60 dias.

Além da avaliação das enzimas antioxidantes nos tecidos hepático e cerebral,

foi feita também a determinação no tecido renal. Os rins foram coletados e o

homogeneizado foi preparado nas mesmas condições do cérebro (item 4.2.8.4).

Para investigar melhor os efeitos do EA de alecrim sobre o metabolismo dos

animais diabéticos, foram realizadas as seguintes análises bioquímicas no soro desses

animais: determinação de creatinina, uréia, proteínas totais, albumina, triglicérides,

34

colesterol total, colesterol HOL e das enzimas hepáticas amino transferases (AST e

AL T). Todas as determinações foram feitas utilizando kit comercial (Labtest®).

4.3 Análise estatística

Para o tratamento estatístico dos dados foi utilizada a análise de variância

(ANOVA), seguida do teste Tukey, usando-se o software Prism 4.0 (GraphPad) . Os

dados foram expressos como média e desvio padrão, adotando um nível de

significância de p<O,05.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Caracterização química

BIBLIOTECA Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Universidade de São Paulo 35

As especiarias são reconhecidas como fontes potenciais de compostos

fenólicos. Estes compostos foram quantificados nos extratos etéreo, alcoólico e aquoso

como também nas frações de ácidos fenólicos (AFL, AFS e AFI) obtidos das folhas de

alecrim. Os resultados apresentados na Tabela 1 mostram que o alecrim contém uma

quantidade expressiva desses constituintes, um dado já bem estabelecido para

algumas especiarias e essencial na avaliação do potencial antioxidante.

Os resultados encontrados neste trabalho estão de acordo com os valores

obtidos no laboratório de Lípides da FCF/USP (CINTRA, 1999) e mostram que o extrato

aquoso apresenta quantidade de fenólicos totais (30,70 mg/g de amostra) superior aos

demais extratos. Uma quantidade significativa também pode ser observada nas frações

de ácidos fenólicos. Dados aproximados foram encontrados por Ninfali et a/o (2005)

quando avaliaram a quantidade de fenólicos totais e a capacidade antioxidante de

vegetais e especiarias.

Tabela 1 - Quantidade de fenólicos totais de extratos e frações de ácidos fenólicos

obtidos das folhas de alecrim expressa por mg de equivalente de ácido gálico.

Extratos e Frações

Etéreo (EEt)

Alcoólico (EAI)

Aquoso (EA)

Ácidos fenólicos livres (AFL)

Ácidos fenólicos solúveis (AFS)

Ácidos fenólicos insolúveis (AFI)

Os dados representam média e desvio padrão.

mg/g de amostra

16,68 ± 0,03

11 ,44 ± 0,01

30,70 ± 0,02

19,15 ± 0,02

23,90 ± 0,05

10,14 ± 0,03

A classe dos compostos fenólicos tem sido muito estudada devido sua

influência na qualidade dos alimentos, como também das suas propriedades em

sistemas biológicos. Englobam grande quantidade de substâncias, entre elas os ácidos

fenólicos (SOARES, 2002).

36

A atividade antioxidante de extratos de plantas, como já citada anteriormente,

está associada a esses compostos. Extratos de alecrim apresentam três grupos

principais: diterpenos fenólicos, flavonóides e ácidos fenólicos. O ácido carnósico, o

carnosol e o ácido rosmarínico, um éster do ácido hidroxicinâmico, são os principais

compostos antioxidantes presentes no alecrim (ALMELA et ai., 2006), além dos ácidos

caféico e ferúlico.

Dessa forma, o alecrim, pertencente à família Lamiaceae, é visto por ser uma

fonte rica e promissora de antioxidantes naturais. A Tabela 2 traz o teor de ácidos

fenólicos das frações de alecrim. Os cromatogramas (Anexos 2, 3 e 4) mostram os

picos cromatográficos dos ácidos fenólicos identificados em cada fração (AFL, AFS e

AFI) , entre eles: ácido salicílico, protocatecuíco, quínico, elágico, ferúlico e caféico.

Tabela 2 - Teor de ácidos fenólicos livres e de esterificados solúveis e insolúveis

individuais presentes na amostra de alecrim.

Ácidos fenólicos AFL AFS AFI

Salicílico 890 460 436

Protocatecuíco 63 32

Quínico 23,5

Elágico 30,2

Ferúlico 224 67

Caféico 109 31

* Resultados expressos em mg/100g de amostra seca.

5.2 Atividade antioxidante in vitro

A atividade antioxidante dos extratos de alecrim depende da sua composição

de fenólicos e tem sido determinada por vários métodos em diferentes sistemas: lipídico

e aquoso, para avaliar os diversos mecanismos de ação, desde o potencial antirradical,

como quelantes de metais ou pelo rompimento de cadeia (DEL BANO et aI., 2006) .

Neste estudo, os extratos e frações foram avaliados em dois sistemas:

sistema j3-caroteno/ácido linoléico e varredura do radical DPPH.

37

5.2.1 Sistema f3-caroteno/ácido Iinoléico

A capacidade em inibir a oxidação do f3-caroteno no sistema pelos extratos e

frações de alecrim é apresentada na Tabela 3.

Pelos resultados pôde-se identificar que tanto o extrato alcoólico como o

extrato aquoso agiram como antioxidantes, inibindo a oxidação, e, quando comparados

ao antioxidante sintético BHT (10 e 20 ~Lg) , apresentaram o mesmo percentual de

proteção, em torno de 70% e 80% na menor (500 ~Lg) e maior (1 .000 ~Lg) concentração,

respectivamente. Os mesmos resultados foram obtidos por Cintra (1999) quando

investigou o efeito antioxidante das especiarias: salsa, cebolinha verde, orégano e

alecrim, no mesmo sistema. Esses dados refletem a utilização de antioxidantes obtidos

de fontes naturais em substituição aos sintéticos.

Proteção ainda maior foi observada no estudo com as frações (AFL, AFS e

AFI) . Em quantidades bem menores, apenas cinco vezes maior do que as

concentrações utilizadas de BHT (10 e 20 ~Lg), a fração AFI (tanto com 50 como 100 ~Lg)

apresentou os melhores resultados de proteção, mesmo assim , vale ressaltar que as

demais frações na maior concentração (1 00 ~Lg) obtiveram valores de proteção acima

de 50%. Isso se deve à sua composição em ácidos fenólicos, ficando clara a correlação

existente entre a quantidade de substâncias fenólicas e sua atividade antioxidante. É

exatamente isso que caracteriza um antioxidante, segundo Halliwell e Gutteridge

(1989) : substâncias que, quando presentes em baixas concentrações em relação ao

substrato oxidável , retardam ou inibem significativamente a oxidação daquele substrato.

38

Tabela 3 - Atividade antioxidante dos extratos aquoso e alcoólico e das frações AFL,

AFS e AFI obtidos das folhas de alecrim em sistema /3-caroteno/ácido linoléico.

Extratos 500 Jl9 1.000 Jl9

EA 69,94 ± 0,80 80,93 ± 0,60

EAI 69,17 ± 1,90 81,50 ± 0,40

Frações 50 Jl9 100 Jl9

AFL 64,32 ± 0,05 70,55 ± 0,60

AFS 41,01 ± 0,40 53,85 ± 0,30

AFI 81,53 ± 0,80 88,76 ± 1,00

Antioxidante sintético 10 Jl9 20 Jl9

BHT 83,53 ± 0,40 88,94 ± 0,30

Análises realizadas em triplicata e resultados expressos em média e desvio padrão.

5.2.2 Sistema de varredura do radical DPPH·

A maioria dos métodos para avaliação da atividade antioxidante in vitro de

compostos fenólicos é baseada na capacidade destes em varrer radicais livres do meio

pela rápida doação de um átomo de hidrogênio para estes radicais (GIADA e MANCINI­

FILHO, 2004).

A capacidade antirradical dos extratos e frações de alecrim foi determinada pelo

método de varredura do radical DPPH, que consiste na transferência de elétrons de um

composto antioxidante para o radical, sendo um método interessante para investigar

substâncias antioxidantes com propriedade antirradical. Num estudo realizado por Brand­

Williams et aI. (1995), os ácidos caféico, gentíssico e gálico demonstraram elevada

atividade antirradical com estequiometria de 4-6 moléculas de DPPH reduzido por cada

molécula de antioxidante.

Os resultados obtidos, tanto para os extratos como para as frações, encontram­

se na Figura 11. A partir de uma curva construída utilizando seis concentrações distintas

(2,5; 5; 10; 20; 40 e 80 ~Lg) de cada extrato e fração foi calculado o IC5o, que corresponde à

quantidade de antioxidante requerida para um decréscimo de 50% na concentração inicial

do radical DPPH.

39

Os resultados demonstram que o alecrim contém constituintes com

propriedade antioxidante e, por isso, justifica-se seu crescente uso na indústria de

alimentos e o interesse em se investigar mais outras propriedades ligadas à sua

capacidade antioxidante.

Almela et aI. (2006), analisando amostras de alecrim com diferentes formas

de tratamento por HPLC e pelo método do DPPH, observaram que a amostra fresca

apresentou atividade antioxidante idêntica ao ó-tocoferol e mais elevada do que o BHT,

com resultados obtidos a partir do cálculo de IC50 similares aos encontrados no

presente estudo, no qual os extratos e frações apresentaram valores de IC50 próximos

ao BHT (8,8 ~lg); merecendo destaque a fração de ácidos fenólicos insolúveis (AFI),

com valor de IC50 igual a 7,3 ~lg, mais eficiente do que o próprio BHT.

Nem sempre é possível fazer correlação entre os diversos métodos de

avaliação do potencial antioxidante, entretanto, a fração de AFI também apresentou a

melhor proteção no sistema l3-caroteno/ácido linoléico.

40

100

~~---:I: a. a. 75 O iii (.)

'õ ~ O

"C 50

~ :::l

"C

ê

"1 11 ICso

<11 > Q) --EEt 15,93

"C

~ ···-- EAI 16,38 Q

--EA 17,47

0.J --BHT 8,80

i i i i i I I I I O 10 20 30 40 50 60 70 80

Concentração (J.lg)

100

I ------=:::4 m

:I: a. a. O 75

iii (.)

'õ ~ o -o 50

~ :::l

rll í "C ICso ê <11

25

1 , --AFL 11 ,35 > Q)

-o --AFS 13,96 cft. '" --AFI 7,30

--BHT 8,80 O

I I I I I I I I I o 10 20 30 40 50 60 70 80

Concentração (J.lg)

Figura 11 - Atividade antioxidante e valores de IC50 dos extratos etéreo, alcoólico e aquoso e frações de ácidos fenólicos livres, solúveis e insolúveis obtidos das folhas de alecrim em sistema de varredura do radical OPPH·,

41

5.2.3 Atividade antioxidante pelo método ORAC

O método ORAC (ensaio de capacidade de absorbância do radical oxigênio)

também é um método que se baseia na capacidade de varredura de radicais livres e,

portanto, vem sendo bastante utilizado nos estudos de atividade antioxidante (GIADA e

MANCINI-FILHO, 2004), inclusive para ervas e especiarias.

