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1. Introdução

1.1. Carcinogênese Química

É muito antiga a constatação de que a exposição dos seres humanos a

determinadas substâncias presentes no meio ambiente ou no seu local de trabalho

pode levar ao desenvolvimento de câncer, tendo sido identificadas muitas

substâncias carcinogênicas (MARNETT e PLASTARAS, 2001). Geralmente

decorre um longo período (anos) entre os eventos iniciais (exposição aos

carcinógenos, ocorrência de lesões no DNA e fixação das mutações) e o

surgimento dos tumores (SCHOR e SCHOR, 2001; LOTEM e SACHS, 2002). A

carcinogênese é o resultado do acúmulo progressivo de alterações gênicas

(SCHOR e SCHOR, 2001; MICHOR et al.,2005).

Figura 1.1: Eventos importantes para a carcinogênese química (adaptado de SINGH e

FARMER, 2006).

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A replicação correta do DNA é necessária para a sobrevivência de qualquer

organismo. Em geral essa replicação ocorre com alta fidelidade, porém um erro

espontâneo pode surgir no DNA. A correção desses erros por enzimas de reparo é

essencial para prevenir a mutagênese e a carcinogênese. A presença de lesões no

DNA pode aumentar os erros do processo de replicação e, assim, a freqüência de

mutações (PORELLO et al., 1998; NOLL et al.,1999; BELOUSOVA et al., 2006).

Dessa forma, a lesão no DNA é considerada o primeiro passo importante no

processo de carcinogênese. Carcinógenos químicos podem formar adutos com o

DNA ou induzir outras modificações nessa biomolécula, como o dano oxidativo,

quebras de fitas, rearranjos cromossômicos e deleções de pares de bases (Figura

1.1) (POIRIER, 2004; SINGH e FARMER, 2006).

Para prevenir contra as conseqüências deletérias das lesões em DNA, uma

rede complexa e complementar de mecanismos enzimáticos de reparo dessa

biomolécula evoluiu desde o surgimento da vida na terra. Como exemplo, quebras

de fita-dupla são reparadas por um mecanismo dependente de recombinação

homóloga ou por uma reação que envolve a religação das extremidades da quebra,

enquanto bases que sofreram pequenas alterações estruturais (p.ex. oxidação) são

removidas principalmente pelo sistema de reparo por excisão de bases (BER).

Adutos grandes que provocam distorção da dupla-hélice, como é o caso das lesões

provocadas por vários xenobióticos, são removidos principalmente pelo sistema de

reparo por excisão de nucleotídeos (NER). Entretanto, existe grande sobreposição

na especificidade por substratos entre as várias vias de reparo e, ainda, algumas

proteínas são utilizadas em mais de uma via. A importância das vias de reparo de

DNA para a redução da incidência de câncer tem sido demonstrada nos estudos de

várias doenças humanas que envolvem deficiência em mecanismos de reparo (ex.,

Xeroderma pigmentosum, síndrome de Cockayne) e em modelos de animais

transgênicos (BOER e HOEIJMAKERS, 2000).

Embora as células possuam mecanismos para o reparo de muitos tipos de

danos ao DNA, os mesmos podem não ser completamente efetivos e resíduos

desses danos ao DNA podem levar à inserção incorreta de bases durante a

replicação, seguida pela transcrição e tradução, culminando, por exemplo, na

síntese de proteínas alteradas (POIRIER, 2004).

Como o desenvolvimento de um tumor requer muitos eventos que ocorrem

durante longo período de tempo, a indução de câncer em humanos muitas vezes

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está dentro de um contexto que envolve o ambiente e as substâncias químicas

nele presentes, às quais as pessoas estão expostas ao longo da vida (POIRIER,

2004). O câncer é um dos problemas mais comuns e graves da medicina clínica. É

uma doença que compreende grande variedade de tumores malignos que se

formam pelo mesmo processo básico de crescimento descontrolado. O diagnóstico

e tratamento precoces são vitais e a identificação de pessoas com risco aumentado

de câncer, antes do seu aparecimento, é um objetivo importante de pesquisa

médica (THOMPSON et al., 1993).

Didaticamente, o processo de carcinogênese pode evoluir em três fases: de

iniciação ou celular, de promoção ou tecidual e de progressão ou sistêmica. Na

fase de iniciação, tanto fatores endógenos quanto exógenos podem, por um único

evento, induzir um dano irreversível ao DNA de uma célula. Contudo, um único

evento não é suficiente para induzir uma alteração maligna, necessitando

posteriormente da ação de promotores tumorais. Na fase de promoção ocorre a

expansão clonal da célula transformada, que sofre inúmeras alterações genéticas e

epigenéticas. Freqüentemente os tumores são diagnosticados nessa fase. Os

carcinógenos podem ser agentes iniciadores ou promotores; alguns carcinógenos

são classificados como completos porque atuam como iniciadores e promotores

tumorais ao mesmo tempo (HARRIS, 1991), como é o caso de potentes

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), quando são repetidamente

aplicados em ratos por longo período de tempo. Tais compostos podem induzir

mutações somáticas (fase de iniciação do tumor) e crescimento descontrolado da

célula irreversivelmente transformada (fase de promoção do tumor) (LUCH, 2005).

A maioria dos cânceres surge após genes importantes para o controle do

crescimento celular (proto-oncogenes, genes supressores de tumor) terem sofrido

alterações pelos carcinógenos ou por erros durante a replicação do DNA e o reparo

das lesões. A divisão das células lesadas transmite as mutações às células-filhas,

originando um “clone” de células alteradas (COUPIER e PUJOL, 2005). Ao menos

seis alterações essenciais na fisiologia celular são necessárias para que ocorra

malignidade: tumor com auto-suficiência de crescimento; com insensibilidade a

fatores inibitórios de crescimento; com potencial de replicação ilimitado; com meios

de escapar à morte celular; com capacidade de manter a angiogênese; invasão e

metástase tecidual (ZHIVOTOVSKY e ORRENIUS, 2003; DIXON e KOPRAS,

2004).

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Em geral, substâncias eletrofílicas de origem exógena e endógena são

capazes de alterar o DNA e outros componentes celulares, levando a lesões

mutagênicas (MARNETT e PLASTARAS, 2001; GARCEA et al., 2003; LIU et al.,

2005). Algumas dessas modificações covalentes às bases do DNA têm sido

relacionadas ao processo de carcinogênese (KAWAI et al., 2004).

1.2. Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs)

Os HPAs constituem uma classe de diversos compostos orgânicos (figura

1.2) que contêm dois ou mais anéis aromáticos fundidos, constituídos de átomos

de carbono e hidrogênio, formados a partir da combustão incompleta de matéria

orgânica (WORLD HEALTH ORGANISATION, 1996; NETTO et al., 2000). Os tipos

de HPAs formados estão mais relacionados às condições de combustão do que ao

tipo de material orgânico queimado (BJORSETH e RAMDAHL, 1985). Essa

formação se baseia em dois mecanismos básicos: pirólise ou combustão

incompleta e processos de carbonização. São moléculas-chaves na química, física

e biologia pelo fato de estarem relacionadas com o surgimento da vida na Terra, há

cerca de 3,5 x 109 anos (DELEUZE, 2004).

As principais fontes de HPAs são: processos industriais (produção de

alumínio, coque, eletrodos de carbono, produção e fundição de ferro e aço),

exaustão de motores a diesel ou gasolina, incêndios em florestas, queima de

carvão, fotocopiadoras, exaustão de incineradores de rejeitos, fumaça de cigarro e

degradação do petróleo por ação de alguns microorganismos presentes no meio

ambiente, tais como algas e bactérias (WORLD HEALTH ORGANISATION, 1996;

NETTO et al., 2000; PERERA et al., 2005). Em geral, HPAs de baixo peso

molecular (com 2-3 anéis aromáticos) são derivados principalmente de produtos do

petróleo, combustão incompleta de material orgânico, entre outros; enquanto que

procedimentos pirogênicos geram principalmente HPAs de alto peso molecular

(com 4 ou mais anéis aromáticos) (LIU et al., 2006).

São sólidos à temperatura ambiente e em geral apresentam elevados pontos

de fusão e ebulição. São solúveis em solventes orgânicos, altamente lipofílicos e

quimicamente estáveis, sendo biodegradados lentamente sob condições aeróbicas

e dificilmente hidrolisados no meio ambiente (FIALA et al., 1999; SAMANTA et al.,

2002). Sua volatilidade diminui com o aumento do peso molecular. Assim, podem

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ser encontrados tanto na fase gasosa quanto adsorvidos a partículas atmosféricas

e do solo. Também podem ser depositados sobre grãos, vegetais e frutas (DENNIS

et al., 1991; VOUTSA e SÂMARA 1998; KIPOPOULOU e SAMARA, 1999) e ser

formados no processo de cozimento de alimentos, tais como carnes assadas na

brasa (JÒGERSTAD e SKOG., 2005), alimentos defumados (FALCÓN et al., 1999;

MORET et al., 1999; OKONA-MENSAH et al., 2005), óleos e gorduras (TOLEDO e

CAMARGO, 1998). Devido à sua baixa hidrossolubilidade e alta afinidade por

material particulado, geralmente se depositam em sedimentos quando lançados na

água. Estão, portanto, presentes como contaminantes do ar, alimentos, solo e água

(WORLD HEALTH ORGANISATION, 1996; RÉ-POPPI e SANTIAGO-SILVA, 2005;

HSIEH et al., 2006). Devido à sua grande distribuição ambiental e ao seu caráter

lipofílico, a contaminação humana por essas substâncias pode ocorrer por

absorção pela pele, ingestão ou inalação, sendo rapidamente distribuídas pelo

organismo (NETTO et al., 2000).

A distribuição ambiental desses compostos tornou-se preocupante à medida

que estudos epidemiológicos passaram a associar a exposição aos HPAs com

aumento na incidência de câncer (BOFFETTA et al., 1997; OKONA-MENSAH et

al., 2005; RÉ-POPPI e SANTIAGO-SILVA, 2005). Assim, trabalhadores expostos

apresentaram maior risco de desenvolvimento de câncer de pulmão, pele, bexiga e

próstata (BOFFETTA et al., 1997) e o risco de desenvolvimento de câncer de

pulmão em áreas urbanas mostrou-se ~1,5 vezes maior que em áreas rurais

(KATSOUYANNI e PERSHAGEN, 1997). Em geral, as concentrações de HPAs em

áreas urbanas tendem a ser de uma a duas ordens de magnitude maior que em

áreas rurais (WORLD HEALTH ORGANISATION, 1996). Estudos realizados em

diversas partes do mundo têm também associado o consumo de alimentos

contendo HPAs à etiologia de processos carcinogênicos, mutagênicos e citotóxicos

no ser humano (PHILLIPS, 1999).

Muitos HPAs são mutagênicos em bactérias e células humanas,

carcinogênicos em animais experimentais e, portanto, suspeitos de terem um papel

na etiologia de muitos cânceres humanos (BIGGER et al., 2000). De fato, alguns

HPAs são classificados como prováveis ou possíveis carcinógenos humanos

(grupos 2A e 2B da IARC): benz[a]antraceno, os benzo[b,j,k]fluorantenos, o

benzo[a]pireno, o dibenz[a,h]antraceno, os dibenzo pirenos, o indeno[1,2,3-

cd]pireno e o 5-metilcriseno (IARC, 1983). Tais substâncias não exercem seus

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efeitos genotóxicos diretamente, mas necessitam de uma ativação metabólica para

intermediários eletrofílicos reativos que, então, levam a lesões no DNA e outras

biomoléculas. O antantreno foi considerado mutagênico em testes de curta duração

realizados em bactérias e exibiu carcinogenicidade de pele após longo tempo de

aplicação tópica empregando o protocolo de iniciação-promoção em camundongos

(SCRIBNER, 1973; JARED et al., 2005) bem como carcinogenicidade em pulmão

de ratos. Porém em muitos estudos epidemiológicos em humanos o antantreno não

mostrou nenhuma atividade carcinogênica. Dessa forma, após avaliação dos dados

experimentais, a Agência Internacional para Pesquisa do Câncer “IARC” concluiu

que “há limitadas evidências de carcinogenicidade do antantreno em animais

experimentais” enquanto que as evidências para a sua mutagenicidade são

consideradas como “inadequadas” (PLATT et al.,2002).

Um dos processos de biotransformação desses compostos envolve a

epoxidação de duplas ligações (uma reação catalisada por monooxigenases

dependentes de citocromo P450 (CYP450)), o rearranjo ou hidratação de epóxidos

a fenóis ou dióis, e a conjugação do derivado oxidado com moléculas endógenas

(ácido glicurônico, sulfato, glutationa). Produtos da oxidação de HPAs por esse

sistema enzimático (epóxidos, diol-epóxidos) são altamente reativos e formam

adutos com o DNA, podendo ser iniciadores de tumores (WEINSTEIN et al., 1976;

MASTRANGELO et al., 1997; WORLD HEALTH ORGANISATION, 1996; DREIJ et

al., 2005). É válido lembrar que o desenvolvimento de um tumor depende de vários

fatores, dentre eles a via de administração, a freqüência e o tempo de exposição

ao agente. Diversos tecidos podem metabolizar os HPAs, tornando-se órgãos

alvos, ou os metabólitos formados em um tecido (ex. fígado) podem ser

transportados para outros tecidos do organismo pela circulação (IARC, 1983;

WORLD HEALTH ORGANISATION, 1996; GOLDMAN et al., 2001).

