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Análise Qualitativa de Microrganismos

Aline Alencar RA: 058691

Cintia Maruiama

RA: 059773

Diogo de Oliveira

RA: 060200

Gustavo Lloret RA: 048790

Pedro Aquino RA: 063624

Renan Joviliano RA: 064035

+Sumário

Atividades Bioquímicas do Microrganismos; Testes Bioquímicos; Controle de Qualidade de Medicamentos e Cosméticos; Provas Adicionais; Métodos Alternativos; Conclusão; Referências Bibliográficas.

+Atividades Bioquímicas de Microrganismos Provas bioquímicas: identificação bacteriana baseada

na detecção do perfil enzimático dos microrganismos. Antes do teste bioquímico, é necessário saber se o

microrganismo é Gram-positivo ou Gram-negativo, pois para cada grupo existe um conjunto de provas.

GRAM + GRAM -

+Testes Bioquímicos

+Provas Fermentativas

Fermentações: reações bioquímicas produtoras de energia (moléculas orgânicas servem como aceitadores e dadores de elétrons).

compostos orgânicos ácidos + H2 ou CO2

Hidratos de C e R-OH

Condições: meio líquido, hidrato de carbono específico indicador de pH e tubo de Durham, que permite detectar a produção de gás.

+Prova do Ácido Sulfídrico

Cisteína: o H2S é produzido pela hidrogenação (redução) do enxofre orgânico.

H2SAminoácidos sulfurados ou

compostos sulfurados inorgânicos

Compostos sulfurados inorgânicos: o H2S é produzido a partir de sua redução. Ex. tiossulfatos (S2O3

2-), sulfatos (SO4

2-) e sulfitos (SO32-).

Ágar SIM: uso do sulfato ferroso amoniacal como indicador, pois o ferro combina-se com o H2S formando sulfureto de ferro que é um precipitado negro insolúvel.

+Hidrólise da Gelatina

Determina a capacidade do microrganismo de secretar gelatinase, uma enzima hidrolítica extracelular capaz de degradar a gelatina.

Se a degradação ocorre, as características de gel da gelatina não são passíveis de restauração, mesmo a baixas temperaturas, ou seja, torna-se líquido.

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+Prova do Indol

Condições: meio de cultura que contenha o aminoácido triptofano e reagente de Kovac’s (amarelo), que reage com o indol produzindo um composto rosado.

IndolTriptofano

Culturas com um anel avermelhado na superfície são indol positivo.

A persistência da coloração amarela do reagente demonstra que o substrato triptofano não foi hidrolisado a indol e indica uma reação negativa.

+Prova da Urease

Determina a capacidade do microrganismo para degradar a ureia através da enzima urease.

É importante para identificar espécies de Proteus. Condições: meio de ureia de Christensen que contém

também o indicador de pH, vermelho de fenol. Quando a ureia é degradada pela

urease, a amônia acumula-se no meio tornando-o alcalino, o que transforma o meio amarelo em rosa.

A ausência da coloração rosa indica uma reação negativa.

+Prova da Oxidase

Verifica a atividade da enzima citocromo oxidase, detectada em bactérias aeróbias, algumas anaeróbias facultativas e microaerófilas.

É importante para distinguir grupos de bacilos Gram negativo patogênicos.

Condições: reagente de oxidase (dihidrocloreto de tetrametil- p-fenilenodiamina).

Após a adição do reagente o desenvolvimento da coloração rosa depois castanha e finalmente negra na superfície das colônias é indicativo da produção de citocromo oxidase e representa uma prova positiva.

+Prova da Catalase

Condições: substrato H2O2. Se houver liberação de bolhas de gás (oxigênio livre), a prova é positiva.

A ausência de formação de bolhas de gás é uma prova negativa.

2 H2O + O22 H2O2catalase

Procedimento alternativo: determinar a produção de catalase adicionando uma porção de bactérias, previamente colocadas numa lâmina, com gotas de H2O2.

+Prova da Coagulase

É utilizada para distinguir espécies patogênicas de Staphylococcus de espécies não patogênicas, sendo um bom indicador da patogenicidade do S.aureus.

Condições: plasma com anticoagulante, como o oxalato, citrato ou heparina, suspensão de microrganismos (caldo de cultura) ou colônias provenientes de um meio sólido.

A formação de coágulos às 2 h, 6 h ou 24 h de incubação é interpretada como uma prova positiva.

A ausência de coagulação após 24 h de incubação é uma prova negativa

+Controle de Qualidade de Medicamentos e Cosméticos Conjunto de técnicas analíticas qualitativas, como o

crescimento bacteriano em um meio sólido;

Importantes microrganismos-chave a serem identificados, como:

Pseudomonas aeruginosas Staphylococcus aureus Escherichia coli Salmonella sp.