Avaliando os extratos e frações de alecrim (Tabela 4) , foi observado que esta

especiaria apresenta altos valores de ORAC, que variou de 2.562,86 ± 211 ,56, para o

extrato aquoso, a 8.230,65 ± 260,81 ~lmoles equivalentes de Trolox®/ 9 de peso seco,

para a fração AFI. Este resultado mostra que o sinergismo entre os compostos

presentes nessa fração e na AFS apresenta capacidade antioxidante maior do que o

Trolox, que é de 4.000 ~Lmoles nessas condições de ensaio. A fração AFI apresentou

os melhores resultados em relação às demais, tanto no sistema j3-caroteno/ácido

linoléico (88,76% de inibição à oxidação), como também o menor valor de ICso (7,30 ~lg)

no sistema de varredura do radical DPPH, mesmo comparada ao BHT (ICso : 8,80 ~Lg).

No estudo de Ninfali e colaboradores (2005) , foi investigada a capacidade

antioxidante pelo método ORAC de vegetais, ervas, especiarias e bebidas. Nas especiarias

avaliadas, a sálvia e o alecrim estavam entre aquelas que apresentaram os maiores

valores de ORAC. Esta capacidade foi correlacionada com o alto teor de compostos

fenólicos presentes nessas ervas aromáticas, como também por serem fontes de ácido

rosmarínico, um potente antioxidante natural. O mesmo potencial de atividade antioxidante

foi observado por Dorman e colaboradores (2003) quando analisaram extrato aquoso de

alecrim e de outras espécies da família Lamiaceae nos modelos de varredura do radical

DPPH, capacidade de redução de ferro, ABTS, atividade de varredura do radical hidroxila e

de inibição da oxidação da LOL.

Zheng e Wang (2001) também observaram correlação positiva entre a atividade

antioxidante do alecrim, pelo método ORAC, com seu conteúdo em compostos fenólicos.

42

Tabela 4 - Resultados de atividade antioxidante de extratos e frações de ácidos

fenólicos de alecrim expresso em micromoles equivalentes de Trolox®1 g de peso seco

do material.

Extratos e Frações

Alcoólico (EAI)

Aquoso (EA)

Ácidos fenólicos livres (AFL)

Ácidos fenólicos solúveis (AFS)

Ácidos fenólicos insolúveis (AFI)

Os dados representam média e desvio padrão.

~moles/g de peso seco

3.393,78 ± 223,65

2.562,86 ± 211,56

2.679,76 ± 144,49

4.146,94 ± 166,07

8.230,65 ± 260,81

Vale ressaltar que mesmo sendo o ORAC um método bastante utilizado nos

estudos de atividade antioxidante, ele não pode ser considerado um ensaio de atividade

antioxidante total, pois avalia apenas a capacidade de varredura de radical peroxila (OU;

HAMPSCH-WOODILL e PRIOR, 2001). É necessário, portanto, o desenvolvimento e

utilização de outros métodos para melhor caracterizar tal potencial antioxidante.

Outro ponto a ser considerado é a correlação entre os métodos avaliados. Os

resultados da atividade antioxidante dos extratos e frações de alecrim nos três métodos (f3-

caroteno/ácido linoléico, DPPH e ORAC) mostraram que tanto os extratos como as frações

de ácidos fenólicos apresentaram expressiva atividade antioxidante sem, no entanto,

apresentar correlação entre os métodos, como mostra a Figura 12.

Os mesmos resultados foram encontrados por Ou e colaboradores (2002)

que, ao analisarem amostras de vários vegetais pelos métodos ORAC e FRAP,

encontraram potencial antioxidante diferente entre as amostras e correlação positiva

entre esses dois métodos apenas para as amostras de beterraba, cebolas (roxa e

branca) e cenoura. Diferentemente desse trabalho, houve correlação positiva (r=0,91)

na capacidade antioxidante de frações de aveia avaliadas pelo ORAC e inibição da

oxidação da LDL (PRIOR e CAO, 2000).

43

20

• RZ =0,6364 16 • 12

l:PPH

8[ 4 -

O ~ O 2 4 6 8 10

ORAC

j3-caroteno

100 ,

• 80 • • ..-60 ,

• I

40

20 l RZ = 0,1451

O

O 2 4 ORAC 6 8 10

j3-caroteno

100

• 80 • •

• 60

• 40

20 I RZ = 0,0377 ,

0 1 ~--

O 5 10 15 20 DPPH

Figura 12 - Correlação entre os três métodos: 13-caroteno/ácido linoléico, DPPH e ORAC dos extratos e frações de ácidos fenólicos obtidos das folhas de alecrim.

44

A partir da caracterização da amostra de alecrim estudada no que diz respeito

ao seu conteúdo de fenólicos totais, dos ácidos fenólicos presentes nas frações AFL, AFS

e AFI e do seu potencial antioxidante in vitro, já bem consistente na literatura e com

resultados reproduzidos no presente estudo, foi proposta a investigação da propriedade

antioxidante do alecrim in vivo, sugerindo a hipótese de que o extrato aquoso de alecrim

pode atuar de forma positiva no estresse oxidativo causado pelo quadro de hiperglicemia

crônica em ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina e que esta proteção está

associada aos seus constituintes químicos.

5.3 Atividade antioxidante in vivo

5.3.1 Efeito da administração do extrato aquoso de alecrim por 30 dias em ratos

diabéticos

Os ratos diabéticos induzidos com estreptozotocina (STZ: 40mg/Kg, e.v.)

expostos à doença por 30 dias apresentaram quadro típico de diabetes mellitus tipo I. A

destruição das células beta do pâncreas pela STZ mimetizou o estado diabético

dependente de insulina, que se caracterizou por quadro hiperglicêmico, ganho de peso

reduzido, demonstrando sinais de polidpsia e polifagia quando comparados aos animais

controle (Tabela 5). O peso corporal basal no começo do estudo foi similar em todos os

grupos. No entanto, os animais diabéticos tratados com extrato aquoso de alecrim, nas

três concentrações (25, 50 e 100 mg/Kg), não tiveram esses marcadores do estado

diabético atenuados com o tratamento.

Tabela 5 - Controle de peso (g) de ratos controle e diabéticos tratados com água ou

extrato aquoso de alecrim por 30 dias.

Grupos Peso Inicial (g)

Controle 287,02 ± 14,28

0-H2O 288,36 ± 15,98

0-25 286,64 ± 22,58

O-50 285,31 ± 19,94

0-100 286,91 ± 12,89

Média e desvio padrão, *p<O,05 vs Controle.

Peso final (g)

373,70 ± 25,40

315,91 ± 23,10

318,89 ± 32,77

308,86 ± 33,94

301,17 ± 24,18

Ganho de peso (g)

96,61 ± 12,26

31,94 ± 14,75*

35,08 ± 10,61*

34,15 ± 15,48*

23,18 ± 9,30*

45

Na tabela 6 são apresentados os resultados de consumo de ração (g/dia) e

ingestão de água (mUdia) dos grupos. Os animais diabéticos consumiram maior

quantidade de ração e de água, mostrando claramente as complicações agudas que o

diabetes promove, além do quadro de poliúria observado nesses animais.

Tabela 6 - Consumo de ração (g/dia) e ingestão de água (mLldia) de ratos controle e

diabéticos tratados com água ou extrato aquoso de alecrim por 30 dias.

Grupos Consumo de ração (g/dia) Ingestão de água (mLldia)

Controle 28,83 ± 1,21 34,5 ± 5,7

D-H2O 42,48 ± 4,04* 148,7 ± 12,5*

0-25 45,38 ± 4,66* 150,7 ± 21,7*

O-50 42,44 ± 5,50* 150,1 ± 26,1*

0 -100 45,17 ± 3,83* 162,9 ± 13,1*

Média e desvio padrão, *p<O,05 vs Controle.

Em relação ao tratamento do diabetes do tipo 11, o estudo mais importante

nesta linha é o United Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS), que analisou se

o controle rigoroso da hiperglicemia e da hipertensão arterial era capaz de reduzir as

complicações do diabetes e a mortalidade (SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES,

2003) e, com isso, mostrou que o controle da glicemia é um marcador importante.

Os sintomas decorrentes de hiperglicemia acentuada, como já foram citados,

incluem perda inexplicável de peso, poliúria, polidipsia e infecções. Mesmo em

indivíduos assintomáticos poderá haver hiperglicemia discreta, porém em grau

suficiente para causar alterações funcionais ou morfológicas por um longo período

antes que o diagnóstico seja estabelecido (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE,

1999).

Foram incluídos no estudo os animais que apresentavam glicemia maior que

300 mg/dL. A dose de STZ empregada foi suficiente para induzir o modelo de diabetes

moderado, apresentando o quadro hiperglicêmico desejável, sem levar à cetoacidose e

à posterior morte desses animais.

Os valores de glicemia inicial e final (após 30 dias) dos animais controle e

diabéticos tratados com EA estão demonstrados na Tabela 7. Os dados indicam que o

46

EA de alecrim não apresenta efeito hipoglicemiante nessas condições, ou seja, por um

período de 30 dias de tratamento. Os valores glicêmicos dos animais diabéticos diferem

estatisticamente dos animais controle.

Tabela 7 - Determinação da glicemia de ratos controle e diabéticos tratados com água

ou extrato aquoso de alecrim por 30 dias.

Grupos Glicemia Inicial (mg/dL) Glicemia Final (mg/dL)

Controle 108,67 ± 10,56 109,75±12,16

D-H2O 379,00 ± 30,32* 404,80 ± 35,18*

0-25 380,40 ± 48,42* 393,25 ± 43,31 *

O-50 374,75 ± 28,76* 416,75 ± 49,93*

0-100 353,50 ± 8,96* 403,00 ± 31,11 *

Média e desvio padrão, *p <0,05 vs Controle.

A hemoglobina glicada, também denominada hemoglobina glicosilada ou

glico-hemoglobina, embora seja utilizada desde 1958 como uma ferramenta de

diagnóstico na avaliação do controle glicêmico em pacientes diabéticos, passou a ser

cada vez mais empregada e aceita pela comunidade científica após 1993, depois de ter

sido validada pelos dois estudos clínicos mais importantes sobre a avaliação do

impacto do controle glicêmico nas complicações crônicas do diabetes: os estudos

DCCT - Diabetes Control and Complications Trial (1993) e o UKPDS (1998) (GRUPO

INTERDISCIPLINAR DE PADRONIZAÇÃO DA HEMOGLOBINA GLlCADA, 2004) .

Estes estudos mostraram também correlação entre o controle glicêmico,

quantificado por determinações seriadas da hemoglobina glicosilada e os riscos de

desenvolvimento e progressão das complicações crônicas do diabetes. Daí ser a

hemoglobina glicada um parâmetro que deve ser constantemente monitorado em

pacientes diabéticos. Foi observado que os animais diabéticos tratados com o EA de

alecrim na dose de 50 mg/Kg apresentaram redução da hemoglobina glicosilada, sem

demonstrar efeito hipoglicemiante. Entretanto, nas doses de 25 e 100 mg/Kg não foi

observado este efeito (Figura 13).