Risco aumentado de mortalidade devida à exposição a material particulado

presente no ar também tem sido relatado (POPE et al., 2002; OKONA-MENSAH et

al., 2005) e, entre indivíduos expostos ocupacionalmente a HPAs, foi verificado

aumento significativo de 1-hidroxipireno urinário (HU et al., 2006), que é um

marcador biológico muito utilizado para verificar a exposição a pireno (MALKIN et

al., 1996; GRIMMER et al., 1997; ROGGI et al., 1997; POPP et al., 1997;

MIELYNSKA et al., 1997; DOR et al., 2000; LAFONTAINE et al., 2000; ACGIH.,

2003). Porém, há controvérsias na literatura quanto ao uso do 1-hidroxipireno

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urinário, devido a polimorfismo do CYP1A1, diferenças relacionadas ao sexo e

ainda a falta de qualquer correlação entre a ingesta de HPAs e a exceção de 1-

hidroxipireno urinário para avaliar risco de desenvolvimento de doenças por

exposição a esses contaminantes (MERLO et al., 1998; SCHOKET et al., 1999;

SCHERER et al., 2000; SORENSEN et al., 2003). Faz-se, portanto, necessária a

investigação de novos biomarcadores que possam fornecer informações mais

diretas quanto ao risco à saúde relacionado com a exposição (WORLD HEALTH

ORGANISATION, 1996).

Figura 1.2: Estruturas de alguns hidrocarbonetos policíclicos aromáticos.

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1.3. Biotransformação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) e

lesões em DNA

Os HPAs são ativados enzimaticamente para metabólitos intermediários

reativos que atacam o DNA, formando adutos ou levando a algum dano oxidativo,

resultando em mutações que podem aumentar o risco de desenvolvimento de

tumores (OESCH et al., 2003; DAI et al., 2005).

As vias de ativação atualmente consideradas mais importantes incluem (i) a

formação de um diol-epóxido nas regiões de baía ou fjord dos HPAs através de

sucessivas epoxidações catalisadas por CYP450, com uma hidrólise intermediária

catalisada pela epóxido hidrolase microssomal (JOSEPHY et al., 1997; XUE e

WARSHAWSKY, 2005) e (ii) oxidação de um elétron catalisada enzimaticamente

(CYP450 ou peroxidases) levando à formação de um cátion radical reativo

(CAVALIERI e ROGAN, 1995; XUE e WARSHAWSKY, 2005). Outras vias de

ativação correspondem à formação de derivados metilados (FLESHER e MYERS,

1990; XUE e WARSHAWSKY, 2005), o-quinonas (McCOULL et al., 1999; XUE e

WARSHAWSKY, 2005) e metabólitos de anel aberto (YANG et al., 2000) cujas

contribuições para a carcinogênese ainda são pouco estudadas (Figuras 1.3 e

1.4).

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Figura 1.3: Algumas vias de ativação metabólica dos HPAs. (i) região de baía e fjord dos

HPAs benzo[a]pireno e dibenzo[a,l]pireno respectivamente, (ii) formação de um diol-

epóxido nas regiões de baía ou fjord dos HPAs através de sucessivas epoxidações

catalisadas por CYP450, com uma hidrólise intermediária catalisada pela epóxido hidrolase

microssomal e (iii) oxidação de um elétron catalisada enzimaticamente (CYP450 ou

peroxidases). (Abreviações: B[a]P, benzopireno; B[a]P-7,8-óxido, benzopireno-7,8-óxido;

B[a]P-7,8-diol; BPDE, benzopireno-diol-epóxido; HPA, hidrocarboneto policiclico

aromático).

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Figura 1.4: Ativação metabólica de HPAs por aldo-ceto redutases e formação de espécies

reativas de oxigênio (adaptado de PARK et al., 2005). (Abreviações: CYP1A1, citocromo

P450 1A1, (+) anti-BPDE, (+) anti-benzopireno-diol-epóxido; NAD(P)+, Nicotinamida

adenina dinucleotídeo fosfato (forma oxidada); NAD(P)H Nicotinamida adenina

dinucleotídeo fosfato (forma reduzida); O2-, Ânion radical superóxido; H2O2, peróxido de

hidrogênio; O2, oxigênio molecular).

Citocromos P450 constituem uma superfamília de proteínas heme que

catalisam a oxidação de várias moléculas endógenas e exógenas. CYP450

pertencentes às famílias 1, 2 e 3 são particularmente importantes para o

metabolismo de HPAs (WORLD HEALTH ORGANISATION, 1996; STEGEMAN et

al., 2001). Adutos resultantes da reação de diol-epóxidos de alguns HPAs com o

grupo amino exocíclico de 2’-desoxiadenosina (dA) e 2’-desoxiguanosina (dG)

foram estruturalmente caracterizados e são considerados importantes na

tumorigênese induzida por esses compostos (XUE e WARSHAWSKY, 2005).

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Assim, o potente carcinógeno, largamente distribuído e extensivamente estudado

benzo[a]pireno (BP) é metabolizado em células de mamífero para (+)-anti-B[a]P-

7,8-diol-9,10-epóxido (BPDE), que reage principalmente com dG no DNA

originando o aduto BPDE-dG (CHENG et al., 1989). Reações de diol-epóxidos do

7,12-dimetilbenz[a]antraceno, dibenzo[a,l]pireno, benzo[c]fenantreno,

benzo[g]criseno, benzo[c]criseno, criseno e benzo[ghi]fluoranteno com dG e dA em

DNA in vitro, células de mamífero ou animais experimentais também foram

descritas, tendo sido verificada uma correlação entre o potencial carcinogênico

desses compostos e a formação de adutos estáveis com o DNA (MELENDEZ-

COLON et al., 2000). Um crescente interesse nessa área se deve às verificações

de que os diol-epóxidos derivados de HPAs contendo a região de fjord

estericamente impedida (como o benzo[c]fenantreno, o 5,6-dimetilcriseno e o

dibenzo[a,l]pireno) são excepcionalmente mutagênicos e tumorigênicos e levam a

um nível maior de adutos com o DNA em relação aos derivados de análogos

menos impedidos, como criseno e BP (revisado por CHANG et al., 2002b e

PUFULETE et al., 2004). Apesar de haver um grande foco no estudo do BP, a sua

contribuição para a carcinogênese de misturas contendo HPAs foi estimada como

sendo de 0,17 a 4% (GRIMMER et al., 1997). Detalhes estruturais e mecanísticos

das interações de diol-epóxidos de HPAs com o DNA, buscando o entendimento de

uma relação estrutura-função, estão começando a ser investigados (CHANG et al.,

2002a,b).

Como mostrado na figura 1.4, aldo-ceto redutases podem catalisar a

formação de catecóis a partir de dihidrodióis resultantes de uma epoxidação inicial.

Uma vez oxidados, os catecóis originam o-semiquinonas, que transferem elétrons

para o oxigênio molecular e dão origem a o-quinonas. Nesse processo, espécies

reativas de oxigênio (ROS) são geradas, as quais podem causar dano oxidativo ao

DNA e outras biomoléculas. Os catecóis, o-semiquinonas e o-quinonas participam

de ciclos redox, levando à geração de grandes quantidades de ROS. Além disso,

o-quinonas podem se ligar a biomoléculas, levando à formação de adutos

(CAVALIERI et al., 1995; PARK et al., 2005).

A outra via de ativação metabólica dos HPAs, que tem sido bastante

investigada nos últimos anos, é a oxidação de um elétron catalisada

enzimaticamente, com subseqüente formação de um cátion radical que reage com

o DNA (nas posições C-8 ou N-7 da guanina e N-3 ou N-7 da adenina) levando à

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formação de adutos que desestabilizam a ligação glicosídica com o esqueleto

desoxirribose fosfato, havendo depurinação (BHATTACHARYA et al., 2003).

A discussão a respeito dos mecanismos responsáveis pela tumorigênese

devida aos HPAs torna-se mais complexa ao se verificar que compostos que não

apresentam a região de baía ou fjord, como o antantreno, o coroneno, o

ciclopenta[cd]pireno e o benzo[ghi]perileno são mutagênicos e carcinogênicos

(FLORIN et al., 1980; HSU et al., 1999; PLATT et al., 2002; PLATT e GRUPE,

2005). A mutagenicidade do antantreno em bactérias após ativação metabólica é

comparável à do BP e, com base na sensibilidade das linhagens de S. typhimurium

utilizadas, os metabólitos do antantreno causam substituições de pares de base,

trocas de fitas e possivelmente dano oxidativo ao DNA. Alguns dos metabólitos que

apresentam ação genotóxica foram recentemente identificados (figura 1.5), mas

uma investigação mais ampla considerando a ligação desses e outros possíveis

metabólitos a biomoléculas, com a identificação dos adutos formados, pode

contribuir para um melhor esclarecimento das vias envolvidas em sua

genotoxicidade (PLATT et al., 2002). O ciclopenta[cd]pireno, por sua vez, mostrou-

se mais potente que o BP em estudos referentes a mutagenicidade em bactérias

(EISENSTADT e GOLD, 1978), malignidade dos tumores induzidos (BUSBY et al.,

1988) e tumorigenicidade em pulmão de camundongos A/J (linhagens isogênicas)

(NESNOW et al., 1994), sendo que adutos de metabólitos do ciclopenta[cd]pireno

com dG foram caracterizados (HSU et al., 1999).

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Figura 1.5.: Vias de ativação microssomal do Dibenzo[def,mno]criseno (antantreno). Via I-

Começa com a epoxidação da região K, formando o 4,5-óxido, que é então hidrolisado para

o 4,5-dihidrodiol, via II- formação da quinonas polinucleares, possivelmente por meio da

oxidação de um elétron e via III- começa com a monoxigenação do anel A da molécula de

antantreno levando a formação do 1- e 3-fenol (adaptado de PLATT et al., 2002).

As observações mencionadas acima indicam que os mecanismos pelos quais

os HPAs induzem câncer em humanos ainda não estão claros e estudos

comparativos de lesões em biomoléculas induzidas por diferentes representantes

dessa classe de compostos são necessários para que se possa ter melhor

compreensão das vias envolvidas. Além disso, a caracterização estrutural de

adutos formados com HPAs ainda pouco estudados (como antantreno, coroneno,

indeno[1,2,3-cd]pireno e trifenileno) irá gerar novas ferramentas para avaliação dos

efeitos induzidos por esses compostos em organismos a eles expostos.

Diante da grande distribuição ambiental desses compostos e da inevitável

exposição humana, torna-se necessária a adoção de medidas para prevenção

contra danos biológicos induzidos por HPAs. Algumas estratégias estudadas são a

adição de óxido de cálcio (CaO) como forma de prevenir a formação de HPAs

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durante a incineração de restos de alimentos e material orgânico (WEY et al.,

2006) e o uso de compostos sintéticos e naturais (p.ex. β-naftoflavona) para

modular enzimas de fase I (em geral enzimas microssomais que catalisam reações

de oxidação, redução e hidrólise) e/ou de fase II (em geral enzimas citosólicas que

catalisam reações de conjugação) ligadas à biotransformação de xenobióticos e

com efeito nos processos de carcinogênese. A ação anti-carcinogênica desses

moduladores tem sido testada em animais experimentais, com concomitante

observação do aumento da excreção ou detoxificação de produtos de

biotransformação e, com isso, conseqüente diminuição das ligações covalentes ao

DNA de tecidos-alvos (MALEJKA-GIGANTI et al., 2005).

1.4. Adutos de DNA como biomarcadores

O uso de biomarcadores em estudos epidemiológicos vem se tornando uma

poderosa ferramenta para determinação da relação causal entre exposição a

xenobióticos e o desenvolvimento de doenças, como o câncer. Os avanços em

métodos analíticos e de biologia molecular têm propiciado a descoberta e validação

de biomarcadores que representam meios bastante sensíveis e seletivos para

avaliação da exposição e risco de danos biológicos, o que é desejável nos casos

de exposição às baixas concentrações de xenobióticos presentes no meio

ambiente. O processo de validação desses biomarcadores envolve estudos in vitro,

em animais experimentais e os estudos epidemiológicos em humanos (Figura 1.6).

No caso de carcinógenos genotóxicos, uma vez conhecidos os mecanismos

principais pelos quais eles interagem com o DNA, as lesões geradas in vitro

(adutos de DNA) podem ser isoladas e utilizadas para a padronização de métodos

analíticos para a sua detecção ultra-sensível em modelos de animais experimentais

expostos às substâncias de interesse. Nos modelos animais podem ser feitas

correlações entre a dose de exposição ao carcinógeno e o nível gerado da lesão

no DNA, que pode ser detectada no órgão alvo de carcinogênese, nos leucócitos e,

após o reparo, na urina. Correlações também são feitas entre os dois parâmetros

anteriores e o desenvolvimento de tumores. Além disso, estudos de

quimioprevenção permitem avaliar se a presença do biomarcador se relaciona com

o desenvolvimento da doença. Sendo verificado que o biomarcador (ex., aduto de

DNA) se relaciona com a exposição ao carcinógeno e com o risco de

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desenvolvimento de doença nos estudos em animais, parte-se para os estudos

epidemiológicos em humanos, nos quais esse mesmo biomarcador é utilizado para

avaliar a relação entre exposição humana ao carcinógeno e o desenvolvimento de

câncer. Décadas de estudo são necessárias para que se tenha um biomarcador

completamente validado (WOGAN et al., 2004; SANTELLA et al., 2005; MIGLIORE

et al., 2006).

Figura 1.6: Modelo para validação de biomarcadores para avaliação de relações causais

entre exposição a carcinógenos e o desenvolvimento de câncer através da epidemiologia

molecular (WOGAN et al., 2004).

Algumas características importantes dos biomarcadores moleculares de

carcinogênese são as seguintes: (i) devem ser moléculas quantificáveis envolvidas

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em eventos fisiológicos ou patológicos que ocorrem entre a exposição a

carcinógenos exógenos ou endógenos e o subseqüente desenvolvimento do

câncer; (ii) devem permitir o diagnóstico precoce de alterações associadas com o

desenvolvimento do câncer antes que os tumores estejam presentes; (iii) devem

ser detectados em fluidos como sangue e urina, não sendo necessária a biópsia de

tecidos (De BONT e Van LAREBEKE., 2004; TURESKY e VOUROS., 2004).