+Procedimentos

As amostras podem ser semeadas em dois tipos de meio, de enriquecimento ou diferenciação, dependendo do microrganismo com o qual se está trabalhando;

Para cada classe de bactérias existe um procedimento normatizado cuja recomendação é preconizada em compêndios

+Staphylococcus aureus

Ágar Baird-Parker – colônias pretas com halo transparente;

Ágar Vogel-Johnson – colônias pretas com halo amarelo;

Ágar-Manitol – colônias amarelas com halo amarelo.

+Pseudomonas aeruginosa

Ágar-Cetrimida – colônias esverdeadas, com fluorescência;

Ágar Pseudomonas para Piocianina – colônias esverdeadas, com fluorescência azul;

Ágar Pseudomonas para Fluoresceína – colônias claras e amarelas, com fluorescência amarela.

hν

+Escherichia coli

Ágar MacConkey – colônias vermelho-púrpura, com halo de precipitação de bile;

Ágar-Eosina com Azul de Metileno – colônias vermelho-escuras, com brilho metálico;

Ágar-Endo – colônias rosadas, com brilho metálico.

+Salmonella sp.

Meios de diferenciação: Ágar Tríplice Açúcar-Ferro – colônias avermelhadas na

superfície e amarelas no fundo, com precipitação de sulfeto de ferro;

Meios de enriquecimento seletivo: Caldo Selenito-Cistina e Tetrationato de Bismuto – colônias

pretas ou esverdeadas; Ágar Xililose-Lisina-Desoxicolato (XLD) – colônias vermelhas

com núcleo preto

+Provas Adicionais

A utilização da microscopia pode ser uma importante ferramenta de análise qualitativa;

A observação de uma suspensão bacteriana através de

lâminas microscópicas permite a identificação de características como tamanho, forma, brilho e arranjo da colônia;

Tais informações são importantes na categorização dos microrganismos.

+Métodos Alternativos

Constituem metodologias de vanguarda: automatizadas, rápidas e em sintonia com a agilidade desejável em uma industria;

Normalmente, implicam alto investimento em equipamentos – análise de custo-benefício deve ser levada em conta;

As análises podem ser baseadas na composição genética do microrganismo, seu metabolismo (e produtos dele) ou moléculas características que permitam sua identificação.

+PCR (Polymerase Chain Reaction) Amplifica uma sequência específica de DNA de um

genoma microbiano e pode, portanto, caracterizar a presença de um patógeno;

Amplamente utilizado na determinação da qualidade de alimentos, pois permite avaliar a qualidade microbiana de forma rápida, com precisão, especificidade e potencial para detecção de baixos níveis de contaminação.

Protocolos de extração de DNA não exigem o emprego de solventes, precipitação com álcool, ou outros tratamentos nas amostras que demandem em tempo de preparo antes da análise.

+Aglutinação no Látex

Rápida forma de se determinar a presença ou ausência de um antígeno ou anticorpo proveniente de bactérias;

Se o antígeno ou anticorpo correspondente estiver presente, ocorrerá uma aglutinação da amostra em partículas visíveis, uma vez que a matriz (látex) estará impregnada com seu correspondente específico.

+Imunofluorescência

A utilização de anticorpos fluorescentes para diferentes epítopos pode ser indicada para identificar a presença de determinados microrganismos na amostra de interesse;

A leitura pode ser realizada através da utilização de microscopia óptica com luz polarizada;

A técnica permite a localização de proteínas sem que a colônia (biofilme) seja destruída.

+Gene Reporter

É um gene identificável qualquer utilizado para identificar outros genes específicos na cultura bacteriana, normalmente inserido em meio ao gene de interesse, reportando sua presença ou não no microrganismo;

Determinados genes são escolhidos como reporters, pois conferem aos organismos que os expressam características facilmente identificáveis ou mensuráveis;

+Conclusão

Os métodos alternativos são, em primeira análise, mais onerosos que os convencionais, contudo, conferem maior exatidão, precisão e confiabilidade às análises;

Além disso, o tempo hábil é um fator limitante em ambientes industriais, e isso deve ser levado em conta quando da escolha de uma metodologia;

É importante ressaltar a enorme relevância da validação metodológica em todo e qualquer processo de controle de qualidade, de modo que os procedimentos sempre tenham reprodutibilidade.

+Referências Bibliográficas

Farmacopéia Brasileira, 4. Ed., São Paulo: Atheneu, 1988. pte. 1, p. 526;

www.anvisa.gov.br - acessado em 08/10/2009; 

PINTO, T.J.A.; KANEKO, T.M.; OHARA, M.T., “Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos”, São Paulo: Atheneu, 2000, p. 309; 

Robert S. Dungan; April B. Leytem; “Qualitative and quantitative methodologies for determination of airborne microorganisms at concentrated animal-feeding operations”; World J Microbiol Biotechnol (2009) 25:1505–1518.

+Agradecemos a Atenção!