47

6.0. * * *I #

ro-o 4.5ro.~

<5roc.o.2 3.0CloE(J)

I(J)

1.5-o~

0.0

Controle O-HzO 0-25 O-50 0-100

Figura 13 - Dosagem de Hemoglobina glicosilada (HbA1c) de ratos controle ediabéticos tratados com água ou extrato aquoso de alecrim por 30 dias. Resultadosexpressos em média e desvio padrão, *p<O,OS vs Controle; #p<O,OS vs D-H20.

5.3.1.1 Efeito do extrato aquoso de alecrim sobre as enzimas antioxidantes nos

tecidos hepático e cerebral

O diabetes é uma condição patológica que resulta em alterações metabólicas

graves em muitos tecidos nos quais o estresse oxidativo desenvolve papel importante

nessa etiologia. Os modelos experimentais de diabetes exibem valores elevados de

estresse oxidativo devido à hiperglicemia crônica e persistente, depreciando a atividade

do sistema de defesa antioxidante e, assim, promovendo a geração de radicais livres,

como também a citotoxicidade e a disfunção tecidual (BAYNES e THORPE, 1999).

Tais modelos incluem o diabetes induzido por estreptozotocina, um antibiótico

bastante comum empregado no diabetes experimental e específico para as células beta

pancreáticas, propiciando menor produção de insulina por estas células.

Já está bem descrito na literatura o quadro de estresse oxidativo no diabetes

causado pela hiperglicemia crônica. Os principais eventos que contribuem com esse

estresse e que envolvem a glicemia elevada são estimulação da via do poliol, formação

dos produtos de glicação avançada e formação subseqüente das espécies reativas

(PACKER; KRAEMER; RIMBACH, 2001).

48

75, 250Superóxido DisrnJtase I ~ Catalase

"[

60

J • i 200

·"O45 ~ 150

ª-

I*

IJ I**

o*

o3

o30" - é* i 100

o ~·"O15" - · 50"O.,;ji

O

Controle D-H2O 0-25 0-50 0-100 Controle O-H,O 0-25 0-50 0-100

1.5 Glutationa Peroxidase O. 125 l Glutationa Redutase

"[ c

]; ];0.100

~1.2 ~. * ·"O "O

D * ~ 0.075E 0.0

ª- ª-3 u

~ 0.6 I. ~ 0.050

~ ~. ·~"O

0.3 "O 0.025.. ..;ji ;ji

0.0 - 0.000

Controle O-H2O 0-25 O-50 D-100 Controle D-H2O D-25 0-50 0-100

Figura 14 - Determinação da atividade das enzimas antioxidantes no tecido hepático deanimais controle e diabéticos tratados com água ou extrato aquoso de alecrim nasconcentrações 30 dias. Resultados expressos em média e desvio padrão, *p<0,05 vsControle; #p<0,05 vs D-H20.

Na figura 14 encontra-se a avaliação da atividade das enzimas SOD, CAT,

GPx e GR no tecido hepático dos animais experimentais. Nesta figura pode-se observar

que os animais diabéticos mostraram valores normais para a atividade da enzima GR

no homogeneizado de fígado, todavia com redução significativa das enzimas SOD, CAT

e GPx, quando comparadas aos controle. Resultados semelhantes foram encontrados

por outros pesquisadores ao estudar o estresse oxidativo em animais diabéticos

expostos à doença num período de 15 a 45 dias (BALASUBASHINI et aI., 2004;

SINDHUN e KOO, 2004).

Já nos animais tratados com EA de alecrim na dose de 50 mg/Kg,

normalizou-se a atividade das enzimas CAT e GPx, sem no entanto, observar aumento

na atividade enzimática da SOD. Os mesmos resultados não foram observados nas

outras concentrações estudadas. Isso mostra que, em menor quantidade (25 mg/Kg), o

EA de alecrim não teve efeito sobre esses marcadores. No que diz respeito à maior

49

dose (100 mg/Kg), os animais diabéticos, mesmo submetidos à concentração mais

elevada de compostos antioxidantes presentes no extrato, não tiveram a atividade das

enzimas antioxidantes aumentada, como se esperava, uma vez que a hipótese deste

trabalho previa efeito também dose-resposta.

Glutationa Peroxidase

0.12

009~ ... ** * .-~ ri *

0.06~ - I

n..

;';-'0.031 - I I - -..

O.OO.J - ~ ~ -Controle D-H,D 0.25 0.50 0-100

#

**

25

Controle D-H,D 0.25 D-SO D-100

Glutationa Redutase0.036

~

I 0.027·..~ê.3 0.018

~Nli· 0.009..·...,~

0.000

Controle D-H,D 0.25 0.50 0.100

cI 20

·..mE 15~o

t 10

~·..·...,~

Superóxido Dismutase

Figura 15 - Determinação da atividade das enzimas antioxidantes no tecido cerebral deanimais controle e diabéticos tratados com água ou extrato aquoso de alecrim por30 dias. Resultados expressos em média e desvio padrão, *p<0,05 vs Controle;#p<0,05 vs D-H20.

o mesmo comportamento foi observado no tecido cerebral (Figura 15), com

redução significativa na atividade das enzimas SOD e GPx. E, ao contrário dos

resultados no homogenato de fígado, a dose de 50 mg/Kg elevou significativamente a

atividade da SOD. Essa resposta enzimática é importante, uma vez que o aumento na

atividade da SOD pode, de certa forma, proteger as enzimas CAT e GPx dos efeitos

deletérios do ânion superóxido.

../ BIBLIOTECA Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Univer5idade de São Paulo 50

Embora seja claro o papel do estresse oxidativo no diabetes, os efeitos dos

antioxidantes na expressão protéica e atividade das enzimas antioxidantes não têm

sido claramente estabelecidos, principalmente no que diz respeito a estas enzimas,

quando se investigam o tempo de exposição à doença, a dose oferecida e o tecido

analisado.

Vários trabalhos na literatura mostram redução na atividade dessas enzimas

em resposta ao quadro de estresse exacerbado relacionado principalmente à formação

elevada do ânion superóxido no diabetes e à glicação não-enzimática das enzimas

antioxidantes, segundo Sindhun e Koo (2004) . Esses mesmos pesquisadores

investigaram o efeito da combinação das vitaminas E e C e/ou associado à

administração de insulina em animais diabéticos tratados por 4 semanas. A terapia

antioxidante normalizou a expressão protéica das enzimas SOO e GPx e quando

associada à insulina, tanto a expressão como a atividade dessas enzimas, foram

aumentadas, concluindo-se que a terapia antioxidante pode contribuir com a redução

do estresse oxidativo causado pela hiperglicemia e pelo aumento da atividade do

sistema de defesa enzimático.

A mesma proteção foi observada na administração de ácido ferúlico a ratos

diabéticos por 45 dias. A suplementação resultou na diminuição dos níveis circulantes

de glicose, das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, hidroperóxidos, aumento

nos níveis de glutationa reduzida e aumento na atividade da SOO, CAT e GPx. O efeito,

sobretudo, foi mais pronunciado com a dose menor de ácido ferúlico (10 mg/Kg)

(BALASUBASHINI et ai. , 2004). O resultado obtido por estes autores com o ácido

ferúlico pode se relacionar com os resultados obtidos neste trabalho, no qual se pode

observar o efeito protetor na dose de 50 mg/Kg do EA de alecrim ; no entanto, na maior

dose (100 mg/Kg), não se observou o efeito esperado.

A partir de evidências e controvérsias acerca do efeito de substâncias

naturais sobre o metabolismo e o estresse oxidativo de animais diabéticos e, ainda,

diante dos resultados obtidos no primeiro ensaio biológico, no qual foi observado um

comportamento diferente nos animais tratados com EA de alecrim na maior

concentração, inclusive no menor ganho de peso, embora não seja diferente

estatisticamente em relação aos demais grupos diabéticos, buscou-se investigar o

51

efeito do EA de alecrim no modelo de diabetes também induzido por estreptozotocina,

contudo, por um período mais prolongado (60 dias).

5.3.2 Efeito da administração do extrato aquoso de alecrim por 60 dias em ratos

diabéticos

Da mesma forma que no primeiro ensaio, nesse segundo momento também

foi feito o acompanhamento do ganho de peso, do consumo de ração e da ingestão de

água. Todos os grupos iniciaram o estudo com o mesmo peso basal , demonstrado na

Tabela 8. Os animais controle, como era esperado, mantiveram seu ganho de peso

normal (105,1 Og) , já os diabéticos não apresentaram o mesmo comportamento. Os

diabéticos não tratados tiveram ganho de peso final de 37,11 g e, mais uma vez, foi

observado ganho menor (31,41 g) para os animais diabéticos tratados com a maior dose

do EA de alecrim (100 mg/Kg).

De acordo com os resultados obtidos no primeiro ensaio (Tabela 5), pode-se

observar ganho de peso de apenas 23,18 g para os animais diabéticos que receberam

100 mg/Kg de extrato aquoso de alecrim, inferior ao grupo diabético não tratado (0-

H20), que apresentou ganho de peso de 31 ,94 g. Neste segundo ensaio, nota-se a

mesma tendência , na qual o grupo 0-100 mostrou ganho de peso de 31,41 g, inferior

aos animais diabéticos que receberam apenas água, com ganho de peso de 37,11 g

(Tabela 8). Estes resultados são sugestivos de algum efeito prejudicial que deve ser

melhor caracterizado. O ganho de peso pode ser considerado um marcador importante

do controle metabólico e deve ser monitorado no modelo de diabetes experimental ,

podendo dar alguns indícios de como está o controle glicêmico, além de refletir o efeito

da suplementação ou da dieta que está sendo oferecida a esses animais .

52

Tabela 8 - Controle de peso (g) de ratos controle e diabéticos tratados com água ou

extrato aquoso de alecrim por 60 dias.

Grupos Peso Inicial (g) Peso Final (g) Ganho de peso (g)

Controle 248,49 ± 18,66 371 ,86 ± 28,57 105,10±6,39

0-H20 259,33 ± 10,94 295,97 ± 24,60 37,11±13,93*

0-25 265,31 ± 13,86 326,94 ± 28,13 46,64 ± 17,29*

O-50 257,24 ± 10,76 304,92 ± 15,39 42,20 ± 11,65*

0-100 259,01 ± 10,94 288,34 ± 21 ,81 31,41 ± 5,99*

Média e desvio padrão, *p<O,05 vs Controle.

Não obstante, houve diferença estatística tanto no consumo de ração como na

ingestão de água dos animais tratados com a dose intermediária, quando comparados

aos diabéticos não tratados. Isso mostra o efeito dos compostos presentes no EA de

alecrim sobre o controle metabólico desses animais. Isso se torna relevante a partir do

momento em que também foi verificada redução nos níveis glicêmicos nesse mesmo

grupo (O-50), indicando que o menor consumo de ração e a menor ingestão de água se

deva ao melhor controle glicêmico por um período de tratamento de 60 dias, nesta

concentração (Tabela 9).