Classicamente, os biomarcadores utilizados em epidemiologia molecular,

buscando avaliar a exposição individual a xenobióticos, identificar alterações

críticas como marcadores iniciais de doença e determinar a susceptibilidade

genética, são divididos da seguinte forma (Figura 1.7, CHEN e HUNTER, 2005):

- Biomarcadores de dose interna: indicam a quantidade da substância absorvida

pelo indivíduo. São importantes para eliminar o problema de informação sobre

exposição baseada em questionários. Em geral refletem a exposição recente

(mas depende da meia-vida). São altamente sensíveis e específicos para a

exposição e em conjunto com biomarcadores de efeito ou de dose

biologicamente efetiva podem servir para a determinação de uma relação dose-

resposta (ex., benzeno no sangue, ácido hipúrico na urina, 2,5 hexanodiona na

urina);

- Biomarcadores de dose biologicamente efetiva: indicam a quantidade de

material reativo que atingiu o tecido em estudo (ex., adutos xenobiótico-

biomoléculas);

- Biomarcadores de efeito: alterações bioquímicas/fisiológicas associadas com

doenças (ex., mutações em genes alvos, alteração da expressão de moléculas

envolvidas na sinalização celular, aberrações cromossômicas etc);

- Biomarcadores de susceptibilidade: indicam se um indivíduo tem uma limitação

para lidar com a exposição química (ex., polimorfismo de enzimas envolvidas

no metabolismo de carcinógenos).

17

Figura 1.7: Epidemiologia molecular abrindo a “caixa preta” da relação causal entre

exposição a xenobióticos e o desenvolvimento do câncer (CHEN e HUNTER, 2005).

Adutos de DNA são muito utilizados como biomarcadores de exposição,

sendo que indicam a dose biologicamente efetiva da substância em estudo. São

também bastante úteis nos estudos de quimioprevenção da carcinogênese

(KYRTOPOULOS et al., 2001; GARCEA et al., 2003). Um exemplo clássico da

epidemiologia molecular que demonstra a importância do uso de adutos de DNA

como biomarcadores é o conjunto de estudos conduzidos desde a década de 1960

que culminou com a validação da relação causal entre exposição a aflatoxinas e

risco de carcinoma hepatocelular em humanos (cerca de 40 anos após o início dos

estudos). Além do estabelecimento dessa relação causal, o uso de adutos de DNA

(aduto aflatoxina B1-guanina) como biomarcadores tem permitido a investigação da

ação quimiopreventiva de alguns compostos, como clorofilina e oltipraz, com

potencial de serem utilizados pela população exposta a aflatoxinas e contribuirem

para redução do risco de desenvolvimento de câncer hepático por essa população.

Uma outra conclusão desses estudos foi a verificação de um efeito sinérgico entre

exposição ao vírus da hepatite B e exposição a aflatoxinas no desenvolvimento de

carcinoma hepatocelular nas populações estudadas. Interferir no processo de lesão

18

desencadeado pelas aflatoxinas contribui significativamente para redução do risco

de câncer hepático mesmo entre os infectados com o vírus da hepatite B (WOGAN

et al., 2004).

Estudos utilizando biomarcadores de exposição e de efeito biológico têm

fornecido evidências dos efeitos genotóxicos dos HPAs presentes na atmosfera em

condições de intensa poluição. Risco aumentado de dano (adutos HPA-DNA) foi

observado em populações ocupacionalmente expostas aos HPAs gerados por

fontes industriais ou urbanas, bem como fumaça de cigarro (SRAM e BINKOVA,

2000; VODICKA et al., 2002). Devido à seletividade de reação desses compostos

com determinadas seqüências de bases do DNA, o espectro de mutações

induzidas por HPAs no gene supressor de tumor p53 em células epiteliais

bronquiais se assemelha aos observados em cânceres pulmonares humanos,

reforçando a idéia de que a exposição aos HPAs se relaciona com o

desenvolvimento de câncer pulmonar (estudos revisados por SINGH e FARMER,

2006). Determinações da natureza, quantidade e localização das lesões no DNA

podem ser de importância para avaliações de risco de desenvolvimento de câncer.

Nos estudos experimentais é verificada boa correlação entre a formação de

adutos de DNA em pele e pulmão de ratos e o potencial carcinogênico em testes

de iniciação e promoção de tumores para muitos HPAs (PUFULETE et al., 2004).

Ainda experimentalmente, a investigação da ativação metabólica, da ligação

covalente ao DNA e da tumorigenicidade de HPAs possibilita a investigação de

qual sistema enzimático favorece a formação dos adutos cruciais para o processo

carcinogênico (DREIJ et al., 2002; MAHADEVAN et al., 2005). Dessa forma, os

mecanismos envolvidos na carcinogênese podem ser melhor compreendidos e

grupos de indivíduos com maior risco de desenvolvimento de câncer podem ser

identificados (VINEIS e HUSGAFVEL-PURSIAINEN, 2005).

1.5. Danos ao DNA por produtos de origem endógena

Estudos epidemiológicos mostram que a exposição a agentes exógenos é

condição necessária para o desenvolvimento de 75 – 80% dos casos de câncer

(WOGAN et al., 2004). Além dos danos biológicos provocados pelos próprios

xenobióticos, como exposto nos itens acima, compostos gerados endogenamente

em concentrações acima da normalidade, podem provocar aumento dos níveis de

19

danos e também contribuir para os processos de mutagênese e carcinogênese.

Nos dois casos, as lesões geradas devem ocorrer em freqüência acima da

capacidade de reparo do DNA para que mutações possam se fixar e levar a

alterações nas funções de genes críticos para a manutenção da estabilidade do

genoma (p.ex.: proteínas envolvidas em reparo e replicação do DNA) (LOEB e

BECKMAN, 2005). Mecanismos intracelulares que levam à ativação de

xenobióticos levam também à geração de espécies reativas de oxigênio, havendo

uma combinação de fatores que resultam em aumento de lesões no DNA e

mutações. A contribuição relativa das vias exógena e endógena para o aumento

das mutações ainda é assunto de debate e estudos quantitativos comparativos

incluindo lesões em DNA induzidas diretamente pelo agente e indiretamente por

estresse oxidativo precisam ser realizados (De BONT e Van LAREBEKE, 2004).

Danos endógenos ao DNA que podem ter sua freqüência aumentada como

resultado da exposição a xenobióticos incluem depurinação, desaminação,

oxidação e formação de adutos com produtos gerados endogenamente (ex.,

aldeídos resultantes do processo de peroxidação lipídica). As lesões mutagênicas

geradas por espécies reativas de oxigênio/nitrogênio e produtos de peroxidação

lipídica são de grande interesse por permitirem intervenção farmacológica através

da indução de defesas antioxidantes, as quais contribuem para diminuição dos

níveis dessas lesões e são importantes para prevenção do envelhecimento, câncer

e outras condições degenerativas (De BONT e Van LAREBEKE, 2004).

8-Oxo-7,8-dihidro-2´-desoxiguanosina (8-oxodGuo) é uma importante lesão

gerada por ataque de radical hidroxila (HO•) ou oxigênio singlete (1O2) à base

guanina no DNA e, por ser de fácil detecção, é considerada um marcador de dano

oxidativo ao DNA. Suas propriedades biológicas foram amplamente investigadas,

tendo sido verificado que é uma lesão mutagênica em bactérias e células de

mamífero, levando principalmente a transversões G→T, as quais são muito

encontradas em genes supressores de tumor e protooncogenes mutados (estudos

revisados por LOUREIRO et al., 2002b).

Fortes evidências apontam no sentido de que bases oxidadas no DNA levam

ao surgimento de mutações ao longo da vida de um indivíduo, podendo contribuir

para o desenvolvimento de tumores. Níveis aumentados de vários produtos

resultantes de danos oxidativos ao DNA foram encontrados em tecidos de câncer

de mama em relação aos respectivos níveis presentes no DNA de áreas

20

adjacentes. Aumentos semelhantes foram observados em cânceres de pulmão,

cólon, estômago, ovário e cérebro (MALKIN et al., 1996). Foi também observado

que na hiperplasia prostática benigna, a qual freqüentemente se relaciona com o

posterior desenvolvimento de câncer de próstata, há níveis elevados de bases

oxidadas no DNA (ORLINSKI et al., 1995).

Uma descoberta crucial que sustenta a hipótese de que danos oxidativos no

DNA são importantes contribuintes para a ocorrência de mutações espontâneas foi

a de que existe um sistema elaborado de reparo em Escherichia coli para reduzir a

mutagênese devida a 8-oxodGuo. Este sistema inclui uma glicosilase para remover

8-oxoguanina do DNA (glicosilase FAPY/produto do gene mutM), uma glicosilase

que remove adenina no pareamento errado 8-oxodGuo:dA (produto do gene mutY)

e uma hidrolase (8-oxodGTPase/produto do gene mutT) para eliminar 8-oxodGTP

da reserva de nucleotídeos (PORELLO et al., 1998; NOLL et al.,1999). Linhagens

de E.coli com mutações em qualquer um desses genes apresentam não só

aumento dos níveis basais de 8-oxodGuo, como também aumento da freqüência

de mutações espontâneas, principalmente transversões G→T (MICHAELS e

MILLER, 1992; TAJIRI et al., 1995; GLASSNER et al., 1998). Existem também

glicosilases para remoção de outras bases oxidadas do DNA (SINGER e HANG,

1997), sendo que as endonucleases III e VIII de E.coli participam da remoção de

diversas pirimidinas oxidadas, tais como timina glicol, 6-hidroxi-5,6-dihidrocitosina e

uracila glicol (KATCHER e WALLACE, 1983; BREIMER e LINDAHL, 1984;

SINGER e HANG, 1997; PURMAL et al., 1998). Homólogos dessas enzimas de

reparo estão presentes em organismos eucariontes (DEMPLE e HARRISON, 1994;

GIRARD e BOITEUX, 1997; MITRA et al., 1997).

Devido à sua abundância nas células e susceptibilidade à oxidação, os ácidos

graxos poliinsaturados são também alvos importantes para os oxidantes. Como

essa oxidação desencadeia uma cascata autocatalítica que gera numerosas

substâncias genotóxicas, tais danos aos lipídios têm grandes implicações para a

integridade do DNA. De fato, a peroxidação lipídica tem sido associada ao

desenvolvimento de condições patológicas induzidas por exposição a agentes

oxidantes. Nesse processo são gerados aldeídos α,β-insaturados, variantes

estruturais dos mesmos (tais como 4-hidroxialcenais e epoxialdeídos) e

malonaldeído, os quais são agentes alquilantes com capacidade de se ligarem

covalentemente a grupos nucleofílicos presentes em DNA, peptídeos e proteínas,

21

provocando alterações nas funções dessas moléculas (MARNETT e PLASTARAS,

2001). Reações de aldeídos resultantes do processo de peroxidação lipídica com

bases do DNA dão origem a diversos adutos exocíclicos denominados

propanoadutos, etenoadutos e adutos de malonaldeído. Vários sistemas

enzimáticos participam do reparo dessas lesões e a predominância do reparo por

excisão de bases (BER) ou do reparo por excisão de nucleotídeos depende das

estruturas dos adutos. Publicações recentes têm apontado os adutos exocíclicos

de DNA de origem endógena como ferramentas potenciais para o estudo do

estresse oxidativo, da etiologia do câncer e para a avaliação da eficácia de agentes

quimiopreventivos contra danos em DNA. Muito esforço tem sido feito no sentido

de elucidar as fontes, o significado toxicológico e as conseqüências genéticas

dessas lesões de DNA; os tipos de fatores exógenos ou condições patofisiológicas

que levam ao seu aumento; e se esses adutos, quando gerados através de

reações mediadas por estresse oxidativo, desempenham um papel na

carcinogênese humana ou em outras doenças degenerativas (MARNETT e

PLASTARAS, 2001).

1.6. Métodos empregados para detecção de adutos de DNA

Nas últimas décadas, diferentes métodos analíticos têm sido desenvolvidos

para a detecção e quantificação de lesões em DNA (Tabela 1.1) (TURESKY e

VOUROS, 2004; SINGH e FARMER, 2006).

As técnicas mais comumente utilizadas para a detecção dos adutos HPA-

DNA acima mencionados são a pós-marcação com 32P e imunoensaios. Estudos

utilizando essas técnicas possibilitaram o conhecimento de que adutos

carcinógeno-DNA são formados em situações nas quais ocorre exposição a HPAs.

Uma vantagem da técnica de pós-marcação com 32P é a sua sensibilidade,

podendo chegar a um limite de detecção de 1 aduto/1010 nucleotídeos em 12 µg de

DNA. Os imunoensaios, por sua vez, apresentam grande simplicidade operacional,

permitindo a análise de múltiplas amostras (POIRIER e WESTON, 1996;

ALBERTINI et al., 2000; de KOK et al., 2002; OKONA-MENSAH et al., 2005;

SINGH e FARMER, 2006). Entretanto, nenhum desses métodos é suficientemente

seletivo para a identificação de adutos específicos (por exemplo, aduto BPDE-dG).