Tabela 9 - Consumo de ração (g/dia) e ingestão de água (mLldia) de ratos controle e

diabéticos tratados com água ou extrato aquoso de alecrim por 60 dias.

Grupos Consumo de ração (g/dia) Ingestão de água (mLldia)

Controle 26,01 ±1 ,90 40,00 ± 13,90

0-H2O 45,81 ± 3,20* 182,00 ± 30,20*

0 -25 48,21 ± 5,60* 188,00 ± 22,70*

O-50 40,31 ± 4,20# 141 ,00 ± 22,40#

0-100 44,57 ± 2,90* 177,00 ± 16,30*

Média e desvio padrão, *p <0,05 vs Controle; #p<0,05 vs D-H20 .

Vale ressaltar que o extrato aquoso de alecrim, nessas condições, apresentou

efeito hipoglicemiante, mas que os valores de glicemia (365 mg/dL) dos animais tratados

•sooilage!p solei ap sodni6 siewep soe sopeJedwoo opuenb salaqe!p op seopgio

saMeolldwoo sep oessaffloJd ç e ojuemnionuesap oe OOSIJ JOUGLIJ we conclui! oss!

.(91, e-1116!d) 001,-CI e 9Z-CI `Ozito sodra sou enb op Jouaw (90`0>d) aluaweo!isneise

(%L'9) og-a odni6 ou oe5npai `wpciweT `epeoupen !od .%L`c ap seuede !oj oe5ea!!6 e

`eras no `alailuoo s!emue soe sopeJedwoo opuenb (0/°£`z) openala epeon6 eumofflowaq

ap ienTueoJed weieluesaide soo!TNello s!ew!ue so `o!esua al!ewpd ou owo3

.(9002 `A3CIV1VV\JVAHS !VHIIEIVS seuewas os enb

awainp apian ÇLIO ap 6)4/6w 00£ woo sopeieJT weJoi `eáueop ep oe5npu! ep seuewas

sias sode `soo!pcieno s!ew!ue opuenb opemasqo °piai\ çijo op alue!wao!lbod!Li (neje

olad s!ançsuodsaa sowspeoew sop sun6le oes sass3 -aseu96oeuoo0 e welailuoo

anb saue6 ap oessaidxe e wanumno wNwei owoo `o!p9s ap awapuedep asoom6

ap Jopepodsue4 e!A asoon6 ap leu4saiu! oe5Josqe e wacpu! seuinbajeoole6!de se

`ossuo w?le .s!ewiou s!emue wa asoo!!6 ç epuçJaloT e weinew waqwel °piai\ ?Lio op

sioualuod so !! od!I owoo 1 od!' soo!iNe!p s!ew!ue wa loquei asooll6 ap s!aniu so Aznpal

Jod sopemai op!s wal owsaw ou saluasaid seu!nbaTeo se a apJan ?Lio O

"Oz1-1-0 Sn 90‘0>d# !G10.11U00 SA 90'0› d, 'o?iped clAsep e el139V11

4,17L‘9£ T- 09‘£917 *H7‘9£ -T 9Z`I-LC 00 L-CI

#t79`ZE T- 09`99£ *6Z`ZE -T- OZ`617£ 09-4

2£`81, T- 9Z` 1.6£ aZ`61. -T 00' I-LE 9Z-GI

21/9£ -T ££`6£t7 28`0£ T £8`69E 03H-GI

179`L T- 00'86 00'9 :1-- 00' LOL elaquoo

(IP/Bw) leuLd e!Lueo!19 (IP/Bw) leP!ul e!wao!10 sodna5

.seio 09 Jod wpoale ap osonbe oleJixe no

enfie woo sopeleal soowcieno a alaquoo solei ap e!weall6 ep oeõeu!wJelea - 0 I, elege".

*(0

eleger s!ewaou s!aniu eied e!wao!!6 e Aznpai ap zedeo !ol oeu v3 o 'Os no `(ip/Ow

86) spAçpnes s!ew!ue sop soe s!en6! oes oeu (6w6w 09) epç!pauwaiu! asop e woo

£S

54

10

ctl"t:lctl 8

.!:!actl

6s::..coC)

o 4E(I)

:::c(I) 2"t:l

~o

o

*

IControle 0-H20

*

0-25

#

O-50

*

0-100

Figura 16 - Dosagem de hemoglobina glicada (HbA1c) de ratos controle e diabéticostratados com água ou extrato aquoso de alecrim por 60 dias. Resultados expressosem média e desvio padrão, *p<O,OS vs Controle; #p<O,OS vs D-H20.

5.3.2.1 Efeito do extrato aquoso de alecrim sobre os parâmetros de função renal

Uma das complicações crônicas vista no diabetes é a nefropatia, bastante

associada ao estresse oxidativo. Tem sido observado em ratos diabéticos aumento

nos níveis de uréia sanguínea que indica maior mobilização de proteínas pelo

organismo, em detrimento à não utilização adequada da glicose pela insulina, bem

como níveis aumentados de creatinina, indicando dano renal progressivo, visto como

um índice de taxa de filtração glomerular (TFG) alterada. A TFG diminuída está

associada com a formação de espécies reativas de oxigênio. Essas espécies podem

acarretar a formação e a liberação de uma variedade de mediadores vasoativos que

afetam as funções renais, por promover vasoconstricção e diminuição no coeficiente

de ultrafiltração capilar glomerular e, assim, reduzir a TFG (SHARMA; KULKARNI;

CHOPRA, 2006).

Sharma, Kulkarni e Chopra (2006), investigando o efeito da cúrcuma

(açafrão) sobre a nefropatia de ratos diabéticos após quatro semanas da indução com

STZ, quando os animais foram tratados com este composto nas concentrações de 15

e 30 mg/Kg ao dia durante duas semanas, notaram efeito nefroprotetor assegurado

pela melhora nos marcadores de função renal (creatinina, uréia, clearance de

55

creatinina e uréia e excreção de albumina urinária). Outras determinações foram

realizadas, como: malonaldeído do tecido renal, glutationa reduzida e atividade das

enzimas antioxidantes SOO e CAT, observando-se atenuação do estresse oxidativo

por meio destes marcadores.

0.75

0.60:J''ti

~ 0.45

lOc~ 0.30lO

I!!o 0.15

0.00 I* *

#

*100

75

:J':gDl

~ 50lO:e::>

25 I* *

Controle 0-1-1,0 0-25 O-50 0-100

3.0

Controle 0-H20 0-25 O-50 0-100

:J':!2 6E!<li

J!.g 4<li

'"cãie 2D.

*

o*

2.5

~ 2.0E!~ 1.5'Ê::J~ 1.0

0.5

0.0

* *

Controle 0-1-1,0 0-25 O-50 0-100 Controle 0-H20 0-25 O-50 0-100

Figura 17 - Determinação da creatinina, uréia, proteínas totais e albumina sérica deratos controle e diabéticos tratados com água ou extrato aquoso de alecrim por 60dias. Resultados expressos em média e desvio padrão, *p<0,05 vs Controle; #p<0,05vs 0-H20.

No presente estudo também foi demonstrado que os animais submetidos à

indução com STZ apresentam quadro de nefropatia após 60 dias de exposição à

doença, com valores aumentados de creatinina e uréia sérica.

Assim como a cúrcuma, o extrato aquoso de alecrim reduziu os valores de

creatinina de 0,65 mg/dL, nos diabéticos não tratados, a 0,49 mg/dL no grupo O-50,

retornando ao valor encontrado para os animais controle (0,44 mg/dL), como mostra

os dados apresentados na Figura 17.

56

Esse quadro de lesão renal progressiva normalmente é acompanhado por

proteinúria e microalbuminúria, observada neste estudo pelos níveis reduzidos de

proteínas totais e albumina circulantes nos animais diabéticos, também ilustrados na

Figura 15.

O efeito protetor da curcumina foi atribuído às suas propriedades

antioxidantes, como seqüestradora de radicais hidroxilas, ânion superóxido e oxigênio

singlet, como quelante de metais, além de inibir as principais fontes de produção de

espécies reativas: xantina oxidase e NADPH oxidase (SHARMA; KULKARNI;

CHOPRA, 2006).

Haraguchi et aI. (1994) isolaram os quatro principais diterpenóides (ácido

carnósico, carnosol, rosmanol e epirosmanol) das folhas do alecrim e verificaram que

esses diterpenóides inibiram a produção do ânion superóxido no sistema da xantina

oxidase e foram capazes de inibir a peroxidação lipídica mitocondrial e microssomal

induzida pela oxidação do NADH ou NADPH, mostrando sua efetividade na proteção

dos sistemas biológicos contra o estresse oxidativo. Portanto, o efeito nefroprotetor do

EA de alecrim, verificado na dose de 50 mg/Kg, pode ser atribuído ao seu potencial

antioxidante.

Estudos in vitro com células mesangiais têm revelado o efeito tóxico da

glicose em concentrações elevadas, tanto pela reação não enzimática com proteínas

e subseqüente formação dos AGE, como pelo metabolismo exacerbado favorecendo o

aumento do estresse oxidativo e a ativação da proteína quinase C (PKC) e da proteína

quinase ativadora de mitógeno (MPKC), ambas ativadas por concentrações elevadas

de glicose, resultando na produção elevada de citocinas (COOPER, 2001).

5.3.2.2 Efeito do extrato aquoso de alecrim sobre os lipídios circulantes

A dislipidemia é um dos principais fatores de risco para doença

cardiovascular em pacientes diabéticos, cuja influência é maior que os demais. As

alterações lipídicas mais freqüentes na população diabética são hipertrigliceridemia,

colesterol HDL baixo e alterações qualitativas nas lipoproteínas, tais como a formação

de partículas de colesterol LDL pequenas e densas. O colesterol LDL denso é mais

freqüente na circulação quanto mais elevados forem os níveis de triglicérides, sendo

57

mais aterogênico do que as demais partículas lipídicas que são maiores e menos

densas (SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES, 2003).

No presente estudo, os animais diabéticos apresentaram níveis aumentados

de triglicérides e de colesterol total e colesterol HDL reduzido, quando comparados aos

animais saudáveis. Porém, o tratamento com extrato aquoso de alecrim no grupo O-50

foi capaz de reduzir os níveis de triglicérides e de colesterol total, sem aumentar o

colesterol HDL, que é um fator de proteção maior para os eventos cardiovasculares. Os

dados são apresentados na Figura 18. Apesar desta dose (50 mg/Kg) não apresentar

efeito sobre o colesterol HDL, destacam-se os valores de 91,50 mg/dL, obtidos para os

triglicérides, e de 51,66 mg/dL, para o colesterol total, sendo estes iguais aos valores

encontrados no grupo de animais controle.

240

20'1*::r ~ *~ *.§. 160

lJlQl

12'j#"ti.;:

I'Ql.!:! 80 ~

Õl ,.;:

•I- 40

O...J

Controle 0-H2O 0-25 O-50 0-100

75 * * * 60

:J' 60 :J' 50"O #

"Oa, a,

40 I - * * ...... *.§. .§.g 45 ..J,. o.B J: 30

"ê 30 "ês l· '" 20li) êii'" '"Õ 15 Õ

<.J <.J 10

o O

-Controle O-H,O 0-25 O-50 0-100 Controle O-H,O 0-25 O-50 0-100

Figura 18 - Determinação de triglicérides, colesterol total e colesterol HDL sérico deratos controle e diabéticos tratados com água ou extrato aquoso de alecrim por 60dias. Resultados expressos em média e desvio padrão, *p<0,05 vs Controle; #p<0,05vs D-H20.

58

Alterações no metabolismo lipídico também foram verificadas em uma

pesquisa na qual se administrou a animais diabéticos extrato de chá verde (300 mg/kg)

por via oral durante 4 semanas. A redução dos valores de triglicérides e de colesterol

LOL e o aumento do colesterol HOL foram atribuídos às propriedades hipolipemiantes já

observadas em estudos anteriores, nos quais se preveniu a hipertrigliceridemia induzida

em ratos suplementados com dieta rica em açúcar e se diminuiu as concentrações de

triglicérides em hamsters alimentados com ração contendo alto teor de gordura (BABU;

SABITHA; SHYAMALAOEVI , 2006).

5.3.2.3 Efeito do extrato aquoso de alecrim sobre as enzimas transaminases

glutâmico piruvato (AL T) e glutâmico oxalacética (AST)

A avaliação do efeito do EA de alecrim sobre as transaminases (AL T e AST),

enzimas marcadoras de dano hepático, foi realizada visando avaliar o extravasamento

destas para a corrente sanguínea, situação característica de injúria do tecido hepático

(SANMUGAPRIYA e VENKATARAMAN, 2006; ANORAOE-WARTHA, 2007).

Os resultados obtidos no grupo de animais diabéticos tratado com uma

quantidade bem maior de antioxidantes (100 mg/kg) levantaram a suspeita de uma

possível agressão ao tecido hepático pela metabolização de uma sobrecarga dessas

substâncias fenólicas presentes em grande quantidade no EA de alecrim . Esta

observação se relaciona com os dados apresentados na Figura 19, os quais

apresentaram valores mais elevados no grupo 0-100, tanto para AL T como AST. Os

valores destas enzimas amino-transferases nesse grupo exibiram as maiores

alterações, ou seja, aumento significativo (p<0,05) no soro desses animais quando

comparados tanto aos animais saudáveis como aos animais diabéticos, que receberam

apenas água ou aqueles tratados com menores concentrações do EA de alecrim.

Verificou-se, por conseguinte, valores normais encontrados para os animais do grupo

O-50 em ambas amino transferases e também apenas da AST para os animais tratados

com 25 mg/kg/dia de EA de alecrim durante 60 dias.

59

SOl*# 120

* 9J*#

*60 *r c

:J :J~ E~ 40 :5 60I- I--I li)c( }. c(

20 . 30,

O O

Controle 0-H2O 0-25 O-50 0-100 Controle 0-H2O 0-25 O-50 0-100

Figura 19 - Determinação das enzimas marcadoras de dano hepático de ratos controlee diabéticos tratados com água ou extrato aquoso de alecrim por 60 dias. Resultadosexpressos em média e desvio padrão, *p<0,05 vs Controle; #p<0,05 vs D-H20.

5.3.2.4 Efeito do extrato aquoso de alecrim sobre as enzimas antioxidantes nos

tecidos hepático, renal e cerebral

A atividade das enzimas SOD, CAT, GPX e GR foi determinada nos tecidos

hepático, renal e cerebral de ratos controle e diabéticos. Os resultados demonstram que

a atividade das enzimas SOD, GPx e GR de animais diabéticos não-tratados foi maior

quando comparada aos animais controle (Figuras 20,21 e 22). Com isso, evidencia-se

que o estresse oxidativo desenvolve papel importante na toxicidade induzida pela

estreptozotocina, corroborado pelo aumento compensatório do mecanismo de defesa

antioxidante, também observado por Yilmaz et aI. (2004), Okutan, Ozcelik e Yilmaz

(2005) e Babu, Sabitha e Shyamaladevi (2006). Em suma, o aumento na expressão e

na atividade dessas enzimas indica que o organismo está respondendo ao estresse

oxidativo induzido pelo diabetes e, como forma de defesa, tenta se proteger.

O aumento na atividade da SOD em animais diabéticos é possivelmente

devido à dismutação aumentada do ânion superóxido a oxigênio molecular e peróxido

de hidrogênio, como uma resposta adaptativa ao estresse oxidativo, o que, com isso,

protegeria a CAT e a GPx contra a inativação pelo ânion superóxido, já reportado na

literatura (BABU; SABITHA; SHYAMALADEVI, 2006).

Tanto o acréscimo como a redução na atividade das enzimas antioxidantes já

foram discutidos na literatura, não havendo consenso nos níveis dessas enzimas em

vários tecidos de animais diabéticos. Yilmaz et aI. (2004), Okutan, Ozcelik e Yilmaz

60

(200S) e Babu, Sabitha e Shyamaladevi (2006), investigando o efeito de compostos

com propriedades antioxidantes em animais diabéticos, mostraram a elevação da

atividade da CAT. Esse aumento pronunciado sugere também uma resposta

compensatória frente à progressão da produção de H20 2 endógeno; desta forma, a

CAT protege contra níveis de peróxido altos.

*

*

u#

*

*

**

Glutationa Redutase

Catalase

*

uControle 0-H20 0-25 O-50 0-100

I

..c: 800]ilO!c-~ 600O>E2-g 400

'E'N; 200..il.">::(

..

.~ 0.24

~c­al" 0.18

~2-~ 0.12

~EN; 0.06

ai

il."

~ 0.00..:

~"k#

O-50 0-100

**

**

Glutationa Peroxidase

Superóxido dismutase

Controle 0-H 20 0-25

I..c: 120]ilO!c-~ 90O>

~~ 60

~N; 3D..il.".:;

~

~ 4a;ec­al."

~2-~ 2

~EN~ 1..."..."

:~~

Controle 0-H20 0-25 O-50 0-100 Controle 0-H20 0-25 O-50 0-100

Figura 20 - Determinação da atividade das enzimas antioxidantes no tecido hepático deanimais controle e diabéticos tratados com água ou extrato aquoso de alecrim por 60dias. Resultados expressos em média e desvio padrão, *p<O,OS vs Controle; #p<O,OSvs D-H20.

Ao contrário desses pesquisadores, no presente estudo foi verificado

comportamento diferente na atividade da CAT frente ao modelo de diabetes

experimental induzido por estreptozotocina (Figuras 20 e 21). Os animais diabéticos

apresentaram níveis reduzidos na atividade dessa enzima. Por outro lado, aumento nos

níveis de GPx foi bem caracterizado nos três tecidos analisados: hepático, renal e

cerebral. A GPx é bastante sensível a pequenas concentrações de peróxido, sendo a

principal enzima responsável pela remoção do H202 em células de mamíferos

61

(HALLlWELL, 1994). Isso pode justificar decréscimo compensatório na atividade da

CAT que também tem a mesma função no organismo. Os mesmos resultados foram

obtidos para a enzima GR, mostrando que as reações envolvendo a glutationa podem

ajudar na melhora contra o dano causado pelas espécies reativas.

CatalaseSuperóxido Dismutase .. 240.. c:

c: 10.0 ]i1 oe i:i 2DDD. * .... 7.5 * * "." * OI 160, - * - *ai ~ E *E 2-:;-

I.. 120· 5.0 I ~u

E Ê 80N N

c:c: 2.5 ...... I.. 40.., "· ..

." "'> 0.0'>

:i :iControle O-H,O 0-25 O-50 0-100 Controle O-H,O 0-25 O-50 0-100

Glutationa PeroxidaseGlutationa Redutase

I. 0.35

O••c:

1 *i I *e * e ...,. *D. *# D. 0.28.... *# "" -~ OI

ai 0.6 EE 2- 0.21

I2-

I· .u "~

.-, ~ 0.14, ..,...," E

'H 0.3 'Hc: :.i: c:.. ! OI 0.07OI OI.., .. -g·.., "'> 0.0 '> 0.00~ :i

Controle O-H,O 0-25 O-50 0-100 Controle O-H,O 0-25 O-50 0-100

Figura 21 - Determinação da atividade das enzimas antioxidantes no tecido renal deanimais controle e diabéticos tratados com água ou extrato aquoso de alecrim por 60dias. Resultados expressos em média e desvio padrão, *p<0,05 vs Controle; #p<0,05vs D-H20.

De acordo com alguns achados e sugestões encontrados na literatura, é

proposto que as enzimas antioxidantes de ratos diabéticos não sejam suficientes e

eficazes e necessitem de um mecanismo antioxidante adicional para reduzir o estresse

oxidativo. Nesse sentido, vem sendo cada vez maior a busca por compostos de fontes

naturais que auxiliem nesses mecanismos de defesa, muitos deles associados à sua

capacidade de varredura de radicais livres, como quelantes de metais, como indutores

da expressão e/ou atividade das enzimas antioxidantes ou como inibidores das

principais vias formadoras de radicais livres.

62

.. Superóxido DisrrutaseGlutationa Peroxidase

40..

r::r:: 0.08

]i * *]i

e e0.06 1Q.

o. *#.. 30.. *

" ~[t'l "OI

C>

E E

2- :f 2-OI 20 .. 0.04

"~ ":gE

"t" '. EN

'.:=\.'1",

r:: 10N.. r:: 0.02.. ..

"..

OI ""

...:; ":i o ;;

0.00~

Controle O-H,O 0-25 O-50 0-100

Glutationa Redutase.. o.oar::

~ I * *o...0.06

"C>E2-.. 0.04

";jENr:: 0.02...."..";; 0.00:i

Controle O-HiO 0-25 O-50 0-100

Controle D-H,O 0-25 O-50 0-100

Figura 22 - Determinação da atividade das enzimas antioxidantes no tecido cerebralde animais controle e diabéticos tratados com água ou ou extrato aquoso de alecrimpor 60 dias. Resultados expressos em média e desvio padrão, *p<0,05 vs Controle;#p<0,05 vs D-H20.

Frente a essas observações, foi proposta, nesse estudo, a hipótese de que

os compostos presentes no alecrim, uma especiaria com potencial antioxidante bem

reconhecido e fonte de constituintes fenólicos com tais propriedades, poderiam atuar

de forma positiva sobre o estresse oxidativo causado pela hiperglicemia crônica e

persistente de ratos diabéticos.

Essa hipótese foi sustentada por vários trabalhos, entre eles o trabalho de

Okutan, Ozcelik e Yilmaz (2005), mostrando que um éster do ácido caféico inibe a

peroxidação lipídica e regula a atividade das enzimas antioxidantes na aorta e coração

de ratos diabéticos - e que esses efeitos estão associados às suas propriedades

antioxidantes. Yilmaz et aI. (1994) também verificaram a mesma proteção frente à

redução das enzimas antioxidantes no tecido hepático, de ratos diabéticos, após

tratamento com o ácido caféico.