A identificação mais precisa da formação de adutos BPDE-DNA ou BPDE-proteína

22

em muitos estudos é feita, por exemplo, por hidrólise ácida dos mesmos, a qual

libera B[a]P-tetraóis. Métodos quantitativos atualmente utilizados para a

determinação de B[a]P-tetraóis incluem cromatografia liquida de alta eficiência

(HPLC)-fluorescência, HPLC-fluorescência a laser e cromatografia gasosa

acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). Diversos estudos mostraram a

formação de adutos BPDE-DNA e BPDE-proteína em sangue, urina e tecidos de

humanos expostos aos HPAs utilizando essas técnicas (BOYSEN e HECHT,

2003). Um exemplo do uso da técnica de pós-marcação com 32P e da fluorescência

a laser é a detecção de adutos de DNA formados a partir do potente carcinógeno

dibenzo[a,l]pireno (DB[a,l]P), na presença de microssomos de fígado de rato in

vitro e em pele de camundongos in vivo (JANKOWIAK et al., 1998).

Entretanto, esses métodos não fornecem informação sobre as estruturas

químicas dos adutos e HPAs que os originaram, parâmetros importantes para

compreendermos melhor a contribuição de cada composto para o processo de

carcinogênese. Atualmente técnicas de HPLC acoplado a espectrometria de

massas têm sido utilizadas para a detecção de adutos em níveis de 0,2 – 2 adutos

/ 108 bases de DNA usando 10 – 100 µg de DNA, com alta especificidade e a

vantagem de fornecer informação estrutural sobre as lesões (SINGH e FARMER,

2006). Através do uso de espectrometria de massas, adutos BPDE-dG, BPDE-dA e

BPDE-dC foram recentemente detectados e quantificados em pulmão de

camundongos expostos a fumo de asfalto (HPLC/Q-TOF MS, WANG et al., 2003) e

o aduto BPDE-dG foi detectado em DNA de fígado e pulmão de camundongos

expostos a B[a]P e em DNA de amostras de pulmão humano (HPLC/ESI/MS-MS,

BELAND et al., 2005).

23

Tabela 1.1: Métodos para determinação de adutos em DNA (POIRIER, 2004).

1.7. Efeitos epigenéticos de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs)

Além dos efeitos genotóxicos descritos anteriormente, HPAs atuam por uma

via não genotóxica, mediada pelo receptor citosólico de hidrocarboneto aromático

(AhR) (Figura 1.8), comparável aos receptores de esteróides/retinóides/hormônios

da tireóide. Esse receptor tem grande afinidade por vários hidrocarbonetos

aromáticos, como 3-metilcolantreno e benzo[a]pireno, e também por compostos

clorados, como dioxinas e bifenilas policloradas. O receptor Ah está normalmente

complexado com proteínas de choque térmico (hsp90) na razão 1:2, as quais se

24

dissociam após ligação do receptor a um de seus ligantes. O receptor é, então,

fosforilado por tirosina quinase e, uma vez ativado, migra para o núcleo e forma um

heterodímero com o transportador nuclear de AhR (Arnt). Esse complexo se liga,

então, a seqüências reguladoras do genoma, conhecidas como elementos

responsivos a dioxina (DRE) ou elementos responsivos a xenobiótico (XRE), e

aumenta a expressão de alguns genes (ex., CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, DT-

diaforase, glutationa S-transferase, UDP-glicuronil transferase, aldeído

desidrogenase) (THURMOND et al., 1999; MATHIEU et al., 2001; LAWRENCE e

VORDERSTRASSE, 2004; MARLOWE e PUGA, 2005; ALLAN et al., 2006;

KORASHI e El-KADI, 2006; SHAROVSKAYA et al., 2006). CYP1B1 é uma

isoforma extra-hepática de CYP450, que tem papel importante na bioativação de

HPAs e arilaminas. A modificação de sua expressão pode modular a

susceptibilidade celular aos efeitos genotóxicos desses pró-carcinógenos

presentes no ambiente em geral (FALLONE et al., 2005). Muitas evidências

indicam que a ativação dos receptores Ah, seguida por aumento na expressão de

isoformas de CYP450, é necessária para que HPAs e dioxinas induzam toxicidade

(HU et al., 2006), reforçando a importância dessa via epigenética para a

carcinogênese induzida por esses compostos (CIGANEK et al., 2004).

25

Figura 1.8: Via de ação epigenética de HPAs

1) Após entrar na célula o xenobiótico (p.ex.: HPAs, dioxinas e etc) se liga ao AhR e há

dissociação da proteína chaperona, sendo o complexo AhR-ligante fosforilado transportado

até o núcleo. 2) No núcleo o complexo é heterodimerizado com o transportador nuclear de

AhR (Arnt), ocorrendo a ligação a elementos responsivos à dioxina (ERD). 3) Há aumento

da expressão de vários genes, incluindo várias isoformas de CYP450. 4) O repressor de AhR

(AhRR) migra para o núcleo e age como um inibidor competitivo da ligação do Arnt ao AhR,

formando um complexo AhRR-Arnt, que é um dímero transcripcional inativo. 5) Isoformas

de CYP450 mais expressas contribuem para a ativação do xenobiótico, que pode então

danificar biomoléculas. Simultaneamente, ocorre a formação de espécies reativas de

oxigênio. Peróxido de hidrogênio leva à ativação do fator nuclear kappa B (NF-kB). A

ativação do NF-kB inibe o AhR e, conseqüentemente, há inibição da expressão dos genes

regulados por ERD (VRZAL et al., 2004).

26

2. Objetivos

-Investigar algumas vias pelas quais o antantreno pode exercer seus efeitos

mutagênicos, através do estudo da indução de lesões em DNA por esse HPA.

-Ampliar os estudos sobre toxicidade do antantreno para duas linhagens de

hepatócitos humanos em cultura (células THLE-2 normais e células HepG2

tumorais).

2.1. Objetivos específicos:

1. Obtenção de produtos de oxidação do antantreno (quinonas e

hidroquinonas);

2. Incubação de células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) e

hepatócitos humanos normais (THLE-2) com diferentes concentrações

de antantreno e seus produtos de oxidação (soluções de quinonas e

hidroquinonas) para verificação da sobrevivência relativa e análise de

dano oxidativo (8-oxodGuo em DNA extraído das células);

3. Investigação da formação de adutos em incubações in vitro de dG com

antantreno oxidado quimicamente;

4. Investigação da formação de adutos em incubações in vitro de DNA com

antantreno, suas quinonas e hidroquinonas na presença de peroxidase

de rábano (HRP)/H2O2.

27

3. Materiais e métodos

3.1. Reagentes

Todos os reagentes utilizados foram da mais alta pureza comercialmente

disponíveis. Soro fetal bovino (SFB) e meio PFMR-4 foram provenientes da Cultilab

- materiais para cultura de células (Campinas, SP, Brasil). Clorofórmio, etanol,

metanol, acetonitrila, hidróxido de sódio, fosfato de potássio monobásico, sulfato de

magnésio, ácido fosfórico, ácido perclórico foram fornecidos pela Merck

(Darmstadt, Alemanha). Carbonato de sódio anidro foi fornecido pela Mallinckrodt

Chemical (Paris, França). Todos os outros reagentes foram obtidos da Sigma

Chemical Co. (St. Louis, MO).

A água foi deionizada em um sistema Milli-Q (Millipore).

3.2. Equipamentos

As medidas de fluorescência foram feitas em um espectrofluorímetro Spex

modelo 1681 (Spex Industries, Edison, NJ). Os espectros de massas foram obtidos

por meio de um espectrômetro do tipo electrospray / triplo quadrupolo, modelo

Quatro II (Micromass, Manchester, U.K.). Para as centrifugações foram utilizadas

centrífugas refrigeradas modelos 5702R e 5804R da Eppendorf (Hamburg,

Alemanha) e centrífugas sem refrigeração modelos Mini–Spin Plus, 5415D da

Eppendorf (Hamburg, Alemanha) e modelo AP56 da Phoenix (São Paulo, Brasil).

As incubações que necessitavam de agitação foram feitas em um agitador de

tubos (Thermomixer 5436 da Eppendorf (Alemanha)). As observações

microscópicas foram feitas em um microscópio invertido DM IL da Leica (Wetzlar,

Alemanha). As soluções foram autoclavadas em autoclave vertical modelo 415 da

Fanem (São Paulo, Brasil). As medidas de pH foram feitas em um potenciômetro

da Denver Instrument Basic Model CO31603098 (Sigma Chemical Co. (St. Louis,

MO)). Foi utilizada balança analítica da Bioprecisa (São Paulo, Brasil) modelo FA

2104N.

As células foram incubadas em uma estufa de CO2 Instrucom®, modelo 310

da ThermoForma (Ohio, E.U.A.). As liofilizações foram feitas em um sistema

consistindo de uma bomba de vácuo de alta eficiência, modelo VLP120, da Savant

(Savant instruments, Nova Iorque, E.U.A.), um micromódulo E-C para secagem a

baixas temperaturas (E-C Apparatus, Nova Iorque, E.U.A.), e um concentrador

28

modelo 5301 da Eppendorf (Alemanha). Foram utilizados banho maria modelo

3162 da Ética (São Paulo, Brasil), agitador magnético modelo 78HW-1 Biomixer

(China) e um leitor de Elisa modelo power wave x340 da Bio-Tek instruments, INC.

(Vermont, E.U.A).

3.3. Oxidação do antantreno para obtenção de quinonas e hidroquinonas

Antantreno (1 mg) foi dissolvido em 200 µL de ácido acético/anidrido acético

1:1 a 0oC. Em seguida foi adicionado lentamente a uma solução de dicromato de

sódio (9,6 µmol) dissolvido em 200 µL de ácido acético/anidrido acético 1:1 a 0oC.

A solução resultante foi incubada sob agitação, 37oC por 24 horas. Após esse

período, foi observado um precipitado verde escuro. Foi adicionado 1 mL de água

Milli-Q e a amostra foi centrifugada por 5 minutos, 10.000 g (2 vezes), sendo o

precipitado recuperado. Finalmente foram adicionados 1 mL de água Milli-Q e 1 mL

de clorofórmio, as amostras centrifugadas por 5 minutos a 10.000 g em

temperatura ambiente e recuperada a fase orgânica que foi evaporada.

Para obtenção de hidroquinonas acetiladas estáveis, a mistura de quinonas

obtida conforme descrito acima foi dissolvida em 200 µL de dimetilformamida e em

seguida foi adicionado 1 mg de NaBH4. A solução resultante foi mantida sob

agitação a 37°C por 1 hora. Após esse período foram adicionados 20 µL de piridina

e 180 µL de anidrido acético e a amostra foi novamente incubada por 5 horas, a

37°C, sob agitação. Decorrido esse período, foram adicionados à solução 500 µL

de água miliQ. A amostra foi centrifugada a temperatura ambiente por 5 minutos,

10 000 g (2 vezes), descartando o sobrenadante. Em seguida foram adicionados 1

mL de água miliQ, 500 µL de clorofórmio e a fase orgânica foi recuperada (10 000

g, 5 minutos) e evaporada.

Para obtenção de hidroquinonas para as incubações com DNA in vitro, foi

feita redução das quinonas com NaBH4 como descrito acima, sem seguir o passo

de acetilação. Como nesse caso as hidroquinonas tendem a voltar para quinonas

quando em contato com o ar, foi tomado o cuidado de borbulhar nitrogênio (N2) por

10 minutos na solução obtida após 1 h de incubação com NaBH4 a 37oC e no éter

utilizado para extração das hidroquinonas. As hidroquinonas foram, então,

extraídas com éter (precipitação do NaBH4) e a solução obtida foi evaporada sob

fluxo de nitrogênio. O precipitado foi ressuspenso com a própria solução de DNA

no tampão no momento da incubação.

29

30

3.3.1. Análise dos produtos de oxidação do antantreno por HPLC/PDA e

HPLC/ESI/MS

Para as análises por HPLC/PDA foi utilizado um sistema da Shimadzu (Kyoto,

Japão) constituído por duas bombas (modelo LC-10AD ou LC-20AT), um injetor

Rheodyne (Cotati, CA), um injetor automático (SIL-20 AC), um detector de arranjo

de diodos (modelo SPD-M10AV ou SPD-M20A), um forno para coluna (modelo

CTO-10AS), controlados por um módulo de comunicação (CBM-10A ou CBM-20A)

e o software CLASS LC-10AWS ou CLASS LC-20AWS. Foi utilizada a seguinte

condição:

Condição 3.3.1.a: uma coluna Luna C18(2) (250 mm x 4,6 mm i.d.,5 µm) da

Phenomenex (Torrance,CA) foi eluída com um gradiente de água e acetonitrila (de

0 a 40 min, 40 a 100% de acetonitrila; de 40 a 65 min, 100% de acetonitrila; de 65

a 66 min, 100 a 40% de acetronitrila; de 66 a 76 min, 40% de acetonitrila a um fluxo

de 0,8 mL/min). Espectros de absorbância foram obtidos no intervalo de 200 a 800

nm.

Para as análises por HPLC/ESI/MS foi utilizado um sistema de HPLC da

Shimadzu constituído por duas bombas (Class LC-10 AD/VP), um injetor

automático (SIL-10AD/VP), uma válvula comutadora de fluxo (FCV-12AH) e um

detector de absorbância (modelo SPD-10 AV/VP) conectado ao espectrômetro de

massas Quattro II da Micromass (Manchester, U.K.). O sistema foi controlado pelo

módulo de comunicação SCL-10A/VP (Shimadzu) e o software MassLynx 3.2

(Micromass) ou Class-VP (Shimadzu). Foi utilizada a seguinte condição:

Condição 3.3.1.b: uma coluna Luna C18(2) (150 mm x 2 mm i.d., 3 µm) da

Phenomenex foi eluída com um gradiente de ácido fórmico (0,1% em água) e

acetonitrila (de 0 a 40 min, 40 a 100% de acetonitrila; de 40 a 65 min, 100% de

acetonitrila; de 65 a 66 min, 100 a 40% de acetronitrila; de 66 a 76 min, 40% de

acetonitrila a um fluxo de 0,15 mL/min). A temperatura da fonte foi ajustada para

150 °C e os fluxos dos gases de secagem e nebulização (nitrogênio) para 350 e 10

L/h, respectivamente. O potencial do capilar foi ajustado para 3,10 kV e do eletrodo

HV para 0,3 kV. Simultaneamente foi feita a detecção por absorbância a 254 nm.