63

Os dados obtidos mostraram que o tratamento com EA de alecrim na dose

de 50 mg/kg preveniu o aumento na atividade da SOD tanto no tecido hepático como

no cérebro de animais diabéticos (Figuras 20 e 22). Foi notada relação dose-resposta

no fígado; quanto maior a dose de EA administrada menor foi a atividade da SOD.

Ainda, foi observada redução dose-dependente na atividade tanto da GPx

como GR nos rins dos animais diabéticos tratados com as maiores concentrações do

extrato aquoso, além de aumento na atividade da CA T na dose de 50 mg/kg (Figura

22); esse mesmo comportamento na atividade da CAT foi visto no tecido hepático

(Figuras 20) .

O efeito de substâncias fenólicas sobre as enzimas antioxidantes,

prevenindo sua elevação, foi avaliado igualmente quando o extrato de chá verde e/ou

um éster do ácido caféico foram administrados durante 8 semanas a ratos diabéticos

(YILMAZ et aI., 2004; OKUTAN; OZCELlK; YILMAZ, 2005; BABU; SABITHA;

SHYAMALADEVI, 2006) , sugerindo que essas substâncias possam, de forma direta,

agir como atenuadores das espécies reativas e, com isso, manter os níveis de

atividade enzimática normais.

Os resultados obtidos nos ensaios realizados com o extrato aquoso de

alecrim são promissores, pois abrem a perspectiva de se ter mais estudos sobre os

compostos presentes no alecrim que possam, por um lado, focalizar compostos

adjuvantes no tratamento do diabetes e, por outro, equacionar os efeitos

antifisiológicos de teores elevados de antioxidantes fenólicos.

64

6. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos, tanto nos ensaios em in vitra como in vivo, permitiram

as seguintes conclusões:

• O alecrim apresenta potencial antioxidante elevado in vitra, observado tanto pelos

extratos como pelas frações de ácidos fenólicos nos três sistemas: promovendo a

varredura do radical OPPH, inibindo a lipoperoxidação em cascata e atuando no

método ORAC.

• O potencial antioxidante está associado aos seus constituintes químicos, pois é

fonte de compostos fenólicos, inclusive de ácidos fenólicos (caféico, ferúlico,

elágico, protocatecuíco, quínico e salicílico).

• O extrato aquoso de alecrim, especificamente na dose de 50 mg/Kg e nas

condições estudadas, apresentou efeito sobre as enzimas antioxidantes (800, CAT

e GPx) e sobre parâmetros bioquímicos de animais submetidos ao diabetes

experimental.

• Esta proteção está intimamente relacionada com a dose de antioxidantes

administrada, ficando claro que hem sempre a quantidade maior oferecida, como

observado na dose de 100 mg/Kg, apresentará os melhores efeitos frente ao

modelo de estresse oxidativo estudado.

65

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABDOLLAHI, M.; RANJBAR, A ; SHADNIA, S.; NIKFAR, S. ; REZAIEE, A Pesticides and oxidative stress: a review. Medicai Science Monitor: International Medicai Journal of Experimental and Clinicai Research, v.10, n.6, p.144-147, 2004.

AGGARWAL, B.B.; SHISHODIA, S. Molecular targets of dietary agents for prevention and therapy ofcâncer. Biochemical Pharmacology, v.71 , p.1397-1421, 2006.

AKSOY, N.; VURAL, H.; SABUNCU, T. ; ARSLAN, O.; AKSOY, S. Beneficiai effects of vitamins C and E against oxidative stress in diabetic rats . Nutrition Research, v.25, p.625-630, 2005.

ALMELA, L. ; SÁNCHEZ-MUNOZ, B.; FERNÁNDEZ-LÓPEZ, J.A ; ROCA, M.J.; RABE, V. Liquid chromatograpic-mass spectrometric analysis of phenolics and free radical scavenging activity of rosemary extract from different raw material. Journal of Chromatography A , v.1120, n.1, p.221-229, 2006.

AMIN, A ; HAMZA, AA Hepatoprotective effects of Hibiscus, Rosmarinus and Salvia onazathioprine-induced toxicity in rats. Life Sciences, v.77, n.3, p.266-278, 2005.

ANDRADE-WARTHA, E.R.S . Propriedades antioxidantes de clones do pedúnculo de caju (Anacardium occidentale L.): efeito sobre a lipoperoxidação e enzimas participantes do sistema antioxidante de defesa do organismo animal. São Paulo, 2007. 116p. Tese de Doutorado - Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Universidade de São Paulo.

ASGARY, S.; NADERI, G.H. ; SARRAFZADEGAN, N.; GHASSEMI , N. ; BOSHTAM, M.; RAFIE, M.; REFIAN, A Anti-oxidant effect of flavonoids on hemoglobin glycosylation. Pharmaceutica Acta Helvetiae, v.73, n.5, p.223-226, 1999.

BABU, P.v.A; SABITHA, K.E.; SHYAMALADEVI, C.S. Green tea extract impedes dyslipidaemia and development of cardiac dysfunction in streptozotocin-diabetic rats. Clinicai and Experimental Pharmacology and Physiology, v.33, p.1184-1189, 2006.

66

BAE, J.W.; LEE, M.H. Effect and putative mechanism of action of ginseng on the formation of glycated hemoglobin in vitro. Journal of Ethnopharmacology, v.91, p.137-140,2004.

BALASUBASHINI, M.S.; RUKKUMANI, R.; VISWANATHAN, P.; MENON, V.P. Ferulic acid alleviates lipid peroxidation in diabetic rats. Phytotherapy Research, v.18, p.310-314,2004.

BAYNES, J.W.; THORPE, S.R. The role of oxidative stress in diabetes complications: a new perspective on an old paradigm. Diabetes, v.48, n.1, p.1-9, 1999.

BEM, AF.; KUNDE, J. A importância da determinação da hemoglobina glicada no monitoramento das complicações crônicas do diabetes mellitus. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, v.42, n.3, p.185-191, 2006.

BEUTLER, E. Red cell metabolism: a manual of biochemical methods. 2.ed. New York, London: Grune & Stratton, 1975. p.89-90.

BLOIS, M.S. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature, v.181, n.26, p.1199-1200, 1958.

BOUSOVÁ, 1.; MARTIN, J.; JAHODÁR, L.; DUSEK, J.; PALlCKA, V.; DRSATA, J. Evaluation of in vitro effects of natural substances of plant origin using a model of protein glycoxidation. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v.37, p.957-962, 2005.

BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principie of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v.72, p.677-685, 1985.

BRAND-WILLlANS, W.; CUVELlER, M.E.; BREST, C. Use of free radical method evaluate antioxidant activity. LWT - Food Science and Technology, v.28, p.25-30, 1995.

67

BRENT JENS, R.; SALTZ, L. Islet cell tumors of the pancreas: the medicai oncologist's perspective. Surgical Clinics of North America, v.81, n.3, p.527-542, 2001 .

BROWNLEE, M. The pathobiology of diabetic complications: A unifying mechanism. Diabetes, v.54, p.1615-1625, 2005.

BROWNLEE, M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature, v.414, p.813-820, 2001.

CAO, G.; ALESSIO, H.M. ; CUL TER, R. Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants. Free Radical Biology & Medicine, v.14, p.303-311 , 1993.

CAPECKA, E.; MARECZECK, A ; LEJA, M. Antioxidant activity of fresh and dry herbs of some Lamiaceae species. Food Chemistry, v.93, p.223-226, 2005.

CHAN, T.Y.K.; CHAN, J.C.N.; TANLlNSON, B.; CRITCHLEY, J.A Chinese herbal medicines revisited : a Hong Kong perspective. Lancet, v.342 , p.1532-1534, 1993.

CINTRA, R.M .G.C. Efeito antioxidante de especiarias: avaliação da salsa (Petroselium sativum Hoffm) , cebolinha verde (Allium shoenoprasum L.), orégano (Origanum vulgare L.) e alecrim (Rosmarinus officinalis L.). São Paulo, 1998. 152p. Tese de Doutorado - Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Universidade de São Paulo.

COOPER, M.E. Interaction of metabolic and homodynamic factors in mediating experimental diabetic nephropathy. Diabetologia, v.44, p.1957-1972, 2001 .

COSKUN , O.; KANTER, M. ; KORKMAZ, A; OTER, S. Quercetin , a flavonoid antioxidant, prevents and protects streptozotocin-induced oxidative stress and f3-cell damage in rat pancreas. Pharmacological Research, v.51 , p.117-123, 2004.

68

CRAIG, W.J. Health-promoting properties of common herbs. American Journal Clinicai of Nutrition, v.70, p.491-499, 1999.

DEL BANO, M.J .; CASTILLO, J.; BENAVENTE-GARCIA, O.; LORENTE, J.; MARTíAN­GIL, R.; ACEVEDO, C.; ALCARAZ, M. Radioprotective-antimutagenic effects of rosemary phenolics against chromosomal damage induced in human Iymphocytes by y­rays. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.54, p.2064-2068, 2006.

DICKINSON, P.J .; CARRINGTON, A.L.; FROST, G.S.; BOUL TON, A.J .M. Neurovascular disease, antioxidants and glycation in diabete. Diabetes/Metabolism Research and Reviews, v.18, p.260-272, 2002.

DRABROWSKI, K.J.; SOSULSKI, F.W. Quantification of free and hydrolysable phenolic acids in seeds by capillary gas-liquid chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.32, p.123-127, 1984.

DROGE, W. Free radicais in the physiological control of cell function. Physiological Reviews, v.82, p.47-95, 2002.

DUCKWORTH, W.C. Hyperglycemia and cardiovascular disease. Current Atherosclerosis Reports, v.3, p.383-391, 2001.

ELLlS, E.M. Reactive carbonyls and oxidative stress: potential for therapeutic intervention. Pharmacology & Therapeutics, v.115, p.13-24, 2007.

GALATI, G.; O'BRIEN, P.J. Potential toxicity of flavonoids and other dietary phenolics: significance for their chemopreventive and anticancer properties. Free Radical Biology & Medicine, v.37, n.3, p.287 -303, 2004.

GIADA, M.L.R.; MANCINI-FILHO, J. Avaliação da atividade antioxidante in vitro de compostos fenólicos de alimentos. Nutrire: Revista da Sociedade Brasileira de Alimentação e Nutrição, v.28, p.91-107, 2004.

69

GOLDSTEIN, D.E. How much do you know about glycated hemoglobin testing . Clinicai Diabetes, v.13, ptA, p.60-63, 1995.

GRUPO INTERDISCIPLINAR DE PADRONIZAÇÃO DA HEMOGLOBINA GLlCADA -A1c. A importância da hemoglobina glicada (A1c) para a avaliação do controle glicêmico em pacientes com Diabetes mellitus: aspectos clínicos e laboratoriais. São Paulo, Posicionamento 2004.

HALLlWELL, B. Free radicais and antioxidants: a personal view. Nutrition Reviews, v.52, n.8, p.253-265, 1994.