31

Os dados foram processados com o software MassLynx 3.2 (Micromass). Foram

obtidos espectros de massas em MS1 no intervalo de 100 – 800 m/z.

3.4. Danos celulares induzidos pelo antantreno e seus produtos de oxidação

3.4.1. Cultivo das células

Meios de cultura:

a) meio Eagle modificado por Dulbecco (DME) suplementado com NaHCO3 (1,2

g/L), 10 mg/mL de penicilina/estreptomicina e 10% de soro fetal bovino (SFB).

O meio de cultura sem suplementação com SFB foi esterilizado por filtração

através de membrana de 0,22 µm diretamente para o interior de frascos estéreis.

Foram utilizados filtros estéreis descartáveis da TPP (Zollikofen, Suiça). O SFB

estéril foi adicionado a alíquotas do meio estéril de acordo com a necessidade de

uso.

b) meio indutor de CYP450: solução balanceada de Earle suplementada com

insulina bovina (1 U/L), hidrocortisona (0,1 mM), ácido-δ-aminolevulínico (0,1 mM),

gentamicina (50 mg/L) e 10% de SFB. Modo de preparo como no item 3.4.1.a.

c) meio PFMR-4 (Cultilab) suplementado com L-glutamina (2 mM), insulina

(1,75 µM), hidrocortisona (0,2 µM), EGF (5 ng/mL), transferrina (10 µg/mL),

fosfoetanolamina (P/E, 50 nM), T3 (50 nM), extrato de pituitária bovina (7,5 µg/mL),

ácido retinóico (0,33 nM), penicilina/estreptomicina (10 mg/L) e SFB (10%). Modo

de preparo como no item 3.4.1.a.

Soluções:

PBS: 137 mM NaCl, 1,68 mM KCl, 1,47 mM Na2HPO4, pH 7,0. Solução

autoclavada.

Tripsina: 0,1% (p/v) de tripsina em PBS (pH 7,0) contendo 1 mM de EDTA.

Solução esterilizada por filtração através de membrana de 0,22 µm diretamente

para o interior de frascos estéreis.

Células de carcinoma hepatocelular humano, linhagem HepG2, de morfologia

epitelial, foram cultivadas nos meios de cultura 3.4.1.a e 3.4.1.b. Células normais

de fígado humano, linhagem THLE-2 de morfologia epitelial, foram cultivadas no

32

meio de cultura 3.4.1.c. Essa linhagem celular expressa características fenotípicas

de hepatócitos. Metabolizam benzo[a]pireno, N-nitrosodimetilamina e aflatoxina B1

para metabólitos reativos, formando adutos com o DNA e indicando vias funcionais

de CYP450. Outras enzimas envolvidas no metabolismo de carcinógenos, como a

epóxido hidrolase, NADPH citocromo P450 redutase, superóxido dismutase,

catalase, glutationa-S-transferase e glutationa peroxidase também são expressas

por células THLE-2. As células HepG2 cresceram aderidas à superfície de garrafas

plásticas de cultura e foram repicadas em períodos de 4 a 5 dias. As garrafas

usadas para a propagação das células THLE-2 foram cobertas (2 h, 37oC) com

meio de cultura contendo albumina bovina (0,01 mg/mL), fibronectina (0,01 mg/mL)

e colágeno I (0,03 mg/mL). O cultivo de ambas as linhagens foi feito em atmosfera

com 5% de CO2, a 370C, no escuro.

Procedimento para o repique das células: após a retirada do meio, a cultura

foi lavada 2 vezes com PBS. A seguir foi incubada a 370C com volume mínimo (1,5

mL) de solução de tripsina (a solução de tripsina utilizada para as células THLE-2

foi diluída 2 vezes com PBS) até que as células se desprendessem (± 2 min). As

células foram, então, ressuspensas nos seus respectivos meios de cultura e a

suspensão distribuída para novas garrafas ou placas na diluição desejada.

3.4.2. Tratamento das células com antantreno, antantreno-quinonas e

antantreno-hidroquinonas

Após as células atingirem a confluência (aproximadamente 5x105

células/poço em placas de 24 poços, 1x105 células/poço em placas de 96 poços e

3x107 células/placa de 15 cm de diâmetro), o meio de cultura foi substituído por

outro com soro. As incubações com antantreno, antantreno-quinonas ou

antantreno-hidroquinonas, partindo de uma solução 10 mM de cada um desses

compostos em DMSO, foram feitas na estufa de CO2 a 370C de diferentes formas.

3.4.2.1. Incubações para determinação da viabilidade celular

Foram utilizadas células HepG2 cultivadas nos meios 3.4.1.a e 3.4.1.b e

células THLE-2 cultivadas no meio 3.4.1.c. Para comparação da viabilidade das

células HepG2 com THLE-2, ambas foram cultivadas sobre filme de colágeno

como descrito no item 3.4.1.

33

A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio do brometo de 3-(4,5-dimetil-

2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT) como descrito abaixo no item 3.4.2.1.1.

As células foram semeadas numa densidade de 1 x 105 células/poço em

placas de 96 poços e incubadas por 24 horas a 37oC em meio de cultura

suplementado com SFB. Após esse período, foram feitas as incubações com

diferentes concentrações (10 µM, 20 µM, 50 µM, 100 µM e 200 µM) das soluções

de antantreno, antantreno-quinonas ou antantreno-hidroquinonas acetiladas, 4

poços para cada amostra, por 16 horas. Ao final desse período, o meio de cultura

foi substituído por outro sem soro ao qual foi adicionado MTT e feita a

determinação da viabilidade como descrito abaixo. O grupo controle consistiu em

incubação das células com 2% de DMSO (concentração máxima de DMSO

presente nas incubações com as soluções de interesse).

3.4.2.1.1. Determinação da viabilidade celular pelo ensaio do brometo de 3-

(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT)

Soluções

Solução de lise: 100% de DMSO

MTT: 5 mg/mL em PBS

O método, originalmente descrito por Mosmann (1983), se baseia na

conversão do sal tetrazólio (MTT) para o produto colorido formazan, cuja

concentração pode ser determinada espectrofotometricamente. Essa conversão

ocorre, principalmente, em mitocôndrias intactas e, portanto, células viáveis

(Hansen et al., 1989).

As células foram semeadas numa densidade de 1x105 células/poço em

placas de 96 poços. No dia seguinte foram feitas as incubações com as

substâncias de interesse por 16 horas a 37oC em meio de cultura suplementado

com SFB.

Ao final de cada incubação, foram adicionados 20 µL de solução de MTT.

Após duas horas de incubação a 37oC, o meio contendo MTT foi removido com

cuidado para que não fosse aspirado o formazan precipitado no poço. Foram,

então, adicionados 200 µL da solução de lise (DMSO) a cada poço. Após

34

solubilização dos precipitados, foi feita a leitura da absorbância a 570 nm em leitor

de ELISA. Os resultados foram expressos em valores relativos ao grupo controle.

3.4.2.2. Incubações para extração do DNA e determinação de dano oxidativo

(8-oxodGuo)

Células HepG2 cultivadas em placas de 15 cm de diâmetro (3x107

células/placa) foram incubadas com antantreno ou seus produtos de oxidação

(misturas de quinonas ou hidroquinonas acetiladas) na concentração final de 20 µM

em 15 mL de meio de cultura com soro por 16 h, a 37oC, na estufa de CO2. Em

seguida as células foram removidas das placas e o DNA foi extraído como descrito

abaixo.

Paralelamente foi extraído DNA de células incubadas com volume de DMSO

(grupo controle) equivalente às amostras.

3.4.2.2.1. Extração do DNA

Soluções

Tampão A: 320 mM sacarose; 5 mM MgCl2; 10 mM Tris-HCl; 0,1 mM

desferroxamina; Triton X100 (1%), pH 7,5

Tampão B: 10 mM Tris-HCl; 5 mM EDTA.Na2; 0,15 mM desferroxamina, pH 8

Tampão C: 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; 2,5 mM desferroxamina, pH 7,4

Solução de NaI: 7,6 M NaI; 40 mM Tris-HCl; 20 mM EDTA.Na2, pH 8

Para a extração do DNA genômico, as células de cada placa foram

homogeneizadas com 5 mL de tampão A e centrifugadas a 1500 g por 10 minutos,

a 40C. Os sobrenadantes foram descartados e os precipitados foram ressuspensos

em 5 mL de tampão A e centrifugados a 1500 g por 10 minutos, 40C. A seguir

adicionou-se em cada tubo 4 mL de tampão B, 233 µL SDS (10%) e agitou-se,

acrescentando-se em seguida 3 µL de RNAse A (10 mg/mL em C) e 0,4 µL de

RNAse T1 (20 U/µL em C). As amostras foram incubadas por 1 hora a 37 ºC. Após

a incubação foram adicionados 30 µL de proteinase K (20 mg/mL) e as amostras

foram incubadas por mais 1 hora a 37 ºC. Após a segunda incubação as amostras

foram centrifugadas a 5000 g por 15 minutos, 40C. Coletou-se o sobrenadante e

35

aos tubos foram adicionados 2 mL de solução de NaI e 5 mL de isopropanol. Após

leve agitação para precipitação do DNA, as amostras foram guardadas no freezer

por 1 dia (-200C). Após esse período as soluções foram centrifugadas a 5000 g por

15 minutos, 40C, os sobrenadantes foram descartados e aos tubos foram

adicionados 5 mL de isopropanol 60% (em água). As soluções foram centrifugadas

novamente a 5000 g por 15 minutos, 40C. O DNA foi lavado com 10 mL de etanol

70% (em água) e centrifugado a 5000 g por 15 minutos, 40C. Adicionou-se então

500 µL de solução de desferroxamina (0,1 mM em água) e agitou-se para dissolver

o DNA. A concentração foi determinada por leitura da absorbância a 260 nm.

3.4.2.2.2. Hidrólise enzimática do DNA

A hidrólise enzimática do DNA para subseqüentes análises por HPLC foi feita

segundo o procedimento descrito abaixo.

Tampão Tris-HCl 0,2 M (10 µL, pH 7,4) e MgCl2 2 M (10 µL) foram

adicionados a uma alíquota de solução contendo 100 µg de DNA. Em seguida, foi

adicionada DNAse 1 (1,25 unidade) e a amostra foi incubada a 37°C por 1,5 h.

Então, foram adicionados 10 µL de tampão glicina-acetato 0,2 M (pH 10) e 0,008

unidade de fosfodiesterase 1 (PDE1) e feita nova incubação a 37 °C por 1,5 h.

Finalmente foram adicionados 25 µL de tampão Tris-HCl-MgCl2 0,2 M (pH 7,4) e 3

unidades de fosfatase alcalina. A amostra foi incubada a 37 °C por 1 hora. O

volume final da solução foi ajustado para 200 µL com água.

3.4.2.2.3. Análise de 8-oxodGuo por HPLC/detecção eletroquímica

Amostras de DNA hidrolisado enzimaticamente foram analisadas por um

sistema de HPLC/detecção eletroquímica constituído por uma bomba (LC-10AD,

Shimadzu), um injetor Rheodyne (modelo 9125i, Cotati, CA), um detector de

absorbância (SPD-10A, Shimadzu) e um detector eletroquímico Coulochem II

(ESA, Chemlsford, MA) controlados por um módulo de comunicação (CBM 10A,

Shimadzu) e o software Class LC10AWS (Shimadzu). A eluição foi feita através de

uma coluna Luna C18(2) (250 mm x 4,6 mm i.d., 5 µm, Phenomenex) com a fase

móvel constituída por 8% de metanol em tampão fosfato de potássio 25 mM (pH

5,5) a um fluxo de 0,8 mL/min (temperatura da coluna: 16oC). Nessas condições o

tempo de retenção de 8-oxodGuo foi de aproximadamente 27 min. Os potenciais

36

dos eletrodos 1 e 2 do detector eletroquímico foram fixados em +130 mV e +380

mV para detecção de 8-oxodGuo. A eluição dos nucleosídeos não modificados foi

monitorada simultaneamente por absorbância a 254 nm. Curvas de calibração de

8-oxodGuo e dG nos intervalos das quantidades esperadas nas amostras de DNA

foram obtidas para a quantificação e, em seguida, a fração molar 8-oxodGuo / dG

presente em cada amostra de DNA foi determinada. Todos os solventes utilizados

foram previamente filtrados e degaseificados. Padrões de 8-oxodGuo e dG foram

obtidos da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).

3.5. Análise de formação de adutos a partir de incubações in vitro de DNA ou

2’-desoxiguanosina com produtos de oxidação do antantreno

3.5.1. Incubações de dG com antantreno + H2O2

a) Solução de dG (2 mM) em tampão carbonato/bicarbonato (pH 11, 50 mM,

200 µL) foi adicionada a 150 µL de solução de antantreno 360 µM em acetonitrila.

Peróxido de hidrogênio (164 µL de uma solução 8,7 mM) foi adicionado e a solução

foi avolumada com acetonitrila para 764 µL. Concentrações finais dos reagentes:

523 µM de dG, 70,7 µM de antantreno, 1870 µM de H2O2. A solução foi incubada

por 24 h a 50oC. Foram realizadas incubações controles (sem antantreno ou sem

dGuo) nas mesmas condições.

b) Solução de dG (8mM) em tampão carbonato⁄bicarbonato (pH 11, 50mM,

500µL) foi adicionada a 1500µL de solução de antantreno 360µM em acetonitrila.

Peróxido de hidrogênio (164µL de uma solução 87mM) foi adicionado.