HARAGUCHI, H.; SAlTO, T.; OKAMURA, N. ; YAGI, A. Inhibition of lipid peroxidation and superoxide generation by diterpenoids from Rosmarinus officinalis. Planta Medica, v.61 , p.333-336, 1995.

HARTGE, M.M.; UNGER, T.; KINTSCHER, U. The endothelium and vascular inflammation in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research, vA, p.84-88, 2007.

JAIN, S.K. Superoxide dismutase overexpression and cellular oxidative damage in diabetes: A commentary on "Overexpression of mitochondrial superoxide dismutase in mice protects the retina from diabetes-induced oxidative stress" . Free Radical Biology & Medicine, vA1, p.1187-1190, 2006.

KIRITOSHI, S.; NISHIKAWA, T. ; SONODA, K.; KUKIDOME, O.; SENOKUCHI , T.; MATSUO, T.; MATSUMURA, T.; TOKUNAGA, H. ; BROWNLEE, M.; ARAKI , E. Reactive oxygen species from mitochondria induce Cyclooxygenase-2 gene expression in human mesangial cells: potential role in diabetic nephropathy. Diabetes, v.52, p.2570-2577, 2003.

KRYGIER, K.; SOSULSKI , F.; HOGGER, L. Free, sterified, and insoluble-bound phenolic acids. 1. Extraction and purification procedure. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.30, n.2, p.330-334, 1982.

70

LAPOLLA, A; FEDELE, D.; TRALDI, P. Glyco-oxidation in diabetes and related diseases. Clinica Chimica Acta, v.357, p.236-250, 2005.

LEMHADRI, A; ZEGGWAGH, N.A; MAGHRANI, M.; JOUAD H.; EOOOUKS, M. Anti­hyperglycaemic activity of the aqueous extract of Origanum vu/gare growing wild in Tafilalet region. Journal of Ethnopharmacology, v.92, p.251-256, 2004.

LlU, F.; NG, T.B. Antioxidative and free radical scavenging activities of selected medicinal herbs. Life Sciences, v.66, p.725-735, 2000.

LUSINI, L.; TRIPOOI, S.A; ROSSI, R.; GIANNERINI, F.; GIUSTARINI, O.; DEL VECCHIO, M.T.; BARBANTI, G.; CINTORINO, M.; TOSI, P.; DI SIMPLlCIO, P. Altered glutathione anti-oxidant metabolism during tumor progression in human renal-cell carcinoma. International Journal of Cancer, v.91, p.55-59, 2001.

MARIANI, E.; POLlDORI, M.C.; CHERUBINI, A; MECOCCI, P. Oxidative stress in brain aging, neurodegenerative and vascular diseases: an overview. Journal of Chromatography: B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, v.827, n.1, p.65-75, 2005.

MANCINI, O.AP.; DIAS, AL.F.; PINTO, J.R.; MANCINI-FILHO, J. Antioxidantes do extrato aquoso da canela (Cinnamomum zey/anicum, Bluma) como inibidores do vírus influenza. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v.35, n.1, p.155-160, 1999.

MANCINI FILHO, J.; VAN-KOIIJ, A; MANCINI, O.AP.; COZZOLlNO, F.F.; TORRES, R.P. Antioxidant activity of cinnamon (Cinnamomum Zey/anicum, Breyne) extracts. BolleUino Chimico Farmaceutico, v.137, n.11, p.443-447, 1998.

MARITIM, AC.; SANOERS, R.A; WATKINS 111, J.B. Diabetes, oxidative stress, and antioxidants: a review. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology, v.17, n.1, p.24-38, 2003.

MARTíN-GALLÁN, P.; CARRASCOSA, A; GUSSINYÉ, M.; OOMíNGUEZ, C. Biomarkers of diabetes-associated oxidative stress and antioxidant status in young diabetic patients with or without subclinical complications. Free Radical Biology & Medicine, v.34, n.12, p.1563-1574, 2003.

71

MC CORO, J.M.; FRIOOVICH, I. Superoxide dismutase, an enzyme function for erythrhrocuprein (hemocuprein). Journal of Biological Chemistry, v.244, p.6049-6055, 1969.

MILLER, H.E. Simplified method for evaluation of antioxidants. Journal of American Oil Chemists' Society, v.48, n.2, p.91 , 1971 .

MOREIRA, A.V.B. ; MANCINI FILHO, J. Atividade antioxidante das especiarias mostarda, canela e erva-doce, em sistemas aquoso e lipídico (CN 136). Nutrire: Revista da Sociedade Brasileira de Alimentação e Nutrição, v.25, p.45-60, 2003.

MOREIRA, A.V.B.; MANCINI FILHO, J. Influência dos compostos fenólicos de especiarias sobre a lipoperoxidação e o perfil lipídico de tecidos de ratos. Revista de Nutrição da PUCCAMP, v.17, n.4, p.411-424, 2004.

NAZIROGiLU , M.; BUTTERWORTH, P. Protective effects of moderate exercise with dietary vitamin C and E on blood antioxidative defense mechanism in rats with streptozotocin-induced diabetes. Canadian Journal of Applied Physiology, v.30, n.2, p.172-185,2005.

NEWSHOLME, P.; HABER, E.P. ; HIRABARA, S.M.; REBELATO, E.; PROCOPIO, J.; MORGAN, O.; OLlVEIRA-EMILlO, H.R. ; CARPINELLI, A.R. ; CURI, R. Diabetes associated cell stress and dysfunction: role of mitochondrial and non-mitochondrial ROS production and activity. Journal of Physiology, v.583, p.9-24, 2007.

NINFALI, P. ; MEA, G.; GIORGINI , S.; ROCCHI, M.; BACCHIOCCAL, M. Antioxidant capacity of vegetables, spices and dressings relevant to nutrition. British Journal of Nutrition , v.93, p.257-266, 2005.

NISHIKAWA, T. ; KUKIOOME, O.; SONOOA, K. ; FUJISAWA, K.; MATSUHISA, T. ; MOTOSHIMA, H.; MATSUMURA, T.; ARAKI, E. Impact of mitochondrial ROS production on diabetic vascular complications. Diabetes Research and Clinicai Practice, v.77, suppl.1, p.S41-S45, 2007.

72

OKUTAN, H.; OZCELlK, N.; YILMAZ, H.R; UZ, E. Effects of caffeic acid phenethyl ester on lipid peroxidation and antioxidant enzymes in diabetic rat heart. Clinicai Biochemistry, v.38, p.191-196, 2005.

ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE. Definição, Diagnóstico, e Classificação do Diabetes Mellitus e suas complicações. Parte 1: Diagnóstico e Classificação, 1999.

OU, B.; HAMPSCH-WOODILL, M.; PRIOR, RL. Development and validation of am improved oxygem radical absorbance capacity assay using fluoescein as the fluorescent probe. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.49, p.4619-4626, 2001 .

OU, B.; HUANG, D. ; HAMPSCH-WOODILL, M.; FLANAGAN, J.A; DEEMER, E.K. Analysis of antioxidant activities of common vegetables employing Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) and Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) assays: a comparative study. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.50, p.3122-3128, 2002.

PACKER, L.; KRAEMER, K.; RIMBACH , G. Molecular aspects of lipoic acid in the prevention of diabetes complications. Nutrition, v.17, p.888-895, 2001 .

PENCKOFER, S.; SCHWERTZ, D. ; FLORCZAK, K. Oxidative stress and cardiovascular disease in type 2 diabetes: the role of antioxidants and prooxidants. Journal of Cardiovascular Nursing, v.16. n.2. p.68-85, 2002.

PEPATO, M.T. ; MIGLlORINI, RH.; GOLDBERG, AL. ; KETTELHUT, I.C. Role of different proteolytic pathways in degradation of muscle protein from streptozotocin­diabetic rats . American Journal of Physiology, v.271, p.340-347, 1996.

PRIOR, RL. ; CAO, G. Analysis of botanicals and dietary supplements for antioxidant capacity: a review. Journal of AOAC International , v.83, n.4, p.950-956, 2000.

RICE-EVANS, C.; MILLER, N.; PAGANGA, G. Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radical Biology & Medicine, v.20, p.933-956, 1996.

73

ROCHA, F.D.; TEIXEIRA, V.L.; PEREIRA, R.C.; KAPLAN, M.AC. Diabetes mellitus e estresse oxidativo: produtos naturais como alvo de novos modelos terapêuticos. Revista Brasileira de Farmácia, v.87, n.2, p.49-54, 2006.

ROLO, AP.; PALMEIRA, C.M. Diabetes and mitochondrial function: role of hyperglycemia and oxidative stress. Toxicology and Applied Pharmacology, v.212, p.167-178,2006.

SANMUGAPRIYA, E.; VENKATARAMAN, S. Studies on hepatoprotective and antioxidant actions of Strychnos potatorum Linn. seeds on CCL4-induced acute hepatic injury in experimental rats. Journal of Ethnopharmacology, v.105, p.154-160, 2006.

SCHEIN, P.S.; COONEY, D.A; MCMENAMIN, M.G. ; ANDERSON , T. Streptozotocin diabetes-further studies on the mechanism of depression of nicotinamide adenine dinucleotide concentrations in mouse pancreatic islets and liver. Biochemical and Pharmacology, v.22, p.2625-2631 , 1973.

SCHNEDL, W.J.; FERBER, S.; JOHNSON, J.H.; NEWGARD, C.8. STZ transport and cytotoxicity: specific enhancement in GLUT2-expressing cells . Diabetes, v.43, p.11, p.1326-1333, 1994.

SCOTT, B.C. ; BUTLER, J.; HALLlWELL, B.; ARUOMA, 0 .1. Evaluation of the antioxidant actions of ferulic acid and catechins. Free Radical Research Communications, v.19, p.241-253, 1993.

SENGUPTA, 8. ; SWENSON, J. Properties of normal and glycated human hemoglobin in presence and absence of antioxidant. Biochemical and Biophysical Research Communications, v.334, p.954-959, 2005.

SHARMA, S. ; KULKARNI, S.K.; CHOPRA, K. Curcumin, the active principie of turmeric (Curcuma longa), ameliorates diabetic nephropathy in rats. Clinicai and Experimental Pharmacology and Physiology, v.33, p.940-945, 2006.

74

SHIMADA, S. ; TANAKA, Y.; OHMURA, C.; TAMURA, Y.; SHIMIZU, T. ; UCHINO, H.; WATADA, H.; HIROSE, 1.; NAKANIWA, 1.; MIWA, S.; KAWAMORI , R N­(carboxymethyl)valine residues in hemoglobin (CMV-Hb) reflect accumulation of oxidative stress in diabetic patients. Diabetes Research and Clinicai Practice, v.69, n.3, p.272-278, 2005.

SIES, H.; KOCH, O.R; MARTINO, E.; BOVERIS, A Increased biliary glutathione disulfide release in chronically ethanol treated rats. FEBS Letters , v.103, p.287-290, 1979.