Concentrações finais dos reagentes: 1848µM de dG, 249µM de antantreno,

6600µM de H2O2. A solução foi incubada por 24 h a 500C.

3.5.1.1. Análise dos produtos das incubações por HPLC/UV/ESI/MS

Para as análises foi utilizado um sistema de HPLC da Shimadzu (Shimadzu,

Kyoto, Japão) constituído por duas bombas (Class LC-10 AD/VP), um injetor

automático (SIL-10AD/VP), uma válvula comutadora de fluxo (FCV-12AH) e um

detector de absorbância (modelo SPD-10 AV/VP) conectado ao espectrômetro de

massa Quattro II da Micromass (Manchester, U.K.). O sistema foi controlado pelo

37

módulo de comunicação SCL-10A/VP (Shimadzu) e o software MassLynx 3.2

(Micromass) ou Class-VP (Shimadzu). Foi utilizada a seguinte condição:

Condição 3.5.1.1.a: Uma coluna Luna C18(2) (150 mm x 2 mm i.d., 3 µm) da

Phenomenex foi eluída com um gradiente de ácido fórmico (0,1% em água) e

acetonitrila (de 0 a 60 min, 5 a 100% de acetonitrila; de 60 a 65 min, 100 a 5% de

acetonitrila a um fluxo de 0,15 mL/min). A temperatura da fonte foi ajustada para

150 °C e os fluxos dos gases de secagem e nebulização (nitrogênio) para 350 e 10

L/h, respectivamente. O potencial do capilar foi ajustado para 3,10 kV e do eletrodo

HV para 0,3 kV. Simultaneamente foi feita a detecção por absorbância a 254 nm.

Os dados foram processados com o software MassLynx 3.2 (Micromass). Foram

obtidos espectros de massas em MS1 no intervalo de 100 – 800 m/z.

3.5.2. Incubações de DNA comercial (timo de bezerro) com antantreno e seus

produtos de oxidação na presença de peroxidase de rábano (HRP)

Antantreno, antantreno-quinonas ou antantreno hidroquinonas (200 µM) foram

incubados com HRP (0,2 mg), H2O2 (0,5 mM) e DNA (2 mg) em tampão fosfato de

sódio 67 mM (pH 7,0). Incubação controle sem o HPA ou seus produtos de

oxidação também foi feita. Volume final das incubações: 1 mL. Após 2 h a 37oC,

sob agitação, o DNA foi precipitado pela adição de 100 µL de acetato de sódio 3 M

(pH 5) e 1 mL de isopropanol (10.000 g, 10 min). O DNA foi, então, lavado duas

vezes com etanol 70% (10.000 g, 10 min), ressuspenso em água e foi feita uma

extração com clorofórmio (5.000 g, 10 min) para remoção de resquícios de

antantreno livre na solução. A concentração de DNA foi determinada por leitura da

absorbância a 260 nm.

3.5.2.1. Análise da formação de produtos fluorescentes no DNA (timo de

bezerro) por espectrofluorimetria

As amostras de DNA obtidas das incubações descritas no item 3.5.2 foram

dissolvidas em tampão fosfato de sódio 10 mM (pH 7,0) (proporção 1:2). Espectros

de fluorescência (emissão) das amostras foram adquiridos fixando-se o

comprimento de onda de excitação em 314 nm. Foi feita comparação com os

38

espectros de emissão de fluorescência do DNA controle e do próprio

hidrocarboneto (λexc. = 314 nm).

3.5.2.2. Hidrólise enzimática do DNA e análise da formação de adutos por

HPLC/UV/Fluorescência e HPLC/ESI/MS

Para as análises por HPLC, as amostras de DNA obtidas no item 3.5.2 foram

hidrolisadas enzimaticamente como descrito no item 3.4.2.2.2. Os produtos da

hidrólise foram analisados por HPLC/UV/Fluorescência.

Sistema de HPLC/UV/Fluorescência: foi utilizado um sistema da Shimadzu

constituído de duas bombas modelo LC-10AT, um injetor Rheodyne (Cotati, CA),

um detector de absorbância modelo SPD-10A e um detector de fluorescência

modelo RF-10A, controlados por um módulo de comunicação modelo SCL-10A e o

software Class-VP. Foi utilizada a seguinte condição cromatográfica:

Condição 3.5.2.2.a: Uma coluna Luna C18(2) (250 mm x 4,6 mm i.d.,5 µm) da

Phenomenex foi eluída com um gradiente de água e acetonitrila (de 0 a 5 min, 5%

de acetonitrila, de 5 a 60 min, 5 a 100% de acetonitrila; de 60 a 65 min, 100 a 5%

de acetonitrila, a um fluxo de 1 mL/min). A absorbância foi monitorada em 254 nm

e a fluorescência foi monitorada em 450 nm (λexc. = 314 nm).

3.6. Análise estatística dos dados

A análise estatística dos dados de 8-oxodGuo foi feita através do teste t

Student para comparação entre duas populações. A análise estatística dos dados

de viabilidade celular foi feita através do teste ANOVA, se significativas realiza-se o

teste de Tukey-Kramer (comparações múltiplas).

39

4. Resultados

4.1. Oxidação do antantreno para quinonas e hidroquinonas

No estudo de mutagenicidade do antantreno em diferentes linhagens de S.

typhimurium (TA97, TA98, TA100 e TA104) conduzido por Platt et al., (2002), foi

verificado que produtos de oxidação desse HPA são os responsáveis pelos efeitos

mutagênicos. Nesse estudo foi investigado o metabolismo microssomal do

antantreno, tendo sido identificados alguns metabólitos mutagênicos, dentre os

quais 1,6-, 3,6- e 6,12-quinonas. Essas quinonas polinucleares não são

intrinsecamente mutagênicas, necessitando de biotransfomação (fração S9 (lisado

de fígado de ratos, contendo várias enzimas microssomais)) para que a

mutagenicidade seja observada (Platt et al., 2002). O baixo potencial de ionização

do antantreno (6,96 eV) propicia sua oxidação enzimática ou autoxidação para

cátion-radicais, que, na presença de oxigênio, originam as quinonas polinucleares

acima. Os cátion-radicais intermediários são espécies eletrofílicas que, ao serem

geradas nos seres vivos, podem modificar covalentemente o DNA e outras

biomoléculas. As quinonas polinucleares podem ser formadas por oxidação de

HPAs no meio ambiente (ex., oxidação por luz UV) ou por ação de enzimas, tais

como peroxidases e monooxigenases, nos sistema vivos. Como exemplo, estudos

mostram que peroxidases convertem BP para uma mistura de 1,6-, 3,6- e 6,12-

quinonas, as quais possuem efeito citotóxico, levando a uma diminuição da

proliferação de células epiteliais pulmonares humanas in vitro. As reações de

oxidação atmosférica e biológica podem levar à conversão significativa de HPAs

para quinonas. Tais quinonas podem ser reduzidas enzimaticamente e entrar em

um ciclo redox, catalisando a geração de espécies reativas de oxigênio. O

intermediário semiquinona gerado nesse processo também pode se adicionar a

macromoléculas celulares, formando adutos (Reed et al., 2003).

Diante dessas informações, resolvemos utilizar um procedimento para

obtenção de quinonas e hidroquinonas do antantreno, como descrito por Cho e

Harvey (1974 e 1976). O método de oxidação de HPAs com dicromato de sódio em

anidrido acético/ácido acético leva à formação de uma mistura de quinonas com

ótimo rendimento (~ 90%). Tal método de oxidação foi utilizado por Platt et al.

(2002) para obtenção de quinonas do antantreno. Para obtenção de hidroquinonas,

incubamos a mistura de quinonas com NaBH4/dimetilformamida como descrito por

40

Cho e Harvey (1976). Para incubação com as células, as hidroquinonas foram

acetiladas com anidrido acético/piridina, pois na sua forma livre as hidroquinonas

são rapidamente oxidadas de volta para quinonas (Cho e Harvey, 1976). O método

utilizado está descrito no item 3.3. Os cromatogramas obtidos para o antantreno,

quinonas e hidroquinonas acetiladas, bem como seus espectros de absorbância,

estão apresentados na figura 4.1. Na figura 4.2 são apresentados os espectros de

massas das quinonas e hidroquinonas acetiladas.

41

Figura 4.1: Cromatogramas obtidos por HPLC/UV (λ = 254nm) do antantreno e seus

produtos de oxidação. Condição cromatográfica descrita no item 3.3.1.a. Estão apresentados

os espectros de absorbância dos picos indicados.

42

Figura 4.2: Espectros de massas do antantreno e seus produtos de oxidação apresentados

na figura 4.1. Condição descrita no item 3.3.1.b.

4.2. Investigação da toxicidade do antantreno e seus produtos de oxidação

em células humanas em cultura

Foram utilizadas duas linhagens celulares de fígado humano para a

verificação da citotoxicidade do antantreno e seus produtos de oxidação (mistura

de quinonas e hidroquinonas acetiladas): uma linhagem de carcinoma

hepatocelular humano (HepG2) e uma linhagem de fígado humano normal (THLE-

2).

Nas figuras 4.3 e 4.4 são apresentados os dados de sobrevivência relativa

das células HepG2 e THLE-2, respectivamente. Ambas as linhagens cresceram

sobre filme de colágeno para que fosse possível fazer a comparação.

43

Figura 4.3: Viabilidade (MTT) de células HepG2 incubadas com: DMSO (controle), N =

antantreno, Q = quinonas e HQ = hidroquinonas acetiladas. Células crescidas sobre filme de

colágeno. Os valores mostram a média ± desvio padrão de quatro experimentos distintos

*p< 0,05 (one-way Analysis of variance – ANOVA em relação ao controle).

Figura 4.4: Viabilidade (MTT) de células THLE-2 incubadas com: DMSO (controle), N =

antantreno, Q = quinonas e HQ = hidroquinonas acetiladas. Células crescidas sobre filme de

colágeno. Os valores mostram a média ± desvio padrão de quatro experimentos distintos

*p< 0,05 (one-way Analysis of variance – ANOVA em relação ao controle).

44

Observamos maior sensibilidade das células THLE-2 ao antantreno e à

mistura de hidroquinonas acetiladas, sendo bem evidente a diferença de toxicidade

do antantreno entre as duas linhagens. Entretanto, ambas as linhagens se

mostraram igualmente sensíveis à mistura de quinonas, sugerindo que o

metabolismo via CYP450 não seja tão importante neste caso, o que precisa ser

melhor investigado. A oxidação monoeletrônica do antantreno e hidroquinonas leva

à formação de radicais que podem reagir com macromoléculas e contribuir para a

maior toxicidade em relação às quinonas, que precisam ser reduzidas para

hidroquinonas por sistemas enzimáticos para, então, exercerem seus efeitos

tóxicos. Nos dois casos, o antantreno foi mais tóxico que seus produtos de

oxidação. Alguns fatores que podem contribuir para a maior toxicidade do

antantreno são a facilidade de penetração nas células (antantreno é mais

lipossolúvel que seus produtos de oxidação) e a reação dos produtos de oxidação

com constituintes do meio de cultura, reduzindo sua disponibilidade para as

células. Verificamos, ainda, a diminuição da sobrevivência das células com o

aumento da concentração dos compostos (citotoxicidade dose-dependente).

Nas figuras 4.5 e 4.6 são apresentados os dados de sobrevivência relativa

das células HepG2 cultivadas em meio DME e em meio de Earle modificado,

respectivamente. Nesse caso não foi utilizado filme de colágeno para o

crescimento das células. Observamos que as células cultivadas em meio de Earle

modificado foram mais sensíveis aos efeitos tóxicos das maiores concentrações de

antantreno utilizadas (100 e 200 µM). Não foi observada diferença de toxicidade de

quinonas e hidroquinonas entre as diferentes condições de cultura.

45

Figura 4.5: Viabilidade (MTT) de células HepG2 incubadas com: DMSO (controle), N =

antantreno, Q = quinonas e HQ = hidroquinonas acetiladas. Células cultivadas em meio

DME. Os valores mostram a média ± desvio padrão de quatro experimentos distintos

*p< 0,05 (one-way Analysis of variance – ANOVA em relação ao controle).

Figura 4.6: Viabilidade (MTT) de células HepG2 incubadas com: DMSO (controle), N =

antantreno, Q = quinonas e HQ = hidroquinonas acetiladas. Células cultivadas em meio de

Earle modificado. Os valores mostram a média ± desvio padrão de quatro experimentos

distintos *p< 0,05 (one-way Analysis of variance – ANOVA em relação ao controle).

46

Como o antantreno na concentração de 20 µM já levava à morte de 20 – 25% das

células HepG2, resolvemos verificar o nível de 8-oxodGuo no DNA dessas células

incubadas com antantreno, antantreno-quinonas e antantreno-hidroquinonas

acetiladas na concentração de 20 µM. As células foram incubadas e o DNA

extraído como descrito no item 3.4.2.2. Uma possível via de toxicidade de HPAs é

a indução de estresse oxidativo. Os dados obtidos na determinação de 8-oxodGuo

estão apresentados na figura 4.7. Observamos indução de dano oxidativo no DNA

das células incubadas com antantreno-quinonas ou antantreno-hidroquinonas

acetiladas.

Figura 4.7: Níveis de 8-oxodGuo em células HepG2 controles e incubadas com antantreno

e seus produtos de oxidação (quinonas e hidroquinonas acetiladas, concentração utilizada:

20 µM). Condições descritas no item 3.4.2.2.. Os valores mostram a média ± desvio padrão

de quatro experimentos distintos *p< 0,05 (one-way Analysis of variance – ANOVA em

relação ao controle).