SINGH, N.; KAMATH, V.; RAJINI , P.S. Attenuation of hyperglycemia and associated biochemical parameters in STZ-induced diabetic rats by dietary supplementation of potato peel powder. Clinica Chimica Acta, v.353, p.165-175, 2005.

SOARES, S.E. Ácidos fenólicos como antioxidantes. Revista de Nutrição da PUCCAMP, v.15, n.1, p.71-81, 2002.

SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES. Consenso Brasileiro sobre Diabetes 2002: diagnóstico e classificação do diabetes melito e tratamento do diabetes melito do tipo 2. Rio de Janeiro: Diagraphic, 2003. 40p. Disponível em: http://neu.saude.sc.gov.br/arquivos/consenso diabetes sbd 2002.pdf. Acesso em: 25.out.2005.

SOOBRATTEE, M.A ; NEERGHEEN, V.S. ; LUXIMON-RAMMA, A ; ARUOMA, 0 .1. ; BAHORUN, 1. Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents: mechanism and actions. Mutation Research, v.579, p.200-213, 2005.

SOTELO-FÉLlX, J.I.; MARTINEZ-FONG, D.; MURIEL, P. ; SANTILLÁN, RL.; CASTILLO, D.; YAHUACA, P. Evaluation of the effectiveness of Rosmarinus officinalis (Lamiaceae) in the alleviation of carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in the rat. Journal of Ethnopharmacology, v.81, p.145-154, 2002.

SWAIN, T. ; HILLS, W.E. The phenolic constituents of Punnus domestica. I-quantitative analysis of phenolic constituents. Journal of the Science of Food and Agriculture, v.19, p.63-68, 1959.

75

SZWERGOLO, 8.S.; HOWELL, S.K.; 8EISSWENGER, P.J. Nonenzymatic glycation/enzymatic deglycation: a novel hypothesis on the etiology of diabetic complications. International Congress Series, v.1245, p.143-152, 2002.

VALKO, M.; LEI8FRITZ, O.; MONCOL, J.; CRONIN, M.T.O.; MAZUR, M.; TELSER, J. Free radicais and antioxidants in normal physiological functions and human disease. International Journal of Biochemistry & Cell Biology, v.39, p.44-84, 2007.

VATTEM, O.A ; SHETTY, K. 8iological functionality of ellagic acid: a review. Journal of Food Biochemistry, v.29, p.234-266, 2005.

WANG, Z.; GLEICHMANN, H. GLUT2 in pancreatic islets: crucial target molecule in diabetes induced with multiple low doses of streptozotocin in mice. Diabetes, v.47, n.1, p.50-56, 1998.

WILO, S.; ROGLlC, G.; GREEN, A; SICREE, R. ; KING, H. Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care, v.27, p.1 047-1053, 2004.

YEH, C.; YEN, G. Induction of hepatic antioxidant enzymes by phenolic acids in rats is accompanied by increased leveis of multidrug resistance-associated protein 3 mRNA expression . Journal of Nutrition, v.136, p.11-15, 2006a.

YEH, C.; YEN, G. Modulation of hepatic phase II phenol sulfotransferase and antioxidant status by phenolic acids in rats. Journal of Nutritional Biochemistry, v.17, n.8, p.561-569, 2006b .

YILMAZ, H.R.; UZ, E.; YUCEL, N.; ALTUNTAS, 1.; OZCELlK, N. Protective effect of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on lipid peroxidation and antioxidant enzymes in diabetic rat liver. Journal of Biochemistry and Molecular Toxicology, v.18, n.4, p.234-238, 2004.

76

YU, Y.; CHANG, W.; WU, C.; CHIANG, S. Reduction of oxidative stress and apoptosis in hyperlipidemic rabbits by ellagic acid. Journal of Nutritional Biochemistry, v.16, p.675-681, 2005.

ZHAO, L. Effects of free radicais in diabetes. Free Radical Biology & Medicine, v.77, p.222, 2001.

ZHENG, W.; WANG, S. Antioxidant activity and phenolic composition in selected herbs. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.49, p.5165-5170, 2001 .

SOX3N'v' "S

LL

Anexo 1 - Especificações da ração oferecida aos animais

I', ·;~;;~~~U Ital ~gwraAça ,,,n Nd n cc() ;\" 1'<:11

.. ~._ .. ,-._--,------ -

INICIAL " SUINOS " NUVI LAB CR 11RRADIAOA

NuvHab CR-1 Irradiada

78

I ~ U

Composição básica do produto: Milho integral moldo, fareio de soja, farelo S de trigo, carbonato de cá tôo , fosfato bicà lcico, cloreto de sódio, gordura

vegetaL premix vitamín:co mineral e aminoácidos,

PA)j~~hl, ", )?:t~~'YJ'!!; jl

~~~~W4~t~:~'L~~~:'

Níveis de garantia por quilograma do produtQ:

Umidade (máx) Proteína Bruta (min) Extrato Etéreo (mio) Matérta Minera! rnax) Matéria Fibrosa (máx) Cálcio (máx) Fósforo (min)

Enriquecimento vor quilograma do produto:

12,50 22,00 5,00 10,00 8,00 1,40

0,80

% % O/h

"lo % % %

Vnaminas: Vitamna A 13000,00 U~ : vitamina D3 2000,00 UI: vitamina 81 5,00 mg; vrtamlna B12 22,00 mcg; vitamina 82 6,00 mg: vitamina B6 7,00 mg vitamina E 34 ,00 mg; vitamina K3 3,00 mg; nrélcina 60,00 mg tnotina 0,05 mg; àcido fólico1.0Q mg; acido p<JntotêniCO 21 ,00 mg: colina 650,00 mg Microeiemenlos Minerais: Cobre 10.00 mg; cobalto 1,50 mg, ferro 50,00 mg; lodo 2,00 n1g , manganes 60.00 mg: selênio 0,05 mg, zinco 60.00 mg,

.',I,~i'lliiE,a Arl'l1l!oa,cidos: USlnaiOQ,QO mg, mettonma 300,00 mg Aditivos : AntiOxtdante 100,00 mg,

;;/) H ;, Indicação: Alimento irradiado para camundongos e ralos de labofEltófÍos

~58~;,::mbt,).~. ~<.~~ .. ~

1 2345678 9 10 11 12 13 14 15 16 1/ 18 19 20 :z 1 22 23 24 25 26 27 28 29 i 30

Uso: Administraçao à vontade através de comedouros suspensos. Apresentação: Peletilada, (extrusada ou fare!ada sob consulta),

,~.

'.

79

Anexo 2 - Cromatograma característico da fração de ácidos fenólicos livres (AFL) obtida

das folhas de alecrim (Rosmarinus officinalis L.) rnV

~ I d a 30

b

20

c

~

I 10

I

o IJ, I I J.. ..... 1 1 ~UJ~L ~ l ~. J\ JL r

~ o 10 20 30 40rmn

a- bsa; b- ácido salicílico; c- protocatecuíco; d- C17 (padrão interno).

80

Anexo 3 - Cromatograma característico da fração de ácidos fenólicos solúveis (AFS)

obtida das folhas de alecrim (Rosmarinus officinalis L.) mV ~~------~-----

a 30

e b

20

d

f -

10

l1l.J~~... ~~~LlJ ~-01-

g

o 10 20 30 40rnln

a- bsa; b- ácido salicílico; c- quínico; d- C17 (padrão interno) ; e- ferúlico; f- caféico; g- elágico.

8]

Anexo 4 - Cromatograma característico da fração de ácidos fenólicos insolúveis (AFI)

obtida das folhas de alecrim (Rosmarinus officinalis L.) mV

A

15 d -

a b

10 e

5 f

o ~ J, ,I LLtL_, I"I~ ~

-

O 10 20 30 40mln

a- bsa; b- ácido salicílico; c- protocatecuíco; d- C17 (padrão interno) ; e- ferúlico; f- caféico.

Anexo 5 - Informações para os Membros de Bancas Julgadoras de Mestrado

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Secretaria de Pós-Graduação

Informações para os Membros de Bancas Julgadoras de Mestrado / Doutorado

1. O candidato fará uma apresentação oral do seu trabalho, com duração máxima de trinta minutos.

2. Os membros da banca farão a argulçao oral. Cada examinador disporá, no máximo, de trinta minutos para argüir o candidato, exclusivamente sobre o tema do trabalho apresentado, e o candidato disporá de trinta minutos para sua resposta.

2.1 Com a devida anuência das partes (examinador e candidato), é facultada a argüição na forma de diálogo em até sessenta minutos por examinador.

3. A sessão de defesa será abelta ao público.

4. Terminada a argüição por todos os membros da banca, a mesma se reunira reservadamente e expressará na ata (relatório de defesa) a aprovação ou reprovação do candidato, baseando-se no trabalho escrito e na argüição.

4.1 Caso algum membro da banca reprove o candidato, a Comissão Julgadora deverá emitir um parecer a ser escrito em campo exclusivamente indicado na ata.

4.2 Será considerado aprovado o aluno que obtiver aprovação por unanimidade ou pela maioria da banca.

5. Dúvidas poderão ser esclarecidas junto à Secretaria de Pós­Graduação: pqfarma@usp.br, (11) 30913621.

São Paulo, 18 de março de 2005.

Profa. Dra. Bernadette D. G. M. Franco Presidente da CPG/FCF/USP

Av . Prol. Lineu Prestes. 580. Bloco 13 A - Cid"", Universitária - CEP 055il8-900 - São Paulo - SP Fone: (11 ) 3091362 1 - Fax (11 ) 3091 3 141 - . -mail : pglarma@usp.b,

82

Anexo 6 - Parecer da Comissão de Ética em Experimentação Animal

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Ofício CEEA n° 10/2006

IImo(a) 5r(a). Ana Mara de Oliveira e Silva Orientador: Prof. Jorge Mancini Filho FBA

Prezado(a) Senhor(a)

Faculdade de Ciências Farmacêutícas Comissão de Ét.ca !!fi' E~penrnel1laç!ic Ammal

São Paulo. 16 de março de 2006

A Comissa<:> de Ética em Experimentação Animal da FCF/USP, em reunião realizada

em 13 de março, APROVOU o projete "Efeito anticxidaT1te dos compostos fenólicQs

do orégano (Origanum vulgare L.) '8 alecrim (Rosmarinus officinalls L) sobre a

gllcaçãc protéica e enz.imas antloxidantes de ratos diat)etlcos induzidos por

estrepto.2:otoclna ' (Protocolo CEEA nO 96) , apresentado por Vossa Senhoria.

Sendo o que nos cumpre , reiteramos protestos àe estima e consideração.

Atenciosamente,

~· .l /~. /~/ ./:>-"'-i-, ~ I ~)

Profa Dra Li~ia Ferreira Gomes Coordenadora do Comitê de Ética em Experimentação Anin,al

Av. P,õl~Un"u P~:;'1e.: 500 -8Íacc;1~A-. Ci<lQ~Ü;;;i::;.r;;itifi .. :c~P055~:~õPa'ü,;; : si' Forte: !11 130St:l617 I fel(; !'1 13e1S-<;o~3 • ""maU! :t"9o@u~P.\>r

83