47

4.3. Análise de formação de adutos a partir de incubações in vitro de 2’-

desoxiguanosina ou DNA com produtos de oxidação do antantreno

Além do dano oxidativo em DNA, outra possível via de indução de mutações

por antantreno seria a formação de adutos antantreno-DNA, o que também ainda

não foi investigado na literatura. A forma mais simples de se verificar se um

determinado composto interage com bases do DNA é através de incubações in

vitro de desoxirribonucleosídeos com o composto na sua forma reativa e análise

por HPLC (PDA, UV, fluorescência ou ESI/MS). No caso da análise por

HPLC/ESI/MS, ao haver a modificação da base do desoxirribonucleosídeo,

observa-se caracteristicamente um fragmento no espectro de massas

correspondente à perda da desoxirribose ([M – 116 + H]+), o que ajuda a identificar

possíveis adutos.

Iniciamos, portanto, a verificação de formação de adutos incubando dG,

antantreno e H2O2 como descrito no item 3.5.1 de Materiais e Métodos. Amostras

controles sem dG ou sem antantreno também foram incubadas. A análise das

reações por HPLC/ESI/MS e HPLC-UV (λ = 250 nm) revelou a formação de

produtos na incubação completa que estavam ausentes nos controles (Figura 4.8).

Um dos produtos apresentou íon molecular [M + H]+ com m/z 588 e um fragmento

[M – 116 + H]+ com m/z 472 (voltagem do cone = 50 V) (Figura 4.9). Tal produto

pode ser resultante da reação do grupo amino exocíclico da dG com uma molécula

de antantreno epoxidada em duas posições. Um dos epóxidos seria hidrolisado

para o dihidrodiol e oxidado para a quinona correspondente. O outro epóxido

reagiria com o grupo amino exocíclico da dG, abrindo para C-OH e sendo oxidado

para C=O (Figura 4.10). Incubações posteriores com maiores concentrações de

antantreno visando obter maior quantidade do possível aduto para coleta e

caracterização via ressonância magnética nuclear (RMN) não levaram mais à sua

formação. Uma possível explicação seria que a diminuição da proporção

dG/antantreno nas incubações posteriores tivesse favorecido a reação entre as

próprias moléculas do HPA oxidado e, com isso, teria sido desfavorecida a reação

com dG. De fato, nova incubação com a proporção dG/antantreno da incubação

inicial voltou a apresentar a formação do mesmo aduto.

48

Figura 4.8: Cromatogramas obtidos por HPLC-UV (λ = 250 nm) das incubações: (A)

antantreno + H2O2; (B) dG + H2O2; (C) dG + antantreno + H2O2. Flecha indicando a

formação de produtos na incubação de dG + antantreno + H2O2 que não se observam nas

amostras controles (antantreno + H2O2 e dG + H2O2).

49

100 200 300 400 500 600

m/z

0

100

0

100

Inte

nsid

ade

Rel

ativ

a (%

)588

588

472

273210

142

273

142

Cone : 30 V

Cone : 50 V

OH

O

OH

NN

NNH

O

NH

O O

O

[M+H-dR]+ = 472

[M+H]+ = 588

Figura 4.9: Espectros de massas obtidos do pico eluído em 47,6 min na figura 4.8.

50

Figura 4.10: Possível via de formação do aduto antantreno-dG

Realizamos também incubações de DNA com antantreno utilizando o sistema

HRP/H2O2 descrito no item 3.5.2. Como mencionado anteriormente, o baixo

potencial de ionização do antantreno (6,96 eV) propicia sua oxidação enzimática

para cátion-radicais, os quais são espécies eletrofílicas que podem modificar

covalentemente o DNA e outras biomoléculas.

Devido à grande fluorescência desses compostos, uma forma de se analisar a

ligação do HPA ao DNA é através da obtenção de espectros de fluorescência do

DNA na faixa de emissão de fluorescência do HPA em um determinado

comprimento de onda de excitação (Kishikawa et al., 2003; Wang et al., 2005;

Watanabe et al., 2005). É importante que o DNA seja bem lavado após a

incubação para que não haja a interferência de moléculas de HPA livres na solução

no momento de obtenção dos espectros. Obtivemos, portanto, espectros de

fluorescência (emissão) das amostras de DNA das incubações em diferentes

comprimentos de onda de excitação e, ao fixarmos λexc. em 314 nm, obtivemos

espectros de emissão que diferiam entre as soluções de DNA controle,

DNA/antantreno/HRP/H2O2, e antantreno, como apresentado na figura 4.11 (o

51

DNA da incubação completa possui um λmáx. de emissão em 445 nm, o qual está

deslocado em relação aos controles). Esses dados constituem forte indício de

ligação do antantreno ao DNA nas incubações realizadas na presença de

HRP/H2O2 e foram confirmados em novas incubações (dados não apresentados).

Figura 4.11: Espectros de emissão de fluorescência (λexc. = 314 nm) do DNA incubado com

antantreno/HRP/H2O2, do DNA controle e do antantreno.

O DNA incubado com antantreno/HRP/H2O2 e o DNA controle (verificar item

3.5.2 de Materiais e Métodos) foram hidrolisados enzimaticamente e analisados por

HPLC/UV/Fluorescência, como descrito no item 3.5.2.2 de Materiais e Métodos. É

possível observar nos cromatogramas apresentados na figura 4.12 a presença de

alguns produtos no DNA da incubação com antantreno que estão ausentes no DNA

controle (tanto na detecção por fluorescência quanto na detecção por UV).

52

Figura 4.12: Cromatogramas obtidos por HPLC/UV/Fluorescência do DNA incubado com

antantreno/HRP/H2O2 e do DNA controle. Condições descritas no item 3.5.2.2 de Materiais

e Métodos. Incubação completa (DNA/antantreno/HRP/H2O2) revelando a formação de

produtos (indicados por frações 1,2 e 3) que não são encontrados nas suas respectivas

amostras controle (DNA controle), tanto por detecção por HPLC/UV como

HPLC/fluorescência (os nucleosídeos são apontados com as abreviações: dC, dG, dT e dA).

53

Quinonas e hidroquinonas do antantreno obtidas como descrito no item 3.3

de Materiais e Métodos (neste caso, hidroquinonas não acetiladas) foram também

incubadas com DNA/HRP/H2O2 e, após hidrólise enzimática, o DNA foi analisado

por HPLC/UV/Fluorescência, comparando-se com DNA controle. Nos dois casos

também verificamos a formação de produtos na detecção por UV e por

fluorescência que não aparecem no DNA controle (Figuras 4.13 e 4.14).

54

Figura 4.13: Cromatogramas obtidos por HPLC/UV/Fluorescência do DNA incubado com

antantreno-quinonas/HRP/H2O2 e do DNA controle. Condições descritas no item 3.5.2.2 de

Materiais e Métodos, revelando a formação de produtos (indicados por frações 1, 2 e 3) que

não são encontrados nas suas respectivas amostras controle (DNA controle) (os

nucleosídeos são apontados com as abreviações: dC, dG, dT e dA).

55

Figura 4.14: Cromatogramas obtidos por HPLC/UV/Fluorescência do DNA incubado com

antantreno-hidroquinonas/HRP/H2O2 e do DNA controle. Condições descritas no item

3.5.2.2 de Materiais e Métodos, revelando a formação de produtos (indicados por frações

1,2) que não são encontrados nas suas respectivas amostras controle (DNA controle), tanto

por detecção por HPLC/UV como HPLC/fluorescência (os nucleosídeos são apontadas

com as abreviações: dC, dG, dT e dA).

56

5. Discussão

Muitos estudos são feitos com o intuito de identificar substâncias tóxicas

presentes no meio ambiente, mas a correta avaliação da exposição humana aos

múltiplos compostos químicos é um desafio (Sato e Aoki, 2002; Claxton et al.,

2004). O maior interesse está em substâncias envolvidas nos complexos

mecanismos do câncer. O teste feito com Salmonella typhimurium tem sido um

ensaio conveniente e muito utilizado para avaliação da atividade genotóxica de

substâncias (Claxton et al., 2004).

Há um grande interesse em identificar efeitos adversos à saúde humana

causados por poluentes presentes no meio ambiente. Centenas de compostos

químicos, incluindo HPAs, compostos orgânicos nitrados e halogenados, ácidos

orgânicos e compostos orgânicos metálicos têm sido identificados como poluentes

em amostras do ar. Alguns dos HPAs presentes como contaminates do ar, água,

solo e alimentos possuem a propriedade de lesar o DNA após biotransformação,

sendo que dentre as possíveis lesões está a formação de adutos. Adutos de DNA

podem levar a mutações após a replicação. A exposição a poluentes pode induzir

ainda a geração de espécies reativas de oxigênio, que também podem lesar o DNA

e outras biomoléculas. Adutos de DNA são potenciais marcadores de exposição a

substâncias genotóxicas, podendo ser dosados em sangue, urina ou células

extraídas de mucosas.

No nosso trabalho investigamos a possibilidade de o antantreno, um HPA

sem a região de baía ou fjord, lesar o DNA (dano oxidativo, formação de adutos),

uma vez que o estudo realizado por Platt et al. (2002) revelou que esse HPA é

mutagênico na presença de fração S9 em ensaios com diferentes linhagens de S.

typhimurium (TA97, TA98, TA100 e TA104). Sua mutagenicidade é comparável à

do benzo[a]pireno, um HPA que possui região de baía e é carcinogênico (Platt et

al., 2002).

Diante das informações de que produtos de biotransformação do antantreno

eram os responsáveis pelos efeitos mutagênicos observados em Salmonella

typhimurium, resolvemos utilizar um procedimento para obtenção de quinonas e

hidroquinonas do antantreno, como descrito por Cho e Harvey (1974 e 1976). O

método de oxidação de HPAs com dicromato de sódio em anidrido acético⁄ácido

acético leva à formação de uma mistura de quinonas com ótimo rendimento

57

(~90%). Tal método de oxidação foi utilizado por Platt et al., (2002) para obtenção

de quinonas do antantreno. Para obtenção de hidroquinonas, incubamos a mistura

de quinonas com NaBH4/dimetilformamida como descrito por Cho e Harvey (1976).

Para incubação com as células, as hidroquinonas foram acetiladas com anidrido

acético⁄piridina, pois na sua forma livre as hidroquinonas são rapidamente oxidadas

de volta para quinonas (Cho e Harvey, 1976) (Figuras 4.1 e 4.2). Alguns dos

metabólitos mutagênicos do antantreno identificados por Platt et al. (2002) foram

1,6-, 3,6- e 6,12-quinonas. Essas quinonas polinucleares não são intrinsecamente

mutagênicas, necessitando de biotransformação (fração S9) para que a

mutagenicidade seja observada (Platt et al., 2002).

O baixo potencial de ionização do antantreno (6,96 eV) propicia sua oxidação

enzimática ou autoxidação para cátion-radicais, que na presença de oxigênio,

originam as quinonas polinucleares acima (Cavalieri et al., 1983; Reed et al., 2003).

Os cátion-radicais intermediários são espécies eletrofílicas que, ao serem geradas

nos seres vivos, podem modificar covalentemente o DNA e outras biomoléculas. As

quinonas polinucleares podem ser formadas por oxidação de HPAs no meio

ambiente (p.ex.: oxidação por luz UV) (Zhang et al., 2004; Crallan et al., 2005; Gao

e col., 2005; Toyooka et al., 2006) ou por ação de enzimas, tais como peroxidases

e monooxigenases, nos sistemas vivos. Como exemplo, estudos mostram que

peroxidases convertem BP para uma mistura de 1,6-, 3,6- e 6,12-quinonas, as

quais possuem efeito citotóxico, levando a uma diminuição da proliferação de

células epiteliais pulmonares humanas in vitro (Reed et al., 2003) . As reações de

oxidação atmosférica e biológica podem levar à conversão significativa de HPAs

para quinonas. Tais quinonas podem ser reduzidas enzimaticamente e entrar em

um ciclo redox, catalisando a geração de espécies reativas de oxigênio. O

intermediário semiquinona gerado nesse processo também pode se adicionar a

macromoléculas celulares, formando adutos (Reed et al., 2003; Zhang et al., 2004;

Tooyoka et al., 2006).

Para investigarmos a citotoxicidade do antantreno e seus produtos de

oxidação (quinonas e hidroquinonas acetiladas), utilizamos duas linhagens

celulares de fígado humano: uma linhagem de carcinoma hepatocelular humano

(HepG2) e uma linhagem de fígado humano normal (THLE-2).

A linhagem HepG2 é muito utilizada em estudos toxicológicos. Ela retém

algumas funções de biotransformação de fase I e fase II, apesar de suas atividades

58

serem geralmente mais baixas que as encontradas em hepatócitos primários

(Harris et al., 2004; Sevastyanova et al., 2007). No caso do crescimento dessa

linhagem em meio DME, a atividade de CYP450 verificada foi 5 – 10 vezes menor

que a atividade encontrada em hepatócitos humanos recém isolados, enquanto as

atividades de glicuroniltransferase e glutationa-S-transferase foram semelhantes

(Doostdar et al., 1988). No entanto, a atividade de CYP450 pode ser modulada

pela composição do meio de cultura dessas células, como demonstrado por

Doostdar et al. (1988) que verificaram um aumento de 498%, 4700%, 2957% e

750% nas atividades de metoxiresorufina-o-dealquilase (MROD), etoxiresorufina-o-

dealquilase (EROD), benziloxiresorufina-o-dealquilase (BROD) e pentoxiresorufina-

o-dealquilase (PROD), respectivamente, quando células HepG2 cresceram em

meio de Earle modificado em relação às crescidas no meio DME (Doostdar et al.,

1988).

A linhagem THLE-2 é derivada de células primárias de fígado humano normal

por infecção com SV40. Expressa características fenotípicas de células epiteliais

de fígado adulto normal (Harris et al., 2004). Há poucos trabalhos na literatura

comparando as respostas de células HepG2 e hepatócitos humanos primários em

cultura (ou células com características de hepatócitos primários, como é o caso da

linhagem THLE-2) a estímulos externos. Diferenças na expressão gênica e,

conseqüentemente, nas respostas celulares são esperadas entre uma linhagem

transformada e proliferante (HepG2) e uma linhagem mais diferenciada e de

proliferação mais lenta (THLE-2) (Harris et al., 2004). As células HepG2 são

deficientes na expressão de muitas isoformas de CYP450 (ex., apresentam níveis

baixos ou não detectáveis de CYP2E1) e álcool desidrogenase. São, portanto,

resistentes aos efeitos citotóxicos do etanol, sendo que hepatócitos primários são

sensíveis a esses efeitos (Harris et al., 2004; Knasmüller et al., 2004; Staal et al.,

2006; Sevastyanova et al., 2007).

Uma vez que o cultivo e proliferação das células HepG2 é mais fácil que o

das células THLE-2 e uma vez que para extração de DNA para análise de lesões

necessitamos de grande quantidade de células (aproximadamente 3x107 células),

resolvemos comparar primeiramente a sensibilidade de ambas as linhagens ao

antantreno e seus produtos de oxidação. Observando-se respostas semelhantes

das duas linhagens nos ensaios de citotoxicidade, poderíamos então utilizar as

células HepG2 (tumorais, de proliferação mais rápida e cultivo mais fácil) para

59

análise do dano oxidativo em DNA. Investigamos também se a alteração da

composição do meio de cultura (meio DME x meio de Earle modificado como

descrito por Doostdar et al., 1988) levaria a respostas diferentes (citotoxicidade)

das células HepG2.

Nas figuras 4.3 e 4.4 são apresentados os dados de sobrevivência relativa

das células HepG2 e THLE-2, respectivamente. Ambas as linhagens cresceram

sobre filme de colágeno para que fosse possível fazer a comparação.

De acordo com o esperado, observamos maior sensibilidade das células

THLE-2 ao antantreno e à mistura de hidroquinonas acetiladas, sendo bem

evidente a diferença de toxicidade do antantreno entre as duas linhagens.

Entretanto, ambas as linhagens se mostraram igualmente sensíveis à mistura de

quinonas, sugerindo que o metabolismo via CYP450 não seja tão importante neste

caso, o que precisa ser melhor investigado. A oxidação monoeletrônica do

antantreno e hidroquinonas leva à formação de radicais que podem se adicionar a

macromoléculas e contribuir para a maior toxicidade em relação às quinonas, que

precisam ser reduzidas para hidroquinonas por sistemas enzimáticos para, então,

exercerem seus efeitos tóxicos. Nos dois casos, o antantreno foi mais tóxico que

seus produtos de oxidação. Alguns fatores que podem contribuir para a maior

toxicidade do antantreno são a facilidade de penetração nas células (antantreno é

mais lipossolúvel que seus produtos de oxidação) e a reação dos produtos de

oxidação com constituintes do meio de cultura, reduzindo sua disponibilidade para

as células. Verificamos, ainda, a diminuição da sobrevivência das células com o

aumento da concentração dos compostos (citotoxicidade dose-dependente), como

esperado.

Nas figuras 4.5 e 4.6 são apresentados os dados de sobrevivência relativa

das células HepG2 cultivadas em meio DME e em meio de Earle modificado,

respectivamente. Nesse caso não foi utilizado filme de colágeno para o

crescimento das células. Observamos que as células cultivadas em meio de Earle

modificado foram mais sensíveis aos efeitos tóxicos das maiores concentrações de

antantreno utilizadas (100 e 200 µM). Não foi observada diferença de toxicidade de

quinonas nas diferentes condições de cultura e no caso da exposição a

hidroquinonas (100 e 200 µM) houve maior sobrevivência relativa das células

HepG-2 cultivadas no meio de Earle modificado. Para verificarmos se o meio de

Earle que utilizamos está, realmente, levando ao aumento de atividade de CYP450

60

nas células HepG2, como descrito por Doostdar et al., 1988, é necessário fazer a

determinação da atividade EROD cultivando essas células nos dois tipos de meio.

A determinação pode ser feita no próprio meio de crescimento das células,

adicionando-se 7-etoxiresorufina que é o-desetilada para resorufina na presença

de atividade de CYP450 (principalmente CYP1A1). A concentração de resorufina é

determinada por medida da fluorescência de uma alíquota do meio de cultura em

590 nm (λexc. = 530 nm) (Donato et al., 1993). Ao compararmos a sobrevivência

relativa das células THLE-2 (Figura 4.4) com a das células HepG2 em meio DME

sem utilização de filme de colágeno (Figura 4.5), verificamos que as duas

linhagens foram igualmente sensíveis aos efeitos tóxicos do antantreno e seus

produtos de oxidação. Pudemos, portanto, utilizar as células HepG2 para a análise

de dano oxidativo no DNA. Como o antantreno na concentração de 20µM já levava

à morte de 20-25% das células, verificamos o nível de 8-oxodGuo nas células

HepG2 incubadas com antantreno, quinonas e hidroquinonas acetiladas na

concentração de 20µM. Como pode ser observado na Figura 4.7., quinonas e

hidroquinonas acetiladas do antantreno levaram ao aumento significativo do nível

de 8-oxodGuo no DNA das células, o mesmo não sendo observado para o

antantreno. Quinonas e hidroquinonas podem participar de ciclos redox e levar à

geração de grande quantidade de espécies reativas de oxigênio que acabam

danificando biomoléculas. Radicais HO• gerados a partir da redução de H2O2 por

metais de transição presentes no DNA nuclear atacam a posição C-8 da

desoxiguanosina, originando a lesão 8-oxodGuo.

A indução de dano oxidativo por esses compostos em organismos expostos

pode levar ao desenvolvimento de doenças crônicas, como o câncer, porém os

mecanismos cruciais ainda precisam ser desvendados (Harri et al., 2005; Rybicki et

al., 2006; Garte et al., 2007; Nilsson et al., 2007).

Além do dano oxidativo em DNA, outra possível via de indução de mutações

seria a formação de adutos HPA-DNA, como é demonstrado na literatura em testes

in vitro e in vivo feitos principalmente com HPAs comprovadamente carcinogênicos

(p.ex.: benzo[a]pireno, benzo[a]antraceno, ciclopenta[c,d]pireno, dibenzo[a,l]pireno)

(Cizmas et al., 2004; Park et al.,2004; Palmqvist et al., 2006 Tai et al., 2007). A

formação de adutos antantreno-DNA não foi anteriormente investigada na

literatura.

61

A forma mais simples de se verificar se um determinado composto interage

com bases do DNA é através de incubações in vitro de desoxirribonucleosídeos

com o composto na sua forma reativa e análise por HPLC (PDA, UV, fluorescência

ou ESI/MS). No caso da análise por HPLC/ESI/MS, ao haver a modificação da

base do desoxirribonucleosídeo, observa-se caracteristicamente um fragmento no

espectro de massas correspondente à perda da desoxirribose ([M – 116 + H]+), o

que ajuda a identificar possíveis adutos (Loureiro et al., 2000; Martinez et al., 2003;

Márquez et al., 2004; Hermida et al., 2006).

Iniciamos, portanto, nossa investigação de formação de adutos incubando dG,

antantreno e H2O2. A análise das reações por HPLC/ESI/MS e HPLC-UV (λ = 250

nm) revelou a formação de produtos na incubação completa que estavam ausentes

nos controles (Figura 4.8). Um dos produtos apresentou íon molecular [M + H]+

com m/z 588 e um fragmento [M – 116 + H]+ com m/z 472 (voltagem do cone = 50

V) (Figura 4.9). Tal produto pode ser resultante da reação do grupo amino

exocíclico da dG com uma molécula de antantreno epoxidada em duas posições.

Um dos epóxidos seria hidrolisado para o dihidrodiol e oxidado para a quinona

correspondente. O outro epóxido reagiria com o grupo amino exocíclico da dG,

abrindo para C-OH e sendo oxidado para C=O (Figura 4.10). A formação desse

produto foi confirmada em incubações posteriores nas quais a mesma proporção

dG/antantreno/H2O2 foi mantida. Entretanto, não foi possível sua purificação para

confirmação estrutural via RMN.

Como é de conhecimento geral o potente carcinógeno benzo[a]pireno exerce

sua atividade carcinogênica após ser biotransformado, principalmente pelo fígado,

produzindo espécies eletrofilicas que podem reagir covalentemente com várias

macromoléculas, formando adutos (Stansbury et al., 2002; Garry et al., 2003;

Fields et al., 2004). Há muitos experimentos descritos na literatura à respeito da

formação de adutos de DNA após bioativação de xenobióticos utilizando

microssomos de fígado de ratos e camundongos (Yoon et al., 2004; Svihalkova et

al., 2007). Realizamos também incubações de DNA com antantreno utilizando o

sistema HRP/H2O2. Como mencionado anteriormente e segundo Cavalieri et al.,

(1983) o baixo potencial de ionização do antantreno (6,96 eV) propicia sua

oxidação enzimática para cátion-radicais, os quais são espécies eletrofílicas que

podem modificar covalentemente o DNA e outras biomoléculas. Os cátion-radicais

são obtidos por meio da remoção de um elétron, ocorrendo mais facilmente a

62

formação desses intermediários para HPAs com potencial de ionização (PI) menor

que 7,35 eV. Outros fatores importantes para a reação com alvos celulares incluem

a localização da carga no cátion-radical, orientação e geometria adequada

(Cavalieri et al., 1983). O sistema HRP/H2O2 é conhecido por catalizar a oxidação

de um elétron de uma série de substâncias. Evidências apresentadas sugerem que

o sistema HRP/H2O2 leva à ligação de HPAs ao DNA (Cavalieri et al., 1983).

Devido à grande fluorescência desses compostos, uma forma de se analisar a

ligação do HPA ao DNA é através da obtenção de espectros de fluorescência do

DNA na faixa de emissão de fluorescência do HPA em um determinado

comprimento de onda de excitação (Kishikawa et al., 2003; Watanabe et al., 2005).

É importante que o DNA seja bem lavado após a incubação para que não haja a

interferência de moléculas de HPA livres na solução no momento de obtenção dos

espectros. Obtivemos, portanto, espectros de fluorescência (emissão) das

amostras de DNA das incubações em diferentes comprimentos de onda de

excitação e, ao fixarmos λexc. em 314 nm, obtivemos espectros de emissão que

diferiam entre as soluções de DNA controle, DNA/antantreno/HRP/H2O2, e

antantreno, como apresentado na figura 4.11 (o DNA da incubação completa

possui um λmáx. de emissão em 445 nm, o qual está deslocado em relação aos

controles). Esses dados foram confirmados em novas incubações (dados não

mostram) com os espectros de emissão das amostras de DNA diferindo entre as

incubações controle. Esses resultados constituem forte indício de ligação do

antantreno ao DNA nas incubações realizadas na presença de HRP/H2O2.

O DNA incubado com antantreno/HRP/H2O2 e o DNA controle foram

hidrolisados enzimaticamente e analisados por HPLC/UV/Fluorescência.

Quinonas e hidroquinonas do antantreno (neste caso, hidroquinonas não

acetiladas) foram também incubadas com DNA/HRP/H2O2 e, após hidrólise

enzimática, o DNA foi analisado por HPLC/UV/Fluorescência, comparando-se com

DNA controle. Em todos os casos verificamos a formação de produtos na detecção

por UV e por fluorescência que estavam ausentes no DNA controle (Figuras 4.12,

4.13 e 4.14). Esses dados indicam a ligação de produtos de oxidação do

antantreno ao DNA. Entretanto, as estruturas dos possíveis adutos gerados ainda

precisam ser elucidadas.

63

6. Conclusões

Este trabalho possibilitou a obtenção de novos dados, ainda não

mencionados na literatura, que mostram que o antantreno e produtos de sua

oxidação em baixas concentrações (20µM) são citotóxicos para linhagens celulares

de fígado humano em cultura. Ao compararmos a citotoxicidade em células HepG2

(tumorais) submetidas a diferentes condições de cultivo com a citotoxicidade em

células THLE-2 (normais) verificamos respostas semelhantes das células HepG2

crescidas em meio DME sem filme de colágeno e das células THLE-2 crescidas no

meio PFMR-4 sobre filme de colágeno. Diante dessa observação, mostrou-se

muito mais conveniente o cultivo das células HepG2 para análise de dano

oxidativo, uma vez que necessitamos de um número grande de células que é mais

facilmente atingido por essa linhagem. Nas incubações das células HepG2 com

antantreno ou seus produtos de oxidação, verificamos a indução de formação de 8-

oxodGuo no DNA por baixas concentrações de quinonas e hidroquinonas

acetiladas do antantreno (20µM).

Paralelamente, em incubações in vitro de dG ou DNA com antantreno

oxidado química ou enzimaticamente, observamos a ligação desse HPA às

moléculas estudadas. No caso das incubações com dG, houve a formação

reprodutiva de um aduto com m/z 588 ([M+H]+), cuja estrutura e via de formação

foram sugeridas, mas precisam ser confirmadas por RMN após futura purificação

de massa suficiente dessa lesão. No caso das incubações com DNA utilizando o

sistema HRP/H2O2, observamos alteração do espectro de fluorescência do DNA

indicando sua ligação ao HPA. Além disso, o DNA hidrolisado enzimaticamente e

analisado por HPLC/UV/Fluorescência revelou a presença de produtos ausentes

no controle. Os dados obtidos até o momento nos indicam que duas vias podem

estar envolvidas na genotoxicidade do antantreno observada nos estudos com S.

typhimurium realizados por Platt et al., (2002): indução de dano oxidativo e

formação de adutos com o DNA.

64

7. Referências bibliográfias:

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